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Evalutation of Different Fermentation Medthods on the Yield and Cost Effectiveness for Recombinant HDGF ProductionWang, Jin-kye 03 August 2009 (has links)
HDGF (hepatoma-derived growth factor) is a novel growth factor,identified from conditioned medium of hepatoma cell line. HDGF has growth stimulating activity for fibroblast and some hepatoma cells. HDGF, a novel defined growth factor with mitogenic effect, has homology protein sequence as HMG (high
mobility group) protein and their three dimension structures appeared to be similar to each other. Recently, elevated HDGF expression was found in developing kidneys but less was found in adult kidney. In addition, HDGF expression was found to be
correlated with angiogenic status of tissues. Thus, it is
speculated that HDGF plays a role during embryonic development and angiogenesis. HDGF also plays a role in cell-cell interaction and cell migration. HDGF is a growth factor that is involved in stimulating vascular smooth muscle cells (SMCs)proliferation during development and in disease. HDGF contains
a true bipartite nuclear localization sequence necessary for nuclear targeting. HDGF is sciential factor in stimulating DNA replication and cell proliferation of vascular smooth muscle cell.In this study,we used E. coli strain BL21 (DE3) to express the recombinant protein hepatoma derived growth factor(HDGF). To find out the optimal production conditions,we studied on the different temperature and fermentor to calculate all cost .
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From protein production to genome evolution in Escherichia coliSchlegel, Susan January 2013 (has links)
The aim of my Ph.D. studies was to improve production yields of membrane- and secretory proteins in the widely used E. coli protein production strain BL21(DE3). In this strain expression of the gene encoding the protein of interest is driven by the powerful T7 RNA polymerase (T7 RNAP) whose gene is located on the chromosome and under control of the strong, IPTG-inducible lacUV5 promoter. Unfortunately, the production of many membrane and secretory proteins is 'toxic' to BL21(DE3), resulting in poor growth and low production yields. To understand this ‘toxicity’, the BL21(DE3) derived mutant strains C41(DE3) and C43(DE3) were characterized. Somehow, these strains can efficiently produce many ‘toxic’ membrane and secretory proteins. We showed that mutations weakening the lacUV5 promoter are responsible for this. These mutations result in a slower onset of protein production upon the addition of IPTG, which avoids saturating the Sec-translocon capacity. The Sec-translocon is a protein-conducting channel in the cytoplasmic membrane mediating the biogenesis of membrane proteins and translocation of secretory proteins. Next, we constructed a BL21(DE3)-derivative, Lemo21(DE3), in which the activity of T7 RNAP can be precisely controlled by titrating in its natural inhibitor T7 lysozyme using the rhamnose promoter system. In Lemo21(DE3), the expression level of genes encoding membrane and secretory proteins can be set such that the Sec-translocon capacity is not saturated. This is key to optimizing membrane and secretory protein production yields. Finally, reconstructing the evolution of C41(DE3) from BL21(DE3) in real time showed that during its isolation C41(DE3) had acquired mutations critical for surviving the starvation conditions used, and provided insight in how the mutations in the lacUV5 promoter had occurred. / <p>At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 3: Manuscript.</p>
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Quantification des contraintes métaboliques et physiologiques liées à la surproduction de protéines recombinantes par Escherichia coli : amélioration des performances et de la robustesse du système d'expression et du procédé de production / Quantification of metabolics and physiologics contraints related to overexpression of recombinants proteins in Escherichia coli : Optimisation of performances and robustness of expression system and production processPatacq, Clement 23 October 2018 (has links)
La production de protéines hétérologues permet de développer une nouvelle génération de vaccins. La bactérie Escherichia coli est l’un des organismes hôtes les plus utilisés pour la production de protéines hétérologues, appelées également protéines recombinantes. Le déclenchement de la production de protéine altère la croissance bactérienne en réponse à la réallocation des ressources métaboliques vers la synthèse de la protéine ; ce qui peut conduire à l’arrêt complet de la croissance. Le maintien de la croissance bactérienne durant la production de la protéine recombinante est pourtant essentiel pour améliorer significativement la quantité et la fonctionnalité des protéines produites. Dans une démarche rationnelle visant à développer un système biologique robuste et performant pour la production d’une grande diversité de protéines recombinantes chez E. coli, les contraintes métaboliques liées à leur production ont été quantifiées. A partir de ces résultats, le système d’expression T7 a été intégré à la régulation métabolique et traductionnelle de la bactérie E. coli BL21 (DE3) afin d’adapter la vitesse de production avec les capacités métaboliques de la souche. Ce nouveau système biologique de production a ainsi permis d’augmenter considérablement les quantités de protéines produites et offre la possibilité de développer de nouveaux procédés performants de production semi-continus et continus en milieu chimiquement défini. / The production of heterologous proteins offers the ability to develop a new generation of vaccines. The most used organism for the production of heterologous proteins, also called recombinant proteins, is the bacterium Escherichia coli. However, the induction of the production often alleviates the bacterial growth by the new allocation of metabolic resources toward the production of the recombinant protein. Even, this may also lead to growth arrest. The production of high quantities of functional recombinant proteins requires a good balance between of bacterial growth and production of the recombinant protein.In order to rationally develop a robust and an efficient biological system for the production of a large variety of recombinant proteins in E. coli, the metabolic constraints associated to their production have been quantified. From this observation, the T7 expression system has been integrated into the metabolic and translational regulation of the E. coli BL21 (DE3) in order to adjust as perfect as possible the protein production rate to the metabolic capacities of the strain. This new biological production system has made it possible to significantly increase the quantities of proteins produced and opens up the possibility of developing performant semi-continuous and continuous production processes in a chemically defined medium.
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Biochemical Study of Engineered Fluorescent Proteins as Calcium Sensors and the Effect of Calcium and PH in Cell Reproduction and Protein ExpressionDelgado, Malcom Arturo 01 December 2009 (has links)
Calcium plays important roles in both eukaryotic and prokaryotic cells. Its actions help to stabilize cell synthesis, growth and development. In this thesis, studies have been completed to determine effects of calcium and pH on bacterial cell growth and protein expression using the bacterial cell strain E.coli BL21(DE3). Our studies demonstrated the addition of calcium addition in the media does not affect growth but increases protein expression, while reducing the pH from 7 to 4 through the addition of 10mM EGTA in LB media inhibits both. Additionally, we report studies on the design, expression, and purification of fluorescent mCherry variants and their differences in their optical properties, including: extinction coefficients , quantum yields and pKa values. Also, we report progress in the crystallization of two GFP calcium sensors: G1 and D1, using 13 and15% PEG 4000 and 3350 respectively in 50mM HEPES buffer (pH 6.8-7.0) in an effort to optimize crystallization.
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Développement et applications de protocoles de synthèse in vitro du canal mécanosensible bactérien à large conductance, pour son étude structurale par résonance magnétique nucléaire en phase solideAbdine, Alaa 29 June 2011 (has links) (PDF)
Le génome de différents organismes contient près de 30% de séquences codantes pour des protéines membranaires. Celles-ci sont impliquées dans des processus biologiques tels que la signalisation cellulaire, la transduction énergétique ou le transport des métabolites. Cependant, leur étude structurale se heurte souvent aux problèmes de surexpression, ainsi qu'aux différents inconvénients liés à leur extraction de leur environnement natif. Le canal mécanosensible à large conductance MscL d'Escherichia coli est une protéine intrinsèque de la membrane interne de la bactérie. L'activité de cette protéine est fortement dépendante de la membrane ; en effet, le canal s'ouvre lorsque la pression au niveau de la membrane augmente, lors d'un choc hypoosmotique, relarguant de l'eau et différents substrats afin que la bactérie retrouve un état osmotique adéquat à sa survie. Il est donc essentiel de recueillir des données structurales de la protéine dans son environnement natif. Pour cela, nous proposons une étude structurale de la protéine par résonance magnétique nucléaire en phase solide. La surexpression de la protéine et son marquage aux isotopes 13C et 15N sont deux étapes clés d'un tel projet. Une surexpression bactérienne et un marquage uniforme de la protéine ont été effectués. Les données spectrales obtenues montrent une bonne résolution, mais l'imbrication des corrélations ne permet pas d'en extraire des données structurales. Afin de réduire le nombre de résidus marqués, un marquage spécifique a été appliqué par la voie de la synthèse in vitro. Le premier test a montré que l'approche permettait de réduire le temps d'acquisition, tout en diminuant la quantité d'informations. Différentes méthodes ont ensuite été appliquées pour trouver les meilleures combinaisons d'acides aminés à marquer spécifiquement en synthétisant la protéine in vitro. Ces approches utilisent les programmes de prédiction de déplacements chimiques ou l'analyse de la séquence à la recherche de paires d'acides aminés uniques. Une approche combinatoire a été également testée. Les différents échantillons synthétisés ont montré une bonne résolution, et ont permis l'identification de plusieurs corrélations. Les méthodes développées au cours de ce travail pourront aider progressivement à déterminer la structure de la protéine MscL. Elles pourront également servir à d'autres protéines membranaires pour leur étude par résonance magnétique nucléaire.
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Process development for the production of a therapeutic Affibody® Molecule / Processutveckling för att tillverka en Affibody®-molekyl avsedd för cancerterapiFridman, Belinda January 2014 (has links)
Recently HER3, member of the epidermal growth factor receptor family (EGFR), has been found to play a crucial role in the development of resistance towards inhibitors that are given to patients with HER1- and HER2-driven cancers. As HER3 is up-regulated or over-activated in several types of human cancers, it is of outmost importance that new innovative drugs target its oncologic activity. The Affibody® Molecule Z08698 inhibits the heregulin induced signalling of HER3 with high affinity (KD~50 pM). As the Affibody® Molecule is small, has high solubility and outstanding folding kinetics, an effective penetration of tumour tissue is suggested together with a rationalized manufacturing process. Further coupling to an albumin binding domain (ABD) expands the plasma half-life of the molecule, hence increasing the molecule's potential of serving as a therapeutic. A process development for production of Z08698-VDGS-ABD094 has been established, where the molecule is efficiently produced in the E. coli host strain BL21(DE3), through a T7 based expression system. Cultivations were performed with a fed-batch fermentation process and the conditions were further optimized in order to obtain highest expression, while avoiding undesirable modifications like gluconoylations. By employing Design of experiments in combination with multivariate data analysis, a production process resulting in ~3.5 g product/ l culture could be verified. Moreover, thermolysis was evaluated as a suitable method for cell disruption, enabling an easy and cost-effective manufacturing process of the ABD fused Affibody® Molecule.
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Stabil och antibiotikafri läkemedelsproduktion i rekombinant Escherichia coliBenevides, Kristina, Broström, Oscar, Elison Kalman, Grim, Swenson, Hugo, Vlassov, Andrei, Ågren, Josefin January 2017 (has links)
Den här rapporten presenterar ett antibiotikafritt, stabilt och kromosombaserat expressionssystem för läkemedelsproduktion i Escherichia coli på beställning av företaget Affibody AB. E. coli-stammen BL21(DE3) valdes som värdorganism för expressionssystemet. Systemet består av en genkassett som innehåller en T7-promotor, en 5′-UTR från genen ompA och en terminatorsekvens från RNA-operonet rrnB. Fyra kopior av genkassetten ska integreras i pseudogenerna caiB, yjjM, hsdS och yjiV. En datormodell som modellerar det egentliga kopietalet i cellerna har skapats i mjukvaran MATLAB, vilket visar att det uppskattas vara maximalt 32 kopior av genkassetten per cell på grund av replikation av kromosomen. Ett högt pH i fermentorn; att använda fed-batch och blandade kolhydratkällor; och att använda stammen BL21(DE3) minskar acetatproduktionen i cellen. En lägre acetatproduktion kan leda till en högre produkthalt. En proteinutbytesmodell för mjukvaran MATLAB har konstruerats för att uppskatta koncentrationen av Affibody®-molekylen i en E. coli cell.
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