La colonisation bactérienne du gros intestin chez le poulain a été très peu étudiée. Pourtant, elle pourrait jouer un rôle capital dans la composition et l’activité de la communauté bactérienne chez l’animal devenu adulte. L’objectif de ce travail a été de mieux décrire la mise en place de la communauté bactérienne et de son activité de dégradation des glucides pariétaux dans les fèces du poulain de la naissance au post-sevrage. La supplémentation maternelle en produits fermentés FAP® (Original Process, France) a été testée comme facteur de variation. Nos travaux confirment que la colonisation bactérienne dans les fèces du poulain est un processus séquentiel qui débute très rapidement après la naissance et s’achève autour d’un mois d’âge. Les bactéries maternelles contenues dans le lait pourraient jouer un rôle majeur dans l’origine des bactéries qui s’implantent chez le poulain au cours des cinq premiers jours de vie. La fonction de dégradation des glucides pariétaux se met en place à partir de la deuxième semaine de vie et est établie à deux mois d’âge. Le sevrage pratiqué à six mois n’a pas d’impact majeur sur la communauté bactérienne et son activité dans les fèces du poulain. Enfin, la supplémentation maternelle a stimulé la mise en place précoce des bactéries anaérobies totales et utilisatrices de lactate et le démarrage des activités fermentaires dans les fèces du poulain. Cependant, aucun effet n’a été rapporté au-delà de cinq jours de vie. Comme la supplémentation en produits fermentés n’a pas modifié la composition et la structure des communautés bactériennes des fèces et du lait de jument, les effets observés chez le poulain pourraient, en partie, s’expliquer par une modification du lait sur le plan qualitatif et/ou quantitatif. Une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans le transfert de bactéries maternelles au poulain est un préalable afin d’envisager de nouvelles pistes de recherche pour optimiser la colonisation bactérienne chez le poulain par la modulation de la microflore maternelle. / In foals, few studies have been conducted on the hindgut bacterial establishment, despite this could play a major role in the composition and activity of the bacterial community in the adult animal. This work aimed at better describing the establishment of the bacterial community and its cell-walls degradation capacity in the foal feces from birth to post-weaning. Maternal supplementation with fermented products FAP® (Original Process, France) was tested as a variation factor. Our results confirm that bacterial establishment in the foal feces is a sequential process that starts very early after birth and ends at around one month of age. Bacteria in the mare milk could play a main role in the origin of the bacteria settling in the foal during the five first days of life. Cell-walls degradation activity starts from the second week of life and is established at two months of age. The weaning at six months had no major impact on the bacterial community and its activity in the foal feces. Finally, the maternal supplementation stimulated the early establishment of total anaerobes and lactate utilizers and the fermentative activity start in the foal feces. However no effect was reported after five days of life. As the maternal supplementation with fermented products did not change the bacterial community composition and structure in mare feces and milk, the change we observed in the foal could partly be explained by a change in the quality or quantity of milk. A better knowledge of the mecanisms implicated in the bacterial transfer from the mare to its foal is necessary before investigating new research area for optimising bacterial establishment in the foal by modulating the maternal microflora.

Lors de la prospection de bactéries d’intérêt dans le milieu marin, nous avons isolé des colonies aux couleurs brillantes sous illumination directe, ressemblant à l’iridescence de certains papillons. L’iridescence est une couleur physique induite par des structures nanoscopiques périodiques. Ce phénomène est peu détaillé chez les procaryotes. Dans cette thèse nous avons souhaité caractériser le phénomène par des analyses physico-optiques,microbiologiques et écologiques. La souche fut identifiée comme appartenant à l’espèce Cellulophaga lytica.Les premières étapes ont permis d’illustrer le phénomène et de prouver une coloration structurale des colonies par microspectrophotométrie. Une comparaison de diverses souches a démontré l’iridescence singulière de C. lytica,dénommée iridescence « glitter-like ». Nous avons ainsi proposé la première classification des iridescences bactériennes. Certaines souches du même phylum Bacteroidetes exprimaient le phénomène. Un lien entre cette iridescence et la motilité « gliding » fut mis en évidence. De façon intéressante, l’iridescence était conservée en conditions mimant le biotope C. lytica. De plus, diverses souches marines iridescentes ont pu être ré-isolées. Elles étaient particulièrement abondantes sur les macro algues (rouges, brunes), mollusques, cnidaires et dans l’eau de mer. Nous supposons alors que ce phénomène pourrait avoir des rôles bio-écologiques. Grâce à la microscopie électronique à transmission et une modélisation, nous avons pour la première fois élucidé des structures reponsables d’une iridescence bactérienne : une organisation populationnelle de cellules alignées équidistantes.Les bases fondamentales et méthodologiques de l’iridescence bactérienne sont données dans cette thèse. Les applications correspondraient aux domaines des nanotechnologies et de la biomimétique. / During collections in the marine environment, colony with bright coloration under direct illumination was isolated. Colors were similar to butterly iridescence. Iridescence is a property of structural color where periodic nanoscopic structures are responsible of intense coloration. Bacterial iridescence is poorly described in the literature. In this work, we aimed to characterize the phenomenon by physico-optical, microbiological and ecological analysis. The marine bacterium was identified as Cellulophaga lytica.In the first experiment we illustrated and proved the physical color by micro spectrophotometry. Comparison with diverse bacteria permitted to demonstrate the uniqueness of C. lytica iridescence, named “glitter-like”. We proposed the first classification of iridescences within the prokaryotes. Others Bacteroidetes strains showed “glitterlike”iridescence effects. A link between iridescence and gliding motility was additionally identified. A biotic factors demonstrated conservation of the phenomenon under conditions that mimic C. lytica stressing biotope. Moreover,other iridescent marine strains were isolated. They were particularly associated to macroalgae (red, brown),mollusks, cnidarians and seawater. Biological and ecological functions of iridescence are then supposed. By using transmission electron microscopy and modeling, structures responsible for iridescence in the colony were first identified: alligned and equidistant cells at a population level.Bacterial iridescence’s fundamental and technical skills are described in this thesis. Applications could lead to biomimetic and nanotechnology of iridescent structures.

L’écosystème digestif est sous l’influence de facteurs abiotiques et biotiques qui déterminent son équilibre et par conséquent influencent la santé digestive de l'hôte. Chez le lapin en croissance, un déséquilibre de l’écosystème caecal est associé aux entéropathies, responsables de mortalités importantes en élevage. La compréhension des interactions biotope – biocénose digestive permettra la mise en oeuvre de stratégies pour garantir l'équilibre de cet écosystème. Ainsi, le rôle des facteurs biotiques de stabilité l’écosystème digestif, tels que des microorganismes exogènes probiotiques, fait actuellement l’objet de nombreuses études, mais leur mode d’action sur la biocénose et le biotope reste encore peu clair. L’objectif de notre travail est de contribuer à la compréhension du fonctionnement de l'écosystème caecal chez le jeune lapin, soumis ou non à un stress nutritionnel et en présence ou non d'une flore exogène ajoutée. Il s'agit aussi, de faire une approche comparative des effets d'un même probiotique (S. cerevisiae) dans cet écosystème et dans le rumen de la vache, pour mieux décrire les mécanismes d'action d'une levure probiotique sur les relations biocénose-biotope. Dans ce but, nous avons mis au point et validé pour le caecum du lapin la mesure du potentiel redox (Eh), pour mieux juger de l'état d'anaérobiose du biotope caecal. Nous avons également validé un nouvel indicateur de l’inflammation générale (haptoglobine sérique) en réponse à l'application d'un stress nutritionnel ou d'un état sanitaire déficient. Comparé au rumen, le biotope caecal est un milieu très anaérobie, puisque son potentiel redox moyen est de -220 mV et ne varie pas avec l’âge (de 28 à 64 jours). La biodiversité de la biocénose bactérienne caecale, calculée à partir de leur empreinte moléculaire (CE-SSCP) est en moyenne de 5,0 (indice de Simpson). Chez l'animal touché par un dysfonctionnement digestif, nous observons une élévation du niveau général de l'inflammation (+70% du taux d’haptoglobine sérique), associée à une chute de l'activité fermentaire caecal (-50%) et une hausse du pH (+ 0,7), mais qui n'est pas associée à des variations d'Eh caecal ou de la diversité bactérienne. L'application d'un stress nutritionnel (déficience en fibres) entraîne chez le lapin une baisse de la concentration caecale en AGV totaux (-25%) et une hausse du pH (+0,1). Cependant, la déficience en fibres n’a pas d'effet marqué sur le Eh caecal, dont la moyenne est de -210 mV. De même, la diversité bactérienne n’est pas modifiée (5,3) par la réduction de la teneur en fibres de l’aliment et la similarité observée est de 76%. La teneur de fibres dans l’aliment n’influence pas non plus le niveau d'inflammation générale. L’apport de levures vivantes dans la ration du lapin tend à augmenter la diversité bactérienne (+10%), et peut élever le potentiel redox caecal de 25 mV caecal. Il n’affecte cependant pas la structure du microbiote bactérien caecal (similarité= 99%). Elle n’entraîne pas non plus de variation du taux d’haptoglobine. L'ingestion de levures vivantes a permis l’amélioration de la santé digestive par la réduction de la mortalité (jusqu'à -50%) pendant les périodes de forte mortalité où le taux d’haptoglobine sérique augmente d’environ 70%. L’effet de la levure observé ici dans le caecum du lapin diffère de celui observé dans le rumen de la vache, pour lequel on observe une baisse du potentiel redox et une hausse du pH, ce qui favoriserait l’activité des bactéries anaérobies strict transformant le lactate en propionate. La levure stabiliserait donc le biotope (pH, potentiel redox) qui favoriserait la croissance ou l’activité de certaines bactéries. Cette hypothèse reste encore à confirmer pour l'écosystème caecal du lapin, à l'aide méthode appropriées. / The digestive ecosystem is influenced by abiotics and biotics factors that determined its balance and consequently influenced the host digestive health. In the young rabbit, caecal ecosystem disorders are largely responsible for nonspecific enteropathies that cause livestock losses. Understanding biotope/biocenosis interrelationships would allow the development of new strategies that preserve the ecosystem balance. Thus, the role of biotic factors that stabilise the digestive ecosystem, such as probiotics is extensively studied, however their effects on biocenosis and biotope remain unclear. The aim of our work is to improve our understanding of the caecal ecosystem functioning, submitted or not to a nutritional stress and with or without addition of an exogenous flora. We also aimed to compare the effects of the same probiotic (S. cerevisiae) in the caecum and in the rumen (dairy cow), to improve our knowledge on the mechanisms of action of yeast probiotic on biocenosis and biotope. We have developed and validated the measure of redox potential in the caecum. We also validated for the growing rabbit, a new indicator of the general inflammation (haptoglobin) in response to the application of nutritional stress or under a deficient sanitary status. Compared to the rumen, the caecal biotope is very anaerobic, since its redox potential is meanly of -220mV, and do not vary with age (35-63d old). The biodiversity of the bacterial community in the caecum, calculated from fingerprint technique (SSCP), reached meanly 5.0 (Simpson index). In the rabbit having a digestive trouble, the seric haptoglobin concentration increased by 70%, while caecal fermentative activity dropped by 50%. In parallel, the caecal pH increased (+0,7 unit) whereas the redox potential and the bacterial diversity remain unaffected in the caecum. When the young rabbit is submitted to a nutritional stress (fibre deficiency), the caecal volatile fatty acids concentration dropped by 25%, while the pH increased by 0.1 unit. However, the fibre deficiency did not affect the caecal redox potential (meanly -210 mV). Similarly, the bacterial biodiversity in the caecum was not modified (5,3) according to dietary fibre intake, as well the bacterial community structure. Besides, the haptoglobin concentration remained similar with fibre intake. The live yeast added in the diet tended to increase the bacterial diversity (+10%), and could slightly increase the caecal Eh (+25 mV). Yeast have no effect on the structure of rabbit caecal microbiota (bacteria only), where the similarity is 99%. It does not change the serum haptoglobin level. In return, yeast addition improved the digestive health by reducing mortality rate by 50%, particularly during periods of high mortality, when the serum haptoglobin increased by 70%. The effect of yeast described in the rabbit caecum differed from that found for the cow rumen: yeast decreased the redox potential and increased the pH that favors the strict anaerobic bacterial activity. The live yeast thus would stabilise the biotope (pH, Eh) and would favor the growth and activity of specific bacteria. However, this hypothesis still remains to be confirmed for the rabbit caecal ecosystem, using pertinent methodology.

L'objectif de la thèse est de caractériser des populations bactériennes susceptibles de dégrader la lignine des résidus de culture afin d'optimiser la biodisponibilité du compartiment holocellulosique. L'originalité du sujet réside dans la recherche de bactéries ligninolytiques en utilisant des approches combinant à la fois de l'isolement de souches, des techniques de biologie moléculaire et de la mise en œuvre de ces micro-organismes à l'échelle de réacteur pilote, dans le cadre de prétraitements des résidus de culture. Les travaux de recherche ont été réalisés pour mettre en évidence et identifier des micro-organismes potentiellement intéressants et caractériser leurs systèmes enzymatiques susceptibles d'intervenir dans la dégradation de la lignine. Suite à l'isolement de plusieurs souches d'intérêts et à la mise en place de réacteurs, des expérimentations ont été réalisées afin de suivre l'effet des prétraitements biologiques sur la dégradation de la biomasse et notamment par l'étude des transformations biochimiques, de l'accessibilité à la cellulose ainsi que de l'évolution des communautés microbiennes. Les résultats de ces travaux ont montré que la communauté endogène joue un rôle primordial dans la biodégradation de la paille de colza. Bien que l'inoculation de bactéries exogènes ait eu peu d'influence, il est possible d'améliorer l'accessibilité à cellulose par un mélange de lignine et des sels minéraux permettant d'enrichir la communauté endogène active. Cette thèse s'articule autour de plusieurs analyses multi-échelles et complémentaires permettant de développer un prétraitement biologique de résidu de culture, d'améliorer sa mise en œuvre et son utilisation pour la digestion anaérobie par voie sèche ou la production de bioéthanol. / The aim of the PhD project is to characterize bacterial populations potentially capable of degrading lignin within crop residues to optimize the bioavailability of holocellulose compartment to be valorized by anaerobic digestion. The originality of the subject lies in finding ligninolytic bacteria using approaches combining the isolation of strains and technique of molecular biology, and the application of these microorganisms on a reactor scale, as part of pretreatment of crop residues. Firstly, research work was carried out to find and identify potentially interesting micro-organisms and characterize their specific enzyme systems. Secondly, studies have been conducted on the application of micro-organisms isolated for a biological pretreatment of rape straw. Pretreatments were carried out in a series of laboratory reactors dedicated to follow the effect in real time. A method allowing the quantification of the cellulose accessibility for cellulases in substrate was established. In parallel, high-throughput sequencing analysis was performed to monitor and/or characterize the bacterial and archaeal communities in the reactors. The results obtained have shown that the main factor influencing the degradation of the straw was not the presence of ligninolytic strains which could not influence the development of endogenous community, but the supply of some nutrients included in a mixture with lignin and mineral salts which could enrich a particularly active community. The data obtained in the thesis allowed to capitalize knowledge on the biodegradation of lignocellulosic biomass. This prospective study allowed the consideration of using the biological pretreatments developed at the upstream of biogas and biofuel sectors.

Bien que présentes dans tous les écosystèmes lacustres, la composition ainsi que l'abondance des communautés bactériennes peut varier à l'échelle régionale mais également à l'échelle locale. Une meilleure compréhension des facteurs responsables de ces patrons biogéographiques permettrait d'améliorer la connaissance des fonctionnements de ces systèmes aquatiques et donc de leur réponse potentielle face aux pressions anthropiques. Dans ce contexte, cette thèse a visé à étudier la biogéographie du compartiment bactérien dans un ensemble de lacs peu profonds. Les objectifs principaux de cette étude ont été d'évaluer aux échelles régionale et locale les facteurs responsables des patrons biogéographiques pour (i) l'ensemble de la communauté bactérienne et (ii) pour un groupe bactérien spécifique, i.e. les mycobactéries non-tuberculeuses. Pour atteindre ces objectifs deux approches complémentaires ont été entreprises. Tout d'abord, la variabilité spatiale à l'échelle régionale a été évaluée par l'échantillonnage en Ile-de-France de 49 lacs pendant trois étés. Couplé à cette approche, une étude plus fine a été entreprise pour caractériser la dynamique spatiotemporelle du compartiment bactérien par le suivi mensuel pendant deux ans et de six évènements pluvieux importants au sein du lac de Créteil (Val de Marne).À l'échelle régionale, la variabilité spatiale de la structure de la communauté bactérienne pour les trois années de suivi (caractérisé par T-RFLP) a été prédite à hauteur de 76% (r carré moyen) par les processus stochastiques et moins de 14% par les facteurs déterministes incluant les paramètres environnementaux (statut trophique) et les processus de dispersion (connexion du lac à une rivière et les axes PCNM). L'analyse de la composition de la communauté bactérienne par séquençage à haut débit (MiSeq Illumina) a mis en évidence des résultats similaires à ceux acquis par T-RFLP. Cependant, cette analyse a révélé que l'importance des processus impliqués dans les patrons biogéographiques pouvait évoluer en fonction des phylums ou des classes bactériens considérés. La variabilité spatiale des densités de mycobactéries (PCR en temps réel), était quant à elle expliquée à hauteur de 50% par des facteurs déterministes (pH de l'eau, concentration en fer labile et connexion à une rivière).À l'échelle locale, le suivi du lac de Créteil n'a révélé aucune variation spatiale significative (le long des transects horizontal et vertical) de la structure de la communauté bactérienne ainsi que des densités de mycobactéries. Par contre une étude spécifique sur deux lacs a révélé des variations significatives de densité et la diversité des mycobactéries au sein de différents compartiments des lacs. À l'inverse, d'importantes variations temporelles de la structure des communautés bactériennes ont été observées au cours des deux années de suivi, principalement associées aux variations de température de l'eau. Par ailleurs, bien que relativement stable au cours des deux années de suivi, les variations de densités des mycobactéries ont seulement été prédites par les processus stochastiques à hauteur de 35% / Although bacteria are widespread in lacustrine environments, their composition and abundance vary at the regional and also at the local scale. A better understanding of the factors responsible for these biogeographic patterns would improve our knowledge of these aquatic systems and thus their potential response to anthropogenic pressures. In this context, this thesis studied the biogeography of the bacterial compartment in a set of shallow lakes located in the Paris area. The main objectives of this study were to assess at the regional and local scale the factors responsible for the biogeographical patterns on (i) the entire bacterial community, and (ii) a specific bacterial group, i.e. the nontuberculous mycobacteria. To achieve these objectives two complementary approaches were undertaken. First, at the regional scale, the spatial variability was assessed by sampling 49 lakes during three consecutive summers. A finer study was also performed to characterize the spatiotemporal dynamics of the bacterial compartment over a two-year monthly monitoring and during six important rain events within the Créteil Lake (Val de Marne).At the regional scale, the spatial variability of the bacterial community structure for the three summers (assessed by T-RFLP) was predicted for 76% (mean r-squared) by stochastic processes and less than 14% by deterministic factors including environmental parameters (trophic status) and dispersal-related process (connection to a river and PCNM axes). The analysis of the bacterial composition by high-throughput sequencing (Illumina MiSeq) showed similar tendencies to those acquired by T-RFLP. However, this analysis revealed that the importance of the processes involved in biogeographical patterns could vary according to the bacterial phyla or classes considered. Spatial variability of mycobacterial densities (real time PCR) was explained up to 50% by deterministic factors (water pH, amount of labile iron and connection to a river).At the local scale, the monitoring of Creteil Lake revealed no significant spatial variation (along the horizontal and vertical transect) on the structure of the bacterial community and mycobacterial densities. However, a specific study of two lakes showed that mycobacterial density and diversity significantly varied among the different compartments of the lakes. Inversely, significant temporal variations on the bacterial community structure were observed over the two-year of monitoring, mainly related to water temperature changes. Although mycobacterial densities were relatively stable over the Créteil Lake monitoring, their variations were only predicted by stochastic processes up to 35%

L’objectif était la caractérisation moléculaire de la vaginose bactérienne (VB) et l’identification d’une relation entre anomalies moléculaires de la flore vaginale et prématurité. Nous avons élaboré un outil de quantification par PCR spécifique en temps réel ciblant 8 microorganismes impliqués dans la VB. Seule la combinaison de la quantification d’Atopobium vaginae (108 copies/mL) à celle de Gardnerella vaginalis (109 copies/mL) présentait une sensibilité (95%) et une spécificité (99%) élevées pour le diagnostic de VB. La classification des flores selon la présence d’une VB, d’après les 2 méthodes de référence (critères d’Amsel et score de Nugent), et d’après notre outil moléculaire était concordante dans 94.5% des cas (kappa=0.81, intervalle de confiance [IC] 95%: 0.70-0.81). La discordance portait sur 9 flores intermédiaires (5.5%) dont les concentrations en G. vaginalis et en A. vaginae étaient élevées. De plus, nous avons démontré une étroite corrélation entre l’auto-prélèvement vaginal et le prélèvement réalisé par le médecin pour la quantification microbienne. Cette méthode alternative semble utile pour le suivi des anomalies de la flore vaginale. Nous avons enfin établi un lien entre la composition de la flore vaginale et le risque de prématurité parmi 90 patientes hospitalisées pour une menace d’accouchement prématuré (MAP). L’analyse par courbe de survie montrait un délai raccourci entre le diagnostic de MAP et le terme de l’accouchement en présence de concentrations élevées en A. vaginae ou en G. vaginalis (hasard ratio: 3.3; IC 95%: 1.1-9.5). Notre travail a contribué à améliorer l’analyse de la flore vaginale et à l’évaluation de son lien avec la prématurité. / The aim was the molecular characterization of bacterial vaginosis (BV) and the estimation of the relationship between molecular abnormalities and preterm delivery. A quantitative molecular tool targeting 8 bacterial vaginosis-related microorganisms was developed using specific real-time PCR. Only the combination of the quantification of Atopobium vaginae (108 copies/mL) and Gardnerella vaginalis (109 copies/ml) had an excellent sensitivity (95%) and specificity (99%) for the diagnosis of BV. The categorization of the vaginal flora according to the presence of BV based on the 2 reference methods (Amsel criteria and Nugent score), and our molecular tool was agree in 94.5% of the cases (kappa=0.81, 95% confidence interval [CI] 0.70-0.81). There was disagreement for 9 intermediate floras (5.5%) for which vaginal concentrations of A. vaginae and G. vaginalis were high. We also reported a good agreement for bacterial quantification in self-collected compared with practitioner-collected vaginal swabs. This method provides an alternative to practitioner-collected swabs especially for follow-up. We finally demonstrated a relationship between the high vaginal concentrations of A. vaginae and G. vaginalis and the risk of preterm delivery among 90 women with preterm labor. Survival curves analysis for preterm labor-to-delivery interval showed a significantly shorter interval for high vaginal concentrations of both A. vaginae or G. vaginalis (hazard ratio: 3.3; IC 95%: 1.1-9.5). Our work improved vaginal flora analysis and investigated the relationship with preterm delivery.

Les bactéries sont des organismes extrêmement sociaux, qui présentent de multiples comportements de coopération. De plus, les génomes bactériens sont caractérisés par la présence de nombreux éléments génétiques mobiles, tels que les plasmides. Ces éléments mobiles sont la cause de transferts génétiques horizontaux, et jouent un rôle important dans l'évolution bactérienne. La coopération et le transfert horizontal ont tous deux des conséquences importantes sur la santé humaine: des comportements coopératifs sont souvent à l'origine de propriétés de virulence chez les bactéries pathogènes, et le transfert horizontal entraîne la dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques. L'évolution du transfert horizontal a jusqu'ici été analysée essentiellement en termes de bénéfices infectieux apportés à des éléments génétiques égoïstes. Cependant, le taux de transfert des plasmides est extrêmement variable et partiellement contrôlé par les gènes des bactéries hôtes, suggérant une co-évolution complexe entre hôtes et plasmides. De plus, les plasmides sont particulièrement riches en gènes liés à des comportements coopératifs, et semblent donc jouer un rôle-clé dans les phénomènes de socialité bactérienne. Ce travail porte sur la coévolution entre mobilité génétique et socialité chez les bactéries. Nous analysons ici les pressions de sélection agissant sur le transfert de plasmides et la production de biens publics, à l'aide de modèles mathématiques et d'un système synthétique que nous avons construit chez Escherichia coli, dans lequel nous pouvons contrôler indépendamment la coopération et la conjugaison. Dans un premier temps, nous montrons expérimentalement que le transfert horizontal favorise le maintien de la coopération dans une population structurée, en augmentant la sélection de parentèle agissant au niveau des gènes transférés. Dans un second temps, nous montrons expérimentalement et théoriquement que l'échange génétique lui-même peut être sélectionné: les bactéries transférant des plasmides codant pour des biens publics sont favorisées dans une population structurée. Le transfert de gènes codant pour des biens privés peut également être sélectionné, à condition que ce transfert s'effectue entre bactéries apparentées. Finalement, ces interactions entre transfert horizontal et coopération peuvent mener à une association entre allèles de coopération et de transfert, expliquant la fréquence élevée de gènes sociaux situés sur des plasmides.Ces résultats permettent de mieux comprendre le maintien de comportements coopératifs chez les bactéries, et suggèrent des moyens de cibler certains cas de virulence bactérienne. / Bacteria are social organisms which participate in multiple cooperative and group behaviours. They moreover have peculiar genetic systems, as they often bear mobile genetic elements like plasmids, molecular symbionts that are the cause of widespread horizontal gene transfer and play a large role in bacterial evolution. Both cooperation and horizontal transfer have consequences for human health: cooperative behaviours are very often involved in the virulence of pathogens, and horizontal gene transfer leads to the spread of antibiotic resistance. The evolution of plasmid transfer has mainly been analyzed in terms of infectious benefits for selfish mobile elements. However, chromosomal genes can also modulate horizontal transfer. A huge diversity in transfer rates is observed among bacterial isolates, suggesting a complex co-evolution between plasmids and hosts. Moreover, plasmids are enriched in genes involved in social behaviours, and so could play a key role in bacterial cooperative behaviours. We study here the coevolution of gene mobility and sociality in bacteria. To investigate the selective pressures acting on plasmid transfer and public good production, we use both mathematical modelling and a synthetic system that we constructed where we can independently control public good cooperation and plasmid conjugation in Escherichia coli. We first show experimentally that horizontal transfer allows the specific maintenance of public good alleles in a structured population by increasing relatedness at the gene-level. We further demonstrate experimentally and theoretically that this in turn allows for second-order selection of transfer ability: when cooperation is needed, alleles promoting donor and recipient abilities for public good traits can be selected both on the plasmid and on the chromosome in structured populations. Moreover, donor ability for private good traits can also be selected on the chromosome, provided that transfer happens towards kin. The interactions between transfer and cooperation can finally lead to an association between transfer and public good production alleles, explaining the high frequency of genes related to cooperation that are located on plasmids. Globally, these results provide insight into the mechanisms maintaining cooperation in bacteria, and may suggest ways to target cooperative virulence.

Chez certains pathogènes, les flavohémoglobines (flavoHbs) jouent un rôle important dans le système de défense des microorganismes en leur conférant une résistance contre le stress nitrosant généré par les cellules du système immunitaire. Dans la mesure où ces protéines sont absentes chez l’homme, plusieurs études ont été réalisées en vue de comprendre le fonctionnement des flavoHbs au niveau moléculaire en les considérant comme des cibles attractives potentielles pour des inhibiteurs sélectifs. L’inactivation de ces enzymes chez les pathogènes entraîne une perte de virulence. Des composés chimiques (dérivés azolés) ont été identifiés comme étant capables d’inhiber leur activité enzymatique et d’affecter les facteurs de virulence bactérienne. Si ces composés sont très utilisés dans le traitement d’infections fongiques cutanées invasives, leur activité antibactérienne potentielle n’est pas encore exploitée.Typiquement, les flavoHbs sont composées de trois domaines : un domaine à hème de type globine, un domaine de site de fixation d’une flavine et un domaine de fixation du substrat de l’enzyme, le NADH. Les structures cristallographiques des flavoHbs montrent que ce sont des protéines capables d'adopter des conformations différentes selon la nature et la présence de ligand de l’hème mais aussi selon l’organisme d’origine. Ces différentes conformations se traduisent par une mobilité d’un seul des trois domaines sans modification majeure des deux autres domaines. Nous avons entrepris, dans ce travail, l’étude de la flavoHb d’une bactérie pathogène, Staphyloccocus aureus (pathogenic bacteria), peu étudiée dans la littérature et sa comparaison avec celle issue de Ralstonia eutropha (bactérie non pathogène), mieux caractérisée, afin de tenter d’apporter des informations nouvelles voire plus spécifiques de leur fonctionnement chez les pathogènes.Le travail présenté dans ce manuscrit décrit tout d’abord la caractérisation fonctionnelle et biochimique de la flavoHb de S.aureus, et approfondi celle de R. eutropha. Du fait de l’absence de structure cristallographique de la flavoHb de S. aureus, nous avons construit un modèle structural théorique en se basant sur l’homologie de séquence forte entre la séquence d’acide aminée de S. aureus et celle de Saccharomyces cerevisiae dont la structure 3D a été récemment déterminée. Dans l’hypothèse où le mécanisme enzymatique des flavoHbs implique une transition entre différentes conformations, les flavoHbs de R. eutropha et S. aureus ont été modifiées génétiquement au niveau du résidu phénylalanine suggéré par l’analyse structurale comme pouvant jouer un rôle dans la transition entre les différentes conformations. Les conséquences de la mutation de Phe396 en Ser ou Ala ont été analysées au regard des activités catalytiques et des propriétés biochimiques de l’enzyme mais aussi des propriétés des transferts d’électrons intramoléculaires entre les groupements prosthétiques (hème et flavine) par différentes techniques spectroscopiques. Ce travail a permis de montrer que l’effet de la substitution du résidu Phe sur les propriétés enzymatiques diffère selon la flavoHb considérée et révèle dans certains cas un site de fixation de substrat autre que le substrat natif. L’effet d’inhibiteurs (dérivés azolés) mais aussi des quinones et de composés aromatiques nitrés sur le fonctionnement des protéines natives et modifiées génétiquement ont été également étudiés dans ce travail, ces derniers composés pouvant agir en tant que "substrats subversifs" pour les flavoHbs, transformant leurs fonctions de protection en fonctions cytotoxiques.L’ensemble de ce travail a montré que, malgré des structures et des séquences protéiques très voisines, les flavoHbs issues de bactéries différentes sont susceptibles de se comporter différemment vis-à-vis de l’introduction d’une même mutation, de l’effet d’un même inhibiteur et peuvent le cas échéant présenter aussi des cycles catalytiques sensiblement différents. / For some pathogens, flavohemoglobins (FlavoHbs) play an important role in the defense of microorganisms by conferring them a resistance against nitrosative stress generated by the immune system cells. Since these protein are absent in human, several studies have been conducted in order to understand the functioning of these proteins at the molecular level, considering them as potential attractive targets for selective inhibitors. Their inactivation results a loss of virulence. Chemical compounds such as azole derivatives have been identified as being capable of inhibiting their enzymatic function and thereby affecting the bacterial virulence factors. If these compounds are widely used in the treatment of invasive fungal skin infections, their potential antibacterial activity is not yet operated.Typically, flavoHbs are composed of three domains: an N-terminal globin domain which harbors a single heme b and a C-terminal ferredoxin reductase-like FAD- and NAD-binding module. The crystallographic structures of flavoHbs show that these proteins are able to adopt different conformations depending on the nature and the presence of heme ligand but also depending on different organisms they are coming from. The different conformations are characterized by a rigid body motion of one of the three domains. We have undertaken in this work, the study of the Staphyloccocus aureus flavoHb, poorly studied in the literature, and compared it to the Ralstonia eutropha flavoHb (non pathogenic bacteria) to provide new and more specific information on behaviors of these proteins derived from pathogens.This PhD work describes first the functional and biochemical characterization of the S. aureus flavoHb. Due to the lack of its crystallographic structure, a theoretical structural model was designed based on the strong sequence homology between the amino acid sequence of S. aureus and Saccharomyces cerevisiae for which the 3D structure was recently determined. We hypothesized that the relative movement of protein domains could be a way to regulate its enzymatic activity by controlling the substrate accessibility. The Phe396 residue (nomenclature according to R. eutropha), suggested by the structural data to play an important role in the enzyme functioning, but also in the equilibrium between different conformations, was substituted by the Ala or Serine amino acids. The effects of the punctual mutations were investigated with respect to the enzyme functioning and biochemical properties. The mutations effect on the internal electron transfer between flavoHbs cofactors (heme and FAD) was also studied by spectroscopic techniques. This work showed that the impact of Phe substitution on the enzymatic properties is different, depending the considered flavoHb and revealed an additional binding site for other substrate than the native one. The effects of azole derivative inhibitors and also quinones and nitroaromatic compounds have been studied on native and genetically modified enzymes functioning. The latter compounds may act as the ‘subversive substrates’ for flavoHb, converting its protective functions into the cytotoxic ones.Taken as a whole, this work showed that, although the protein structures and sequences are similar, the flavoHbs from different bacteria may behave differently towards an identical mutation, an identical inhibitor and could display different catalytic cycles.

Les matériaux en contact avec des fluides biologiques peuvent être colonisés par de nombreux microorganismes (bactéries, levures…) et des macromolécules telles que les protéines. Lorsqu’il s’agit de bactéries pathogènes, l’adhésion bactérienne devient un problème, en particulier dans les milieux agroalimentaire et biomédical, car elle se poursuit jusqu’à la formation de biofilms bactériens, des bio-structures plus résistantes à l’action des antibiotiques que les bactéries isolées. Malgré une littérature abondante sur les processus d’adhésion bactérienne, l’interface surface – bactérie est encore mal comprise principalement à cause du manque de caractérisation à l’échelle moléculaire. Dans ce travail, nous utilisons une technique d’optique non linéaire du second ordre, la spectroscopie vibrationnelle de Génération de Fréquence Somme (SFG) à large bande, pour sonder spécifiquement des interfaces ordonnées à l’échelle moléculaire. Le principe consiste à envoyer un faisceau picoseconde visible et un faisceau femtoseconde infrarouge (accordé aux longueurs d’onde des vibrations des molécules de la surface) sur le substrat en contact avec des biomolécules en milieu aqueux. L’optimisation de la déconvolution et la modélisation du spectre SFG expérimental, réalisées dans le cadre de travail, permettent d’obtenir quantitativement la conformation des molécules de la surface du substrat. Nous nous sommes intéressés à la colonisation d’une surface structurée en « brosse » composée de monocouches autoassemblées (SAM) hydrophobes d’OctaDécaneThiol (ODT) par des bactéries Lactococcus lactis. Afin de reproduire les conditions naturelles de la colonisation bactérienne, nous avons aussi étudié le rôle de la présence de protéines, en l’occurrence l’albumine de sérum bovin. L’étude par spectroscopie SFG couplée avec des mesures de microscopie confocale de fluorescence a permis de proposer un mécanisme de l’adhésion bactérienne sur la SAM d’ODT, qui dépend de la présence des protéines. Nous avons démontré que les bactéries seules en suspension avaient un impact sur la conformation du support pouvant conduire à une augmentation ou à une diminution de la colonisation bactérienne selon le caractère hydrophobe / hydrophile de la paroi bactérienne. La présence des protéines avant ou pendant la colonisation bactérienne conduit à de nouveaux changements structuraux de la SAM d’ODT et à une importante diminution de l’adhésion bactérienne et du biofilm résultant (indépendamment du caractère hydrophobe / hydrophile de la paroi bactérienne). Cette étude démontre d’une part la faisabilité et l’intérêt de la spectroscopie vibrationnelle SFG pour l’étude de l’adhésion bactérienne in situ, et d’autre part que l’effet des bactéries et des protéines sur la conformation des surfaces est à prendre en compte lors de l’ingénierie de nouveaux matériaux à effet antiadhésif et/ou bactéricide. / Materials exposed to a fluid can be contaminated by microorganisms and macromolecules such as proteins. In food industry or biomedicine, surface colonization by pathogenic bacteria is harmful because it leads to biofilm formation, a microbial consortium more resistant to antiobiotics than planktonic bacteria. Despite of an abundant literature on bacterial adhesion, bacteria-surface interactions still require more studies, in particular at the molecular level. In this work, Broad Band Sum Frequency Generation (BBSFG) spectroscopy was employed to investigate specifically well-ordered interfaces at the molecular level. BBSFG consists in overlapping in time and in space a picosecond visible beam and a femtosecond infrared beam onto the sample in contact with bacteria in water. The IR beam is tuned to the wavelength range of suitable vibrational transitions of adsorbed molecules. Optimisation of the deconvolution procedure of SFG spectra and modeling were performed to derive quantitatively the molecular conformational changes of the interface in response to bacterial adhesion. We have studied the colonization of a well-defined “brush” surface composed of hydrophobic OctaDecaneThiols (ODT) Self-Assembled Monolayer (SAM) by Lactococcus lactis bacteria. In order to mimic natural conditions of bacterial adhesion, where bacteria and proteins coexist, we have also studied the role of Bovin Serum Albumin (BSA) proteins. SFG data and fluorescence confocal microscopy measurements led us to propose a mechanism of bacterial adhesion onto the ODT SAM which depends on the presence of BSA. We have demonstrated that adhesion of bacteria in distilled water induces measurable effects on the ODT SAM conformation and on the bacterial adhesion strength, depending on the hydrophobic / hydrophilic character of the bacterial cell wall. Different behaviors of the ODT were observed when BSA proteins were present before or during bacterial colonization. In particular, BSA leads to a marked antimicrobial effect (independent of the hydrophobic / hydrophilic character of the bacterial surface). This study demonstrates the potential of BBSFG to study in situ bacterial adhesion. It also shows that the modification of surface properties by bacterial adhesion must be taken into account for the design of materials suitable to control or eradicate biofilm formation.

Les bactéries utilisent la communication intercellulaire pour se coordonner afin de réguler des processus bactériens majeurs comme la virulence, la sporulation, la compétence ou la formation de biofilms en fonction de la densité cellulaire. Ce processus repose sur la sécrétion de petites molécules signal appelées phéromones. Chez les bactéries à gram positif, ces phéromones sont de petits peptides qui peuvent être, soit reconnus au niveau de la membrane externe par des systèmes à deux composants dits systèmes indirects, soit être re-internalisés afin de se fixer directement sur un régulateur transcriptionnel cytoplasmique. Dans la recherche de nouveaux agents antimicrobiens, le potentiel thérapeutique d’inhibiteurs ciblant les systèmes de communication intercellulaire est bien étudié chez les bactéries à gram négatif qui utilisent des homosérine lactones comme phéromones. Quelques études s’intéressent aux systèmes indirects de bactéries pathogènes à gram positif mais le potentiel des systèmes directs, plus récemment identifiés, n’a pas encore été explorés.Les récepteurs cytoplasmiques directement régulés par des peptides signal re-internalisés forment la famille des RNPP. Ces récepteurs sont caractérisés par un domaine de fixation du peptide composé d’une répétition de motifs en hélice  appelés TetratricoPeptide Repeats (TPR). La plupart de ces récepteurs sont des régulateurs transcriptionnels contenant un domaine N-terminal de fixation de l’ADN de type Hélice-Tour-Hélice (HTH). Les études précédentes ont montré que, malgré une structure conservée, les modes de régulation des différents membres de la famille RNPP suivent des mécanismes moléculaires distincts. L’un de ces systèmes directs le mieux caractérisé est le système ComRS qui régule la compétence chez les streptocoques. La compétence permet aux bactéries d’internaliser des fragments d’ADN exogènes pour l’acquisition de nouveaux phénotypes tels que la résistance aux antibiotiques ou la virulence. Dans le groupe salivarius, il a été montré que les récepteurs ComR de deux espèces très proches, S. thermophilus et S. vestibularis, ne sont pas capables de coordonner leur état de compétence par échange de leurs peptides ComS respectifs.L'objectif de ma thèse a été d'étudier les déterminants structuraux de la spécificité du système ComRS. J’ai produit, purifié et cristallisé le récepteur ComR de S. vestibularis afin d’en déterminer la structure cristalline, seul et en présence de son peptide signal ComS. La comparaison de ces structures avec celles précédemment résolues chez S. thermophilus, conjointement à une étude fonctionnelle par mutagénèse dirigée réalisée chez nos collaborateurs (P. Hols, UCLouvain, Belgique), a permis d’aller plus loin dans la compréhension du mécanisme de régulation de ComR mais aussi d’identifier les résidus responsables de la spécificité du système ComRS. En parallèle, j’ai également initié la caractérisation structurale de deux paralogues de ComR chez S. salivarius, ScuR et SarF, qui ne sont pas activés par ComS et ne reconnaissent pas les mêmes cibles ADN que ComR malgré des séquences très conservées. Une analyse par SEC-MALS et SAXS m’a permis de montrer que ScuR semble suivre un mécanisme similaire à celui de ComR alors que SarF se comporte différemment en solution. J’ai proposé un modèle par homologie pour ScuR et cristallisé SarF. La résolution de sa structure est en cours. Cette étude permet donc de mieux comprendre la régulation de la compétence chez les streptocoques et ouvre la voie à d’éventuelles applications biotechnologiques ou biomédicales. / Bacteria use intercellular communication to coordinate and regulate major bacterial processes such as virulence, sporulation, competence or biofilm formation, as a function of cell density. This process relies on the secretion of small signal molecules called pheromones. In gram-positive bacteria, these pheromones are small peptides that can be either recognized at the outer membrane by two-component systems called indirect systems, or can be re-internalized to directly interact with a cytoplasmic transcriptional regulator. In the search for new antimicrobial agents, the therapeutic potential of inhibitors targeting intercellular communication systems is well studied in gram-negative bacteria that use homoserine lactones as pheromones. Some studies focus on the indirect systems of gram-positive pathogenic bacteria, but the potential of the more recently identified direct systems has not yet been explored.The cytoplasmic receptors directly regulated by re-internalized signal peptides form the RNPP family. These receptors are characterized by a peptide binding domain consisting of repeats of  helical motifs called TetratricoPeptide Repeats (TPR). Most of these receptors are transcriptional regulators containing an N-terminal DNA binding domain of the helix-turn-helix (HTH) type. Previous studies have shown that, despite a conserved structure, the modes of regulation of the different members of the RNPP family follow distinct molecular mechanisms. One of the best characterized direct systems is the ComRS system that regulates competence in streptococci. Competence allows bacteria to internalize exogenous DNA fragments for the acquisition of new phenotypes such as antibiotic resistance or virulence. In the salivarius group, it has been shown that the ComR receptors of two closely related species, S. thermophilus and S. vestibularis, are not able to coordinate their state of competence by exchange of their respective ComS peptides.The aim of my thesis was to study the structural determinants of the specificity of the ComRS system. I produced, purified and crystallized the ComR receptor from S. vestibularis in order to determine its crystal structure, alone and in the presence of its ComS signal peptide. The comparison of these structures with those previously solved with ComR from S. thermophilus, together with a functional study by directed mutagenesis performed by our collaborators (P. Hols, UCLouvain, Belgium), allowed us to go further in the understanding of the regulatory mechanism of ComR but also to identify residues responsible for the specificity of the ComRS system. In parallel, I also initiated the structural characterization of two ComR paralogs from S. salivarius, ScuR and SarF, which are not activated by ComS and do not recognize the same DNA targets as ComR despite highly conserved sequences. SEC-MALS and SAXS analyses allowed me to show that ScuR seems to follow a mechanism similar to that of ComR whereas SarF behaves differently in solution. I proposed a homology model for ScuR and crystallized SarF. The resolution of its structure is in progress. This study therefore provides a better understanding of the regulation of competence in streptococci and opens the way to potential biotechnological or biomedical applications.