Für Patienten mit fortgeschrittener Herzinsuffizienz ist die Herztransplantation die einzige kurative Therapieoption. Die akute Abstoßungsreaktion ist ein entscheidender Faktor der Mortalität nach Transplantation. Zur Früherkennung einer Abstoßungsreaktion gilt nach wie vor die Endomyokardbiopsie als Goldstandard. Diese stellt jedoch ein invasives Verfahren mit seltenen, aber potentiell schwerwiegenden Komplikationen dar. In der vorliegenden Studie wurde die diagnostische Wertigkeit der kardialen Magnetresonanztomographie zur Detektion der Abstoßungsreaktion nach Herztransplantation untersucht. Als Referenz diente die Myokardbiopsie mit histologischer Beurteilung nach dem Schema der International Society of Heart and Lung Transplantation (ISHLT). Insbesondere bei Kombination mehrerer Parameter konnte ein hoher negativ prädiktiver Wert zum Ausschluss einer akuten Abstoßungsreaktion erzielt werden. Dagegen waren Spezifität und positiv prädiktiver Wert zu gering, um eine Therapie-Änderung alleine auf Basis eines positiven MRT-Befundes zu rechtfertigen.:1 Titelblatt 1 2 Bibliographische Beschreibung 4 3 Einführung 5 3.1 Hintergrund zur Herztransplantation 5 3.1.1 Indikation und Epidemiologie 5 3.1.2 Abstoßungsreaktion und Immunsuppression 6 3.1.3 Statistiken zu Abstoßung und Immunsuppression 8 3.1.4 Verfahren und Probleme der Endomyokardbiopsie 10 3.2 Bisherige Ansätze zum nicht-invasiven Screening 12 3.2.1 Echokardiographie 12 3.2.2 Elektrokardiogramm 14 3.2.3 Biomarker im peripheren Blut 14 3.2.4 Kardiale Magnetresonanztomographie 16 3.3 Rationale und Fragestellungen zur vorliegenden Studie 19 4 Publikationsmanuskript 21 5 Zusammenfassung der Arbeit 33 6 Anlagen 39

Auf Basis der vorgestellten Untersuchungen lässt sich ein großes Potenzial der OCT für die Erkennung initialer Kariesstadien sowie für die Darstellung der dentalen Mikrostruktur ableiten. Die eingeführte Depolarisationsbildgebung stellt dabei eine Erweiterung bisheriger OCT-basierter Ansätze dar und wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmalig für die Anwendung am Zahn präsentiert. Darüber hinaus bilden die Ergebnisse der Untersuchungen die Grundlage für die Entwicklung weiterer Prototypen für die intraorale OCT-Bildgebung, die zukünftig eine vielversprechende Ergänzung zu klinisch etablierten Verfahren bei der Diagnostik der Approximalbereiche und Okklusalflächen darstellen könnte.

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Introduction Since its development by Al Wolf and colleagues in the 1970s1, [11C]cyanide has been a useful synthon for a wide variety of reactions, most notably those producing [1-11C]-labeled amino acids2. However, despite its position as rote gas-phase product, the catalytic synthesis is difficult to optimize and often only perfunctorily dis-cussed in the radiochemical literature. Recently, [11C]CN– has been used in the synthesis of indole-3-[1-11C]acetic acid ([11C]IAA), the principal phytohormone responsible for a wide variety of growth and development functions in plants3. The University of Wisconsin has expertise in cyclotron production and radiochemistry of 11C and previous experience in the PET imaging of plants4,5. In this abstract, we present work on optimizing [11C]CN– production for the synthesis of [11C]IAA and the PET imaging of auxin transport in living plants. Material and Methods [11C]CH4 was produced by irradiating 270 psi of 90% N2, 10% H2 with 30 µA of 16.1 MeV protons from a GE PETtrace cyclotron. After irradiation, the [11C]CH4 was converted to [11C]CN– by passing through a quartz tube containing 3.0 g of Pt wire and powder between quartz wool frits inside a 800–1000 ˚C Carbolite tube furnace. The constituents and flow rate of the [11C]CH4 carrier gas were varied in an effort to optimize the oven\'s catalytic production of [11C]CN– from CH4 and NH3. The following conditions were investigated: i. Directly flowing irradiated target gas versus trapping, purging and releasing [11C]CH4 from a −178 ˚C HayeSep D column in He through the Pt furnace. ii. Varying the amount of anhydrous NH3 (99.995%) mixed with the [11C]CH4 carrier gas prior to the Pt furnace. Amounts varied from zero to 35 % of gas flow. iii. Varying the purity of the added NH3 gas with the addition of a hydride gas purifier (Entegris model 35KF), reducing O2 and H2O impurities to < 12 ppb. iv. Varying the flow rate of He gas carrying trapped, purged and released [11C]CH4. After flowing through the Pt furnace, the gas stream was bubbled through 300 µL of DMSO containing IAA precursor gramine (1 mg), then passed through a 60×5 cm column containing ascarite to absorb [11C]CO2, followed by a −178˚C Porapak Q column to trap [11C]CH4 and [11C]CO. After bubbling, the DMSO/gramine vial was heated to 140 ˚C to react the gramine with [11C]CN–, forming the intermediate indole-3-[1-11C]acetonitrile ([11C]IAN), which was subsequently purified by solid phase extraction (SPE). The reaction mixture was diluted into 20 mL water and loaded onto a Waters Sep-Pak light C18 cartridge, followed by rinsing with 5 mL of 0.1% HCl : acetonitrile (99 : 1) and 10 mL of the same mixture in ratio 95 : 5, and finally eluted with 0.5 mL of diethyl ether. The ether was subsequently evaporated under argon flow, followed by the hydrolysis of [11C]IAN to [11C]IAA with the addition of 300 µL 1 M NaOH and heating to 140 ˚C for 5 minutes. After hydrolysis, the solution was neutralized with 300 µL 1 M HCl and purified using preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) using a Phenomenex Luna C18 (10μ, 250×10mm) column with a mobile phase acetonitrile : 0.1% formic acid in H2O (35 : 65) at flow rate of 3 mL/min. The [11C]IAA peak, eluting at 12 minutes, was collected and rotary evaporated to dryness, then again after the addition of 5 mL acetonitrile, followed by its reconstitution in 50 µL of water. Analytical HPLC was performed on the [11C]IAA before and after this evaporation procedure using a Phenomenex Kinetex C18 (2.6μ, 75× 4.6 mm) column with a linear gradient elution over 20 minutes of 10 : 90–30 : 70 (acetonitrile : 0.1% formic acid) at a 1 mL/min flow rate, eluting at 7.6 minutes. The transport of [11C]IAA was monitored following administration through the severed petiole of rapid cycling Brassica oleracea (rcBo) using a Siemens microPET P4 scanner. Transport was compared following administration to the first true leaf versus the final fully formed leaf in plants with and without exposure to the polar auxin transport inhibitor naphthylphthalamic acid (NPA). Results and Conclusion Optimization of the [11C]CN– gas phase chemistry was performed using two key metrics for measuring conversion yield. First is the fraction of total produced radioactivity that trapped in the DMSO/gramine solution (denoted %DMSO), and second, the fraction of DMSO/gramine-trapped activity that was able to react with gramine to form [11C]IAN (denoted %CN–). Under certain conditions, the former of these metrics experienced significant losses due to unconverted [11C]CH4 or through combustion, forming [11C]CO2 or [11C]CO. The latter metric experienced losses due to production of incomplete oxidation products of the CH4-NH3 reaction, such as methylamine. Total [11C]CH4 to [11C]CN– con-version yields is reported by the product of the two metrics. It was initially hypothesized that the irradiation of a 90% N2, 10% H2 target gas would produce sufficient in-target-hot-atom-produced NH3 to convert [11C]CH4 to [11C]CN– in the Pt furnace. However, conversion yields were found to be low and highly variable, with 13 ± 8 % trapping in DMSO/gramine, 9 ± 9 % of which reacted as CN– (n = 15). While in disagreement with previous reports1, this is likely as a result the batch irradiation conditions resulting ammonia losses in the target chamber and along the tubing walls. Yields and reproducibility were improved when combining the target gas with a stream of anhydrous NH3 gas flow with conversion yields reported in TABLE 1. However, these yields remained undesirably low, potentially as a result of the 10% H2 carrier gas having an adverse effect on the oxidative conversion of [11C]CH4 to [11C]CN–. To remedy this, the irradiated target gas was trapped, purged, released in He and combined with NH3 gas before flowing through the Pt furnace. Initial experiments using 99.995% anhydrous NH3 gas resulted in very poor (< 0.1%) [11C]CN– yields as a result of nearly quantitative combustion forming [11C]CO2. Installation of a hydride gas purifier to reduce O2 and H2O impurities in NH3 improved yields for CH4 in He, but did not significantly affect those from [11C]CH4 in N2/H2 target gas. In disagreement with previous reports2, conversion yields were found to be highly sensitive to overall carrier gas flow rate, with lower flow rates giving the best yields, as shown in TABLE 1. Optimization experiments are continuing. The total decay-corrected yield for the 1 hour synthesis of [11C]IAA in 50 µL of water is 2.3 ± 0.7 %, based on the total produced [11C]CH4 with a specific activity ranging from 1–100 GBq/µmol. The principal radiochemical impurity was determined to be indole-3-carboxylic acid. The SPE procedure isolating the [11C]IAN intermediate product was optimized to minimize this impurity in the final sample. After a rapid distribution of the administered [11C]IAA through the cut petiole and throughout the rcBO plant, upward vascular transport of auxin and downward polar auxin transport was visualized through time-activity curves (TACs) of regions of interest along the shoot. Comparison of these TACS with and without exposure to NPA yields insight into the fundamental physiological process of polar auxin transport in plants. In conclusion, the Pt-catalyzed oxidative conversion of [11C]CH4 and NH3 to [11C]CN– is a challenging process to optimize and highly sensitive to carrier gas composition and flow rate. Optimization for our experimental conditions yielded several results which disagreed with previous reports. [11C]IAA produced using [11C]CN– is well suited for PET imaging of polar auxin transport in living plants.

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The heart and its mechanical components, especially the heart valves and leaflets, are under enormous strain during lifetime. Like all highly stressed materials, also these biological components undergo fatigue and signs of wear, which impinge upon cardiac output and in the end on health and living comfort of affected patients. Thereby pathophysiological changes of the aortic valve leading to calcific aortic valve stenosis (AVS) as most frequent heart valve disease in humans are of particular interest. The knowledge about changes of the dynamic behavior during the course of this disease and the possibility of early stage diagnosis could lead to the development of new treatment strategies and drug-based options of prevention or therapy. ApoE-/- mice as established model of AVS versus wildtype mice were introduced in an ex vivo artificially stimulated heart model. 4D optical coherence tomography (OCT) in combination with high-speed video microscopy were applied to characterize dynamic behavior of the murine aortic valve and to characterize dynamic properties during artificial stimulation. OCT and high-speed video microscopy with high spatial and temporal resolution represent promising tools for the investigation of dynamic behavior and their changes in calcific aortic stenosis disease models in mice.

Der Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1) wird von verschiedenen Tumorentitäten überexprimiert und hemmt durch die Bindung an das auf T-Zellen vorkommende Programmed Cell Death Protein (PD-1) die Immunantwort. Immuncheckpoint-Inhibitoren sind in der Lage, diese Blockade aufzubrechen und die Immunantwort zu reaktivieren. Auf eine solche Monotherapie sprechen aber nur etwa 30 % der Patienten an, sodass klinischer Bedarf an nichtinvasiven, bildgebenden Diagnosemethoden besteht. Eine Möglichkeit stellen Radioliganden für die nichtinvasive Bildgebung mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT) dar, welche einen Therapieerfolg prognostizieren könnten. Die vorliegende Dissertationsschrift beschäftigt sich mit der Entwicklung und Synthese einer neuen Klasse von PD-L1-adressierenden Radioliganden sowie deren biologischer Evaluierung in Zellen (in vitro) und in Kleintieren (in vivo). Nach der Identifikation von drei hochaffinen PD-L1-Inhibitoren in der Patentliteratur, wurden zunächst diese als Referenzverbindungen in einer neuen, konvergenten Synthesestrategie dargestellt. Diese ermöglichte nicht nur eine höhere Gesamtausbeute der Substanzen, sondern erlaubte auch dank des modularen Aufbaus den einfachen Zugang zu einer großen Substanzbibliothek an PD-L1-Radioliganden. Mithilfe einer Kokristallstruktur aus PD-L1 und einem Inhibitor wurden Modifikationen des Inhibitors für eine Transformation in einen Radioliganden geplant. Zur Erhöhung der Hydrophilie der Substanzen wurden löslichkeitsvermittelnde Gruppen (Sulfon-/Phosphonsäuren) in dem Molekülteil eingeführt, welcher in der „Solvent-Exposed-Region“ des Proteins lokalisiert ist. Funktionalisierung des Bindungsmotivs mit einem Alkin erlaubte die Einführung eines Linker-Chelator-Konstruktes mittels kupferkatalysierter Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) zur Komplexierung des Radiometalls. In der ersten Generation an PD-L1-Radioliganden wurden zwei Bindungsmotive und drei verschiedenen Linker erprobt, sodass nach Konjugation mit dem DOTA-Chelator sechs PD-L1-Radioliganden zur Verfügung standen. Nach erfolgreicher Radiomarkierung mit 64Cu, 68Ga und 177Lu erfolgten mit den 64Cu-markierten Radioliganden Bindungsaffinitätsbestimmungen in einem Sättigungsbindungsassay (Zugabe von 2,5 % BSA im Medium) an transduzierten PC3 PD-L1-Zellen. Dabei erwies sich [64Cu]Cu-62 mit Dimethylbiphenyl als Bindungsmotiv und Piperazinpropyl als Linker mit einem KD-Wert von 60 nM als der vielversprechendste Radiotracer, sodass dieses Bindungsmotiv als Grundlage für die folgenden Radioliganden dienen sollte. Nach bestätigter In-vitro-Stabilität der Radioliganden in verschiedenen Medien (PBS, Humanserum, gegenüber Lebermikrosomen), wurden für alle sechs Verbindungen aus der ersten Generation µPET-Aufnahmen in tumortragenden Mäusen durchgeführt. Die Aufnahmen zeigten eine geringe Akkumulation im PD-L1-positiven Tumor, eine hepatobiliäre Ausscheidung trotz niedriger log D7,4-Werten von –2,73 bis –3,50 und für kleine Moleküle ungewöhnlich lange Zirkulationszeiten. Diese konnten mit Gelelektrophorese und Größenausschlusschromatographie auf eine ausgeprägte Albuminbindung der Radioliganden zurückgeführt werden. In Echtzeit-Radioliganden-Bindungsversuchen mittels LigandTracer® konnten für die meisten Radioliganden einstellige, nanomolare KD-Werte erzielt werden. In Abwesenheit von Albumin zeigen diese Bindungsaffinitäten mit hoher Wahrscheinlichkeit die reine Bindung an PD-L1. Um die Tumoraufnahme zu erhöhen, wurden für die PD-L1-Radioliganden der zweiten Generation die funktionelle Gruppe am Pyridinring und das Halogen am zentralen Aromaten ausgetauscht. Trotz höherer KD-Werte in Sättigungsbindungsversuchen zeigten die µPET-Aufnahmen eine erhöhte Tumoraufnahme für das Brom- ([64Cu]Cu-115) und Iodderivat ([64Cu]Cu-116), vermutlich aufgrund höherer Bmax-Werte. Um eine Transchelatierung zu vermeiden, wurde für die PD-L1-Radioliganden der dritten Generation DOTA gegen NODA-GA als Chelator ausgetauscht. Außerdem wurde auf eine Verbesserung des pharmakokinetischen Profils abgezielt: Mittels Einführung von weiteren Sulfonsäuren und deren partiellen Austausch durch Phosphonsäuren sollte zum einen die Albuminbindung verringert und zum anderen die renale Ausscheidung begünstigt werden. Die sechs Radioliganden mit bis zu vier Sulfon-/Phosphonsäuren zeigten, abhängig von der Art und Anzahl der löslichkeitsvermittelnden Gruppe, stark unterschiedliche pharmakokinetische Profile. Dabei überzeugte der Radioligand [64Cu]Cu-148 mit einem KD-Wert von 94 nM im Sättigungsbindungsversuch und einem log D7,4-Wert von –3,80 insbesondere in der µPET-Bildgebung: Größtenteils renale Ausscheidung, moderate Tumoraufnahme (SUVmax = 3,5) und ausgeprägtes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zum PD-L1-negativen Tumor. Die vierte Generation sollte das wünschenswerte pharmakokinetische Profil des Radioliganden [64Cu]Cu-148 mit den höheren Bmax-Werten der Radioliganden der zweiten Generation kombinieren. Die µPET-Aufnahmen zeigten für alle vier synthetisierten Radioliganden sehr geringe Tumoraufnahmen, dafür ein unerwartetes pharmakokinetisches Profil mit hoher Leberaufnahme – trotz niedriger log D7,4-Werte – und eine Akkumulation in Knochen/Knochenmark und Gelenken. Es wird vermutet, dass es trotz des räumlichen Abstandes der beiden Phosphonsäuren zu einer Ca2+-vermittelten Knochenanreicherung und/oder einer Bindung an anderen biologischen Strukturen wie Makrophagen kommt. Dank des modularen Aufbaus und der Einführung einer Alkin-Funktionalität wird über 18F-prosthetische Gruppen ein einfacher Zugang zu 18F-Radioliganden mittels CuAACReaktionen eröffnet, für welche bereits 19F-Referenzverbindungen und Markierungsvorläufer synthetisiert wurden. Nach weiteren Optimierungen des pharmakokinetischen Profils und damit kürzeren Zirkulationszeiten soll dies zukünftig den Zugang zu vielversprechenden 18F-Radiotracern ohne Chelator-Linker-Einheit ermöglichen.

Die Diagnostik von Kardiovaskulären Erkrankungen erfolgt vorwiegend mit unspezifischen Methoden, die keine molekularen Informationen über das Gefäß liefern. Die molekulare Bildgebung könnte eine präzisere Diagnose ermöglichen. Ein geeigneter Biomarker für die molekulare Diagnostik von Erkrankungen der Aorta ist das Proteoglycan-spaltende Enzym ADAMTS4 (A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs), welches von Zellen im erkrankten Gewebe von Aorten überexprimiert wird. Insbesondere für die Magnetresonanztomographie (MRT) haben sich Peptide als geeignete Binder für die molekulare Bildgebung erwiesen. In dieser Arbeit wurde eine bestehende Screening-Methode, durch cyclische, hexamere Peptide einer One-Bead-One-Compound (OBOC)-Bibliothek erweitert. Die Cyclisierung erfolgte über eine Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinen. Ein Abbruchsequenzspektrum ermöglichte die Sequenzierung mittels Matrix-unterstützter Laser Desorption/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-ToF-MS). In einem Screening gegen ADAMTS4 konnten cyclische Peptide gefunden werden und mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) charakterisiert. Die Sequenz C*-S-A-A-G-C* zeigte jeweils die selektivste und stärkste Bindung gegen ADAMTS4. In einer Bindungsstudie mit Microscale Thermophoresis (MST)-Spektroskopie zeigte das Peptid eine für die molekulare MR-Bildgebung vorteilhafte, selektive Affinität von (50 ± 20) nM gegenüber ADAMTS4. Die Peptidsequenz wurde mit einem Spacer und einem MRT-aktiven Gadolinium(III)-DOTA-Komplex gekoppelt und zeigte in vitro keine Toxizität. Die Sonde wurde in vivo in einem abdominalen Aortenaneurysma-Modell untersucht. Der Anstieg des Kontrast-zu-Rausch-Verhältnisses (CNR, Contrast-to-Noise Ratio) ermöglichte die Unterscheidung zwischen erkrankten und nicht erkrankten Tieren. Zusätzlich konnte bereits in einem frühen Stadium das Rupturrisiko abgeschätzt und eine tödliche Aorten-Ruptur vorhergesagt werden. / Currently, the diagnosis of cardiovascular diseases is performed with unspecific methods, which do not provide any molecular information about the condition of the vessel wall. Molecular imaging could fill the gap and offer a more precise diagnosis. The proteoglycan-cleaving enzyme ADAMTS4 (A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs) could be used as a biomarker for molecular imaging of aneurysm and atherosclerosis, since it is highly upregulated in the unstable course of cardiovascular diseases. Especially for magnetic resonance imaging (MRI), peptide probes have been proven to be suitable for contrast increase of vessel diseases. In this work, a screening technique was optimized and upgraded for the use of cyclic, hexameric One-Bead-One-Compound (OBOC)-libraries. The cyclisation was performed via a disulfide bridge between two cysteines. A ladder sequence was used for sequencing by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Flight-Mass Spectrometry (MALDI-ToF-MS). In a high throughput screening against ADAMTS4 several peptides were found and classified by their interaction against ADAMTS4 with Surface Plasmon Resonance (SPR). The peptide with the sequence C*-S-R-R-G-C* showed not only the highest selectivity against ADAMTS4 in the screening, but also the strongest interaction in the SPR. In a binding assay by Microscale Thermophoresis (MST), the peptide had a favorable and selective affinity against ADAMTS4 of (50 ± 20) nM. The peptide was extended by a short peptide spacer and a magnetic resonance (MR) active gadolinium(III)-DOTA complex and showed no in vitro toxicity at all. Finally, the probe was tested in an abdominal aortic aneurysm mouse model. Here, the probe enabled the differentiation between diseased animals and the sham group. By the increase of the Contrast-to-Noise Ratio (CNR), the diseases could be visualized. Additionally, an early prediction of the disease development, course, and mortality could be performed.

Background Caseous mitral annular calcification (CMAC) is a rare liquefactive variant of mitral annular calcification (MAC) and superficially mimics a cardiac vegetation or abscess. CMAC is viewed as a benign condition of MAC, while MAC has clinical implications for patients’ lives. Correctly diagnosing CMAC is essential in order to avoid unnecessary interventions, cardiac surgery or even psychological suffering for the patient. Case presentation We report on 6 patients with suspected intra-cardiac masses of the mitral annulus that were referred to our institution for further clarification. A definitive diagnosis of CMAC was achieved by combining echocardiography (Echo), cardiac magnetic resonance imaging (MRI) and cardiac computed tomography (CT) for these patients. Echo assessed the mass itself and possible interactions with the mitral valve. MRI was useful in differentiating the tissue from other benign or malign neoplasms. CT revealed the typical structure of CMAC with a “soft” liquefied centre and an outer capsule with calcification. Conclusion CMAC is a rare condition, and most clinicians and even radiologists are not familiar with it. CMAC can be mistaken for an intra-cardiac tumour, thombus, vegetation, or abscess. Non-invasive multimodality imaging (i.e. Echo, MRI, and CT) helps to establish a definitive diagnosis of CMAC and avoid unnecessary interventions especially in uncertain cases.

Quantitative phase imaging (QPI) is a label-free technique providing both morphology and quantitative biophysical information in biomedicine. However, applying such a powerful technique to in vivo pathological diagnosis remains challenging. Multi-core fiber bundles (MCFs) enable ultra-thin probes for in vivo imaging, but current MCF imaging techniques are limited to amplitude imaging modalities. We demonstrate a computational lensless microendoscope that uses an ultra-thin bare MCF to perform quantitative phase imaging with microscale lateral resolution and nanoscale axial sensitivity of the optical path length. The incident complex light field at the measurement side is precisely reconstructed from the far-field speckle pattern at the detection side, enabling digital refocusing in a multi-layer sample without any mechanical movement. The accuracy of the quantitative phase reconstruction is validated by imaging the phase target and hydrogel beads through the MCF. With the proposed imaging modality, three-dimensional imaging of human cancer cells is achieved through the ultra-thin fiber endoscope, promising widespread clinical applications.