A erva-mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil.) é uma espécie nativa da América do Sul, muito utilizada no preparo de bebidas estimulantes. As folhas e ramos utilizados no preparo destas bebidas não são consumidos na sua forma in natura ou bruta, ao contrário, eles passam por uma série de processamentos industriais como o sapeco, secagem, moagem e envelhecimento. As condições de processamento podem modificar as características sensoriais assim como podem influenciar diretamente a quantidade final de substâncias bioativas presentes na ervamate. As principais classes de compostos bioativos encontrados na erva-mate são as metilxantinas, os polifenóis e as saponinas. Essas substâncias são responsáveis por uma série de efeitos benéficos, como a atividade antioxidante, hipocolesterolemiante, anti-obesidade, anti-inflamatória e cardioprotetora. Porém, não foram encontrados na literatura, estudos que correlacionem a atividade da erva-mate sobre o metabolismo de proteínas. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o metabolismo de aminoácidos e de lipídios em ratos tratados com extrato aquoso de erva-mate comercial e bruta. Foram utilizados 30 ratos Wistar machos divididos em três grupos: grupo controle (CTR): animais tratados com ração padrão e água ad libitum, grupo da erva-mate comercial (COM) e grupo da erva-mate bruta (BRU): animais tratados com ração padrão e extrato de erva-mate comercial ou bruta ad libitum, respectivamente. Além da captação do ácido aminoisobutírico (AIB-14C), da oxidação de Lalanina- 14C e da síntese de proteínas a partir de Leucina-14C, também foram avaliados o peso corporal, os níveis séricos de insulina, glicose, colesterol total, triglicerídeos, ureia, proteínas totais e os índices das gorduras retroperitoneal e epididimal e a respectiva atividade lipolítica desses tecidos. O tratamento com o extrato de erva-mate comercial aumentou significativamente a captação de AIB-14C no fígado. Ambos os tratamentos com extrato aquoso de erva-mate comercial e bruta reduziram drasticamente a síntese de proteínas no fígado e o peso das gorduras retroperitoneais e aumentaram os níveis de lipólise do tecido adiposo epididimal. Apenas o grupo COM reduziu significativamente o ganho de peso dos animais enquanto que apenas o grupo BRU reduziu os níveis séricos de triglicerídeos. Ambos os extratos COM ou BRU não modificaram o metabolismo de proteínas no músculo sóleo. Este trabalho demonstrou pela primeira vez que a erva-mate é capaz de interferir no metabolismo hepático de aminoácidos e no metabolismo de lipídeos, sem interferir no metabolismo de proteínas do músculo esquelético. Além disso, foi observado que alguns efeitos estão diretamente relacionados a proporção entre os compostos bioativos presentes nos extratos, visto que os extratos de erva-mate comercial e bruta diferiram em vários resultados. / Yerba mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil.) is a native specie from South America, widely used in the preparation of stimulant drinks. The leaves and branches used in these drinks are not consumed in the natural or gross form, rather, they undergo a series of industrial processes such as singeing, drying, milling and aging. The processing conditions can modify the sensory characteristics and can directly influence the final amount of bioactive substances present in yerba mate. The major classes of bioactive compounds found in yerba mate are methylxanthines, polyphenols and saponins. These substances are responsible for a number of beneficial effects such as antioxidant activity, cholesterol lowering activity, anti-obesity, antiinflammatory and cardioprotective effects. However, weren’t found in the literature, studies that correlate the activity of yerba mate on proteins metabolism. The aim of this study was to evaluate the amino acids and lipids metabolism on rats treated with aqueous extract of commercial or gross yerba mate. We used 30 male Wistar rats divided into three groups: control water group (CW): animals treated with standard chow and water ad libitum, commercial mate group (CM) and gross mate group (GM): animals treated with standard chow and aqueous extract of commercial or gross yerba mate ad libitum, respectively. Beyond the uptake of aminoisobutiric acid (AIB-14C), the oxidation of L-alanine-14C and protein synthesis from Leucine-14C, were also evaluated body weight, seric levels of insulin, glucose, total cholesterol, triglycerides, urea, total protein and fat contents of retroperitoneal and epididymal and the lipolytic activity of these tissues. The treatment with the commercial yerba mate extract significantly increased uptake of AIB-14C in the liver. Both treatments with aqueous extract of commercial and gross yerba mate drastically reduced protein synthesis in the liver and retroperitoneal fat weight and increased levels of epididymal adipose tissue lipolysis. Only the CM group significantly reduced the weight gain of the animals while only the GM group reduced levels of seric triglycerides. Both extracts CM or GM did not change the protein metabolism in the soleus muscle. This study first demonstrated that yerba mate is able to interfere with the hepatic metabolism of amino acid and lipid metabolism, without interfering with protein metabolism in skeletal muscle. Moreover, it was observed that some effects are directly related to the ratio of bioactive compounds present in the extracts, whereas extracts of commercial yerba mate and gross yerba mate differed in several outcomes.

Orientador: Adriana Zerlotti Mercadante / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-28T11:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Squina_FabioMarcio_M.pdf: 21730351 bytes, checksum: a93d531f3b4f081de1a75a819883dd6a (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Os carotenóides compõem um grupo de pigmentos naturais amplamente distribuídos na natureza com grande diversidade de estruturas e funções. O interesse pelos carotenóides tem aumentado onsideravelmente nos últimos anos, havendo uma potencial demanda por fontes naturais destes compostos nas indústrias de alimentos, farmacêutica e cosmética. As principais fontes industriais de carotenóides são a síntese química e a extração a partir de plantas, porém são poucos os carotenóides que possuem métodos economicamente eficientes de produção. Atualmente, apesar do pequeno número de carotenóides produzidos por biossíntese microbiana, esforços têm sido direcionados no desenvolvimento de processos biotecnológicos para a sua produção. Os carotenóides em microrganismos estão localizados intracelularmente, portanto além de uma elevada quantidade de carotenóides, os organismos selecionados para o desenvolvimento de processos biotecnológicos devem apresentar outras possibilidades, como o cultivo em resíduos ou substratos de baixo custo, produção de carotenóides com alto valor agregado, ou de outros compostos de interesse comercial, como ácidos graxas insaturados ou polissacarídeos. A primeira etapa deste trabalho foi o desenvolvimento de uma metodologia para extração e separação dos carotenóides de Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. araucariae, R. minuta e R. lactosa. Dos métodos de extração testados, a utilização de areia tratada como agente abrasivo para o rompimento da parede celular e liberação dos carotenóides, apresentou grande eficiência ¿Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-01-24T15:31:02Z No. of bitstreams: 2 Tese Parcial - Taciana A. Silva.pdf: 642153 bytes, checksum: 78a995acdf724a4ed84b1797ea4aa9fb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-01-24T15:31:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese Parcial - Taciana A. Silva.pdf: 642153 bytes, checksum: 78a995acdf724a4ed84b1797ea4aa9fb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-24T15:31:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Parcial - Taciana A. Silva.pdf: 642153 bytes, checksum: 78a995acdf724a4ed84b1797ea4aa9fb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-08-10 / This study evaluated the potential of Aspergillus strains in the extracellular synthesis of silver nanoparticles with antimicrobial properties. The 20 Aspergillus lines were subcultured in 2% (w/v) glycoside broth at 28 °C for seven days. After monosporic cultivation, the morphological characteristics of Czapek agar, CYA [Czapek Dox agar and 0.5% (w/v) yeast extract] and malt extract agar (MEA) were evaluated for lineage authentication. Molecular identification was performed using rDNA ITS region sequences. The biomass production was done by submerged fermentation in 200 mL of MGYP extract, at 28 ºC, 180 rpm. And as inoculum was added in medium 106 spores/mL medium. After 96 h, in the mycelial extract recovered from the biomass washing AgNO3 solution was added to a final concentration of 1 mM. The synthesis reaction of the silver nanoparticles was performed in the absence of light, at 25 ºC, 180 rpm. The AgNPs were confirmed by UV-vis spectroscopy and the characterization was performed by dynamic light scattering, transmission electron microscopy, X-ray diffraction, X-ray dispersive energy and advanced spectroscopy and spectroscopy methods. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Candida albicans and Trichosporon beigelii were the test microorganisms used in the antimicrobial activity of AgNPs by the agar diffusion technique and in the determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC). The membrane was synthesized by electro-spinning and the thickness was analyzed by scanning electron microscopy (SEM). Subsequently, the AgNPs were added to the NanoMAC and the antimicrobial effect was evaluated by the agar diffusion method. The cytotoxicity test was performed against human fibroblasts (MRC5) by the method of Alarmar Blue® using 100 μg/ml of lyophilized AgNPs. The alginate microspheres were synthesized by complex coacervation with incorporation of AgNPs by the in situ and ex situ method and characterized in the SEM. The techniques used in the authentication of Aspergillus were efficient, and the molecular tests classified the strains in the niger and flavus groups. 70% of Aspergillus mediated the synthesis of AgNPs, and the flavus group lineages were more effective. The AgNPs produced were more efficient for yeasts, with CMI for T. beigelii of 0.11 μg/mL and for C. albicans of 0.22 μg/mL, showing no toxicity against the MRC5 lineage. NanoMAC coated with AgNPs showed an increase in antifungal activity of 24.22% when tested against C. albicans. The incorporation of AgNPs into alginate microspheres potentiated the antimicrobial effect of these molecules, especially the anti-yeast effect. Aspergillus isolates from Amazonian biome substrates are promising for use in biological synthesis processes of AgNPs with relevant antimicrobial properties, demonstrating great potential for use in the medical, pharmaceutical and cosmetic fields. / Neste estudo foi avaliado o potencial de linhagens de Aspergillus na síntese extracelular de nanopartículas de prata com propriedades antimicrobianas. As 20 linhagens de Aspergilllus foram subcultivadas em caldo glicosado 2% (p/v) a 28 ºC por sete dias. Após cultivo monospórico foram avaliadas as características morfológicas das culturas em ágar Czapek, CYA [ágar Czapek Dox e extrato de levedura 0,5% (p/v)] e ágar extrato de malte (MEA) para autenticação das linhagens. A identificação molecular foi realizada utilizando sequencias da região ITS do rDNA. A produção de biomassa foi realizada por fermentação submersa em 200 mL de extrato de MGYP, a 28 ºC, 180 rpm. E como inóculo foi adicionado no meio 106 esp/mL de meio. Após 96 h, no extrato micelial recuperado da lavagem da biomassa foi adicionado solução de AgNO3 até concentração final de 1 mM. A reação de síntese das nanopartículas de prata foi realizada na ausência de luz, a 25 ºC, 180 rpm. A confirmação das AgNPs foi feita por espectroscopia de UV-vis e a caracterização foi realizada por espalhamento dinâmica de luz, microscopia eletrônica de transmissão, difração de raios- X, energia dispersiva de raios-X e métodos de espectrometria e espectroscopia avançados. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Candida albicans e Trichosporon beigelii foram os micro-organismos teste utilizados na atividade antimicrobiana das AgNPs pela técnica de difusão em ágar e na determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI). A síntese da membrana foi feita por eletrofiação e a espessura foi analisada no microscópio eletrônico de varredura (MEV). Posteriormente, as AgNPs foram adicionadas à NanoMAC e o efeito antimicrobiano foi avaliado pelo método de difusão em ágar. O teste de citotoxicidade foi realizado frente a fibroblastos humanos (MRC5) pelo método de Alarmar Blue® utilizando 100 μg/mL de AgNPs liofilizadas. As microesferas de alginato foram sintetizadas por coacervação complexa com incorporação de AgNPs pelo método in situ e ex situ e caracterizadas no MEV. As técnicas utilizadas na autenticação dos Aspergillus foram eficientes, e os testes moleculares classificaram as linhagens nos grupos niger e flavus. 70% dos Aspergillus mediaram a síntese de AgNPs, sendo as linhagens do grupo flavus mais eficazes. As AgNPs produzidas foram mais eficientes para leveduras, com CMI para T. beigelii de 0,11 μg/mL e para C. albicans de 0,22 μg/mL, não apresentando toxicidade frente a linhagem MRC5. A NanoMAC revestida com AgNPs apresentou incremento na ação antifúngica de 24,22% quando testadas frente a C. albicans. A incorporação de AgNPs em microesferas de alginato potencializou o efeito antimicrobiano dessas moléculas, principalmente o efeito anti-levedura. Os Aspergillus isolados de substratos do bioma Amazônico são promissores para utilização em processos de síntese biológica de AgNPs com propriedades antimicrobianas relevantes, demostrando grande potencial para utilização na área médica, farmacêutica e cosmética.

A β-D-galactofuranose é um componente de várias macromoléculas de muitos organismos, incluindo bactérias, protozoários e fungos. Interessantemente este carboidrato não usual está ausente de glicoconjugados de mamíferos. Um método alternativo foi utilizado para purificar a β-D-galactofuranosidase utilizando p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. O meio de cultura concentrado do fungo Penicillium fellutanum foi cromatografado em coluna de DEAE-Sepharose CL 6B, seguido de cromatografia em coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose, que permitiu a separação de dois picos com atividade enzimática após a eluição com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de 100 a 500 mM de NaCl. Os dois picos resultaram, quando analisados por SDS-PAGE, em um polipeptídeo de 70 kDa. Anticorpos produzidos contra a mistura das bandas recortadas do gel são capazes de imunoprecipitar 77 % das unidades totais de enzima. Uma das bandas recortadas foi submetida a microseqüenciamento, obtendo-se seqüências para 3 peptídeos (65, 73, 101). Anticorpos foram produzidos contra os peptídeos sintéticos e usados para imunoprecipitar um polipeptídeo com atividade de β-D-galactofuranosidase. Para verificar a presença de β-D-galactofuranosidase em T. cruzi, usamos a mesma coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose. Um extrato de formas epimastigotas marcadas metabolicamente com 35S-metionina foi aplicado na coluna de afinidade. A enzima foi eluída após a lavagem com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de NaCl 100 a 500 mM. A análise por SDS-PAGE do material eluido mostrou um polipeptídeo de massa molecular aparente 50-60 kDa que é reconhecido por anticorpos anti-β-D-galactofuranosidase. Os anticorpos reagem por imunoflorescência indireta também com parasitas fixados com paraformaldeído. O polipeptídio de 50-60 kDa foi empregado em ensaios de atividade enzimática. Praticamente nenhuma atividade foi detectada utilizando-se p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. A LPPG (lipopeptideofosfoglicana), um glicoconjugado isolado de epimastigotas de T. cruzi foi empregada como substrato. A galactopiranose, produto da hidrólise da atividade enzimática, foi detectada por cromatografia de troca iônica em alto pH sugerindo a presença de β-D-galactofuranosidase em T.cruzi. / β-D-galactofuranose is a component of several galactofuranose containing macromolecules of many organisms, including bacteria, protozoa and fungi. Interestingly, this unusual sugar is absent in mammalian glycoconjugates. An alternative and fast method for the purification of β-D-galactofuranosidase was developed using p-nitrophenyl-β-D-galactofuranoside as substrate. A concentrated culture medium from Penicillium fellutanum was chromatographed on DEAE-Sepharose CL 6B followed by an affinity chromatography column of 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside-Sepharose which yielded two separate peaks of enzyme activity when elution was performed with 10mM D-galactonic acid-γ-lactone in a 100-500 mM NaCl gradient. Both peaks rendered a single 70 kDa protein as detected by SDS-PAGE. Antibodies elicited against a mixture of the single bands excised from the gel were capable to immunoprecipitate 77 % units out of total units of the enzyme from the crude extract. One of the excised bands was submited to microsequencing and the sequence for 3 peptides (65, 73, 101) was obtained. Antibodies were raised against the corresponding synthetic peptides and used to immunoprecipitade a polypeptide with β-D-galactofuranosidase activity. To verify the presence of β-D-galactofuranosidase in T. cruzi we used the same 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside-Sepharose affinity column. An extract of epimastigotes metabolically labelled with 35S-methionine was applied on the affinity colunm. After washing, the putative enzyme was eluted by 10 mM D-galactonic acidy-γ-lactone and 100-500 mM NaCl gradient. SDS-PAGE analysis of the eluted material show a polypeptide with an apparent molecular mass of 50-60 kDa that is recognized by all the antibodies raised against β-D-galactofuranosidase from P. fellutanum. Also the antibodies react with p-formaldehyde fixed parasites as detected by indirect immunofluorescence. The 50-60 kDa polypeptide was then employed in enzymatic assays. Almost no enzymatic activity was observed when p-nitrophenyl galactofuranoside was employed as substrate. LPPG (lipopeptidophosphoglycan), a galactofuranose-con taining glycoconjugate isolated from epimastigotes of T. cruzi was then employed as substrate. Galactopyranose, the product of the enzymatic activity, was detected by high pH anion-exchange chromatography, suggesting the presence of β-D-galactofuranosidase in T. cruzi.

Pilocarpus pennatifolius Lemmaire (Rutaceae) é uma espécie nativa que ocorre nas regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do Brasil, e é popularmente conhecida por jaborandi. Essa e outras espécies de Pilocarpus encontram-se em risco de extinção devido ao extrativismo (uso como planta medicinal) e ao desmatamento. O cultivo in vitro de P. pennatifolius foi realizado como uma alternativa para a produção de pilocarpina (princípio ativo do jaborandi). A cultura de células foi obtida em meio MS semi-sólido, suplementado com sacarose, como fonte de carbono, e tendo como reguladores de crescimento BAP, IAA e NAA. O tempo de duplicação da cultura de calos foi de 22 dias. A concentração do alcalóide, determinada por técnicas cromatográficas, foi de aproximadamente 0,1 µg/ mg de biomassa. Os ensaios enzimáticos referentes à biossíntese da pilocarpina tiveram como objetivo elucidar a etapa inicial de formação do anel imidazólico, além da localização desta reação na planta. Os experimentos realizados indicaram a presença da enzima histidina amino-transferase (HAT, EC 2.6.1.38) cuja atividade catalítica foi de 46,09 nKat/ mg de proteína, apenas no extrato protéico das raízes de P. pennatifolius. A determinação da composição do óleo essencial por CG e CG/EM indicou como constituintes majoritários os hidrocarbonetos tridecano (56,8 %) e pentadecano (25,5 %). Os sesquiterpenos não oxigenados constituíram cerca de 15 % do óleo obtido. / Pilocarpus pennatifolius Lemmaire (Rutaceae) is a native Brazilian species which is commonly known as jaborandi. This species is endangered due to its exploitation as medicinal plant and the increasingly deforestation. A callus culture of P. pennatifolius was established as an alternative source for pilocarpine production (the active compound of jaborandi). The cell culture was obtained in a semi-solid media, supplemented with sucrose as carbon source and as growth regulators, BAP, IAA e NAA. The doubling time for the callus culture was determined as 22 days. The concentration of the alkaloid, obtained by chromatographic techniques was ca. 0.1 µg/ mg dry weight. The enzymatic assays related to pilocarpine biosynthesis were carried out with the aim to elucidate the imidazole ring formation beyond identify the site were this reaction takes place. The results indicated the presence of the enzyme histidine ammonia transferase (HAT, EC 2.6.1.38) only in the protein extract obtained from the roots of P. pennatifolius. The catalytic activity for this enzyme was 46.09 nKat/ mg protein. Volatile constituents from the leaves were analyzed by GC and GC/MS and the major compounds were determined as the hydrocarbons tridecane (56.8 %) and pentadecane (25.5 %). Almost 15 % of the total composition was constituted of non-oxygenated sesquiterpenes.

Pilocarpus pennatifolius Lemmaire (Rutaceae) é uma espécie nativa que ocorre nas regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do Brasil, e é popularmente conhecida por jaborandi. Essa e outras espécies de Pilocarpus encontram-se em risco de extinção devido ao extrativismo (uso como planta medicinal) e ao desmatamento. O cultivo in vitro de P. pennatifolius foi realizado como uma alternativa para a produção de pilocarpina (princípio ativo do jaborandi). A cultura de células foi obtida em meio MS semi-sólido, suplementado com sacarose, como fonte de carbono, e tendo como reguladores de crescimento BAP, IAA e NAA. O tempo de duplicação da cultura de calos foi de 22 dias. A concentração do alcalóide, determinada por técnicas cromatográficas, foi de aproximadamente 0,1 µg/ mg de biomassa. Os ensaios enzimáticos referentes à biossíntese da pilocarpina tiveram como objetivo elucidar a etapa inicial de formação do anel imidazólico, além da localização desta reação na planta. Os experimentos realizados indicaram a presença da enzima histidina amino-transferase (HAT, EC 2.6.1.38) cuja atividade catalítica foi de 46,09 nKat/ mg de proteína, apenas no extrato protéico das raízes de P. pennatifolius. A determinação da composição do óleo essencial por CG e CG/EM indicou como constituintes majoritários os hidrocarbonetos tridecano (56,8 %) e pentadecano (25,5 %). Os sesquiterpenos não oxigenados constituíram cerca de 15 % do óleo obtido. / Pilocarpus pennatifolius Lemmaire (Rutaceae) is a native Brazilian species which is commonly known as jaborandi. This species is endangered due to its exploitation as medicinal plant and the increasingly deforestation. A callus culture of P. pennatifolius was established as an alternative source for pilocarpine production (the active compound of jaborandi). The cell culture was obtained in a semi-solid media, supplemented with sucrose as carbon source and as growth regulators, BAP, IAA e NAA. The doubling time for the callus culture was determined as 22 days. The concentration of the alkaloid, obtained by chromatographic techniques was ca. 0.1 µg/ mg dry weight. The enzymatic assays related to pilocarpine biosynthesis were carried out with the aim to elucidate the imidazole ring formation beyond identify the site were this reaction takes place. The results indicated the presence of the enzyme histidine ammonia transferase (HAT, EC 2.6.1.38) only in the protein extract obtained from the roots of P. pennatifolius. The catalytic activity for this enzyme was 46.09 nKat/ mg protein. Volatile constituents from the leaves were analyzed by GC and GC/MS and the major compounds were determined as the hydrocarbons tridecane (56.8 %) and pentadecane (25.5 %). Almost 15 % of the total composition was constituted of non-oxygenated sesquiterpenes.

Peperomia pellucida (L.) HBK (Piperaceae) (erva de jaboti) é uma herbácea amplamente encontrada nos trópicos e que possui diversas propriedades biológicas. Seus estudos fitoquímicos haviam demonstrado a presença da pellucidina A, uma rara dinorlignana ciclobutânica, que seria formada por acoplamento oxidativo de 2,4,5- triidroxi-estireno seguido de metilações. Nesse trabalho, foram caracterizados o ácido 2,4,5-trimetoxi-cinâmico, 2,4,5-trimetoxi-estireno, 2,4,5-trimetoxi-benzaldeído, dilapiol, 5,6,7-trimetoxi-flavona, sesamina, além da pellucidina A. Estudos de aspectos dinâmicos envolvidos na formação da pellucidina A incluíram a ontogenia e respostas à diferentes tratamentos como estresse hídrico, predação por herbívoros, ácido jasmônico e luz UV360. O tratamento com ácido jasmônico resultou num significativo incremento do dilapiol enquanto que, o tratamento sob luz UV360 resultou no aumento na produção da pellucidina A sugerindo um mecanismo de cicloadição [2+2] para sua biossíntese. A administração de diferentes precursores in vivo revelou que a L-[2-13C]- fenilalanina (0,75%), ácido [8-13C]-cinâmico (1,32%), ácido [8-13C]-ferúlico (0,51%), ácido 2,4,5-trimetoxi-[8-13C]-cinâmico (7,9%) e o 2,4,5-trimetoxi-estireno (13,3%) foram incorporados à pellucidina A. Ensaios de conversão enzimática indicaram a descarboxilação do ácido 2,4,5-trimetoxi-cinâmico em 2,4,5-trimetoxi-estireno enquanto que o 2,4,5-trimetoxi-estireno foi dimerizado em pellucidina A através da reação de cicloadição [2+2] sensibilizada pela presença da 5,6,7-trimetoxi-flavona (18,45%), tal qual a benzofenona (11,15%). Assim, sugere-se a sequência L-fenilalanina, ácido cinâmico, ácido 2,4,5-trimetoxi-cinâmico, 2,4,5-trimetoxi-estireno e pellucidina A, sendo a última etapa através de mecanismo fotoquímico tendo como sensibilizador a 5,6,7-trimetoxi-flavona. / Peperomia pellucida (L.) HBK (Piperaceae) (erva de jaboti) is an herbaceous plant that is widespread in the tropics and have several biological properties. Previous reports described the presence of pellucidin A, a rare dinorlignan having the unique cyclobutane moiety, that was supposedly formed by oxidative coupling of the precursor 2,4,5-trihydroxy-styrene followed by methylations steps. In this study, a comprehensive phytochemical study resulted in the description of 2,4,5-trimethoxy-cinnamic acid, 5,6,7-trimethoxy-flavone, 2,4,5-trimethoxy-styrene, 2,4,5-trimethoxy-benzaldehyde, dillapiol and sesamin in addition to pellucidin A. Studies of the dynamic aspects involved in the formation of pellucidin A included changes during ontogeny and responses to different treatments such as drought stress, herbivory, jasmonic acid and UV360 light. The treatment with jasmonic acid resulted in a significant increase in dillapiol whereas treatment under UV360 light resulted in an increase in production of pellucidin A, suggesting that a cycloaddition [2+2] mechanism is involved in its formation. The in vivo administration of different precursors to plants of P. pellucida revealed that L-[2-13C]-phenylalanine (0.75%), [8-13C]-cinnamic acid (1.32%), [8-13C]-ferulic acid (0.51%) 2,4,5-trimethoxy-[8-13C]-cinnamic acid (7.9%) and 2,4,5-trimethoxy-[8-13C]-styrene (13.3%) were incorporated into pellucidin A. The enzymatic conversion assays indicated decarboxylation of 2,4,5-trimethoxy-cinnamic acid into 2,4,5-trimethoxy-styrene while the 2,4,5-trimethoxy-styrene was dimerized in the pellucidin A by cycloaddition reaction [2+2] sensitized by 5,6,7-trimethoxy-flavone (18.45%), as well as by benzophenone (11.15%). Thus, we suggest the sequence L-phenylalanine, cinnamic acid, 2,4,5-trimethoxy-cinnamic acid, 2,4,5-trimethoxy-styrene and pellucidin A, the last step being carried out by a photochemical mechanism having 5,6,7- trimethoxy-flavone as a sensitizer.

No tubo digestivo das larvas de Anastrepha fraterculus e Anastrepha pickeli há β-glicosidases capazes de clivar dissacarideos, β-glicosídeos tóxicos produzidos por plantas e substratos sintéticos. As β-glicosidases de A. fraterculus são pouco ativas e as de A. pickeli são bastante ativas sobre alguns compostos, entre eles linamarina, um glicosídeo cianogênico. Esse composto está presente, em altas concentrações, no fruto da mandioca do qual a larva se alimenta. A. fraterculus alimenta-se do fruto da goiaba e aparentemente consegue o carboidrato que necessita por ação de α-glicosidases, que são bem mais ativas do que as β. O fruto da mandioca não é tão nutritivo e A. pickeli deve aproveitar a glicose da linamarina para obter energia e consegue desintoxicar-se do aglicone tóxico. Rhynchosciara americana apresenta quatro β-glicosidases nas membranas microvilares intestinais, sendo três delas β-galactosidases. Dessas, duas são ativadas por Triton X-100 sendo que a glicosidase, de maior mobilidade eletroforética é ativada por este composto, com uma Ka de 4µM, um α de 0,5 e um β de 2. β-tioglicosidases foram demonstradas em afideos. Nós verificamos que ocorre a clivagem do tioglicosídeo sinigrina após separação das β-glicosidases digestivas do Lepidoptera Diatraea saccharalis por cromatografia hidrofóbica. Nesse inseto, a mesma enzima é capaz de clivar O- e S-glicosídeos com atividades semelhantes. Enzimas com essas características nunca foram descritas anteriormente. Esses experimentos ilustram a viabilidade das adaptações dos insetos na utilização de compostos formados for ligações β-glicosídicas, viabilizando a exploração de nutrientes normalmente inacessíveis a outros animais. / Anastrepha fraterculus and Anastrepha pickeli have in their midguts 13-glycosidases able to hydrolase dissaccharides, synthetic substrate and plant toxic β-glucosides. β-glycosidases from A. fraterculus have low activity and the enzymes from A. pickeli may be highly active depending on the substrate used. Linamarin, a cyanogenic β-glucoside present in A. pickeli food (Manihot fruit) is easly hydrolysed by A. pickeli β-glycosidases (A. fraterculus eats on guava fruits and may obtain carbohydrate through the action of α-glycosidases, that are much more active them the β-glycosidases). A. pickeli probably uses glucose derived from linamarinan avoiding the effects of the toxic aglycon. Rhynchosciara americana has 4 β-glycosidases (3 galactosidases and I glucosidase) in their intestinal microvilar membranes. Two of these enzymes are activated by Triton X-100. In β glucosidase the activation has Ka= 4µM, α=0,5 e β=2. β-thioglycosidases occur in Aphids. One digestive β-glucosidase from Diatraea saccharalis resolved by hydrofobic chrornatography hydrolyses sinigrin. The same enzyme may hydrolyse O- and S-glucosides with the same efficienly. Enzymes with this specificity have never been described before. In this study we shown some adaptations of insects to use substrates with β-glycosidic bonds, allowing these organisrns to explore nutrients usualy avoided by other animals.

Microorganismos são uma excelente fonte de substâncias bioativas, porém muitas destas substâncias são biossintetizadas em baixas quantidades. A utilização de técnicas de planejamento experimental e de análise multivariada permite melhorar as condições de cultivo e incrementar a produção de metabolitos secundários. A linhagem fúngica Roussoella sp. DLM-33 produziu o composto roussoellatídeo (33) inédito na literatura com esqueleto de carbono novo. A utilização do planejamento fatorial fracionado e da metodologia multicritério permitiu incrementar a produção do composto roussoellatídeo (33), para investigar sua biossíntese utilizando precursores marcados com 13C. Experimentos de incorporação com precursores [1-13C]acetato de sódio, [1,2-13C]acetato de sódio e [metil-13C]metionina permitiu verificar que a biossíntese do composto (33) envolve dois rearranjos de Favorskii e uma ciclização de Diels-Alder intermolecular entre duas cadeias policetídicas independentes. Também, o estudo químico do meio de cultivo da linhagem Annulohypoxylon moriforme MA9, levou ao isolamento e identificação de dois compostos inéditos denominados por: (E)-3-benzilidenohexahidro-2-metilpirrolo[1,2-a]-pirazina-1,4-diona (36) e 4,7,9-trihidroxi-3-metoxi-2,3,6b,7-tetrahidro-1H-benzo[j]fluoranten-8-ona (53), e 10 compostos conhecidos: TCM-95A (43), TMC-95B (44), daidzeína (45), 5-hidroxi-3,4-dihidro-2H-naftalen-1-ona (46), 4,8-dihidroxi-3,4-dihidro-2H-naftalen-1-ona (47), 4-metoxi-1-naftalenol (48) e 3-benzil-hexahidro-pirrolo[1,2-a]-pirazina-1,4-diona (49), hypoxylonol C (50), hypoxylonol B (51) e hypoxylonol E (52). Os compostos 43 e 44 foram descobertos ainda quando presentes no extrato bruto de Annulohypoxylon moriforme MA9 por meio da co-cristalização do extrato com a enzima responsável pela atividade do proteassomo. Os dados obtidos por cristalografia de raio-X juntamente com os dados da literatura permitiram determinar suas estruturas químicas. / .Microorganisms are an excellent source of bioactive substances. However, most metabolites are biosynthesized in small amounts. The use of experimental design and multivariate analysis allows to improve the culture conditions and increase the production of secondary metabolites. The fungal strain Roussoella sp. DLM33 produced the roussoellatide (33), which is unprecedented and present a with novel carbon backbone chemical structure. Utilizing fractional factorial design and multicriteria analyses allowed us to increase the production of the roussoellatide (33) in order to investigate its biosynthesis using precursors labeled with 13C. Feeding experiments utilizing [1-13C]acetate, [1,2-13C]acetate, and [methyl-13C]methionine enabled us to verify that the biosynthesis 33 we postulate the involvement of two Favorskii rearrangements and one intermolecular Diels-Alder cyclization between two independent polyketide chains. Also, the chemical investigation of the culture medium of the strain Annulohypoxylon moriform MA9 led to the isolation and identification of two new compounds: (E)-3-benzylidenehexahydro-2-methylpyrrolo[1,2-a]pyrazine-4-dione (36) and 4,7,9-trihydroxy-3-methoxy-2,3,6b,7-tetrahydro-1H-benzo[j]fluoranenen-8-one (53), along with 10 compounds already known in the literature: TCM-95B (43), TMC-95A (44), daidzein (45), 5-hydroxy-3,4-dihydro-2H-naphthalen-1-one (46), 4,8-dihydroxy-3,4-dihydro-2H-naphthalen-1-one (47), 4-methoxy-1-naphthalenol (48) and 3-benzylhexahydro-pyrrolo [1,2-a]pyrazine-1,4-dione (49), hypoxylonol C (50), hypoxylonol B (51) and hypoxylonol E (52). Compounds 43 and 44 were discovered by the co-crystallization of the extract medium with the enzyme responsible for the proteasome activity. Data obtained by X-ray crystallography, NMR and MS analyses combined or data available in the literature allowed to determine their chemical structures.

O presente trabalho teve por objetivo realizar experimentos de incorporação de precursores isotopicamente marcados em produtos naturais isolados do meio de cultura de duas espécies de fungos do gênero Penicillium, de maneira a se verificar a rota de biossíntese dos compostos produzidos pelas linhagens P. citrinum F53 e P. oxalicum F30. Para tanto, os meios de cultura utilizados na fermentação das linhagens foram enriquecidos com os seguintes precursores: [1-13C1]acetato de sódio, [1,2-13C2]acetato de sódio, [2,3-13C2]propionato de sódio, [metil-13C1]metionina, [1-13C1]glicose, [U-13C5]ornitina, [U-13C6]lisina, [U-13C5]prolina, [U-13C6]histidina, [2-indol-13C1]triptofano e [U-13C6]ácido antranílico, separadamente. Ao final do período de fermentação, as culturas foram separadamente submetidas à extração em fase sólida e analisadas por CLAE/UV/EM/IES. Os experimentos de incorporação que apresentaram resultados positivos tiveram seus produtos purificados por CLAE/UV e analisados por RMN de 13C. Os resultados obtidos mostraram que dois dihidropirrois produzidos por P. citrinum F53 são formados por uma rota biossintética mista, oriunda de um resíduo de ornitina, um grupo metila derivado da metionina e uma cadeia policetídica derivada do acetato. Os alcaloides citrinalina B e 17-hidroxicitrinalina B, também produzidos por P. citrinum F53, são ambos derivados de dois resíduos de aminoácidos, ornitina e triptofano (via ácido antranílico), e dois grupos isopreno derivados da glicose (via mevalonato). Os alcaloides oxalina e meleagrina, produzidos por P. oxalicum F30, são formados a partir de uma via biossintética mista derivada de dois resíduos de aminoácidos, histidina e triptofano (via ácido antranílico), e grupos metila derivados da metionina. / The present investigation aimed to carry out feeding experiments for the incorporation of isotopic labeled precursors on natural products isolated from the culture media of two fungal species belonging to the Penicillium genus, in order to verify the biosynthetic pathway of the compounds produced by the P. citrinum F53 and P. oxalicum F30 fungal strains. Culture media used in the fermentation of the fungal strains were enriched with the following isotopic labeled precursors: [1-13C1]sodium acetate, [1,2-13C2]sodium acetate, [2,3-13C2]sodium propionate, [methyl-13C1]methionine, [1-13C1]glucose, [U-13C5]ornithine, [U-13C6]lysine, [U-13C5]proline, [U-13C6]histidine, [2-indol-13C1]tryptophan, and [U-13C6]anthranilic acid, separately. At the end of the fermentation period, culture media were separately subjected to solid phase extraction and analyzed by LC/UV/ESI/MS. The incorporation experiments that showed positive results were purified by HPLC/UV, and the pure compounds labeled in different positions were then analyzed by 13C-NMR. The results demonstrated that two dihydropyrroles produced by P. citrinum F53 were formed via a mixed biosynthetic route, derived from ornithine, a methyl group derived from methionine, and a polyketide chain derived from acetate. The alkaloids citrinalin B and 17-hydroxycitrinalin B, also produced by P. citrinum F53, are both derived from two amino acid residues, ornithine and tryptophan (via anthranilic acid), and two isoprene units derived from glucose via the mevalonate pathway. The alkaloids oxaline and meleagrine, produced by P. oxalicum F30, are formed via a mixed biosynthetic pathway by two amino acid residues, histidine and tryptophan (via anthranilic acid), and methyl groups derived from methionine.