Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Shaker Chuck Farah / Banca: Celso Eduardo Benedetti / Resumo: O presente trabalho teve como principal objetivo realizar estudos funcionais na bactéria Xac, estudando o possível envolvimento dos genes copA, copB e cutC no mecanismo de resistência a cobre nesta bactéria. Estes estudos funcionais envolveram: análise da expressão dos genes durante o crescimento na presença de cobre por Northern e Western blots e por eletroforese bi-dimensional, produção e purificação das proteínas recombinantes e produção de anticorpos, inativação de um dos genes (copA) para avaliar a participação da proteína CopA no mecanismo de resistência a cobre e análise da interação das proteínas de resistência a cobre com outras proteínas de Xac através do ensaio de duplo híbrido de leveduras. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem mutante infecta a planta, mas os sintomas são mais retardados na presença do metal, quando comparada à linhagem selvagem. O crescimento das células mutantes na ausência e presença de cobre in planta indicou maior sensibilidade ao cobre pelas células mutantes. Na tentativa de verificar se as proteínas CopA, CopB e CutC interagem com outras proteínas de Xac, um ensaio de duplo híbrido de leveduras foi realizado. Através deste ensaio, algumas proteínas foram identificadas, as quais necessitam de estudos de caracterização adicionais. / Abstract: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker, a serious disease that affects the most commercial citrus cultivars causing serious economic impacts. Symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruit and leaves and general tree decline. By sequencing the genome of this bacterium (ONSA Network, FAPESP, Brazil), a better knowledge of this microorganism and its molecular interactions with the host might be elucidated. For this, we analyzed the gene expression during growth in the presence of copper by Northern and Western blots, 2D-electrophoresis, production and purification of the CopA, CopB, and CutC recombinant proteins, inactivation of the copA gene to evaluate the participation of CopA protein in the copper resistance mechanism, and protein-protein interactions assays by the yeast two-hybrid assay. Results showed that the mutant strain infects the plant, but the lesions formation was retarded in the presence of copper. The mutant strain showed more sensitivity to copper than the wild type strain during growth in planta. In order to verify whether the CopA, CopB, and CutC proteins interact with other proteins of Xac, a yeast two-hybrid assay was performed. By this assay, some proteins were identified, which need further characterizations. / Doutor

Orientador: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Renate Krause Sakate / Banca: Julio Rodrigues Neto / Resumo: O presente trabalho teve por objetivo avaliar a produção e a sensibilidade de 48 isolados de Xanthomonas axonopodis pv. citri e de 14 isolados de Xanthomonas spp. à bacteriocinas. Estudos foram realizados para verificar o efeito da temperatura, tempo de incubação e do tipo do meio de cultura sobre a produção de bacteriocina por isolados de X. axonopodis pv. citri. Todos isolados de X. axonopodis pv. citri não foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por eles, não sendo essas afetadas pelo meio BDA, nutriente ágar + NaCl e YPDA, nos diferentes tempos e temperaturas de incubação. Porém, isolados de X. axonopodis pv. passiflorae foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por 25 isolados de avaliados e o isolado de X. campestri pv. campestris e o de X. axonopodis pv. manihotis apresentaram sensibilidade variável. Dos 25 isolados de X. axonopodis pv. citri apenas cinco não foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas por dois isolados de X. axonopodis pv. passiflorae. As bacteriocinas produzidas pelos isolados de X. axonopodis pv. citri (FDC-806) e de X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) foram termolábeis e resistentes à lisozima e sensíveis a DNAse. A bacteriocina produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. passiflorae foi resistente à ação de proteinase K, tripsina e RNAse enquanto que a produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. citri foi sensível a essas enzimas. / Abstract: The objective of this work was to evaluate the production and sensitivity of 48 Xanthomonas axonopodis pv. citri strains and 14 Xanthomonas spp. strains to bacteriocins. A number of studies were carried out to verify the effect of temperature, incubation time, and type of culture medium on bacteriocine yield by X. axonopodis pv. citri strains. None of the X. axonopodis pv. citri strains were sensitive to the bacteriocins produced by themselves, and were not affected by the PDA, nutrient agar + NaCl, and YPDA media, at the different incubation times and temperatures studied. However, X. axonopodis pv. passiflorae and strains were sensitive to the bacteriocins produced by the 25 Xac strains evaluated, while a X. campestri pv. campestris and X. axonopodis pv. manihotis strains showed variable sensitivity. Of the 25 X. axonopodis pv. citri strains, only five were not inhibited by the bacteriocins produced by the two X. axonopodis pv. passiflorae strains. The bacteriocins produced by X. axonopodis pv. citri (FDC-806) and X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) were thermolabile and resistant to lysozyme and sensitive to DNAse. The bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. passiflorae was resistant to the action of proteinase K, trypsin and RNAse, while the bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. citri isolate was sensitive to those enzymes. / Mestre

Orientador: Dilermando Perecin / Coorientador: Silvana Aparecida Creste Dias de Souza / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Álvaro Sanguino / Resumo: Xanthomonas aliblineans é um importante patógeno da cana-de-açúcar, causando grandes perdas na produção. Este trabalho teve como objetivos o desenvolvimento de um antissoro específico para X. albilineans bem como a caracterização molecular e fenotípica de um banco de isolados de diferentes regiões do Brasil. O antissoro foi produzido a partir da imunização de coelhos da raça Nova Zelândia, utilizando com antígeno, o isolado 2256 utilizado neste trabalho. Os isolados foram obtidos de canas sintomáticas, coletadas a campo, utilizando-se meio de cultura seletivo XAS. "Simple Sequence Repeats" - SSRs obtidas a partir da análise do genoma de X. albilineans foram utilizadas para o desenho de 15 "primers", e o polimorfismo avaliado em gel de poliacrilamida corados com nitrato de prata. O antissoro desenvolvido foi altamente específico para X. albilineans. Os 15 "primers" amplificaram um total de 54 alelos polimórficos. A análise de agrupamento mostrou a existência de variabilidade genética entre os isolados coletados em diferentes estados brasileiros, os quais foram divididos em três grupos principais, embora não foi possível agrupar esses indivíduos por local de coleta. A avaliação da patogenicidade mostrou a existência de diversidade patogênica entre os isolados, embora vários deles não tenham sido distinguidos molecularmente pelo marcadores utilizados. Dois alelos foram identificados como associados a patogenicidade, sendo que um deles, , está localizado no loco que codifica a síntese de peptídeos não ribossomais (non ribosomal peptide synthetase - NRPS), os quais estão associados à virulência de muitas bactérias fitopatogênicas / Abstract: Xanthomonas albilineans is an important pathogen of sugarcane, causing important losses in production. This study aimed to develop an antiserum specific for X. albilineans and the phenotypic and molecular characterization of a set of isolates from different regions of Brazil. The antiserum was produced from immunizing New Zealand rabbits, using as antigen, the isolated 2256 used in this work. The isolates were obtained from symptomatic canes, collected in the field, using selective culture media XAS. Simple Sequence Repeats - SSRs obtained from the analysis of the genome of X. albilineans were used to design 15 primers and the polymorphism analyzed on polyacrylamide gels stained with silver nitrate. The antiserum developed was highly specific for X. albilineans. The 15 primers amplified a total of 54 polymorphic alleles. Cluster analysis showed the existence of genetic variability among isolates collected in different Brazilian states, which were divided into three main groups, although it was not possible to group these individuals based on collect site. The evaluation showed the presence of pathogenic diversity among isolates, although many of them have not been distinguished with the molecular markers used. Two alleles were identified as being associated with pathogenicity, one of which is located in the site encoding the non-ribosomal peptide synthetase - NRPS, which are associated with virulence of many pathogenic bacteria / Mestre

Orientador: Silvio Roberto Andrietta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-11T21:28:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_ErikaDurao_D.pdf: 4132476 bytes, checksum: f7ca415cbb893825fe426e0ef7afa813 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade de produção de goma xantana em reator de coluna de bolha utilizando processo de batelada repetida bem como otimizar as condições de produção e avaliar algumas etapas típicas da recuperação da goma. Foram utilizadas neste estudo duas linhagens da bactéria Xanthomonas campestris: ATCC 13951 (ou NRRL B-1459) e ATCC 55298. Os ciclos variaram de 3 a 8 bateladas consecutivas de 48 horas. Ao final de cada batelada, parte do caldo fermentado era retirado do reator e aproximadamente 20% do volume era deixado no reator para servir de inóculo para a próxima batelada que se iniciava com a adição de meio para produção de goma. O primeiro ensaio preliminar que consistiu de um ciclo com 6 bateladas demonstrou ser viável o processo em bateladas repetidas de modo que ensaios subseqüentes foram realizados com a finalidade de se otimizar as condições de operação para cada linhagem por planejamento fatorial de dois níveis em configuração estrela com repetição do ponto central. Os fatores estudados foram concentração inicial de sacarose, vazão de ar e temperatura e as respostas analisadas foram rendimento, concentração final de xantana bruta e o índice de consistência k (mPa.sn), parâmetro reológico indicativo da qualidade da goma produzida. De uma maneira geral, os fatores estudados não apresentaram efeitos significativos nas respostas estudadas. Nos ensaios do planejamento fatorial, para a linhagem ATCC 13951, obteve-se valores médios de 10,7±1,9 g/L para a concentração final de xantana, 48,6±14,3% para o rendimento, 1228±310 mPa.sn para o índice de consistência e 0,29±0,022 para o índice de comportamento de fluxo. Para a linhagem ATCC 55298 obtivesse valores médios de 11,1±1,6 g/L para a concentração final de xantana, 50,5±11,7% para o rendimento, 1478±223 mPa.sn para o índice de consistência e 0,27±0,016 para o índice de comportamento de fluxo. A análise dos resultados por meio da função desejabilidade global apontou condições ótimas de trabalho que foram validadas experimentalmente. Os ensaios de validação, tanto com a linhagem ATCC 13951 quanto com a linhagem ATCC 55298, apontaram que a concentração inicial de sacarose em 20 g/L, temperatura de 31ºC e aeração de 1,5 vvm maximizam rendimento e concentração final de xantana. / Abstract: The aim of this work is to evaluate xanthan production in a bubble column reactor using a repeated batch process as well as to optimize de gum production operational conditions and evaluate some of the typical steps of the recovery process. Two Xanthomonas campestris strains were evaluated: ATCC 13951 (or NRRL B-1459) and ATCC 55298. The cycles were comprised of 3 to 8 repeated 48-hour batches. At the end of each batch 20% of the broth volume was left inside the fermentor to serve as innoculum to the next bacth that were initiated by addition of fresh medium. Preliminary experimental assay showed satisfactory results in a cycle with six 48-hour successive batches so that subsequent assays were conducted to optimize the operational conditions for each strain using two level factorial design plus star configuration with three central point replicates. The factors evaluated were the initial sucrose concentration, temperature and aeration and the responses were the final xanthan concentration, the overall yield and the consistency index. The evaluated factors did not presented significant effect on the responses studied. The mean values obtained in the assays with strain ATCC 13951 were 10.7±1.9 g/L to final xanthan concentration, 48.6±14.3% to the overall yield, 1228±310 mPa.sn to the consistency index and 0.29±0.022 to the flow behavior index. The mean values obtained in the assays with strain ATCC 55298 were 11.1±1.6 g/L to final xanthan concentration, 50.5±11.7% to the overall yield, 1478±223 mPa.sn to the consistency index and 0.27±0.016 to the flow behavior index. The analysis of the factorial design results through desirability function pointed the optimal conditions to maximize yield and product quality and these conditions were validated experimentally. It was concluded that for both strains, the optimal conditions were 20g/L initial sucrose, 31ºC and 1.5 vvm. / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-07-11Bitstream added on 2014-06-13T20:06:02Z : No. of bitstreams: 1 vigoschultz_sc_dr_botfca.pdf: 498277 bytes, checksum: c7de24a4b6e67b28a4f1cf2cd6af9342 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O crestamento bacteriano comum do feijoeiro (CBCF), incitado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, é responsável por expressivos danos na cultura e por reduções no rendimento e qualidade dos grãos. A preocupação com o meio ambiente e o uso indiscriminado de agrotóxicos tem impulsionado a pesquisa para a busca de métodos alternativos ao controle de patógenos em plantas. Os indutores de resistência têm se mostrado eficientes e promissores no controle de diversos patógenos de culturas. O presente trabalho teve como objetivos verificar o potencial de tinturas etanólicas de Lippia alba (erva cidreira), Lippia sidoides (alecrim pimenta), Mikania glomerata (guaco), Equisetum sp. (cavalinha) e Hedera helix (hera), óleos essenciais de Rosmarinus officinalis (alecrim) e Cinnamomum zeylanicum (canela) e de piraclostrobina e acibenzolar-S-metil no controle do crestamento bacteriano comum em feijão vagem cultivar Bragança. Esses produtos foram utilizados nos seguintes ensaios: atividade antimicrobiana in vitro (exceção ao acibenzolar-S-metil), atividade in vivo em plantas cultivadas sob condições de casa de vegetação, tratadas com os produtos e calculada a área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD); atividade de polifenoloxidases, peroxidases e proteínas solúveis totais em folhas tratadas e não tratadas de feijão vagem, inoculadas e não inoculadas, coletadas em diferentes épocas (0, 3, 5, 8 e 10 dias após pulverização das tinturas etanólicas, óleos essenciais, acibenzolar-S-metil e pyraclostrobin). Os resultados obtidos demonstraram que as tinturas de L. alba e L. sidoides e os óleos essenciais apresentaram atividade in vitro aos isolados de X. axonopodis pv. phaseoli, enquanto que piraclostrobina não apresentou ação in vitro sobre a bactéria. A tintura etanólica de L. alba, pyraclostrobin e acibenzolar-S-metil apresentaram menores valores da AACPD,... / Common bacterial blight of snap bean (CBCSB), caused by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli responsible for expressive culture damage and reduction of seeds production and quality. The environmental impact of the indiscriminate use of pesticides has lead to search alternative methods of plant pathogens control. Resistance inducers have been efficiently successful on several plant pathogens control. Thus, this study aimed to evaluate the potential of alcohol extracts of Lippia alba (Melissa), Lippia sidoides (pepper-rosmarin), Mikania glomerata (guaco), Equisetum sp. (horsetail) and Hedera helix (English Ivy), essential oils of Rosmarinus officinalis (rosemary) and Cinnamomum zeylanicum (cinnamon) and, pyraclostrobin and acibenzolar-S-metil on the control of common bacterial blight in snap beans, Bragança cultivar. These products were used in the following assays: in vitro bactericidal activity (except for acibenzolar-S-metil), in vivo activity of greenhouse-cultivated plants treated with products and the area under the disease progress curve (AUPDC) was calculated; activity of poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins in treated anduntreated bean leaves, infected and non-infected leave collected in different stages (0, 3, 5, 8 and 10 days after sprinkling with alcohol extracts, essential oils, acibenzolar-S-metil and pyraclostrobin). Results showed in vitro activity against X. axonopodis pv. phaseoli for L. alba and L. sidoides extracts, and essential oils while pyraclostrobin did not show any in vitro activity effect. L. Alba alcohol extract, pyraclostrobin and acibenzolar-S-methy showed the lowest AUPDC values compared to control treatment. The highest poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins values were observed in plant leaflets sprinkled with these products which probably are related to resistance induction. Essential oils did not show difference on AUPDC nor protein induction.

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: José Belasque Júnior / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Franklin Behlau / Resumo: As bactérias pertencentes ao gênero Xanthomonas constituem um dos grupos de fitopatógenos mais importantes na natureza, com capacidade de infectar aproximadamente 120 tipos diferentes de plantas monocotiledôneas e 270 dicotiledôneas. A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) é o agente causal do cancro cítrico, uma das principais doenças dos citros. Restrita à Flórida, a mancha bacteriana dos citros, causada por Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis (Xacm), afeta principalmente o citrumelo 'Swingle'. A bactéria Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii (Xfa) é o agente causal das cancroses B e C, encontradas apenas na América do Sul. As técnicas mais utilizadas na diferenciação e caracterização dos patógenos bacterianos, hibridização DNA-DNA (DDH) e sequenciamento da região do DNA que codifica o RNA ribossomal 16S (rRNA 16S), são onerosas, trabalhosas, lentas e de resultados restritos, não permitindo a comparação dos resultados obtidos entre diferentes estudos laboratoriais. Por isso, a técnica de análise de sequências multilocus (MLSA), considerada rápida, barata e confiável, tem sido recomendada para a caracterização e delimitação de espécies de patógenos bacterianos, tais como as do gênero Xanthomonas, permitindo o estabelecimento das relações filogenéticas por meio de genes housekeeping. Portanto, o objetivo do trabalho foi caracterizar os isolados de Xanthomonas (Xcc-A, Xfa-B, Xfa-C e Xacm) por meio da técnica MLSA. Foram utilizados 27 isolados de Xanthomonas patogênicas a citros, sendo quatro de X. citri subsp. citri (Xcc), três de X. fuscans subsp. aurantifolli B (Xfa-B), dezenove de X. fuscans subsp. aurantifolli C (Xfa-C) e um de X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xacm). Os genes atpD, dnaK e fusA foram utilizados como genes housekeeping e para a reação da PCR... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bacteria belonging to the genus Xanthomonas are one of the main groups of phytopathogens in nature, capable to infecting about 120 different monocots and 270 dicots plants. Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) is the causal agent of bacterial citrus canker, one of the major diseases of citrus. Restricted to Florida, citrus bacterial spot, caused by Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis (Xacm), affects mainly citrumelo 'Swingle'. Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii (Xfa) is the causal agent of canker B and C, found only in South America. The most widely used techniques for the differentiation and characterization of bacterial pathogens, DNA-DNA hybridization (DDH) and analysis of DNA sequences coding for small subunit ribosomal RNAs (16S rRNA), are costly, cumbersome, slow and give limited results, do not allowing the interlaboratorial comparisons of the results. Therefore, the technique of multilocus sequence analysis (MLSA), which is considered fast, cheap and reliable, has been recommended for characterization and delineation of species of bacterial pathogens, such as the genus Xanthomonas, allowing the establishment of phylogenetic relationships between them through housekeeping genes. Therefore, the objective of this study was to characterize strains of Xanthomonas (Xcc-A, Xfa-B, Xfa-C and Xacm) using the MLSA technique. We used 27 strains of Xanthomonas pathogenic to citrus, being four Xcc, three Xfa-B, 19 Xfa- C and one Xacm. The PCR reaction was performed using the specific primers to amplify the atpD, dnaK and fusA genes. PCR products were purified, sequenced and the sequences were analyzed using the software CodenCode Aligner version 3.7.1. Phylogenetic analysis was performed using Maximum Likelihood based on the model of Tamura-Nei and using the software MEGA 5. Analyses ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Valmir Luiz de Souza / Banca: João Pereira Torres / Banca: Rafael Moreira Soares / Resumo: O crestamento bacteriano comum do feijoeiro (CBCF), incitado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, é responsável por expressivos danos na cultura e por reduções no rendimento e qualidade dos grãos. A preocupação com o meio ambiente e o uso indiscriminado de agrotóxicos tem impulsionado a pesquisa para a busca de métodos alternativos ao controle de patógenos em plantas. Os indutores de resistência têm se mostrado eficientes e promissores no controle de diversos patógenos de culturas. O presente trabalho teve como objetivos verificar o potencial de tinturas etanólicas de Lippia alba (erva cidreira), Lippia sidoides (alecrim pimenta), Mikania glomerata (guaco), Equisetum sp. (cavalinha) e Hedera helix (hera), óleos essenciais de Rosmarinus officinalis (alecrim) e Cinnamomum zeylanicum (canela) e de piraclostrobina e acibenzolar-S-metil no controle do crestamento bacteriano comum em feijão vagem cultivar Bragança. Esses produtos foram utilizados nos seguintes ensaios: atividade antimicrobiana in vitro (exceção ao acibenzolar-S-metil), atividade in vivo em plantas cultivadas sob condições de casa de vegetação, tratadas com os produtos e calculada a área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD); atividade de polifenoloxidases, peroxidases e proteínas solúveis totais em folhas tratadas e não tratadas de feijão vagem, inoculadas e não inoculadas, coletadas em diferentes épocas (0, 3, 5, 8 e 10 dias após pulverização das tinturas etanólicas, óleos essenciais, acibenzolar-S-metil e pyraclostrobin). Os resultados obtidos demonstraram que as tinturas de L. alba e L. sidoides e os óleos essenciais apresentaram atividade in vitro aos isolados de X. axonopodis pv. phaseoli, enquanto que piraclostrobina não apresentou ação in vitro sobre a bactéria. A tintura etanólica de L. alba, pyraclostrobin e acibenzolar-S-metil apresentaram menores valores da AACPD, ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Common bacterial blight of snap bean (CBCSB), caused by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli responsible for expressive culture damage and reduction of seeds production and quality. The environmental impact of the indiscriminate use of pesticides has lead to search alternative methods of plant pathogens control. Resistance inducers have been efficiently successful on several plant pathogens control. Thus, this study aimed to evaluate the potential of alcohol extracts of Lippia alba (Melissa), Lippia sidoides (pepper-rosmarin), Mikania glomerata (guaco), Equisetum sp. (horsetail) and Hedera helix (English Ivy), essential oils of Rosmarinus officinalis (rosemary) and Cinnamomum zeylanicum (cinnamon) and, pyraclostrobin and acibenzolar-S-metil on the control of common bacterial blight in snap beans, Bragança cultivar. These products were used in the following assays: in vitro bactericidal activity (except for acibenzolar-S-metil), in vivo activity of greenhouse-cultivated plants treated with products and the area under the disease progress curve (AUPDC) was calculated; activity of poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins in treated anduntreated bean leaves, infected and non-infected leave collected in different stages (0, 3, 5, 8 and 10 days after sprinkling with alcohol extracts, essential oils, acibenzolar-S-metil and pyraclostrobin). Results showed in vitro activity against X. axonopodis pv. phaseoli for L. alba and L. sidoides extracts, and essential oils while pyraclostrobin did not show any in vitro activity effect. L. Alba alcohol extract, pyraclostrobin and acibenzolar-S-methy showed the lowest AUPDC values compared to control treatment. The highest poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins values were observed in plant leaflets sprinkled with these products which probably are related to resistance induction. Essential oils did not show difference on AUPDC nor protein induction. / Doutor