Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-18T19:22:50Z No. of bitstreams: 1 2018_PriscilaPeresDuarteNogueira.pdf: 2026785 bytes, checksum: 7642632a0be351dfb8af86af1fba45b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-29T16:41:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_PriscilaPeresDuarteNogueira.pdf: 2026785 bytes, checksum: 7642632a0be351dfb8af86af1fba45b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-29T16:41:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_PriscilaPeresDuarteNogueira.pdf: 2026785 bytes, checksum: 7642632a0be351dfb8af86af1fba45b7 (MD5) Previous issue date: 2018-05-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O Brasil é o segundo maior produtor mundial de etanol, utilizando cana-deaçúcar como matéria-prima. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o principal microrganismo utilizado em escala industrial tanto para produção de bioetanol quanto para produção de bebidas fermentáveis, como a cerveja. Tipicamente, nas dornas de fermentação, a levedura hidrolisa açúcares produzindo etanol, dióxido de carbono e biomassa. Como essas fermentações não são mantidas estéreis, contaminantes bacterianos são originados de diversas fontes e proliferam nos tanques de fermentação, causando diversos prejuízos como a redução da produtividade e do rendimento de etanol. Bactérias do gênero Lactobacillus são as mais frequentes dentro das dornas industriais. Essas competem pelo substrato e produzem ácidos orgânicos que limitam o crescimento das leveduras e reduzem o rendimento de etanol. Dessa forma, estratégias de controle microbiano de baixo custo são requeridas, uma vez que as tecnologias existentes afetam o metabolismo das leveduras, não são economicamente viáveis ou representam uma ameaça ao meio ambiente. Nesse contexto, o presente trabalho propõe o uso de peptídeos antimicrobianos (PAMs) para o controle de contaminações bacterianas em processos fermentativos. Para isso, os peptídeos antimicrobianos PR-39, PMAP-23 e Cecropin P1 foram adicionados em cultivos de diferentes cepas de leveduras industriais para avaliar qualquer interferência nos seus perfis de crescimento. Dos PAMs testados, PR-39 apresentou a menor interação, sendo escolhido para produção heteróloga em cepa recombinante de S. cerevisiae, porém nenhuma atividade antimicrobiana foi detectada no sobrenadante do cultivo dessa cepa. Dessa forma, outros dois PAMs, X e Y, foram selecionados pela sua alta atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas. Assim, esses foram utilizados em cocultivos de espécies de Lactobacillus e cepas industriais de S. cerevisiae. Observou-se total inibição do crescimento das bactérias com 5 µg/mL desses peptídeos no meio de cultivo, além de terem apresentado pouca interferência no crescimento das leveduras. Dessa forma, eles são potenciais candidatos para serem aplicados contra contaminações bacterianas, sendo o presente trabalho a etapa inicial para o estabelecimento de uma nova tecnologia de controle bacteriano em dornas industriais de fermentação alcóolica. / Brazil is the world's second largest producer of ethanol, using sugarcane as its raw material. The Saccharomyces cerevisiae yeast is the main microorganism used on industrial scale for bioethanol and fermentable beverages production, such as beer. Typically, in industrial fermenters, yeast hydrolyses sugars producing ethanol, carbon dioxide, and biomass. As these fermentations are not kept sterile, bacterial contaminants come from a variety of sources and proliferate in the fermentation tank, causing several losses, like the ethanol yield and productivity reduction. Bacteria of the genus Lactobacillus are the most common in industrial fermenters. They compete for the substrate and produce organic acids that limit the yeast growth and reduce the ethanol yield. Thus, low-cost microbial control strategies are required, since existing technologies affect yeast metabolism, are not economically feasible or pose a threat to the environment. In this context, the present work proposes the use of antimicrobial peptides (AMPs) for the control of bacterial contaminations in fermentative processes. For this, the antimicrobial peptides PR-39, PMAP-23 and Cecropin P1 were added in cultures of different industrial strains of yeasts to evaluate any interference in their growth profiles. From the AMPs tested, PR-39 presented the lowest interaction, being chosen for heterologous production in a recombinant strain of S. cerevisiae, however no antimicrobial activity was detected in the supernatant of the culture of this strain. In this way, two other AMPs, X e Y, were selected for their high antimicrobial activity against gram-positive bacteria. Thus, they were used in cocultures of Lactobacillus species and industrial strains of S. cerevisiae. Complete inhibition of bacterial growth was observed with 5 μg/ml of these peptides in the culture medium, presenting little interference in the yeast growth. In this way, they are potential candidates against bacterial contaminations and the present work is the initial stage for the establishment of a new bacterial control technology in industrial alcoholic fermentation.

Plantas de batata (Solanum tuberosum L.) com sintomas de murcha bacteriana (MB) foram coletadas em 25 lavouras de 10 municípios de quatro regiões produtoras do Rio Grande do Sul (RS), de setembro a dezembro de 1999. Quatrocentos e noventa isolados de Ralstonia solanacearum foram obtidos e 96 e 4% identificados como biovares 1 e 2, respectivamente. A análise dos resultados da PCR-ERIC e BOX de 13 estirpes da biovar 1 e 72 da biovar 2 demonstrou baixa variabilidade genética. Através de RAPD foi possível associar local de origem do isolado com perfil eletroforético. Em outro experimento avaliou-se o comportamento de 14 cultivares e clones de batata cultivados nos períodos das safras de primavera de 1999 e 2000, em uma área naturalmente infestada com a biovar 2, em Caxias do Sul, RS. O número de plantas com sintomas foi registrado semanalmente. Os tubérculos produzidos por plantas assintomáticas foram coletados e submetidos a testes para detectar a presença de R. solanacearum. A área sob a curva de progresso da doença foi utilizada para comparar a resistência dos genótipos de batata à MB e o modelo logístico foi o que melhor se ajustou. A cultivar cruza 148 e o clone MB 03 mostraram-se como os mais resistentes, apresentando, no entanto, tubérculos com infecções latentes. As implicações da incidência de R. solanacearum em lavouras de batata e de sua variabilidade genética, assim como da resistência dos genótipos acompanhada de infecções latentes, no manejo integrado da MB no RS foram discutidas.

Introdução: As IH são consideradas um dos maiores problemas de saúde pública em todo o mundo. Estima-se que entre 5 e 15% dos pacientes hospitalizados adquirem infecção durante a internação e aproximadamente 25% a 40% deles recebem antibiótico para tratamento ou profilaxia de infecções. A exposição a antimicrobianos exerce pressão seletiva sobre os microrganismos e é fator decisivo para a emergência de multirresistência. Objetivos: Este estudo tem por objetivos (1) descrever o consumo de antimicrobianos através das taxas de DDD do CTI adulto e do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, no período de julho de 2004 a dezembro de 2006, (2) estimar a prevalência de GMR em isolados clínicos de pacientes do CTI, com diagnóstico de infecção hospitalar, (3) avaliar a correlação entre o consumo de antimicrobianos no CTI e no hospital com a prevalência de GMR nos isolados clínicos de pacientes do CTI, com diagnóstico de infecção hospitalar e (4) caracterizar o perfil de resistência dos GMR isolados em exames microbiológicos realizados em pacientes internados no CTI.Delineamento: Estudo ecológico Métodos: Foi aferido o consumo mensal de antimicrobianos, em gramas, em toda a instituição e no CTI, de julho de 2004 a dezembro de 2006, a partir dos quais foram calculadas as respectivas Doses Diárias Definidas/100 pacientes-dia (DDD). A DDD foi calculada para aminoglicosídeos, carbapenêmicos, cefalosporinas, fluoroquinolonas, glicopeptídeos, ampicilina sulbactam e piperacilina tazobactam. No mesmo período, foi avaliada aprevalência de germes multirresistentes em isolados microbiológicos de todos pacientes adultos internados no CTI, com diagnóstico de infecção hospitalar adquirida antes ou após a admissão. Foi estimada a freqüência de multirresistência em Staphylococcus aureus, Enterococcus spp, Escherichia coli, Klebsiella spp, Pseudomonas spp, Enterobacter spp, Citrobacter spp, Serratia spp, Proteus spp, Acinetobacter spp, Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltophilia, principais bactérias relacionadas à presença de resistência aos antimicrobianos em CTI. A associação entre o consumo de antimicrobianos e a prevalência de germes multirresistentes foi avaliada através do coeficiente de correlação de Spearman’s.Resultados: O consumo de piperacilina tazobactam, cefalosporinas e fluoroquinolonas aumentou significativamente durante o período, de 1,9 para 2,3 DDD/100 pacientes-dia (r= 0,61; P< 0,01), de 12,1 para 16,4 DDD/100 pacientes-dia (r= 0,60; P< 0,01) e de 4,7 para 10,3 DDD/100 pacientes-dia (r= 0,56; P<0.01) respectivamente. Em contraste, o consumo de ampicilina sulbactam e aminoglicosídeos diminuiu de 9,8 para 1,6 DDD (r=-0,75; P< 0,01) e de 4,7 para 4,4 DDD (r=-0,60; P< 0,01), respectivamente. Considerando-se somente o consumo de antimicrobianos do CTI, apenas as DDD de piperacilina-tazobactam e ampicilina-sulbactam variaram no tempo, elevandose de 6,8 para 9,0 DDD/100 pacientes-dia (r=0,57; P < 0,01) e diminuindo de 22,0 para 3,8 DDD/100 pacientes-dia (r=-0,37; P=0,04), respectivamente. Foram incluídos no estudo 1.490 isolados microbiológicos, e GMR foram identificados em 31,3% (466) dos isolados – 45,3% (190) entre microrganismos Gram positivos e 31,9% (276) entre Gram negativos. Houve aumento na taxa de Klebsiella spp resistente à meropenem (r=0,76; P=0,01), Acinetobacter sppresistente à meropenem (r=0,70; P=0,02) e tendência de redução na taxa de Pseudomonas spp resistente à ciprofloxacina (r=-0,56; P=0,09). Foi identificada correlação positiva entre taxa de GMR do CTI e consumo de cefalosporinas (r= 0,79; P <0,01) e fluoroquinolonas (r=0,68; P=0,03) na instituição. A taxa de Klebsiella spp resistente à ceftazidima correlacionou-se com o consumo de fluoroquinolonas (r=0,70; P=0,02) e cefalosporinas (r=0,77; P=0,01), Pseudomonas spp resistente à ceftazidima com consumo de cefalosporinas (r=0,65; P=0,04) e MRSA com consumo de fluoroquinolonas (r=0,88; P<0,01). Não houve correlação com multirresistência quando somente o consumo de antimicrobianos do CTI foi considerado. Conclusão: Houve correlação entre consumo de antimicrobianos na instituição e prevalência de germes multirresistentes no CTI. Monitorar o consumo de antimicrobianos através da DDD e a prevalência de resistência bacteriana são medidas que auxiliam na política institucional de uso de antimicrobianos e no controle da emergência de germes multirresistentes.

Determinou-se a Intensidade de Atividade de Inibição (IINIB) e a Intensidade de Atividade de Inativação (IINAB) de extratos hidroalcoólicos submetidos a destilação fracionada em rota-vapor com reidratação posterior, de 32 plantas com indicativo etnográfico condimentar na região metropolitana de Porto Alegre/RS, sobre inóculos padronizados de Escherichia coli (ATCC 11229), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Salmonella enteritidis (ATCC 11076) e Enterococcus faecalis (ATCC 19433). Coletou-se talos, folhas, frutos ou bulbos preferencialmente em período de floração. Extratos de 12 plantas apresentaram capacidade de inibição e ou inativação seletiva sobre os inóculos padronizados, sendo que as plantas que melhor se destacaram foram sálvia (Salvia officinalis L.), alho poró (Allium porrum L.), alho nirá (Allium tuberosum L.) e pimentas do tipo Jardim (Capsicum annuum L.), malagueta (Capsicum frutencens L.), calabreza (pool de Capsicum sp.) e dedo de moça (Capsicum baccatum L.). S. aureus demonstrou a maior resistência, enquanto que S. enteritidis foi a mais sensível. Simulou-se ainda, alimento envolvendo leite desnatado estéril, condimentado com estragão (Artemisia dracunculus Linn. ASTERACEAE var inodora) no substrato BHI , contaminado com Log 104 UFC/ml de Salmonella enteriditis (ATCC 11076), verificando-se posteriormente, em duas repetições independentes, a ausência de isolamento desta bactéria em alíquotas de 25 ml, após períodos de 24, 48 e 72 horas de incubação à 36ºC, comprometendo a Validade Preditiva dos Resultados Negativos (VPR -) da pesquisa de salmonela, neste alimento, segundo as normas regulamentares vigentes. Através do método de diluição, com sistema de tubos múltiplos e o emprego de desinibidores bacterianos, determinou-se a Intensidade de Inibição/Inativação (IINIB/IINAB) sobre esta bactéria, a partir de extrato aquoso do estragão, observando-se inibição expressiva, bem como ausência de inativação sobre salmonela. Na presença do fator matéria orgância/sujeira, representado por leite desnatado estéril, estes atributos se repetiram, embora com menor intensidade de inativação. Nas investigações epidemiológicas de surtos toxinfectivos alimentares poderiam ser acrescidas informações sobre condimentação vegetal, entre outras, pertinentes à complexidade crescente dos sistemas de alimentação e nutrição. / It was determined Intensity of Activity of Inhibition and the Intensity of Activity of Inativation of hidro-alcoholic extracts submitted the fracionated destillation in route-vapor with posterior rehidratation of 32 plants with etnograph indicative to spices in the region metropolitan of Porto Alegre/RS P, on standardized steins of Escherichia coli (ATCC 11229), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Salmonella enteritidis (ATCC 11076) and Enterococcus faecalis (ATCC 19433). One collected stems, leves, fruits or bulbs preferential in period of budding. Extracts of 12 plants had presented inhibition capacity and or selective inativation on the standardized species of bacteria, being that the plants that had better been distinguished had been sage (Salvia officinalis L.), poró garlic (Allium porrum L.), nirá garlic (Allium tuberosum L.) e types of peppers like, "garden" (Capisucum annuum L.), "malagueta" (Capsicum frutencens L.), "calabreza" (pool of Capsicum sp.) and young-woman-finger (Capsicum baccatum L.). S. aureus demonstrated the biggest resistence, while that S. enteritidis was most sensible. In the simulated food involving skimmed barren milk, condimented with tarragon (Artemisia dracunculus Linn. ASTERACEAE var. inodora) in substratum BHI, contaminated with Log 104 CFU/ml de Salmonella enteritidis (ATCC 11076), later, it was verified, in two independent repetitions, the absence of isolation of this bacterium in aliquot of 25 ml, after periods of 24, 48 and 72 hours of incubation at 36ºC, compromising the Preditive Validity of the Negative Results (PVR -) of the research of salmonela, in this food, according to prescribed norms. Through the Method of Dilution, with system of multiple pipes and the job of bacterial inhinibitors, it was determined Intensity of inhibition/inativation on the bacterium in study, from aquous extract of the tarragon, observing itself significant inhibition, as well as absence of inactivation on this bacteria. In presence of the organic substance, represented by skimmed barren milk, these attributes if had repeated, even so with lesser intensity of inhnibition. In the epidemiologic inquiries of alimentary toxinfective studies, information could be increased about vegetal condimentary, among others, pertinent to the increasing complexity of the systems of feeding and nutrition.

Pectobactérias (Pectobacterium spp. e Dickeya spp.) são os agentes causais da canela-preta e podridão-mole, e Ralstonia solanacearum da murcha bacteriana. A principal fonte de inóculo dessas doenças é o tubérculo-semente assintomático. As importações brasileiras de tubérculo-semente podem representar um risco à cultura. Tubérculos-semente livres de patógenos é considerada a melhor estratégia para manejar essas doenças. Entrentanto, métodos sensíveis para detecção desses patógenos são necessários. Sendo assim, o principal objetivo dessa pesquisa foi desenvolver e validar um método para detecção de pectobactérias e R. solanacearum presentes em baixa densidade populacional em tubérculos de batata, através de qPCR. A qPCR foi realizada com sondas de hidrólise (sondas TaqMan® MGB) e fluoróforo intercalante de DNA fita-dupla (SYBR Green I). Esse método poderá ser utilizado como uma ferramenta em estudos epidemiológicos, programas de certificação e inspeção quarentenária. O uso de cartões FTA para a coleta e extração do DNA dos tubérculos foi testado, utilizando três métodos de transferência de amostras: pressão direta; cone triturado em PBS; e fragmentos retirados com seringa e triturados em PBS. O primeiro método foi o mais sensível, proporcionando um limite de detecção por PCR de 1x102 UFC.mL-1. Oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados para as bactérias-alvo, exceto para R. solanacearum, na qual se usou os oligonucleotídeos iniciadores OLI1/Y2 em PCR e qPCR. Dickeya spp. (54,9%) e R. solanacearum (52,9%) apresentaram a maior incidência nas 206 amostras analisadas por qPCR, seguidas por P. brasiliensis (16,5%), P. atrosepticum (9,2%), P. carotovorum (6,3%) e P. betavasculorum (1,9%). Esta última trata-se do primeiro registro em batata no Brasil. Associações entre as espécies bacterianas nos tubérculos também foram verificadas, onde Dickeya spp. e R. solanacearum foram encontradas em associação (24,8%) nos tubérculos, mas estavam presentes isoladamente em 20,8 e 13,4%, respectivamente. Dentro desse contexto, a presença de uma população bacteriana heterogênea nos tecidos vasculares dos tubérculos foi demonstrada. / Pectobacteria (Pectobacterium spp. and Dickeya spp.) are the causal agent of blackleg and soft rot, and R. solanacearum of bacterial wilt, in potato crop. The main source of inocula is symptomless seed potato tuber. The Brazilian imports of seed potato may pose a risk to the crop. Pathogen-free seed is the best strategy to manage these diseases. Therefore high-sensitive methods for detection of these bacteria are mandatory. Thus, the main objective of this study was to develop and validate a method for detection of pectobacteria and R. solanacearum present in low population density in potato tubers, by qPCR (absolute quantification) in assay with hydrolysis probes (TaqMan® MGB probes) and double-stranded DNA binding dye (SYBR Green I). This method can be used as a tool in epidemiological studies, certification programs, and quarantine inspection. The use of FTA cards to collection, and DNA extraction was tested using three methods: direct pressure, cone crushed in PBS, and small pieces removed with syringe and crushed in PBS. The first method was the most sensitive, providing a limit of detection by PCR of 1x102 CFU.mL-1. Primers were designed for target bacterial species, except for R. solanacearum, in which was used OLI1/Y2 primers for PCR and qPCR. Dickeya spp. (54.9%) and R. solanacearum (52.9%) had the highest incidence in the 206 samples analyzed by qPCR, followed by P. brasiliensis (16.5%), P. atrosepticum (9.2%), P. carotovorum (6.3%) and P. betavasculorum (1.9%). The occurrence of P. betavasculorum in potato is the first record of potato in Brazil. Associations between bacterial species in the tubers were also found, where Dickeya spp. and R. solanacearum were found in association (24.8%) in the tubers, but were present alone in 20.8 and 13.4%, respectively. Within this context, the presence of a heterogeneous bacterial population in the vascular tissues of the tubers was demonstrated.

A resistência aos antibióticos dos patógenos mais comuns do trato respiratório está aumentando mundialmente. Recentemente, Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina tem sido isolado em diversos países, e a freqüência dessas cepas tem elevado de modo alarmante. O aumento da resistência, com conseqüentes implicações terapêuticas, tem levado a uma reavaliação do uso dos antibióticos ß-lactâmicos para o tratamento de infecções pneumocócicas. No presente trabalho, um total de 107 amostras de Streptococcus pneumoniae, obtidas de materiais provenientes de pacientes adultos ambulatoriais e hospitalizados, em dois centros médicos de duas cidades do Rio Grande do Sul (Porto Alegre e Caxias do Sul), os quais apresentavam quadro clínico-radiológico de infecção pulmonar, foram analisadas com o objetivo de estudar-se a resistência do germe à penicilina. As amostras constituídas de escarro (80,4%), lavado brônquico (13,5%) e aspirado traqueal (6,6%) foram coletadas no período compreendido entre Julho de 1998 e Julho de 1999. O material foi semeado em meio de Agar sangue e as colônias suspeitas de Streptococcus pneumoniae foram transferidas para meio de Mueller-Hinton para teste de optoquina e de sensibilidade à penicilina com discos de oxacilina. Um halo de inibição da oxacilina menor do que 20 mm indicava a realização de teste para determinação da concentração inibitória mínima (MIC) com E-test. Um total de nove cepas foi identificado como tendo resistência intermediária à penicilina (MIC 0,1-1,0μg/ml) e nenhuma cepa resistente (resistência elevada: MIC > 2,0 μg/ml) foi identificada. Uma monitorização local das cepas quanto à resistência antimicrobiana é de grande importância para os clínicos no manejo de infecções pneumocócicas. / Antibiotic resistance to the common respiratory tract pathogens is increasing worldwide. Recently, penicillin-resistant pneumococci have been isolated in several countries, and the incidence of these strains has risen alarmingly. The increased of resistance with consequence therapeutic implications has led to a re-evaluation of ß-lactam antibiotics for the treatment of streptococcal infections. In present study a total of 107 isolates of Streptococcus pneumoniae from samples of adult hospitalizated patients ando outpatients were prospectively collected in 2 different medical centers of Rio Grande do Sul - Brazil (Caxias do Sul and Porto Alegre) with clinical and radiologyc signs of respiratory infections, were analyzed with objective to study the penicillin-resistant pneumococci. The samples consisting of sputum (80,4%), bronchial lavage (13,5%) and inhaled traqueal (6,6%) had been colected in the period understood between 98 July and 99 July. The material was sown in agar-blood and the colonies suspicion of Streptococcus pneumoniae had been transferred to Mueller-Hinton for test of optochin and for sensitivity to penicillin test with oxacilin disks. One inhibition of the lesser that 20 mmm for oxacilin indicates the test accomplishment to determine minimum inhibitory concentration (MIC) with E-test. A total of 9 strains were intermediate-resistant to penicillin (MIC 0,1-1,0μg/ml) and neither was resistant to penicillin (MIC > 2,0 μg/ml). Monitoring local of antimicrobial resistant strains is of great importance to clinicians for the management of pneumococcal infections.

O desenvolvimento de materiais tipo Burley resistente a Murcha Bacteriana é de suma importância para a fumicultura brasileira. Em fumo tipo Burley não existem variedades comerciais com boa adaptação resistentes à R. solanacearum. O objetivo desse trabalho foi determinar o efeito da seleção artificial para resistência à murcha bacteriana na população Burley x Virgínia em diferentes gerações segregantes. Este estudo foi realizado em um infectário de R. solanacearum, localizado em Santa Cruz do Sul, RS. Foi realizado cruzamento entre um cultivar tipo Burley moderadamente resistente (BY 26) e um material tipo Virgínia resistente à murcha (Oxford 207). Foram comparados quatro gerações F1, F3, F5, F7, pai moderadamente resistente (BY 26), pai resistente (OX 207) e uma testemunha suscetível (01528). O delineamento experimental utilizado foi de blocos ao acaso, com quatro repetições e 10 plantas em cada parcela, para uniformizar e aumentar o nível de severidade da moléstia, as plantas foram inoculadas através da deposição de 20 mL de uma suspensão (108 UFC/mL) de R. solanacearum. Para a murcha bacteriana não houve diferença significativa entre as médias das quatro gerações e nem destas com o genitor resistente, já que provavelmente a seleção efetuada em todas as gerações foi suficiente para manter os níveis de resistência observados na geração F1. Observou-se em F7 que várias linhas já estavam fixas com níveis de resistência à murcha semelhante ao genitor resistente. Portanto, os resultados finais mostraram que a seleção artificial foi eficiente para selecionar a resistência à murcha bacteriana, e que é possível transferir resistência a R. solanacearum de fumo Virgínia para fumo tipo Burley – mantendo as características desejadas de cor e tipo do fumo Burley com a resistência similar a do pai resistente.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-01-05T14:35:38Z No. of bitstreams: 1 2016_MaurícioRossato.pdf: 3410176 bytes, checksum: deb7c72c5b63bb15ba465dfeee816c69 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-08T21:24:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MaurícioRossato.pdf: 3410176 bytes, checksum: deb7c72c5b63bb15ba465dfeee816c69 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T21:24:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MaurícioRossato.pdf: 3410176 bytes, checksum: deb7c72c5b63bb15ba465dfeee816c69 (MD5) / A murcha bacteriana, atualmente reconhecida como sendo causada por um complexo de espécies do gênero Ralstonia (Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum e R. syzygii) apresenta uma ampla diversidade, podendo ser dividida em raças, biovares, filotipos e sequevares. O objetivo deste trabalho foi: (i) ampliar os conhecimentos sobre o importante complexo de espécies de Ralstonia por meio da caracterização biológica, bioquímica e molecular do isolado CNPH-RS 488, que se mostrou capaz de suplantar a resistência da linhagem ‘Hawaii 7996’; (ii) gerar um novo protocolo de identificação de biovares por meio de técnicas moleculares, visando aumentar a eficiência do processo e reduzir os custos associados com o teste de biovar; (iii) identificar novas fontes de resistência em tomateiro à murcha bacteriana em germoplasma selvagem de Solanum, considerando o melhoramento antecipatório contra possíveis novos variantes do patógeno, como o isolado CNPH-RS 488; (iv) gerar informações sobre o patossistema Coffea – Ralstonia. No presente estudo, o isolado CNPH-RS 488 foi classificado quanto ao biovar e filotipo, e foram caracterizados o seu perfil de virulência, a capacidade de suplantar de resistência da linhagem ‘Hawaii 7996’, a produção de EPS e de biofilme, bem como a sensibilidade a antibióticos e sua gama de hospedeiras. Os sistemas de marcadores RAPD/SCAR em associação com a estratégia de bulk segregant analysis foram inicialmente empregados visando o desenvolvimento de primers específicos para identificação de biovares. Para a busca por novas fontes de resistência avaliou-se uma coleção de 75 genótipos de Solanum peruvianum em comparação com as linhagens controle ‘Hawaii 7996’ (resistente) e ‘L390’ (suscetível). Os genótipos foram inoculados com os isolados CNPH-RS 488 (biovar 2A) e CNPH-RS 489 (biovar 1). O status do cafeeiro como hospedeira do complexo de espécies de Ralstonia foi demonstrado em bioensaios com nove isolados em três cultivares de Coffea arabica, comparando com a resposta do tomateiro suscetível ‘San Vito’. A confirmação da capacidade de suplantação da resistência do ‘Hawaii 7996’ pelo CNPH-RS 488 não pôde ser explicada pelos testes de produção de exopolissacarídeo e biofilme. Foi também constatado que o isolado apresenta uma maior virulência sobre espécies mais resistentes como jiló e berinjela. Onze primers RAPD foram selecionados com potencial valor diagnóstico para identificação de biovares. Amplicons obtidos com quatro primers que geraram marcadores estáveis foram clonados e a informação de sequência foi utilizada para o desenho dos primers do tipo SCAR. Os primers J1-B1-B e SCAR-i18-B2A apresentaram especificidade parcial para isolados de biovar 1 e 2A, respectivamente. Para a biovar 3, foi empregada uma estratégia de subtração in silico que permitiu o desenho de um par de primers específico para a região do gene polS (codificador da enzima sorbitol desidrogenase). Sete genótipos dos 75 de S. peruvianum foram considerados como promissoras fontes para o melhoramento do tomateiro visando à resistência à murcha bacteriana. O cafeeiro se mostrou suscetível exclusivamente a isolados de R. pseudosolanacearum, indicando os potenciais riscos que a murcha bacteriana pode apresentar para a cafeicultura brasileira. O presente trabalho destaca que a existência de isolados capazes de suplantar a resistência do tomateiro, como o CNPH-RS 488, e isso implica em potenciais riscos da disseminação dos mesmos pelo país, podendo inviabilizar as cultivares de tomateiro atualmente disponíveis no mercado e que usam a linhagem ‘Hawaii 7996’ como parental. Estudos adicionais sobre esse variante do patógeno serão necessários bem como o desenvolvimento de programas de melhoramento com novas fontes de resistência efetivas contra isolados com um perfil de virulência similar ao apresentado pelo CNPH-RS 488. / The bacterial wilt is currently recognized as being caused by a complex of three species: Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum, and R. syzygii. The causal agents of the bacterial wilt display a wide diversity, being classified in races, biovars, phylotypes, and sequevars. The objective of the present thesis was: (i) add new information about this important bacterial complex via biological, biochemical and molecular characterization of the isolate R. solanacearum CNPH-RS 488, which was found to be able to break down the resistance of the tomato (Solanum lycopersicum) inbred line ‘Hawaii 7996’; (ii) develop a new protocol for molecular characterization of biovars, focusing on making a faster and cheaper biovar identification test; (iii) search for new sources of resistance to bacterial wilt disease within a germplasm collection of wild Solanum (section Lycopersicon) species, using the preemptive breeding and developing new resistant cultivar to new and atypical strains like the CNPH-RS 488; (iv) study and characterize a new pathosystem: Coffea – Ralstonia. Studies with the isolate R. solanacearum CNPH-RS 488 involved different approaches: (1) determination of its biovar and phylotype; (2) determination of its virulence profile, including the capability of breaking down the resistance of ‘Hawaii 7996’; (3) production of exopolysaccharides (EPS) and biofilm; (4) antibiotic sensitivity, and (5) host range. The RAPD/SCAR marker systems in association with bulk segregant analysis was the strategy initially employed aiming to develop biovar-specific PCR-based markers. The search for new sources of resistance to bacterial wilt was carried using 75 Solanum peruvianum accessions and two standard lines ‘Hawaii 7996’ (resistant) and ‘L390’ (susceptible). Bioassays were carried out with two isolates, CNPH-RS 488 (biovar 2A) and CNPH-RS 489 (biovar 1). For the study of coffee as a host of the Ralstonia species complex, plants of three C. arabica cultivars were inoculated with a collection of nine isolates and their reactions were compared with that of the susceptible standard (tomato ‘San Vito’). The ‘Hawaii 7996’-resistant breaking ability of the isolate CNPH-RS 488 could not be explained by EPS and biofilm production. In addition, it was found that this isolate displayed a wider virulence profile being also able to infect accessions of scarlet eggplant and eggplant (which are naturally more tolerant to bacterial wilt). Eleven RAPD primers with potential diagnostic value for biovar were selected. Four stable amplicons (generated by four RAPD primers) were gel-purified and cloned. The sequence information was used for the design of SCAR-like primers. The primers J1-B1-B and SCAR-i18-B2A displayed partial specificity to isolates biovar 1 and 2A, respectively. For the biovar 3, it was employed the in silico subtraction technique, which allowed the design of a polS (sorbitol dehydrogenase) gene-specific primer. Seven out of the 75 S. peruvianum accessions were considered as promising sources for future use in tomato breeding programs to bacterial wilt resistance. Coffee accessions were susceptible exclusively to R. pseudosolanacearum isolates, indicating the potential risk of the bacterial wilt for the Brazilian coffee production. The present work emphasizes the existence of isolates (such as the CNPH-RS 488), which are able to break down the major sources of resistance available in tomato breeding programs. The present work also points out the potential risks of the spread of isolates with similar virulence profile across the country, which may preclude the employment of ‘Hawaii 7996’ as parental material. More studies on these variants will be necessary aiming to help the tomato breeding programs in the search for new sources of resistance to isolates with virulence profiles similar to CNPH-RS 488.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC, para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / A meningite bacteriana é a doença infecciosa mais comum do sistema nervoso central (SNC), caracterizada por uma inflamação das meninges. O Streptococcus agalactiae é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em recém-nascidos em todo o mundo, causando sepse, pneumonia e meningite. Sobreviventes a meningite podem sofrer graves sequelas neurologicas a longo prazo. Nosso objetivo foi verificar os níveis de citocina/quimiocina, atividade de mieloperoxidase (MPO), o stress oxidativo e ruptura da barreira hematoencefálica (BHE) no hipocampo e córtex cerebral dos ratos Wistar recém-nascido após indução da meningite por S. agalactiae e os efeitos da meningite na vida adulta através de testes comportamentais e níveis de fator de crescimento neuronal (NGF) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Ratos Wistar recém-salina estéril como um placebo ou um volume equivalente de S. agalactiae em uma concentração de 1x106 UFCol/mL. em diferentes tempos após a indução da meningite, os animais foram mortos e o hipocampo e córtex cerebral foram retiradas para avaliação dos nívies das citocinas quimiotática indutora de neutrófilos tipo 1 (CINC-1), interleucina1 beta (IL-1β), IL-6, IL-10 e fator de crescimento tumoral (TNF-α) e permeabilidade da BHE. Sessenta dias após a indução, os animais foram submetidos a testes comportamentais e mortos, e o hipocampo e no córtex cerebral foram retirados para análise dos níveis de BDNF e NGF. No hipocampo os níveis de CINC-1 foram aumentados em 6 h e 12 h após a indução, IL-1β em 6, 12 e 24 h após, a IL-6 em 6, 24 e 96 h após, de IL-10 às 24, 48 e 96 h após e TNF-α às 24 h e 96 h após. No córtex cerebral os níveis CINC-1 e IL-1β foram encontrados aumentada 6 h após a indução da meningite. A atividade da MPO foi elevado em 24, 48 e 96 h após a indução no hipocampo e em 6, 12, 24, 48 e 96 h após a indução no córtex cerebral A ruptura da BHE teve inicio em 12 h após a indução. Os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram elevados no hipocampo em 6, 12, 24, 48, 72 e em 96 h e no córtex cerebral as 72 e 96 h após a indução da meningite. Os níveis da carbonilação de protreínas foram elevadas no hipocampo e no córtex cerebral em 6, 24, 48, 72 e 96 h após. Houve uma diminuição da atividade da superóxido dismutase (SOD) no hipocampo e no córtex cerebral. A atividade da catalase (CAT) foi elevada no hipocampo em 6 h e no córtex cerebral de 12 e 96 h após a indução da meningite. O teste campo aberto não demonstrou nenhuma diferença motora, atividade exploratória e memória de habituação entre os grupos. O teste de esquiva inibitória, quando avaliamos a memória de longo prazo em 24h após a sessão de treino, verificou-se que o grupo meningite teve uma diminuição na memória aversiva, quando comparado com o teste de memória de longo prazo do grupo sham. Os níveis de BDNF foram diminuidos no hipocampo e córtex cerebral; no entanto, os níveis de NGF diminuiu apenas no hipocampo. Estes resultados sugerem que o modelo de meningite pode ser uma boa ferramenta de pesquisa para o estudo dos mecanismos biológicos envolvidos nas alterações comportamentais secundários da meningite por S. agalactiae.

Resumo: A disposição em solos agrícolas e florestais de lodos resultantes de estações de tratamento de esgoto vem sendo amplamente revisada e questionada nos países que se utilizam desta prática. Embora isto venha a resolver um problema sério de falta de espaço e alto custo de destinação do lodo, e ainda substituindo parcialmente as necessidades de adubação química, os problemas de acréscimo de metais pesados aos solos através do lodo e a presença de patógenos se constituem hoje nos principais fatores de restrição de uso. Apesar deste método de disposição não ser muito utilizado ainda, a tendência é de aumento, pois houve um crescimento expressivo no número de Estações de Tratamento de Esgoto, criando uma demanda para destinação do lodo gerado. Com relação aos níveis de metais pesados, a preocupação tem sido quanto aos efeitos cumulativos destes metais, pois a legislação dos países onde a disposição agrícola do lodo já é utilizada tende a ficar cada vez mais rígida, baixando os limites aceitáveis pela legislação. Este trabalho avaliou a eficiência de bio-lixiviação de metais pesados por bactérias do gênero Thiobacillus em lodos ativados, assim como caracterizou química e biologicamente o lodo antes e depois do processo de bio-lixiviação, e trabalhou nos isolamentos de microrganismos nativos do lodo capazes de lixiviar metais pesados. As eficiências de bio-lixiviação alcançadas para os quatro elementos considerados neste estudo foram: Cd (95%); Pb (95%); Cu (95%), Zn (50%). As propriedades fertilizantes não foram afetadas pelo processo. Palavras-chave: Thiobacillus, metais-pesados, biohidrometalurgia, biolixiviação, lodos aeróbios, disposição agrícola