Os astrovírus são agentes virais associados com enteropatias e infecções extra-intestinais em aves, ocasionando prejuízos no desenvolvimento produtivo e saúde animal. Porém, são escassos os estudos no Brasil que visem a detecção e caracterização deste vírus com maior amplitude. Nesse contexto, detectaram-se e caracterizaram-se cepas de astrovírus a partir de 60 amostras fecais de aves procedentes de diferentes criações comerciais brasileiras (postura, corte e matrizes), mediante o emprego de uma reação PanAstrovírus como triagem inicial, que consistiu numa reação de RT-hemi-nested-PCR, visando a amplificação e posterior sequenciamento de um segmento parcial do gene RdRp (RNA polimerase dependente de RNA) do gene ORF1b, uma região gênica conservada entre todos os astrovírus. Subsequentemente, nas amostras positivas na triagem, realizou-se a amplificação, clonagem e sequenciamento do gene ORF2 codificante do capsídeo viral, analisado mediante análise filogenética. Os dados obtidos demonstraram uma frequência de infecção por astrovírus em 48,3% (29/60) das amostras analisadas. As espécies virais detectadas foram as seguintes: Avastrovírus 2 (Avian Nephritis Virus, ANV) em 72,4% (21/29), Chicken Astrovírus (CAstV) em 6,8% (2/29) e Avastrovírus 1 (Turkey Astrovírus tipo 1, TAstV-1) em 20,8% (6/29) das amostras positivas. O sequenciamento total do gene ORF2 foi possível em oito amostras (8/21) positivas a ANV, em uma amostra (1/6) positiva a TAstV-1 e uma amostra (1/2) positiva para CAstV. A análise deste gene revelou, nas sequências ANV, a presença de três genótipos bem diferenciados, segundo critérios do Astroviridae Study Group, sendo que um deles, agrupou-se dentro do genótipo 5. Além disso, quando analisado com sequências procedentes de outras regiões, as sequências deste estudo formaram seis clusters, dois deles, relacionados com sequências procedentes de Austrália e Reino Unido. O análise do ORF2 em CAstV, revelou também um agrupamento com cepas procedentes do Reino Unido. Já o análise da ORF2 de TAstV-1, revelou divergência genética com cepas isoladas em Estados Unidos, que foram as únicas sequências disponíveis no GenBank. O presente estudo traz a luz vários dados epidemiológicos concernentes aos astrovírus aviário de origem brasileira o que permitirá a realização de outros estudos relacionados a epidemiologia deste vírus, seus possíveis riscos potenciais em saúde pública e a adoção de medidas de controle direcionadas a este agente / The astroviruses are viral agents associated with enteropathy and extraintestinal infections in poultry, causing injuries to the productive development and animal health. However, are scarce the studies in the Brazil that aimed to detection and characterization of this virus with greater scale. In this context, were detected and characterized astrovirus strains from 60 fecal samples of poultry from differents Brazilian commercial flocks (laying hens, broilers and breeders) by using of the Pan-Astrovirus reaction as initial screening, consisting of RT-Hemi-nested PCR reaction, aiming the amplification and subsequent sequencing of a partial segment of the RdRp gene (RNA polymerase RNA dependent) of the ORF1b gene, a genic conserved region among all of the astroviruses. Thereafter, in the positive samples in the screening, amplification, cloning and sequencing of the ORF2 gene, codificant of the viral capsid, was performed, and analyzed by phylogenetic analysis. The data obtained demonstrated a astroviruses frequency infection in 48,3% (29/60) of the analyzed samples. The viral species detected were the following: Avastroviruses 2 (Avian Nephritis Virus, ANV) in 72,4 % (21/29), Chicken Astrovirus (CAstV) in 6,8% (2/29) and Avastrovirus 1 (Turkey Astrovirus type 1, TAstV-1) in 20,8% (6/29) of the positive samples. The total sequencing of the ORF2 gene was possible in eight positive samples (8/21) to ANV, in one positive sample (1/6) to TAstV-1 and a one positive sample (1/2) to CAstV. The analyze of this gene showed, in the ANV sequences, the presence of three distinct genotypes, according to the Astroviridae Study Group criteria, being one of them, was grouped within of the genotype 5. Furthermore, when analyzed with sequences from other regions, the sequences of this study, formed six clusters, two of them, related with sequences from Australia and United Kingdom. The ORF2 analyze in CAstV showed likewise a grouping with strains from United Kingdom. And the analyze of TAstV-1 ORF2, showed genetic divergence with strains isolated in United States of America, that were the only sequences available in the GenBank. The present study brings to light several data concerning to the Brazilian avian astroviruses, allowing to realization of the others studies related to the epidemiology of this virus, theirs potential public health risks and the adoption of the control measures targeted to this agent

Neste trabalho foi estuda a interação da E. coli patogênica aviária (APEC), agente etiológico da colibacilose aviária, e células não fagocitárias. A APEC é uma ExPEC (E. coli extra-intestinais), grupo que também inclui a UPEC (E. coli uropatogênica) e a NMEC (E. coli de meningite neonatal). Foi analisado o comportamento de 8 cepas APEC - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - frente a duas linhagens de células não-fagocitárias, fibroblastos aviários CEC-32 e células endoteliais humanas EAhy926. Foi realizada a genotipagem de 33 genes associados à virulência, verificou-se capacidade de associação (adesão e invasão), de invasão e de multiplicação intracelular, de citotoxicidade e de ativação das caspases 3/7 das cepas após infecção de fibroblastos aviários. Foi observado que enquanto todas as cepas foram capazes de aderir aos fibroblastos aviários, somente a cepa MT78 foi capaz de invadí-los em níveis comparáveis à bactéria invasiva Salmonella Typhymurium SL1344. As cepas APEC não induziram ativação de capases 3/7, nem foram citotóxicas aos fibroblastos. Uma vez que a cepa invasiva, MT78, e a não invasiva, IMT2470, apresentam genótipos de virulência muito similares, foi realizado o estudo da expressão por RT-PCR dos genes de virulência da bactéria crescida com e sem fibroblastos aviários, por 3 h. Os resultados mostraram a expressão de adesinas, sideróforos e protectinas/estruturas de resistência ao soro para ambas as cepas na ausência e presença de fibroblastos. A análise da expressão dos genes fimH, ompA, ibeA e gimB pela técnica RT-qPCR revelou a repressão do gene fimH na MT78, mas indução do mesmo na IMT2470. Já as invasinas, gimB e ibeA, estavam induzidas em MT78 e reprimidas em IMT2470, enquanto o gene ompA estava sendo expresso em ambas as cepas. A expressão das invasinas gimB e ibeA explica em parte o fenótipo invasivo da MT78. No presente estudo também foi analisado o comportamento das 8 cepas APEC em relação ao perfil de associação, invasão e multiplicação intracelular ao infectarem células EAhy926. As cepas não mostraram capacidade de invadir as células mas apresentaram um nível de associação muito superior ao dos fibroblastos aviários (até 14 vezes superior para algumas cepas). Este trabalho mostrou que o ensaio in vitro com CEC-32 é um modelo adequado para o estudo da interação celular entre APEC e células eucarióticas e agregou mais conhecimento sobre o patotipo. / In this work the interaction between avian pathogenic E. coli (APEC), the etiological agent of avian colibacillosis, and non-phagocytic cells was studied. APEC is an ExPEC (extraintestinal E. coli), a group that also includes UPEC (uropathogenic E. coli) and NMEC (E. coli neonatal meningitis). We analysed the behavior of 8 APEC strains - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - against two non-phagocytic cell lines, avian fibroblasts (CEC-32) and human endothelial cells (Eahy926). Strains were genotyped for 33 virulence associated genes, and investigated the association capacity (adhesion and invasion), the invasion ability, intracellular multiplication, cytotoxicity and activation of caspases 3/7 of the strains after infecting avian fibroblasts. While all strains were able to adhere to avian fibroblasts, only the strain MT78 was able to invade them at levels comparable to the invasive bacterium Salmonella Typhymurium SL1344. APEC strains could not induce activation of caspases 3/7, nor were cytotoxic to fibroblasts. Since the invasive MT78 and the non-invasive IMT2470 strains presented very similar virulence genotypes, the expression of virulence genes of the bacteria grown in the absence and presence of avian fibroblasts by 3 h was analysed by RT-PCR. Results showed the expression of adhesins, siderophores and protectins/serum resistance structures for both strains in the two culture conditions, with and without fibroblasts. Analysis of the expression of fimH, ompA, ibeA and gimB by RT-qPCR revealed the repression of fimH in MT78, but the induction in IMT2470. In relation to ibeA and gimB invasins, they were induced in MT78 but repressed in IMT2470, while the ompA gene was expressed in both strains. The expression of invasins partly explains the invasive phenotype of MT78. It was also analysed the behaviour of the strains in relation to the association profile, invasion and intracellular multiplication when infecting EAhy926 human endothelial cells. The strains showed no ability to invade endothelial cells but showed a high level of association (up to 14 times higher than for fibroblasts cells for some strains). This study showed that the CEC-32 in vitro model is suitable for the study of cellular interaction between APEC and eukaryotic cells, and added more knowledge about the pathotype.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-07-29T16:47:15Z No. of bitstreams: 1 Ana Lizia Brito da Cunha.pdf: 5020684 bytes, checksum: 4b8626104d83eb8de1f36f4e1110c8ee (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T16:47:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Lizia Brito da Cunha.pdf: 5020684 bytes, checksum: 4b8626104d83eb8de1f36f4e1110c8ee (MD5) Previous issue date: 2007-07-27 / Between the some sanitary problems that affect the wild avian, the parasitic diseases are the most frequent, since causing sub-clinics infections until the death. The endoparasites are very common in captivity kept birds, mainly in cases of high population density. The ectoparasites provoke serious damages that compromise the health of the wild avian being able to take them it the death, as well as indirect damages that intervene with the behavior and the performance of these animals in captivity. Being thus, the present work had for objective to relate the prevalence of endo and ectoparasites in cracides maintained in captivity at Dois Irmãos Zoo Park, Recife-Pernambuco. Dois Irmãos Zoo Park pertaining birds of the Cracidae family had been studied. These animals were born at breeders from different regions of Zona da Mata of Pernambuco State. Samples of excrement and sand had been collected. For the analysis of these samples four excrement collections and one of sand in a period of 60 days had been made. A total of 84 feces samples of 21 species of cracides of 58 animals were collected. The harvested material was submitted to examinations by direct method and spontaneous sedimentation. The results had been positive for Strongyloides sp, Ascaridia sp, Capillaria sp and cysts of Entamoeba coli and eggs of the Strongyloidea family. Two collections with interval of 60 days of plumes to search ectoparasites had been made. A total of 42 samples of plumes had been examined of 21 cracides species. This material was submitted to optic microscope direct examination of identification. The results had evidenced the presence of Analgidae, Glycyphagidae and Pterolichidae mites and Menoponidae lices. / Entre os vários problemas sanitários que afetam as aves silvestres, as enfermidades parasitárias estão entre as mais freqüentes, podendo causar desde infecções sub-clínicas até a morte. Os endoparasitos são muito comuns em aves mantidas em cativeiro, principalmente em casos de alta densidade populacional. Os ectoparasitos provocam danos diretos que comprometem a saúde das aves podendo levá-las à morte, bem como danos indiretos que interferem no comportamento e no desempenho destes animais em cativeiro. Sendo assim, o presente trabalho teve por objetivo relatar a prevalência de endo e ectoparasitos em cracídeos criados em cativeiro no Parque Dois Irmãos, Recife-PE. Foram estudadas aves da família Cracidae pertencentes ao acervo do Parque Dois Irmãos, as quais foram oriundas de criatórios particulares, da Região Metropolitana e Zona da Mata do Estado de Pernambuco. Para isto, foram coletadas amostras de fezes e areia. Para a análise dessas amostras foram feitas quatro coletas de fezes e uma de areia em um período de 60 dias, com um total de 84 amostras fecais de 21 espécies de cracídeos de 58 animais. O material colhido foi submetido a exames coproparasitológicos pelo método direto e de sedimentação espontânea. Os resultados foram positivos para Strongyloides sp, Ascaridia sp, Capillaria sp e cistos de Entamoeba coli, além de ovos pertencentes a grande família Strongyloidea. Para os ectoparasitos, foram feitas duas coletas de penas, com intervalo de 60 dias entre as duas, ao total foram examinadas 42 amostras de penas de 21 espécies de cracídeos. O material colhido foi submetido ao exame de identificação direto, feito através do microscópio óptico. Os resultados constataram a presença de ácaros pertencentes às famílias Analgidae, Glycyphagidae e Pterolichidae, e piolhos da família Menoponidae.

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Marcelo Palma Sircili / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T16:00:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maturana_VictorGoncalves_M.pdf: 5059455 bytes, checksum: b3305e2d1e0d658292aa1e194e68fb8f (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Escherichia coli patogênica para aves (APEC) causa diferentes tipos de infecções sistêmicas extraintestinais nestes hospedeiros, coletivamente denominadas colibaciloses, causando grandes prejuízos econômicos à indústria aviária. Essas doenças incluem, dentre outras, septicemia, onfalite, celulite e síndrome da cabeça inchada. Entretanto, não há até o momento wna descrição de genes ou características que permitam classificar as linhagens aviárias em patótipos responsáveis por causar doenças específicas em seus hospedeiros, a semelhança do que ocorre para linhagens de E. co/i patogênicas para seres humanos. O objetivo deste estudo foi caracterizar linhagens de Escherichia coli de origem aviána representantes de 4 grupos, sendo um grupo de linhagens comensais (AFEC - stgla em inglês para "Avian Fecal Escherichia co/i") e três grupos de linhagens patogêmcas, causadoras de três sindromes diferentes em seus hospedeiros (septicemia, síndrome da cabeça inchada e onfalite). Para o trabalho, as características biológicas estudadas foram: adesão em células eucarióticas, formação de biofilme, produção de molécula sinalizadora de quorum sensing, presença de genes de ilhas de patogenicidade, dose de letalidade (LD50), grupo filogenético e presença de genes de virulência. A comparação entre as diferentes linhagens com base nestes traços genotípicos e fenotípicos, por meio de diferentes ferramentas de estatística multivariada além de redes complexas, permitiu inferir a estrutura populacional do grupo estudado. Os resultados indicam que APEC não constitui um grupo homogêneo, mas um conjunto estruturado de diferentes subgrupos, cada um associado a uma síndrome infecciosa específica causada no hospedeiro, possivelmente definindo diferentes patótipos ou subpatótipos dentro de linhagens APEC. Assim, sugerimos a existência de um subpatótipo associado à onfalite, com características de letal idade semelhantes as de linhagens AFEC, mas com um padrão de adesão diferente, que pode ser atribuído a uma especialização do grupo relacionada a colonização de um nicho particular, o saco da gema do ovo. E um subpatótipo associado à síndrome da cabeça inchada, igualmente adaptado à patogenicidade, mas com características mais "agressivas" evidenciadas pelos altos índices de letalidade, grande número de genes de virulência e altos índices de adesão. Linhagens associadas à septicemia, contudo, não constituem um grupo coeso, sugerindo tratar-se de uma miscelânea de linhagens que podem pertencer a diferentes subpatótipos e que em última instância geram a síndrome sistêmica (septicemia), devido à evolução do quadro clínico e/ou às condições imunológicas do hospedeiro. Este trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de subpatótipos dentro de linhagens APEC, relacionando diferentes síndromes infecciosas com grupos específicos de linhagens as quais possuem características fenotípicas e genotípicas particulares. Tais resultados abrem novas possibilidades no estudo de genes responsáveis pelos diferentes processos de patogênese em APEC, bem como no desenvolvimento de vacinas. Talvez seja importante considerar estes subgrupos no desenvolvimento de vacinas, com o intuito de produzir vacinas com proteção cruzada, o que ainda não foi atingido com sucesso para linhagens APEC. / Abstract: Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) cause different types of systemic extraintestinal infections in poultry, which are collectively termed colibacillosis, imposing significant economic casses for the avian industry Among these diseases are septicaemia, omphalitis, cellulites and swollen head syndrome. However, to the date, there is no description of genes or characteristics which allow us to classify avian strains in pathotypes responsible for causing specific diseases in their hosts, as there are for human pathogenic E. co/i strains. In this study we aimed to characterize avian pathogenic E. co/i strains representing 4 groups, one of commensal strains (AFEC - Avian Fecal Escherichia co/i) and 3 groups of pathogenic strains responsible for causing 3 different syndromes in their hosts (septicaemia, omphalitis and swollen head syndrome). The biological characteristics studied were: adhesion to eukaryotic cells, biofilm formation, capacity of synthesizing quorum sensing s1gnaling molecule, presence of pathogenicity island, pathogenicity levels according to lethal dose (50%) assay, phylogenetic group and presence of virulence genes. The comparison between strains based on these genotypic and phenotypic traits, by different multivariate statistics tools and complex network, allowed us to infer. the population structure of the studied group. The results indicate that APEC do not constitute a unique homogeneous group, but a structured set of different subgroups, each one associated to a specific infectious syndrome inflicted to the host, possibly defining pathotypes or subpathotypes within APEC strains. Thus, we suggest the existence of a subpathotype associated to omphalitis, with lethality characteristics similar to AFEC strains, but with a different adhesion pattem, which may be due to a specialization related to the colonization of a particular niche, the egg's yolk sac. Anda subpathotype associated to the swollen head syndrome, equally adapted to pathogenicity, but with more "aggressive" characteristics demonstrated by the high lethality and adhesion levels. Septicaemic strains, however, do not constitute a cohesive group, which suggests a constellation of strains associated to different subpathotypes and capable of, eventually, cause a systemic syndrome (sepsis), due to the clinical evolution of the illness ami/or host immunological conditions. This work is pioneer in demonstrating the existence of subpathotypes within APEC strains, relating different infectious syndromes to specific groups of strains possessing particular genotypic and phenotypic characteristics. These results offer new possibilities in studying the genes responsible for different pathogenesis processes within APEC and for the vaccine developing. It may be important to consider these subgroups in the process of vaccine developing, in the efforts for obtain cross protection, which had not yet being accomplished successfully concerning APEC strains. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T18:03:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nakazato_Gerson_D.pdf: 8124428 bytes, checksum: 0945b4124057f20c385fd7c7658685be (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Duas linhagens de Escherichia co/i patogênicas isoladas de aves (APEC) com sinais clínicos de septicemia (517 e 521) e wna isolada de aves com sinais clínicos de 5índrome de Cabeça Inchada (5CIl O) foram selecionadas, do conjunto de 49 linhagens pertencentes ao Laboratório de Biologia Molecular Bacteriana, após a caracterização das mesmas quanto à presença das capacidades de adesão e invasão em células HEp-2 e HeLa, perfil de resistência a diferentes antimicrobianos, presença de genes (detectados por PCR) relacionados à patogenicidade, e perfil de DNA plasmidial. Teste de REP-PCR também foi realizado para separação destas linhagens em grupos clonais. Os plasmídios dessas linhagens foram transferidos, através de conjugação, para a linhagem receptora não patogênica, E. co/i HBI0l. A análise das amostras recombinantes obtidas, através das características estudadas, demonstrou que somente aquelas transconjugantes derivadas da linhagem 517, uma delas denominada de 517-1, apresentaram adesão e invasão nessas culturas celulares utilizadas, indicando que os genes responsáveis por estas características estão localizados no plasmídio que foi transferido (70 MDa). Pelo fato das capacidades de adesão e invasão das linhagens 521 e SCIl O não terem sido detectadas em transconjugantes em que ocorreram as transferências de plasmídios existentes nestas duas linhagens, indica que os genes responsáveis por estas características não são plasmídio-mediado, podendo, ou serem cromossômicos, ou mesmo serem plasmidiais, porém com controle de genes cromossômicos. A mutação da amostra 517-1, com o transposon TnphoA levou à perda das capacidades de adesão e/ou invasão em células HEp-2 e HeLa, o que indica que o processo de inserção do transposon tenha ocorrido em genes relacionados aos processos citados. O gene tsh (hemaglutinina termo-sensível) presente na linhagem 521, e os genes relacionados ao sistema de aerobactina presentes nas linhagens SCIlO ifepC) e 521 (iucA), também não foram identificados nas amostras transconjugantes. Com isso, sugere-se que estes genes possam estar localizados no cromossomo destas linhagens, bem como os genes de adesão e invasão dessas linhagens. Esta observação pode indicar a presença de possíveis "ilhas de patogenicidade" nestas linhagens, porém outros estudos devem ser realizados para que esta hipótese se confirme. A produção de colicinas (Ia, Ib, El, E3, B, K) pela linhagem SCIlO também foi passível de ser transferida para a linhagem bacteriana receptora, o que indica que esta característica é expressa por genes presentes no plasmídio transferido (120 MDa). Através de testes de invasão na linhagem celular HEp-2, Microscopia Eletrônica de Varredura e teste de F AS verificou-se que a capacidade de invasão celular presente na linhagem S 17 é diferente daquelas descritas para outras E. coZi invasivas, Salmonella spp. e Shigella sp / Abstract: Two pathogenic Escherichia coZi strains isolated from avian (APEC) showing c1inical signs of septicemia (817 and 821), and one isolated from avian showing c1inical signs of 8wollen Head 8yndrome (8H8 1 O), were selected from a total of 49 strains belonging to the Laboratory of Bacterial Molecular Biology, after a biological characterization regarding the presence of adhesion and invasion capacities to HEp-2 and HeLa cells, resistance profile to different antimicrobial drugs, presence of genes (detected by PCR) associated with pathogenicity, and plasmidial DNA profile. REP-PCR assay also was performed for separation of these strains in c10nal groups. Plasmids from these strains were transferred by conjugation assays to the non-pathogenic E. coZi strain HB 1 O 1. The analysis of the obtained recombinants strains, demonstrated that only recombinant strains derived from 817, one of these designated as 817-1, showed adhesion and invasion to these cells, indicating that the genes responsible for these characteristics are located in the transferred plasmid (70 MDa). 8ince the adhesion and invasion capacities of 821 and 8H8 1 O strains were not detected in recombinant strains where the transference of plasmids presents in these two strains occurred, indicates that the genes responsible for these characteristics are not plasmid-mediated. The location of these genes could be chromosomal, or thus plasmidial, but with chromosomal control. The mutation of 817-1 strain, with TnphoA transposon, resulted in the lost of adhesion and/or invasion capacities to HEp-2 and HeLa cells, which indicate that the transposon insertion process had occur at genes associated with the described processo The tsh gene (temperature-sensitive hemagglutinin) from 821 strain, and aerobactin genes from 8H810 ifepC) and 821 (iucA) strains, also were not found in the recombinants strains. These results suggest that these genes could be located in chromosomal regions as well as the adhesion and invasion genes from these strains. This observation could indicate that the presence of possible "pathogenicity islands" in these strains, but other studies must be realized for confirmation of this hypothesis. The production of colicins (Ia, Ib, El, E3, B and K) by strain 8H810 also was transferred to the recipient strain, which indicate that this characteristic is expressed by genes located at the transferred plasmid (120 MDa). Using invasion assays to HEp-2 cells, 8canning Electron Microscopy and FA8 assay, it was possible to observe that the cellular invasion capacity from 817 strain is different of those processes described by others invasive E. coZi, Salmonella spp. and Shigella sp / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Clarice Weis Arns, Renata Servan de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:41:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_HelenaLage_D.pdf: 2290087 bytes, checksum: 244512a14adbf81da5ab74893d3c12b2 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O metapneumovírus aviário (AMPV) é o agente primário da rinotraqueíte dos perus (TRT). O AMPV pertence à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gênero Metapneumovirus. Também está associado à síndrome da cabeça inchada (SHS) em galinhas e é responsável por significativas perdas econômicas em sua produção. O presente estudo foi dividido em três partes. A primeira parte do trabalho consistiu em avaliar a beta-actina, gene utilizado como controle interno das técnicas moleculares de detecção viral, das células chicken embryo related (CER). Para isso, foi realizado o sequenciamento dos amplicons gerados pelo PCR do gene da beta-actina. A beta-actina das células BHK21 e CER foram detectadas utilizando oligonucleotídeos hamster-específicos. Além disso, pela análise filogenética as células CER e BHK21 apresentaram uma alta similaridade genética (p>0.996). Estes resultados sugerem que as células CER não deveriam ser mais consideradas como células aviárias. A segunda parte do estudo consistiu em comparar a especificidade e limite de detecção de duas novas técnicas de RT-PCR convencional (genes da nucleoproteína (N) e da proteína de fusão -F) e de duas novas técnicas de real time RT-PCR (RRT-PCR; genes F e N) com um RT-PCR (gene da glicoproteína -G) previamente estabelecido para a detecção do AMPV. Todos estes métodos foram capazes de detectar os isolados AMPV subtipo A (AMPV/A). As técnicas RRT-PCR (genes F e N) foram capazes de amplificar os maiores limites de detecção (diluições 10-5 e 10-5, respectivamente). Além disso, o RRT-PCR gera resultados rápidos e sensíveis, o que o torna uma ferramenta alternativa para o isolamento viral. Na terceira parte, foi realizado o silenciamento gênico de AMPV pela aplicação de seqüências curtas e específicas de RNA (siRNAs, do inglês short interfering RNA) para regiões alvo do genoma viral. Assim, foram desenhadas moléculas de siRNA contra os genes N e F do AMPV. Três dias após a infecção viral, o efeito do siRNA na replicação viral foi verificado por titulação viral, RRT-PCR e RT-PCR. Os títulos virais das células CER transfectadas com o siRNA/N apresentaram queda de até 99,9% em relação ao controle. A produção de mRNAs para os genes N, F e G do AMPV também apresentou uma redução de até 99,7%. Desta forma, a molécula de siRNA contra o gene N foi capaz de inibir a replicação do AMPV in vitro. Em estudos futuros, a associação de siRNAs tendo como alvo o complexo da RNA polimerase deve ser avaliada como uma eficiente ferramenta para evitar o escape viral na terapia antiviral / Abstract: Avian metapneumovirus (AMPV) is the primary causative agent of severe rhinotracheitis in turkeys. AMPV belongs to the Paramyxoviridae family, Pneumovirinae subfamily, within the genus Metapneumovirus. It is associated with swollen head syndrome in chickens and is the source of significant economic losses to animal food production. The present study is divided in three parts. In the first part, the chicken embryo related (CER) cells beta-actin was evaluated. The CER beta actin gene was amplified by RT-PCR, and the amplicon was sequenced. The BHK21 and CER beta-actins were detected using hamster-specific primers. The results showed that such cells are closely related to BHK21 (p > 0.966), having a p-distance of 0.7 from chicken embryo fibroblasts. This confirms that CER cells are phylogenetically closely related to BHK21 cells. The second part of the study, we compared the specificity and detection limits of two newly designed conventional RT-PCRs (F and N genes) and two newly defined real time RT-PCR (RRT-PCR; (F and N genes), with an established RT-PCR (G gene) for AMPV detection. All the RT-PCR tested assays were able to detect the six isolates. The higher detection limits were observed at 10-5- fold and 10-5-fold dilutions of the N- and F- based RRT-PCR, respectively. Important to note that RRT-PCR assays generate fast and sensitive results, becoming a feasible alternative for virus isolation. In the third part, the silencing of AMPV by targeting its viral regions was promoted. We designed specific short interfering RNA (siRNA) targeting the nucleoprotein (N) and fusion (F) genes. Three days after the virus infection, the effect of siRNA in the virus replication was verified by virus titration, real time RT-PCR, and RT-PCR assays. AMPV titers presented reduction by 99.9%, when compared to the siRNA/F and siRNA/GFP treated samples. Also, real time RT-PCR results presented reduction of AMPV N, F and G mRNAs by 99.7%, when transfected with siRNA/N. Therefore, an siRNA sequence targeting the N gene was able to inhibit the AMPV production in vitro. In future studies, a combination of siRNAs targeting the RNA-polymerase complex may be used as a tool to study AMPV-infected cells or as an antiviral therapy / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Clarice Weis Arns, Dagmar Ruth Stach-Machado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T14:40:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coswig_LiaTreptow_D.pdf: 19863975 bytes, checksum: 7e0e923baa4947ed3f77ff3ca34747e9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: o Metapneumovírus Aviário (AMPV), também denominado vírus da rinotraqueíte dos perus (TRT), é um vírus que acomete e causa infecção no trato aéreo superior das galinhas e perus. Além da infecção respiratória, em poedeiras e matrizes está associado com uma queda significativa na produção de ovos. Em galinhas o vírus está relacionado com a Síndrome da Cabeça Inchada (SCI), uma enfermidade multifatorial, e por este motivo é importante o diagnóstico diferencial. Testes realizados com anticorpos monoclonais (Mabs) e técnicas moleculares são capazes de detectar diferenças entre os subtipos do vírus. Os métodos de diagnóstico incluem isolamento ou detecção da partícula viral ou testes sorológicos. O isolamento das amostras virais SHS-BR-121 (subtipo A) e STG-SHS-1439 (subtipo B) foi realizado em cultura de anel de traquéia, em fibroblasto de embrião de galinha (FEG) e em células chicken embryo related (CER). A comparação das médias dos títulos obtidos para as duas amostras virais, em célula CER, apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,014) com p< 0,05. Neste projeto foi avaliada a suscetibilidades de seis sistemas celulares (CER, Vero, BHK-21, HEp-2, MDBK e ED) para a multiplicação das duas amostras virais (subtipos A e B). Destes sistemas as células CER, Vero e BHK-21 demonstraram ser apropriadas para a replicação vira!. Os títulos nestas células variaram de 105.5 a 107,o/mL DICC50 , para o vírus SHS-BR-121, e 105,5 a 106.0/mL DICC50 para o vírus STG-SHS-1439. As diferenças entre as médias dos títulos nos diferentes sistemas celulares foi estatisticamente significativa para a amostra SHS-BR-121 inoculada em CER em relação as células Vero e BHK-21 (P= 0,01 e P=0,004, respectivamente) com p< 0,05. Para a amostra STG-SHS-1439 não houve diferença estatística significativa, com p<0,05. A curva da cinética viral foi realizada para as duas amostras virais, em três sistemas celulares, CER, Vero e BHK-21, demonstrando estas diferenças. Foram produzidos anticorpos monoclonais contra o AMPV isolado no Brasil, sendo obtidos cinco anticorpos monoclonais para o antígeno viral através da fusão celular que apresentaram os isotipos IgG1, IgG2a e IgG2b quando da isotipagem. Dos cinco anticorpos monoclonais, três possuíam atividade neutralizante e quatro deles inibiram a fusão invitro. No teste de soroneutralização cruzada foram utilizadas três amostras virais para a análise, sendo elas SHS-Br-121, STG 854/88 e TRT-SHS-1439. Todos os anticorpos monoclonais apresentaram resultado positivo em relação à amostra homóloga, sendo que três apresentaram resultados positivos também para as amostras heterólogas. Os resultados confirmam que os dois anticorpos monoclonais descritos podem ser utilizados com importante ferramenta nos estudos epizootiológicos e para o diagnóstico específico dos subtipos na infecção pelo Metapneumovírus Aviário / Abstract: Avian Metapneumovirus (AM PV) , also denominated virus of the rhinotracheitis of the turkeys, it is a virus that attacks and it causes infection in the upper respirator) tract of chickens and turkeys. Besides the respiratory infection, in breeders and layers is associated with a significant fall in the production of eggs. In chickens the virus is related with the Swollen Head Syndrome (SHS), an illness multifactorial and for this reason it is very important the differential diagnosis. Tests accomplished with monoclonal antibodies (Mabs) and molecular techniques are capable to detect differences among the subtypes of the virus. Methods for the diagnosis of AMPV infections include detection or isolation of the virus itself, demonstration of a specific antibody response to the virus. For the primary isolation of the two samples of AMPV SHS-BR-121 (subtype A) and STG-SHS-1439 (subtype B) was it accomplished ir chicken embryo tracheal" organ culture (TOC), in chicken embryo fibroblast cell culture (CEF) and was it accomplished in cell line chicken embryo related (CER). Done the comparison of the averages of the titers obtain for the two strains, in cellline CER, did present statistically significant difference (P=0,014) with p< 0,05. The growth of SHS121-BR and STG-SHS-1439 was evaluated in six different celllines (CER, Vero, BHK21, HEp-2, MDBK and ED). CER, Vero and BHK-21 showed to be the most appropriate for virus multiplication. The titers in these cells varied from 105.5 to 107,o/mL !CID50, for the virus SHS-BR-121, and 105,5 to 106,o/mL TCID50 for the virus STG-SHS71439. The differences among the averages of the titers in the different cell lines was statistically significant differences (P=0,01) with p<0,05 for the strain SHS-BR-121 in CER cellline. One-step growth curves of the strains SHS-BR-121 and STG-SHS-1439 in CER, Vero and BHK-21 showed that there was not statistically significant difference in the infectious virus titers from 0 to 60 hours after infection. Five monoclonal antibodies were obtained for the viral antigen through the cell fusion that showed the isotypes IgG1, IgG2a and IgG2b, when of the characterization of Mabs. Three of them showed neutralizing activity and four inhibited the fusion in vitro. These MAbs were used to investigate antigenic relationship among three strains (SHS-BR-121, STG 854/8o/and TRT1439/91) of a MPV subtypes A and B using cross-neutralization test. When the five hybridomas were analyzed showed result positive for the homologus virus. In relation t4 two samples of heterologus AMPV three Mabs were positive to heterologus AMPV. Th4 results confirm that the two monoclonal antibodies described can be used as a valuable tool in the epizootiological and serological studies, and also for the specific diagnosis o the subtypes in the infection for Avian Metapneumovirus / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-21T10:51:58Z No. of bitstreams: 1 ushavashist.pdf: 630186 bytes, checksum: 745a558bec12dae7850947a507e2f344 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-25T12:31:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ushavashist.pdf: 630186 bytes, checksum: 745a558bec12dae7850947a507e2f344 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-25T12:31:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ushavashist.pdf: 630186 bytes, checksum: 745a558bec12dae7850947a507e2f344 (MD5) Previous issue date: 2007-02-23 / Plasmodium juxtanucleare é o agente causador da malária aviária que ocorre em alguns estados do Brasil. Esta malária está relacionada a diversos sinais clínicos e pode causar danos em criações rústicas de aves. O modelo aviário já foi utilizado para a investigação de drogas no combate à malária e hoje em dia o modelo mais utilizado é o Plasmodium berghei em roedores. A busca por anti-maláricos e malaricidas é de extrema relevância. O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito da 4-(6-MERCAPTOPURINA)-7-CLOROQUINOLINA, uma substância recém sintetizada a partir da cloroquina, sobre a malária aviária em Gallus gallus e aprimorar o modelo aviário para testes de potenciais malaricidas. Para o encontro de uma ave doadora, foram visitadas no município de Juiz de Fora duas granjas e feitos esfregaços sangüíneos de 30 aves. A prevalência foi de 100%. Dentre as 30 aves examinadas, as seis com os maiores valores de parasitemia foram adquiridas e levadas para o laboratório. Para verificar qual o melhor dia para a retirada de sangue de aves infectadas e imunossuprimidas pelo acetato de metilprednisolona, cinco das seis aves receberam em dose única este imunossupressor e uma serviu como controle. A parasitemia das aves foi acompanhada por 26 dias após o dia da imunossupressão, por meio de esfregaços sangüíneos preparados a cada dois dias. Também foram aferidos o peso e temperatura corporal e feitos microhematócritos sangüíneos. Verificou-se que ao 10º dia pós-imunossupressão ocorreu pico de parasitemia. Houve queda de peso corporal e correlação com a parasitemia. Ocorreu pouca variação na temperatura corporal e hematócrito e não houve correlação destes com a parasitemia. Em outras oito aves adquiridas em casa comercial com 15 dias de idade, foram realizadas infecções experimentais com sangue inoculado via intramuscular e via intraperitonial nas doses de 0,3mL e 0,5mL para as duas vias. Durante um mês as aves tiveram o valor médio de parasitos acompanhado para comparar qual a via mais efetiva e se havia diferença entre as doses testadas no estabelecimento da infecção. Não foi observada diferença entre as xv dosagens, mas foi possível verificar que a infecção via intraperitonial atinge mais rapidamente o pico de parasitemia, com médias de parasitos mais altas, entretanto ao fim do experimento o número total de parasitos quase não diferiu entre as doses e vias. Para testar o efeito malaricida da 4-(6-MERCAPTOPURINA)-7-CLOROQUINOLINA, uma droga derivada da cloroquina, recém sintetizada, foram infectados 45 pintos, Leghorn branco, via intramuscular. As aves foram separadas em quatro grupos experimentais com 15 aves por grupo (Grupo1- não infectado, Grupo 2- infectado e sem tratamento, Grupo 3- infectado e tratado com a cloroquina e grupo 4- infectado e tratado com o derivado da cloroquina). A droga foi administrada via gavagem por 4 dias consecutivos na dose de 100mg/Kg de peso vivo. Para a avaliação do efeito malaricida da droga, as aves tiveram o número médio de parasitos encontrados acompanhados por esfregaços sangüíneos feitos a cada dois dias após o décimo dia da inoculação. Também foram aferidos o peso e temperatura corporal a cada dois dias e hematócrito a cada quatro dias. O derivado da cloroquina teve atividade malaricida, mantendo a parasitemia mais baixa em relação ao grupo controle não tratado e ao grupo controle tratado com a cloroquina. Entretanto em todos os grupos a parasitemia se manteve baixa. Sugere-se a investigação da ação malaricida desta droga em modelos com P. berghei ou culturas com P. falciparum. / Plasmodium juxtanucleare is the agent of the avian malaria that occurs in some states of Brazil. This malaria is related to several clinical signs and it can cause damages in the poultry section. The aviary model was already used for the investigation of drugs in the combat to the malaria and nowadays the model more used is the Plasmodium berghei in rodents. The search for anti-malarial drugs is of extreme importance. The aim of this study was to accomplish experimental infections of Plasmodium juxtanucleare in Gallus gallus and to test a substance recently synthesized, the 4-(9H-purin-6-ylthio)-7-cloroquinoline, derived of the cloroquine, to verify their effects on the avian malaria and to improve the aviary model for these types of tests. For a bird donor's encounter, two chicken farms were visited in the Juiz de Fora city and blood smears made in 30 hens. The prevalence was 100%. Among the 30 examined hens, six with the largest parasitemia values had been acquired and taken to the laboratory. To verify which the best day to retreat the blood to infected hens, five of the six hens received only dose of the imunossupressor substance (metilprednisolon acetate) and one served as control. The parasitaemia of the hens was accompanied by 26 days after the day of the imunossupression, through blood smears prepared each two days. The weight and corporal temperature were checked and made blood hematocrits. It was verified that to the 10th day powder-imunossupression it happened parasitaemia pick. There were fall of body weight and correlation with the parasitaemia. There was a little variation in the body temperature and hematocrite and there was not correlation of these with the parasitaemia. In other eight acquired hens in commercial house with 15 days old, experimental infections were accomplished with blood inoculated through intramuscle and intraperitoneally in the 0,3mL and 0,5mL for the two routes. During one month the hens had the value of parasites accompanied to compare which the most effective route and difference among the doses tested in the establishment of the infection. Significant difference was not observed among the xvii doses but it was possible to verify that the infection through intraperitonial reaches the parasitemia pick more quickly, with higher averages of parasites, however to the end of the experiment the total number of parasites differed hardly between the doses and routes. To test the effect a derived drug of the cloroquine, 45 chicks were infected, white Leghorn, through intramuscle route . The hens were separate in four experimental groups, 15 chicks for group (Group1 - no infected, Group 2 - infected and without treatment, Group 3 - infected and treated with the cloroquine and Group 4 - infected and treated with derived of the cloroquine) The drug was administered four consecutive days in the 100mg/Kg of alive weight dose. For the evaluation of the antimalarial effect of the drug, the hens had the number of parasites accompanied by blood smears done each two days after the tenth day of the inoculation. Also the weight and corporal temperature were checked each two days and hematocrit four days. Derived of the cloroquine had antimalarial activity, reducing the number of parasites and maintaining the lowest parasitaemia in relation to the group not treated and to the group treated with cloroquine.

Os rotavírus estão entre os principais causadores de diarreia em humanos e animais, inclusive em mamíferos e aves. Os sintomas da doença geralmente incluem diarreia e depressão, aumento da mortalidade, e \"runting and stunting syndrome\", caracterizado principalmente por perda de peso, também tem sido atribuído a infecções por rotavírus em aves. O capsídeo externo da partícula viral é formado pelas proteínas estruturais VP4 e VP7 que possuem antígenos de neutralização baseados nos quais os rotavírus são classificados em genotipos P e G, respectivamente. O capsídeo intermediário é formado pela VP6 que define os grupos de rotavírus de A-G de acordo com a reatividade de anticorpos ou sequenciamento nucleotídico desta proteína. A proteína não estrutural NSP5 está envolvida no processo de replicação viral, sendo essencial para a formação dos viroplasmas. Este estudo teve o objetivo de pesquisar a frequência de ocorrência de rotavírus dos grupos A e D, em amostras fecais de aves de diferentes criações comerciais brasileiras, seguida da caracterização dos genotipos P e G, dos rotavírus do grupo A, através de sequenciamento nucleotídico. Para isso, 111 pools de amostras fecais foram processados através das técnicas de ELISA, PAGE e RT-PCR (NSP5), resultando em 43 (38,73%) amostras positivas pelas três técnicas. Definiram-se os genotipos G5, G8 e G11 através de RT-PCR (VP7) e o genotipo G19 após reação de RT-PCR seguida de sequenciamento nucleotídico. Definiu-se ainda o genotipo P[31] a partir do sequenciamento de amostras positivas por RT-PCR (VP4). Das 111 amostras processadas por RT-PCR visando o gene codificador da VP6, obtiveram-se 4 sequências que confirmaram tratar-se de rotavírus do grupo D. Os genotipos G5, G8 e G11 estão relacionados a surtos em bovinos e suínos, enquanto que os genotipos G19 e P[31] estão descritos em aves. Conclui-se que os rotavírus encontram-se amplamente disseminados nas criações comerciais brasileiras devido à elevada frequência da ocorrência e que existe a possibilidade de transmissão interespécie. / Rotavirus are a major cause of diarrhea in humans and animals, including several mammalian and avian species. The symptoms of the disease generally include diarrhea and depression, increased mortality and the chronic runting and stunting syndrome mainly characterized by weight loss have also been linked to rotavirus infections of birds. The outer layer of the virus particle is formed by VP4 and VP7 proteins, which possess neutralization antigens. Based on VP7 and VP4 the rotavirus are classified into genotypes G and P respectively. The intermediate layer consists of VP6 which defines the rotavirus groups. Based on the antibody reactivity and sequence identity of VP6, seven rotavirus groups (A to E) have been defined. The NSP5 are involved in viral replication and they are essential for the formation of viroplasm. Here we report the occurrence of group A and D rotavirus in feces of broilers, layers and broiler breeders from Brazilian poultry farms. A total of 111 pools of intestinal contents were processed in this study, using a ELISA, PAGE and RT-PCR (NSP5) techniques. Out of 111 pools of fecal samples tested, 43 showed positive results (38.73%) for rotavirus. Were typed the G5, G8 e G11 genotypes using the RT-PCR (VP7) and the G19 genotype using a RT-PCR followed by nucleotide sequencing reaction of the amplicons. Was defined the P[31] genotype using the RT-PCR (VP4) technique followed by nucleotide sequencing reaction. Out of 111 pools of fecal samples tested by RT-PCR (VP6), 4 showed positive results for rotavirus of group D. The G5, G8 and G11 are typical bovine and porcine rotavirus genotypes, whereas the G19 and P[31] genotypes are found in birds. As a conclusion, rotavirus is widely spread in commercial Brazilian poultry farms due to the high frequency of occurrence and there is the possibility of interspecies transmission.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:44:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Claudio_Marcos_Metzner.pdf: 1253028 bytes, checksum: c662af6172282a4b707bf70ce4a721b4 (MD5) Previous issue date: 2014-12-18 / Data indicate that Brazil imports on average 75% of the nutrients that make up the base of mineral fertilizers. This implies that there is a moderate correlation in prices of mineral fertilizers with the Dollar. Also, it appears that Brazil is the fourth-largest producer of broilers, demonstrating that there is a large volume of waste generation in this activity, which could be used as corn fertilizer and the farmer can sell the bed of avian. Thereby we seek to answer the research questions: How to determine the price of poultry litter from their nutrients? And how to determine which is the best option in economic terms, of fertilization with avian or mineral bed, to the farmer who plans corn? Thus, the aim of this research was to establish benchmarks for pricing support in the aviary as fertilizer bed. The results show that there is a moderate correlation between the prices of poultry litter, corn and the dollar and the selling price of the poultry litter, from its fertilizer value oscillates between US $ 85 and $ 140 to tonne and that from the productivity of organic fertilization x mineral, it was elaborated arate of reference a benchmark, demonstrating that for the organic fertilizer, poultry litter, is the best option for the farmer who plans corn, in financial terms, considering prices and productivity, the market price in the poultry litter should be over 15% of the price of mineral fertilizer, with formulation 8-20-20 / Dados apontam que o Brasil importa em média 75% dos nutrientes que compõem a base dos fertilizantes minerais. Isso implica que há uma correlação moderada dos preços dos adubos minerais com o Dólar. Também, verifica-se que o Brasil situa-se como quarto maior produtor mundial de frangos de corte, demonstrando que existe grande volume de geração de resíduos nesta atividade, que poderia ser aproveitado como adubação do milho e o avicultor pode comercializar a cama de aviário. Desta forma buscou-se responder as perguntas da pesquisa: Como determinar o preço da cama de aviário a partir de seus nutrientes? E como determinar qual é a melhor opção, em termos econômicos, de adubação, com cama de aviário ou mineral, para o agricultor que planta milho? Assim, objetivou-se com esta pesquisa estabelecer índices de referência para apoio na precificação da cama de aviário como fertilizante. Os resultados encontrados demonstram que existe uma correlação moderada entre os preços da cama de aviário, o milho e o dólar e que o preço de venda da cama de aviário, a partir do seu valor fertilizante, oscila entre U$ 85 e U$ 140 a tonelada e que a partir da produtividade da adubação orgânica x mineral, elaborou-se um índice de referência, demonstrando que para que o adubo orgânico, cama de aviário, seja a melhor opção para o agricultor que planta milho, em termos financeiros, considerando preços e produtividades, o preço de mercado da cama de aviário não deve ser superior a 15% do preço do adubo mineral, com formulação 8-20-20