Contexte et objectifs : L'encéphalopathie hépatique (EH) est un trouble neuropsychiatrique, une complication majeure de la maladie hépatique chronique (MHC). L'EH se manifeste par un large éventail de symptômes, allant d'un léger manque d'attention et de troubles de la mémoire à une léthargie sévère et un coma. L'hyperammoniémie est centrale dans la pathogenèse de l'EH puisque l'ammoniac est neurotoxique et que l'ammoniac dérivé du sang traverse facilement la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cependant, d'autres facteurs pathogènes sont également impliqués dans l'EH, notamment le stress oxydatif. Au cours de la MHC, le muscle joue un rôle compensatoire essentiel dans l'élimination de l'ammoniac par l'action de l'enzyme glutamine synthétase (GS), qui transforme le glutamate en glutamine. Étant donné que les cellules endothéliales de la BHE sont l'interface entre le sang et le cerveau, il est plausible qu'elles métabolisent l'ammoniac pour protéger le cerveau de la neurotoxicité induite par l'ammoniac. Cependant, cela n'a jamais fait l'objet d'études. Les thérapies de réduction de l'ammoniac sont les traitements courants de l'EH. Cependant, les réponses des patients aux traitements sont hétérogènes, et les différences de sexe pourraient en être la cause. Par conséquent, nos objectifs étaient 1) d'explorer le métabolisme de l'ammoniac dans les cellules endothéliales de la BHE par la présence de GS et 2) d'évaluer l'impact du sexe sur la MHC et ses complications, y compris la sarcopénie et l'EH. Méthodes : Pour le premier objectif, nous avons évalué l'expression et l'activité de la protéine GS in vitro et ex vivo chez des rats naïfs. Nous avons également évalué l'impact de l'ornithine, du glutamate et du α-kétoglutarate sur l'activité de la GS dans les cellules endothéliales de la BHE via la génération de glutamine 5-13C marquée. Pour le deuxième objectif, nous avons évalué l'impact du sexe sur le neurophénotype (anxiété, mémoire, coordination motrice et activité) chez des rats ligaturés des voies biliaires (BDL) (et contrôles respectifs) ainsi que sur le développement d'une EH sévère (léthargie/perte du réflexe de redressement). Nous avons également évalué les marqueurs des lésions hépatiques, l'hyperammoniémie, le stress oxydatif systémique, la masse et la fonction musculaire et la clairance de l'ammoniac musculaire. Résultats : Nous avons trouvé l'activité et l'expression de la GS in vivo et ex vivo dans les cellules endothéliales de la BHE. L'analyse au microscope confocal a montré que la GS dans les cellules endothéliales est moins abondante que dans les astrocytes. L'exposition de cellules endothéliales cultivées à des substrats marqués a révélé que l'ornithine est la plus efficace pour générer de la glutamine. Chez les femmes, la chirurgie BDL a provoqué une MHC (augmentation des enzymes hépatiques circulantes et de la bilirubine) et de l'EH (altération de la coordination motrice et de l'activité nocturne) par rapport aux rats contrôles respectifs. De plus, le degré d'hyperammoniémie et la clairance musculaire de l'ammoniac étaient similaires entre les sexes. Contrairement aux mâles, les rats femelles n'ont pas développé de perte musculaire, d'œdème cérébral et de perte de mémoire à court terme. De plus, les femelles présentaient un stress oxydatif plus faible et étaient complètement protégées contre les EH sévères précipitées par l'ammoniac par rapport aux mâles BDL. Conclusions : Nous concluons que la GS est exprimée dans les cellules endothéliales de la BHE, jouant peut-être un rôle dans l'atténuation ou le retard de l'entrée de l'ammoniac dans le cerveau et que la supplémentation en ornithine améliore l'activité de la GS en fournissant du glutamate pour la détoxification de l'ammoniac. De plus, nous concluons que le sexe a un impact sur les complications des maladies du foie, y compris la sarcopénie et l'EH, le stress oxydatif systémique jouant un rôle vital dans la susceptibilité à l'EH sévère induite par l'ammoniac. / Background and aims: Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric disorder and a major complication of chronic liver disease (CLD). HE manifests with a wide range of symptoms, from mild lack of attention and memory impairments to severe lethargy and coma. Hyperammonemia is central in the pathogenesis of HE since ammonia is neurotoxic, and blood-derived ammonia easily crosses the blood-brain barrier (BBB). However, other pathogenic factors are also implicated in HE, including oxidative stress. During CLD, muscle plays an essential compensatory role in removing ammonia by the action of the enzyme glutamine synthetase (GS), which amidates glutamate into glutamine. Since the endothelial cells of the BBB are the interface between the blood and the brain, it is plausible that they metabolize ammonia to protect the brain from ammonia-induced neurotoxicity. However, this has never been investigated. Ammonia lowering therapies are the mainstream treatments for HE. However, patients' response to treatments are heterogeneous, and sex differences might be the cause. Therefore, our aims were 1) To explore ammonia metabolism in BBB’s endothelial cells through the presence of GS and 2) to assess the impact of sex on CLD and its complications, including sarcopenia and HE. Methods: For the first aim, we assessed GS protein expression and activity in vitro and ex vivo in naïve rats. We also evaluated the impact of ornithine, glutamate, and α-ketoglutarate on GS activity in endothelial cells of the BBB via the generation of labeled 5-13C glutamine. For the second aim, we assessed the impact of sex on the neurophenotype (anxiety, memory, motor coordination, and activity) in bile-duct ligated (BDL) rats (and respective SHAMs) as well as on the development of an ammonia-precipitated severe HE (lethargy/loss of righting reflex). We also assessed liver injury markers, hyperammonemia, systemic oxidative stress, muscle mass and function, and muscle ammonia clearance. Results: We found GS activity and expression in vivo and ex vivo in endothelial BBB cells. The confocal microscope analysis showed that GS in endothelial cells is less abundant than astrocytes. Exposing cultured endothelial cells to labeled substrates revealed that ornithine is the most efficient in generating glutamine. In females, BDL surgery caused CLD (increased hepatic enzymes and bilirubin) and HE (impaired motor coordination and night activity) vs. respective SHAMs. Furthermore, the degree of hyperammonemia and muscle ammonia clearance was similar between sexes. Contrary to males, female rats did not develop muscle loss, brain edema, and short-term memory loss. In addition, females had lower oxidative stress and were completely protected against ammonia-precipitated severe HE compared to male BDLs. Conclusions: We conclude that GS is expressed in endothelial cells of the BBB, possibly playing a role in attenuating or delaying ammonia entry into the brain and, ornithine supplementation enhances GS activity by providing glutamate for ammonia detoxification. In addition, we conclude that sex impacts the complications of liver disease, including sarcopenia and HE, with systemic oxidative stress playing a vital role in the susceptibility to ammonia-induced overt HE.

La gélification est un phénomène courant dans lequel une grande quantité de solvant est immobilisée dans un réseau constitué de relativement petites quantités de substrat. Avec des propriétés à la fois solides et liquides, un gel est un état unique. L'étude des propriétés et du mécanisme de la gélification attire l'attention des chercheurs du monde entier. Cependant, de nombreuses questions restent en suspens, telles que le processus d'auto-assemblage et les interactions moléculaires dans le système de gel, la relation entre les solutions, les gels et les cristaux et l'organisation moléculaire dans le réseau de gel. L'exploration de ces questions fournira des connaissances sur le mécanisme de gélification et contribuera à la conception et à la fabrication de nouveaux gels aux applications diverses. Cette thèse décrit notre étude des gels et de leur relation avec les solutions et les cristaux à l'aide de sels biliaires, qui sont des molécules amphiphiles naturelles abondantes. La rigidité de la partie stéroïde et l'hydrophobie variable des sels biliaires facilitent l'étude du processus d'autoassemblage. La recherche est présentée à travers trois articles publiés ou soumis au cours de mon programme de doctorat. Le premier article explore les interactions moléculaires qui se produisent dans la formation d'hydrogels moléculaires fabriqués à partir de mélanges de désoxycholate de sodium et d'acide formique. La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire fournit de nouvelles informations sur la transition gel-sol au niveau moléculaire, l'interaction entre les espèces libres/gélifiées et l'interaction des régions hydrophobes des sels biliaires avec le réseau de gel. Le deuxième article résume notre exploration de la relation entre les gels et les cristaux, en particulier la façon dont les composants moléculaires sont organisés. Les sels d'ammonium d'acide lithocholique produisent différents modèles d'auto-assemblage, tels que des gels, des fibres et des cristaux, avec divers anions d'ammonium. L'organisation moléculaire de l’acide lithocholique dans différentes conditions est remarquablement cohérente, indiquant qu'il existe une relation intime entre la gélification et la cristallisation dans ce système. Les résultats ont également mis en lumière la question de longue date de l'agencement des molécules dans les fibres de gel. Le troisième article décrit notre étude systématique de la gélification et de la cristallisation en utilisant une gamme plus large de sels biliaires. Généralement, avec l'augmentation de iii l'hydrophobie des sels biliaires, la préférence pour la formation de solutions est progressivement remplacée par une tendance à produire des gels et finalement des cristaux. Une association bord à bord d'anions biliaires est également observée dans différents types de sels biliaires. Les résultats renforcent notre conclusion selon laquelle les structures moléculaires internes des fibres dans les gels et dans les cristaux sont étroitement liées. / Gelation is a common phenomenon in which a large amount of solvent is immobilized in a network made up of relatively small amounts of substrate. With properties of both solid and liquid, a gel is a unique state. Gelation draws attention from researchers worldwide to study its properties and mechanism. However, many questions are still unraveled, such as the self-assembly process and molecular interactions in the gel system, the relationship between solutions, gels, and crystals, and the molecular organization in the gel network. Exploring these questions will provide knowledge about the mechanism of gelation and contribute to the design and fabrication of new gels for different applications. This thesis describes our study of gels and their relationship with solutions and crystals using bile salts, which are abundant natural amphiphiles. The rigid steroid moiety and the variable hydrophobicity of the bile salts facilitate the study of the self-assembly process. The research is presented through three articles published or submitted during my Ph.D. program. The first paper probes the molecular interactions that occur in the formation of molecular hydrogels made from mixtures of sodium deoxycholate and formic acid. Nuclear magnetic resonance spectroscopy provides new information about the gel-sol transition on the molecular level, the interaction between free/gelated species, and the interaction of hydrophobic regions of bile salts with the gel network. The second paper summarizes our exploration of the relationship between gels and crystals, especially how the molecular components are organized. Ammonium salts of lithocholic acid produce different patterns of self-assembly, such as gels, fibers, and crystals, with various ammonium anions. The molecular organization of lithocholates under different conditions is remarkably consistent, indicating that there is an intimate relationship between gelation and crystallization in this system. The results also shed light on the long-existing question of how molecules are arranged in gel fibers. The third paper describes our systematic study of gelation and crystallization using a broader range of bile salts. Generally, with increasing hydrophobicity of the bile salts, the preference to form solutions is gradually superseded by a trend to produce gels and finally crystals. An edge-to-edge association of bile anions is also observed in different kinds of bile salts. The results strengthen our conclusion that the internal molecular structures of fibers in gels and in crystals are closely related.

Grâce à de récentes percées scientifiques, certains médiateurs clés dans divers états pathologiques ont été identifiés et de nouveaux composés thérapeutiques ont été développés pour les inhiber. Bien que très efficaces, ces composés possèdent souvent des propriétés physico-chimiques incompatibles avec celles du corps humain et deviennent, donc, difficiles à formuler. Au cours des dernières décennies, les systèmes de vectorisation de médicaments ont été étudiés comme une solution potentielle promettant une augmentation de la concentration du médicament au site d'action tout en atténuant les problèmes de stabilité et de solubilité. Plus particulièrement, les polymères ont démontré un succès en tant que matière première dans la conception de ces formulations. Cependant, un obstacle majeur à leur développement clinique est le faible niveau d’encapsulation du principe actif. Afin de remédier à cette limitation, les travaux présentés dans cette thèse se sont concentrés sur l'utilisation de copolymères blocs en forme d'étoile et à base d'acide cholique pour faciliter l'encapsulation. Divers principes actifs aux propriétés physico-chimiques variables ont été encapsulés dans nos systèmes polymères, témoignant ainsi de leur grande efficacité et ceci à travers une large gamme de médicaments. Dans un premier temps, les propriétés physico-chimiques de notre système ont été étudiées. Les copolymères bloc sont composés d'un noyau d'acide cholique (CA) sur lequel le poly (allyl glycidyl éther) (PAGE) et le poly (éthylène glycol) (PEG) sont polymérisées séquentiellement pour donner lieu au CA-(PAGE-b-PEG)4 amphiphiles à quatre branches. De plus, le bloc PAGE a été fonctionnalisé pour porter des groupements amines primaires. Les effets de la longueur du bloc PEG et des groupements amines sur le comportement thermosensible des polymères dans l'eau ont été examinés. Cette thermosensibilité a aussi été étudiée en présence de diverses concentrations de sels. Il a été découvert que l'augmentation de la longueur du PEG augmente la température du point de trouble. De même, la fonctionnalisation des blocs PAGE pour porter des groupements amines a augmenté le point de trouble en l'absence de sel, mais a significativement diminué en présence de sel. Cette observation a été attribuée au « salting-out » des polymères. Dans un second temps, employée comme un médicament hydrophobe modèle, la doxorubicine (Dox) a été encapsulée à l’aide de nos copolymères blocs CA-(PAGE-b-PEG)4. Dans ce cas, les interactions polymère-médicament régissant l’encapsulation de la Dox ont été étudiées. Plus précisément, les interactions hydrophobes et électrostatiques ont été comparées pour leur influence sur la charge de médicament à l'intérieur des copolymères blocs. Une charge élevée de Dox a été obtenue à l’aide des interactions électrostatiques par rapport aux interactions hydrophobes avec ou sans la présence d'acide oléique comme co-tensioactif. De plus, les interactions électrostatiques conféraient au système de relargage une réactivité au pH permettant ainsi un relargage de la Dox en présence d’un pH acide. Les copolymères blocs ont présenté une bonne biocompatibilité lors d’essai in vitro. Les nouveaux copolymères blocs en étoile et à base d'acide cholique ont montré un grand potentiel en tant que vecteurs de relargage de médicaments pour l’encapsulation de la Dox. Pour démontrer l’étendue de l’application de notre système, des petits acides ribonucléiques interférant (pARNi) ont été encapsulés à l’aide des copolymères blocs CA-(PAGE-b-PEG)4 où le PAGE a été fonctionnalisé pour porter des groupements amines. Les pARNi sont des composés thérapeutiques hydrophiles chargés négativement et nécessitant une méthodologie d’encapsulation différente de celle utilisée pour la Dox. Les groupements allyles du bloc PAGE ont été fonctionnalisés pour porter des amines primaires ou tertiaires. Également, l'acide folique a été greffé sur l'extrémité de la chaîne PEG pour augmenter l'absorption cellulaire. Les (CA-PAGE-b-PEG)4 fonctionnalisés avec des amines primaires ou tertiaires ont présenté une forte complexation des pARNi. Des agrégats micellaires uniformes ont ainsi été obtenus. De plus, des lipides ont été ajoutés comme co-tensioactifs pour aider à stabiliser les nanoparticules dans les milieux de culture cellulaire. Ces systèmes micellaires mixtes avaient une charge élevée de pARNi et une absorption cellulaire améliorée avec une augmentation concomitante de la transfection des pARNi dans des cellules modèles de HeLa et HeLa-GFP, respectivement. Les résultats présentés dans cette thèse témoignent du grand potentiel de l'utilisation de copolymères blocs en forme d'étoile et à base d'acide cholique dans la conception de systèmes de vectorisation de médicaments. Ces résultats offrent des conclusions pertinentes sur les différents paramètres clés contrôlant l’efficacité des systèmes de vectorisation des médicaments à base de polymères pouvant être traduits dans d'autres systèmes. Les stratégies développées ici aideront grandement au développement des systèmes de vectorisation de médicaments et accéléreront potentiellement leur évolution vers la clinique. / Recent scientific breakthroughs have fostered the identification of key mediators of various diseased states while permitting the development of novel therapeutic compounds to address them. Although very potent, these compounds often possess physico-chemical properties that are incompatible with those of the human body and are becoming increasingly difficult to formulate. In the recent decades, drug delivery systems have been studied as a potential solution in the formulation of these therapeutic compounds promising improved accumulation at the site of action while mitigating issues of stability and solubility. Most notably, polymers have shown tremendous success as starting material in the design of these drug formulations. However, one major hurdle curtailing their clinical translatability is their low drug loading levels. In an effort to address this limitation, the work presented in this thesis focused on the use of cholic acid-based star-shaped block copolymers for the encapsulation of active pharmaceutical ingredients with varying physico-chemical properties thereby demonstrating their successful application to a broad range of compounds. First, the physico-chemical properties of our proposed system were studied. The block copolymers are composed of a cholic acid (CA) core onto which poly(allyl glycidyl ether) (PAGE) and poly(ethylene glycol) (PEG) are polymerized sequentially to afford an amphiphilic CA-(PAGE-b-PEG)4 with four branches. The PAGE block was further functionalized to bear pendant amine groups. The effects of PEG length and of the amine groups on the thermoresponsive behavior of the polymers in water at various salt concentrations were examined. It was discovered that increasing the length of PEG increases the cloud point temperature. Similarly, functionalizing the PAGE blocks to bear pendant amine groups increased the cloud point in the absence of salt, but significantly decreased the cloud point in the presence of salt. This observation was attributed to the salting-out of the polymers. Acting as a model hydrophobic drug, doxorubicin (Dox) was first encapsulated using our proposed CA-(PAGE-b-PEG)4 block copolymers. In this case, the polymer-drug interactions driving the loading of Dox was studied. Specifically, hydrophobic and electrostatic interactions were compared for their influence on the drug loading inside the block copolymers. A high loading of Dox was achieved vis electrostatic interactions compared to hydrophobic interactions with or without the presence of oleic acid as a cosurfactant. Also, the electrostatic interactions conferred a pH responsiveness to the system where the Dox remained encapsulated at physiological pH but was released in acidic pH. The block copolymers displayed good biocompatibility in vitro. The new functionalized star block copolymers based on cholic acid showed great potential as drug delivery carriers for the loading of Dox. To demonstrate the widespread application of our proposed system, small interfering RNA (siRNA) was loading using the CA-(PAGE-b-PEG)4 block copolymers where PAGE was functionalized with amine. siRNA is a hydrophilic, negatively charged therapeutic compound necessitating a different loading methodology than that used for Dox. The allyl groups of PAGE were functionalized to bear primary or tertiary amines and folic acid was grafted onto the PEG chain end to increase cell uptake. (CA-PAGE-b-PEG)4 functionalized with either primary or tertiary amines show high siRNA complexation. Uniform micellar aggregates were obtained. Lipids were added as co-surfactants to help stabilize the nanoparticles in the cell culture media. The mixed micelles had high siRNA loading and improved cell uptake with a concomitant increase in siRNA transfection in HeLa and HeLa-GFP model cells, respectively. The results presented in this thesis, demonstrate the feasibility of using cholic acid-based star-shaped block copolymers in the design of drug delivery systems and offers insights into key parameters controlling their efficacy which can be translated to other polymer-based systems. The strategies developed herein will greatly aid in the development of drug delivery systems and potentially accelerate their progress into the clinic.

Contexte: L'encéphalopathie hépatique (EH) est une complication majeure de la maladie hépatique chronique (MHC) caractérisée par des symptômes débilitants, notamment des troubles cognitifs, psychiatriques et moteurs. Il est cru que l’EH, définie comme étant un syndrome métabolique, disparaît après une transplantation hépatique (TH). Cependant, des complications neurologiques persistantes ont été signalées chez jusqu'à 47 % des receveurs de TH. Plusieurs études rétrospectives ont démontré une association entre des antécédents d'épisodes d'EH pré-TH et une mauvaise condition neurologique après la TH. D’autre part, l’alcool est un facteur étiologique fréquent à l’origine de la MHC. Cependant, une consommation excessive d’alcool a également un impact sur le cerveau. À ce jour, l’impact des épisodes d’EH ainsi que de l’alcool sur le développement de l’EH et l’intégrité cérébrale reste indéfini. Par conséquent, nos objectifs étaient 1) d’évaluer l'impact de plusieurs épisodes d’EH (induits par l'ammoniac) et 2) d'évaluer l'effet d'une consommation constante d'alcool sur le déclin neurologique, l'intégrité et les lésions cérébrales chez les rats atteints de MHC induite par la ligature des voies biliaires (LVB). Méthodes: Pour le premier objectif, des rats LVB ont reçu une injection (s.c.) d'acétate d'ammonium (LVB-Ammoniac), précipitant un épisode sévère d'EH réversible (perte du réflexe de redressement) tous les 4 jours à partir de la semaine 3 post-chirurgie LVB ( total ; 4 épisodes). Des rats SHAM ont également reçu une injection d'ammoniaque et des rats témoins BDL/SHAM ont reçu une injection de solution saline. La coordination motrice (rotarod) et la mémoire à court et à long-terme (test de reconnaissance d'objets nouveaux) ont été évaluées une semaine après la dernière injection. Pour évaluer l'intégrité neuronale, une analyse d’immunobuvardage de type Western et d’immunofluorescence a été réalisée dans le cortex frontal, le cervelet et l'hippocampe. Pour le deuxième objectif, des rats LVB ont reçu de l'alcool (LVB-Alcool) deux fois par jour (51 % v/v, dose de 3 g/kg, par gavage) pendant 4 semaines. Les rats SHAM ont également reçu de l'alcool et les rats LVB/SHAM servant de contrôles ont reçu une solution saline. La coordination motrice (rotarod) et le comportement anxieux (champ ouvert et labyrinthe surélevé) ont été évalués une semaine après la dernière administration d'alcool. Des analyses d’immunobuvardage de type Western et d’immunofluorescence ont été effectuées pour étudier l'intégrité neuronale du cortex frontal et du cervelet. Résultats: Chez les LVB-Ammoniac, des niveaux protéiques plus élevés d’un marqueur astrocytaire (GFAP) et apoptotique (caspase-3 et Bax/Bcl2) ont été trouvés dans l'hippocampe, alors que les niveaux de marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311) ont été réduits par rapport à tous les autres groupes expérimentaux. Les rats LVB-Ammoniac ont présenté des niveaux accrus de stress oxydatif plasmatique par rapport aux rats SHAM/BDL respectifs. Une diminution des niveaux de capacité antioxydante totale (CAT) et une augmentation des protéines modifiées par le 4-HNE ont été observées dans l'hippocampe (et non dans le cortex frontal ou le cervelet) du groupe LVB-Ammoniac par rapport aux rats SHAM/BDL respectifs. Les résultats d'immunofluorescence ont révélé la colocalisation du marqueur apoptotique (caspase-3 clivée) avec un marqueur neuronal (NeuN) dans la région CA1 de l'hippocampe des rats LVB-Ammoniac. Chez les rats LVB-alcool, il a été démontré une altération de la coordination motrice aux semaines 2, 3, 4 et 5 ainsi qu'une augmentation du comportement anxieux par rapport aux rats SHAM respectifs. Chez les rats BDL-alcool, il a été démontré une diminution des marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311), une augmentation de l'activité enzymatique apoptotique (caspase-3 clivée), une augmentation des marqueurs de nécroptose (pRIP3 et pMLKL), une diminution de la CAT et une augmentation des protéines modifiées par 4-HNE dans le cervelet par rapport à tous les groupes. Les résultats d'immunofluorescence ont révélé la colocalisation du marqueur apoptotique (caspase-3 clivée) et du marqueur de nécroptose (pMLKL) dans les neurones de la couche granulaire du cervelet de rats LVB-alcool. Conclusion: De multiples épisodes d'EH sévère ont entraîné une perte de cellules neuronales dans l'hippocampe des rats LVB et qui est associée à une augmentation du stress oxydatif, à l'apoptose et à une diminution des cellules neuronales. Des niveaux élevés du marqueur astrocytaire (GFAP) dans l'hippocampe insinuent une gliose, pouvant être le résultat d'une perte neuronale. De plus, l'administration d'alcool aggrave les troubles de la coordination chez les rats LVB et qui ont été associés à une augmentation du stress oxydatif, à une diminution des marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311) avec l’apoptose et la nécroptose dans le cervelet des rats LVB-alcool. Globalement, de multiples épisodes d’EH sévère ainsi qu'une consommation constante d'alcool, via le stress oxydatif, déclenchent une perte/lésion neuronale qui entraînera par conséquent une mauvaise condition neurologique après la TH. / Background: Hepatic encephalopathy (HE) is a major complication of chronic liver disease (CLD) characterized by debilitating symptoms, including cognitive, psychiatric, and motor disturbances. HE, defined as a metabolic syndrome, is believed to resolve following liver transplantation (LT). However, persisting neurological complications have been reported in up to 47% of LT recipients. Several retrospective studies have demonstrated an association between a history of HE episodes pre-LT and poor neurological outcome following LT. Furthermore, alcohol is a common etiological factor which causes CLD. However, excessive alcohol consumption also impacts the brain. To date, the impact of HE episodes as well as of alcohol on the development of HE and brain integrity remains undefined. Therefore, our aims were to 1) evaluate the impact of multiple episodes (induced by ammonia) and 2) evaluate the effect of constant alcohol consumption on neurological decline, brain integrity and injury in rats with CLD induced via bile-duct ligation (BDL). Methods: In the first aim, BDL rats were injected (s.c.) with ammonium acetate (BDLAmmonia), precipitating a reversible overt episode of HE (loss of righting reflex) every 4 days from week 3 post-BDL surgery (total; 4 episodes). SHAM rats were also injected with ammonia and BDL/SHAM rats were injected with saline as controls. To assess the neuronal integrity, western blot and immunofluorescence analysis were performed for frontal cortex, cerebellum, and hippocampus. Motor coordination (rotarod) and short- and long-memory (novel object recognition test) were assessed one week following last injection. In the second aim, BDL rats were administered alcohol (BDL-Alcohol) twice a day (51% v/v, dose of 3g/kg, via gavage) for 4 weeks. SHAM rats also received alcohol and BDL/SHAM rats received saline as controls. Motor coordination (rotarod) and anxiety-like behavior (open field and elevated plus maze) were assessed one week following last alcohol administration. Western blot and immunofluorescence analyses were performed to investigate neuronal integrity in frontal cortex and cerebellum. Results: In BDL-Ammonia, higher protein levels of astrocytic marker (GFAP) and apoptotic markers (caspase-3 and Bax/Bcl2) were found in the hippocampus, whereas neuronal markers (NeuN and SMI311) levels were reduced compared to all other experimental groups. BDLAmmonia rats showed increased levels of plasma oxidative stress compared to respective SHAM/BDL rats. Decreased levels of total antioxidant capacity (TAC) and increased 4-HNE modified proteins were found in the hippocampus (not in frontal cortex or cerebellum) of the BDL-Ammonia group compared to respective SHAM/BDL rats. Immunofluorescence results revealed the colocalization of apoptotic marker (cleaved caspase-3) with neuronal marker (NeuN) in the CA1 region of the hippocampus of BDL-Ammonia rats. BDL-Alcohol rats demonstrated impaired motor coordination at weeks 2, 3, 4, and 5 as well as an increase in anxiety-like behavior compared to respective SHAM rats. BDL-Alcohol rats showed a decrease in neuronal markers (NeuN and SMI311), an increase in apoptotic enzyme activity (cleaved caspase-3), an increase in necroptosis markers (pRIP3 and pMLKL), a decrease in TAC and an increase in 4-HNE modified proteins in the cerebellum compared to all groups. Immunofluorescence results revealed the colocalization of apoptotic marker (cleaved caspase3) and necroptosis marker (pMLKL) in granular layer neurons of the cerebellum of BDLAlcohol rats. Conclusion: Multiple episodes of overt HE led to neuronal cell loss in the hippocampus of BDL rats which was associated with increased oxidative stress, apoptosis and decreased neuronal count. Elevated levels of astrocytic marker (GFAP) in the hippocampus insinuate gliosis, possibly a result of neuronal loss. Moreover, alcohol administration worsens coordination impairments in BDL rats which were associated with increased oxidative stress, decreased neuronal markers (NeuN and SMI311) with apoptosis and necroptosis in the cerebellum of BDL-Alcohol rats. Overall, both multiple episodes of overt HE as well as continuous alcohol consumption, via oxidative stress, triggers neuronal loss/injury which consequently will lead to poor neurological outcome post-LT.

L’œdème cérébral est une complication associée à l’encéphalopathie hépatique (EH) lors d’une insuffisance hépatique chronique (cirrhose du foie). Présentement, l’origine de sa pathogenèse, vasogénique (rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE)) ou cytotoxique (prise anormale d’ions), n’a pas encore été déterminée. Il a été démontré que le co-transporteur Na-K-Cl (NKCC1) du côté luminal des microvaisseaux sanguins cérébraux (CMV) joue un rôle dans le développement de l’œdème cérébral dans des modèles d’ischémie où la bumetanide, un inhibiteur de NKCC, atténue l’œdème cérébral. Deux modèles d’EH ont été utilisés pour cette étude i) la ligature de la voie biliaire (BDL) qui présente l’hyperammoniémie chronique, l’œdème cérébral et le stress oxydatif systémique ; ii) l’anastomose portocave (PCA) qui présente de l’hyperammoniémie chronique seulement. Les buts du projet étaient de: i) définir l’origine du développement de l’œdème chez les rats BDL en étudiant l’extravasation de macromolécules, les jonctions serrées et l’activation des métalloprotéinases matricielles de la BHE; ii) observer les effets de l’hyperammoniémie chronique indépendamment sur la BHE chez les rats PCA; iii) évaluer le rôle de l’hyperammoniémie et du stress oxydatif et iv) étudier le rôle du NKCC1 dans les CMV dans la pathogenèse de l’œdème cérébral. Les résultats du projet démontrent que l’œdème est d’origine cytotoxique chez les rats BDL et que l’intégrité de la BHE est conservée chez les rats PCA malgré l’hyperammoniémie. L’expression génique du NKCC1 est associée à l’œdème mais pas son expression protéique et sa phosphorylation. Enfin, l’étude démontre que l’hyperammoniémie et le stress oxydatif indépendant ne jouent pas un rôle dans la pathogenèse de l’œdème mais suggère qu’ils y aient un effet synergique. / Brain edema is a complication associated with hepatic encephalopathy (HE) due to chronic liver failure (cirrhosis). It is unclear whether brain edema is of vasogenic (blood brain barrier (BBB) breakdown) or cytotoxic (abnormal cellular uptake of ions) origin. It has been demonstrated that the Na-K-Cl cotransporter (NKCC1) located on the luminal side of the cerebral microvessels (CMV) is implicated in the pathogenesis of brain edema in animal models of ischemia and that the administration of bumetanide, an inhibitor of NKCC, attenuates brain water increase. Two distinct animal models of chronic liver failure and HE are used in the present study; 1) bile duct ligation (BDL) where brain edema, chronic hyperammonemia and systemic oxidative stress are observed; 2) portacaval anastomosis (PCA) where only chronic hyperammonemia is observed. The aims of the study were to: i) determine the origin of brain edema in BDL rats measuring brain extravasation, tight junctions expression and matrix metalloproteinase activation; ii) observe the effects of chronic hyperammonemia on the BBB in PCA rats; iii) study the role of oxidative stress and hyperammonemia; iv) evaluate the role of NKCC in CMV in the pathogenesis of brain edema. The results of the study determined that brain edema in BDL rats is of cytotoxic origin and chronic hyperammonemia independently has no effect on the BBB. An increase of NKCC1 mRNA is associated with brain edema but protein expression and phosphorylation are not. Furthermore, hyperammonemia and oxidative stress independently are not implicated in the development of brain edema however a synergistic effect between the two pathogenic factors in BDL rats remains a possibility.

La dysfonction endothéliale vasculaire constitue un marqueur précoce des maladies cardiovasculaires car l’endothélium est l’une des premières cibles des facteurs de risque cardiovasculaire. La présence d'un stress chronique engendré par les facteurs de risque cardiovasculaire sollicite les mécanismes de défense endogènes, tels que les enzymes antioxydantes, qui servent au maintien de la fonction endothéliale. L’environnement vasculaire auquel l’endothélium est exposé a un effet direct sur son fonctionnement à long terme. Certaines habitudes de vie sont ainsi associées à une bonne santé cardiovasculaire. Par exemple, la diète méditerranéenne et/ou la pratique régulière de l’exercice physique aident à maintenir une fonction endothéliale adéquate et à réduire l’incidence des maladies cardiovasculaires. D'autre part, certains gènes clés, comme le gène suppresseur de tumeurs p53, régulent plusieurs voies métaboliques importantes pour préserver l’intégrité des cellules endothéliales. Nous posons l’hypothèse que l’environnement vasculaire post-natal influence la mise en place de mécanismes de défenses endogènes tels que les enzymes antioxydantes afin de faire face à des stress plus tard dans la vie. Notre objectif global était d’évaluer les impacts d’interventions post-natales bénéfiques et d’une diminution endogène du gène suppresseur de tumeurs p53, sur la fonction endothéliale vasculaire et sur sa capacité à faire face à un stress métabolique. Dans une première étude, nous avons soumis des souris saines C57Bl/6 dès leur sevrage et jusqu’à l’âge de 9 mois, à un programme d’exercice physique volontaire (course dans une roue) ou à un antioxydant (catéchine), comparé à un groupe de souris sédentaires et sans antioxydant. Puis les interventions ont été stoppées et une diète riche en gras a été introduite, ou non, pour une période de 3 mois; les souris ont été sacrifiées à l'âge de 9 ou 12 mois. Nous avons observé que l’exercice a protégé les cellules endothéliales des effets délétères induits par la diète riche en gras en préservant la fonction endothéliale par le maintien d’un profil rédox sain et en évitant la hausse de l’inflammation. La catéchine a maintenu la fonction endothéliale aortique, mais n’a pas prévenu le profil inflammatoire en présence de la diète riche en gras. Finalement, chez les souris sédentaires, la fonction endothéliale a été détériorée en présence de la diète riche en gras, sans indice d’inflammation vasculaire. Dans une seconde étude, des souris partiellement déficientes en p53 (p53+/-) et contrôles C57Bl/6 ont été exposées à la même diète riche en gras à partir de 3 mois et ce jusqu’à l’âge de 6 mois. Notre raisonnement était basé sur la démonstration que p53 est un régulateur de l’expression des enzymes antioxydantes in vitro. Chez les souris p53+/-, les cellules endothéliales ont été protégées du stress induit par l’hypercholestérolémie engendrée par la diète riche en gras. Cependant, chez les souris p53+/- cette protection pourrait être secondaire à un métabolisme accru des acides biliaires, qui en prévenant la hausse de cholestérol, protègerait indirectement l'endothélium. Nous avons donc pu démontrer l’importance de l’environnement vasculaire sur la fonction endothéliale. La diète riche en gras a stimulé certains mécanismes de défense vasculaires tels que la voie des EDHF et la superoxyde dismutase afin de maintenir la fonction endothéliale malgré les conditions pro-athérosclérotiques. Nous avons observé que l’exercice et la catéchine influencent différemment l’endothélium malgré leurs capacités antioxydantes. Ces études soulignent la sensibilité de l’endothélium aux changements dans l’environnement vasculaire. En accord avec le vieillissement de la population et la progression des maladies cardiovasculaires, la proportion de personnes ayant une dysfonction endothéliale augmente. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes ou d’interventions qui permettent le maintien de la fonction endothéliale à long terme s’avère utile. / Endothelial dysfunction is an early marker of atherosclerosis and cardiovascular diseases. Cardiovascular risk factors generate a chronic stress, challenging endogenous defense mechanisms that are critical to maintain endothelial function, such as antioxidant enzymes. The vascular environment impacts the integrity and long-term function of endothelial cells. Thus, a healthy lifestyle is beneficial for cardiovascular health: regular physical training and/or a Mediterranean diet are associated with the maintenance of endothelial function and a lower incidence of cardiovascular diseases. On the other hand, some key genes such as tumor suppressor gene p53, are known to regulate numerous cellular functions that are necessary to maintain endothelial cells integrity. We hypothesized that the post-natal vascular environment impacts the development of endogenous cellular defense mechanisms such as antioxidant enzymes, in order to protect against vascular stress that will occur later in life. Our major goal was to evaluate the impact of post-natal interventions and endogenous reduction of p53 expression on vascular endothelial function and its capacity to resist against a metabolic stress. In our first study, healthy C57Bl/6 mice were exposed from weaning to the age of 9 months to physical voluntary training (running wheel) or to the antioxidant catechin, and were compared to physically inactive mice that did not receive catechin. Then, exercise and catechin were stopped and mice were subjected to a regular or a high fat diet for 3 months; mice were sacrificed either at the age of 9 or 12 months. In trained mice, we observed that exercise prevented endothelial dysfunction and inflammation induced by the high fat diet. In catechin-treated mice, aortic endothelial function was maintained despite exposure to the high fat diet, but an inflammatory profile was observed. In physically inactive mice, the high fat diet induced endothelial dysfunction without inflammation. In our second study, mice partially deficient in p53 (p53+/-) were exposed to the same high fat diet from 3 to 6 months of age. Our rationale was based on the discovery that in vitro, p53 regulates antioxidant enzymes gene expression. In p53+/- mice, endothelial cells were protected from the stress of hypercholesterolemia induced by the high fat diet. However, this endothelial protection could be linked with an unexpected enhanced bile acid metabolism in p53+/- mice: low endogenous expression of p53 prevents the rise in plasma total cholesterol when fed a high fat diet, indirectly protecting the endothelium. In summary, we were able to demonstrate the importance of the vascular environment on endothelial function. The pro-atherosclerotic environment induced by the high fat diet stimulated vascular defense mechanisms, as observed by the activation of the compensatory EDHF pathway and superoxide dismutase activity, to maintain an adequate endothelial function. We observed that exercise and catechin had a different impact on the endothelium despite their antioxidant properties. These studies demonstrate the sensitivity of the endothelium to changes within the vascular environment. As the population is aging and the incidence of cardiovascular diseases is increasing, endothelial dysfunction will be more frequent. Therefore, a better comprehension of mechanisms or interventions that can protect endothelial function can only be beneficial.

L’encéphalopathie hépatique (EH) est un syndrome neuropsychiatrique découlant des complications de l'insuffisance hépatique. Les patients souffrant d'une insuffisance hépatique chronique (IHC) présentent fréquemment une EH minimale (EHM) caractérisée par des dysfonctions cognitives subtiles qui affectent leur qualité de vie. L'insuffisance hépatique entraîne une hyperammoniémie, le facteur central dans la pathogenèse de l'EH. Pourtant, les taux d'ammoniaque sérique ne sont pas corrélés avec la sévérité de l'EH lors d'une IHC, suggérant que d'autres facteurs y contribuent. L'oedème cérébral est une caractéristique neuropathologique décrite chez les patients souffrant d'une EHM et plusieurs facteurs dont le stress oxydatif, les altérations du métabolisme énergétique et l'augmentation de la glutamine cérébrale pourraient contribuer à la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC. Les mécanismes sous-jacents exacts ainsi que les relations entre ces facteurs et l'ammoniaque ne sont pas connus. Présentement, le seul traitement efficace de l'IHC est la transplantation hépatique, une option thérapeutique très limitée. Le but de cette thèse est de contribuer à l'avancement des connaissances sur les mécanismes sous-jacents liés au rôle du stress oxydatif, de la glutamine et du lactate dans la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC afin d'envisager de nouvelles options thérapeutiques. Les objectifs précis étaient: 1. Établir le rôle de l’ammoniaque et sa relation avec le stress oxydatif dans la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC. 2. Établir le rôle du stress oxydatif dans la pathogenèse de l'oedème cérébral, sa relation avec l'ammoniaque et l'effet du traitement avec des antioxydants. 3. Confirmer l'effet synergique entre l'ammoniaque et le stress oxydatif dans la pathogenèse de l'oedème cérébral. 4. Établir le rôle du lactate et de la glutamine dans la pathogenèse de l'oedème cérébral et leur relation avec l’ammoniaque. Pour atteindre ces objectifs, 2 modèles animaux d'EHM obtenus par microchirurgie chez le rat ont été utilisés: 1) la ligature de voie biliaire, un modèle d'IHC et 2) l'anastomose porto-cave, un modèle d'hyperammoniémie induite par la dérivation portosystémique. Nos résultats démontrent que l'ammoniaque et le stress oxydatif indépendamment n'induisent pas l'oedème cérébral lors d'une EHM. Pourtant, lorsque les 2 facteurs agissent ensemble ils présentent ii un effet synergique qui entraîne le développement de l'oedème cérébral, le stress oxydatif étant une première insulte, qui est suivie par l'hyperammoniémie comme deuxième insulte. En plus, le stress oxydatif a été mis en évidence seulement au niveau systémique, et non au niveau central dans notre modèle d'IHC en association avec l'oedème cérébral, suggérant que le stress oxydatif systémique est une conséquence de la dysfonction hépatique et que l'hyperammoniémie n’induit pas le stress oxydatif ni systémique ni central. Nous avons démontré qu’une augmentation du lactate cérébral est une conséquence directe de l'hyperammoniémie et joue un rôle important dans la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC, tandis qu’une augmentation de la glutamine au niveau cérébral n'est pas un facteur clé. La compréhension de ces mécanismes a entraîné la proposition de 3 nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles pour l'EHM. Elles ciblent la diminution de l'ammoniaque sérique, la réduction du stress oxydatif et l'inhibition de la synthèse du lactate. / Hepatic encephalopathy (HE) is a metabolic neuropsychiatric syndrome which occurs as a complication of liver failure/disease. Patients with chronic liver disease (CLD) present often with minimal HE (MHE) characterized by subtle cognitive dysfunction which impairs their quality of life. Impaired liver function leads to hyperammonemia which is a central factor in the pathogenesis of HE. However, ammonia alone is poorly correlated with the severity of HE during CLD, strongly suggesting other factors may contribute. Brain edema is a neuropathological feature described in MHE patients and several factors such as oxidative stress, energy metabolism alterations and an increase in glutamine may to contribute to the pathogenesis of brain edema during HE related to CLD. However the exact underlying mechanisms and the relationships between these factors and ammonia are poorly understood. To date, the only effective treatment of CLD remains liver transplantation, a limited therapeutic option. The aim of this thesis is to advance the knowledge into the mechanisms underlying the role of oxidative stress, glutamine and lactate in the pathogenesis of brain edema during MHE associated with CLD in order to uncover new therapeutic options. The study objectives were: 1. Define the role of ammonia and its relationship with oxidative stress in the pathogenesis of brain edema in CLD. 2. Define the role of oxidative stress in the pathogenesis of brain edema, its relationship with ammonia as well as the effect of antioxidant treatment. 3. Confirm a synergistic role of ammonia and oxidative stress in the pathogenesis of brain edema. 4. Define the role of lactate and glutamine in the pathogenesis of brain edema and their relationship with ammonia. To achieve these objectives, we used 2 microsurgical rat models: 1) bile-duct ligation, a cirrhosis model and 2) portacaval anastomosis, a hyperammonemia model following portal-systemic shunting. Our findings demonstrate that ammonia and systemic oxidative stress independently do not induce brain edema in MHE related to CLD. However, when both factors are present, they exert a synergistic effect leading to the development of brain edema with oxidative stress presenting as a “first hit”, followed by hyperammonemia as a “second hit”. Moreover, solely systemic and not central oxidative stress was observed in our CLD rat model in relation to brain edema implying that systemic oxidative stress is a consequence of liver dysfunction and that central oxidative stress is not a direct iv effect of hyperammonemia in the setting of CLD. Moreover, we revealed that increased cerebral lactate is a direct consequence of hyperammonemia and also plays an important role in the pathogenesis of brain edema, while increased cerebral glutamine does not. The understanding of these mechanisms led to the proposal of three different strategies as potential HE therapies. These are directed towards lowering ammonia, reducing oxidative stress and inhibiting lactate synthesis.

Introdução: A maioria dos pacientes acometidos pela neoplasia que envolve a confluência biliopancreática é diagnosticada em fase avançada. A Colangiopancreatografia Retrógrada Endoscópica (CPRE) é o método de escolha para a drenagem da via biliar obstruída. Todavia, existe um índice de insucesso em torno de 10%. Nesses casos, técnicas alternativas serão aplicadas, como drenagem percutânea trans-hepática e drenagens cirúrgicas. Objetivo: Avaliar o sucesso técnico, clínico, qualidade de vida e sobrevida da drenagem biliar pela cirurgia convencional e técnica endoscópica ecoguiada em pacientes portadores de neoplasia maligna da confluência biliopancreática. Método: No período de abril de 2010 a setembro de 2013, foram estudados 32 pacientes portadores de neoplasia maligna da confluência biliopancreática. Todos os que foram incluídos nesse estudo apresentaram falha na drenagem biliar por CPRE. Três deles foram excluídos por insucesso técnico (falha na confecção da anastomose hepaticojejunal e da formação da fístula coledocoduodenal ecoguiada). O Grupo I foi formado por 15 pacientes submetidos à Hepaticojejunostomia (HJT) em \"Y\" de Roux e derivação gastrojejunal. O Grupo II foi formado por 14 pacientes submetidos à coledocoduodenostomia ecoguiada (CDT). O sucesso clínico foi avaliado pela queda da bilirrubina sérica total em mais de 50% nos sete primeiros dias após o procedimento. A qualidade de vida foi avaliada pelo questionário SF-36 e a sobrevida pela curva de Kaplan-Meier. Resultados: O sucesso técnico foi de 93,75% (15/16) no Grupo I e de 87,5% (14/16) no Grupo II (p = 0,598). O sucesso clínico ocorreu em 14 (93,33%) pacientes pertencentes ao Grupo I e em 10 (71,43%) do Grupo II. Não houve diferença estatisticamente significativa (p = 0,169). O comportamento médio dos escores de qualidade de vida foi estatisticamente igual entre as técnicas ao longo do seguimento (p > 0,05 Técnica * Momento). Houve alteração média estatisticamente significativa ao longo do seguimento nos escores de capacidade funcional, saúde física, dor, aspectos sociais, aspectos emocionais e saúde mental em ambas as técnicas (p < 0,05). O escore de saúde mental foi, em média, estatisticamente maior nos do Grupo II (CDT) em todos os momentos (p = 0,035). O tempo médio de sobrevida daqueles pertencentes ao Grupo I foi de 82,27 dias e os do Grupo II, de 82,36 dias. Sessenta por cento dos pertencentes ao Grupo I faleceram até 90 dias após o procedimento cirúrgico. Por outro lado, 42,9% dos submetidos à CDT faleceram no mesmo período. Não houve diferença estatisticamente significativa no tempo de sobrevida entre os Grupos (p = 0,389). Conclusão: Os dados relacionados aos sucessos técnico, clínico, qualidade de vida e sobrevida foram semelhantes em ambos os grupos, não se verificando diferença estatisticamente significativa / Introduction: Most patients with neoplasm in the biliopancreatic junction are diagnosed at an advanced stage. Endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP) is the method of choice for drainage of obstructed biliary tract. However, there is a failure rate of about 10%. In such cases, alternative techniques, such as, percutaneous transhepatic drainage and surgical drainage are applied. Aim: To evaluate the technical and clinical success, quality of life and patient survival of biliary drainage by conventional surgery and endosonography-guided technique in patients with malignant neoplasm of the biliopancreatic junction. Methodology: From April 2010 to September 2013, 32 patients with malignant neoplasm of the biliopancreatic junction were studied. All patients included in this study had failed biliary drainage by ERCP. Three patients were excluded due to technical failure (failure in the construction of hepatico-jejuno anastomosis and formation of endosonography-guided choledochoduodenal fistula). Group I comprised of 15 patients who underwent Roux-en-Y hepaticojejunostomy (HJT) and gastrojejunal bypass. Group II consisted of 14 patients who underwent endosonography-guided choledochoduodenostomy (CDT). Clinical success was assessed by the decrease of more than 50% in total serum bilirubin in the first seven days after the procedure. Quality of life was assessed by SF-36 questionnaire and survival by Kaplan-Meier curve. Results: Technical success rate was 93.75% (15/16) in group I and 87.5% (14/16) in group II (p = 0.598). Clinical success occurred in 14 (93.33%) patients in group I and 10 (71.43%) patients in group II. There was no significant statistically difference (p = 0.169). The average quality of life score were statistically equal between the techniques during follow-up (p > 0.05 * Technical Moment). There were statistically significant mean changes during follow-up of functional capacity score, physical health, pain, social functioning, emotional and mental health aspects in both techniques (p < 0.05). The mental health score was, on average, statistically higher in group II (CDT) at all times (p = 0.035). The median survival time of patients in group I was 82.27 days and Group II patients was 82.36 days. Sixty percent of patients in group I died within 90 days after the surgical procedure. On the other hand, 42.9% of the patients who underwent CDT died in the same period. There was no statistically significant difference in survival time between the groups (p = 0.389). Conclusion: Data relating to technical and clinical success, quality of life and survival were similar in both groups and there were no statistically significant differences

Os mecanismos responsáveis pela fibrose hepática na infância são pouco conhecidos. Crianças com atresia das vias biliares, quando submetidas a portoenterostomia a Kasai com sucesso, se tornam anictéricas mas mesmo assim desenvolvem cirrose a longo prazo. Da mesma forma, a ocorrência de estenoses biliares segmentares intra-hepáticas no pós-operatório de transplante hepático podem levar ao desenvolvimento de cirrose em todo o órgão. Tais fatos sugerem que mecanismos endócrinos ou parácrinos estejam envolvidos na fibrogênese hepática. Para elucidar este processo o modelo de ligadura seletiva das vias biliares em ratos jovens foi desenvolvido em nosso laboratório. Usando este modelo, identificamos mudanças na expressão do gene da alfa-actina de músculo liso, tanto no parênquima hepático obstruído como no parênquima hepático adjacente à obstrução. No entanto, o perfil de expressão gênica da desmina, uma proteína presente em níveis elevados durante a ativação das células estreladas hepáticas e o TGF-beta1, principal citocina pró-fibrogênica, não demostraram diferenças significantes quando analisados pelo método do RT-PCR semiquantitativo. Assim, os mecanismos moleculares envolvidos na modulação da fibrogênese hepática nesse modelo experimental não estão totalmente compreendidos. A metodologia do qRT-PCR (PCR em tempo real), têm sido previamente descrita como um método mais preciso e sensível, possibilitando a detecção do aumento do número de cópias do gene à medida que ocorre a amplificação, enquanto que o método do RT-PCR semiquantitativo a análise dos transcritos só é realizada após a etapa da amplificação. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações moleculares no modelo experimental de ligadura seletiva das vias biliares e comparar os resultados obtidos entre os métodos do RT-PCR semiquantitativo e do qRT-PCR em tempo real. Foi realizada a ligadura seletiva do ducto biliar em ratos Wistar com 21 dias de vida, os grupos foram separados de acordo com o momento da morte: 7 ou 60 dias após a cirurgia. A expressão da desmina, alfa actina de músculo liso e TGF-beta1 foi avaliada no tecido do parênquima hepático com obstrução biliar (ducto ligado - DL) e no parênquima hepático adjacente à obstrução biliar (ducto não ligado - DNL) usando o RT-PCR semiquantitativo e o qRT-PCR em tempo real. A metodologia do qRT-PCR em tempo real permitiu identificar mudanças no perfil de expressão gênica que não foram demonstrados pelo método semiquantitativo. O parênquima DL mostrou reação fibrogênica mais intensa, com aumento na expressão da alfa actina de músculo liso e TGF-beta1 após 7 dias. O parênquima DNL apresentou resposta fibrogênica tardia, com aumento da expressão da desmina 7 dias e 60 dias após a cirurgia, além de aumento da alfa-actina de músculo liso 60 dias após a cirurgia. O qRT-PCR em tempo real apresentou maior sensibilidade para identificar mudanças no perfil de expressão gênica em relação ao método convencional do RT-PCR semiquantitativo. Nossos resultados ajudam a esclarecer a dinâmica das alterações moleculares envolvidas na modulação da fibrogênese hepática no modelo experimental de ligadura seletiva do ducto biliar e pode ser diretamente aplicado para o estudo de estenoses biliares intra-hepáticas e atresia das vias biliares / The mechanisms responsible for liver fibrosis in childhood are poorly understood. Children suffering from biliary atresia, when submitted to the successful Kasai portoentostomy, become anicteric, but nonetheless develop cirrhosis in the long term. Similarly, the occurrence of intrahepatic biliary stenosis in the postoperative period of liver transplantation may lead to cirrhosis of the whole organ. Such facts suggest that endocrine or paracrine mechanisms are involved in hepatic fibrogenesis. To elucidate this process, the selective bile duct ligation model in young rats was developed in our laboratory. Using this model, we identified changes in the expression of smooth muscle alpha-actin both in the obstructed parenchyma and the hepatic parenchyma adjacent to the obstruction. However, the expression profiles of desmin, a protein present at high levels during activation of hepatic stellate cells and TGF-beta1, the main pro-fibrogenic cytokine, were unchanged when analyzed with semiquantitative RT-PCR. Thus, the molecular mechanisms involved in the modulation of hepatic fibrogenesis in this experimental model are not fully understood. The methodology of qRT-PCR (real time PCR) has previously been described as a more precise and sensitive method, allowing the detection of increased copy number of the gene while amplification occurs, whereas by semiquantitative RT-PCR analysis transcripts is only perfomed after the amplification step. This study aimed to evaluate the molecular changes in experimental model of selective bile duct ligation and compare the results between semiquantitative RT-PCR and real-time qRT-PCR methods. Selective biliary duct ligation was performed on Wistar rats with 21 days of life, the groups were separated according to the moment of death: 7 or 60 days after surgery. The expression of desmin, alpha-actin smooth muscle and TGF-beta1 was examined in tissue from hepatic parenchyma with biliary obstruction (duct ligation - DL) and in the adjacent hepatic parenchyma (duct non-ligated - DNL) using semiquantitative RT-PCR and real-time qRT-PCR. The methodology of the real-time qRT-PCR allowed to identify changes in gene expression profile that were not shown by semiquantitative method. The DL parenchyma showed a more severe fibrogenic reaction, with increased alpha-actin smooth muscle and TGF-beta1 expression after 7 days. The DNL parenchyma presented a later fibrotic response, with increased desmin expression 7 and 60 days after surgery, besides of increased alpha-actin smooth muscle 60 days after surgery. Real-time qRT-PCR was more sensitive to identify changes in gene expression profile comparated to the semiquantitative method. Our results help to clarify the dynamic of molecular changes involved in the modulation of hepatic fibrogenesis in an experimental model of selective bile duct ligation and can be directly applied to the study of intrahepatic biliary stenosis and biliary atresia

As complicações biliares mais comuns pós-transplante hepático são as estenoses da anastomose, as estenoses não-anastomóticas e as fístulas biliares e podem ocorrer de diferentes modos, de forma isolada ou associada. A origem do enxerto (doador cadáver ou doador vivo) tem influência na incidência de estenose biliar, bem como na resposta ao tratamento endoscópico. A terapêutica endoscópica utilizando-se esfincterotomia, dilatação balonada da estenose e inserção de próteses biliares através da CPRE é utilizada como método inicial de tratamento dessas complicações. Objetivos: Comparar as diferentes técnicas de tratamento endoscópico das estenoses biliares pós-transplante hepático. Método: Foi realizada uma revisão sistemática da literatura e metanálise sendo a busca conduzida nas bases MEDLINE, EMBASE, Scielo - LILACS e Biblioteca Cochrane até junho de 2015. A metanálise foi executada utilizando-se os softwares Review Manager, 2012 (RevMan) versão 5.2 e OpenMetaAnalyst e os cálculos dos desfechos foram feitos comparando-se os resultados dos estudos incluídos utilizando-se a diferença de risco absoluto e adotando-se um intervalo de confiança (IC) de 95%. Os estudos foram agrupados comparando-se transplantes hepáticos com doador cadáver versus doador vivo; dilatação biliar endoscópica com balão exclusiva versus dilatação biliar endoscópica com balão associada à inserção de próteses plásticas e próteses biliares plásticas comparadas à prótese biliar metálica por endoscopia. Os desfechos clínicos analisados foram incidência da estenose biliar, falha do tratamento endoscópico, resolução da estenose, recorrência da estenose e complicações. Resultados: Foram recuperados 1.110 artigos, sendo motivo de análise dez ensaios clínicos, com apenas um Ensaio Clínico Randomizado e nove Ensaios Clínicos não randomizados, dos quais sete foram incluídos na metanálise. Comparando-se doador cadáver e doador vivo observou-se redução da incidência de estenose biliar (p=0,0001), bem como da falha técnica do tratamento endoscópico (p=0,0009) e da recorrência da estenose biliar (p=0,03) nos transplantes realizados com enxertos provenientes de doador cadáver. Dois estudos compararam o tratamento da estenose da anastomose biliar pós-transplante hepático utilizando dilatação com balão exclusiva versus dilatação com balão associada à inserção próteses plásticas e não foram observadas diferenças estatisticamente significantes em relação aos desfechos falha de tratamento, recorrência da estenose ou complicações. Somente o desfecho clínico complicações teve resultado estatisticamente significante na comparação entre prótese metálica autoexpansível versus prótese plástica no tratamento da estenose da anastomose biliar pós-transplante hepático (p= 0.03). Conclusões: O tratamento da estenose biliar anastomótica pós-transplante hepático com prótese metálica foi igualmente efetivo quando comparado ao uso de prótese plástica, mas associou-se a um menor risco de complicações. A comparação entre dilatação com balão exclusiva e dilatação com balão associada à prótese plástica apresentou resultados semelhantes em relação à falha do tratamento endoscópico, complicações e recorrência da estenose. A utilização de enxerto proveniente de doador cadáver reduziu o risco de estenose biliar pós-transplante hepático e o tratamento endoscópico nesse grupo de pacientes, foi mais efetivo quando comparado com as estenoses biliares após transplante com doador vivo / The most common biliary complications after liver transplantation are anastomotic strictures, non-anastomotic strictures and biliary fistulas and they can occur in different fashions, isolated or in combination. Graft source (cadaveric liver donor or living liver donor) has an influence on the incidence of biliary strictures as well as on the response to endoscopic treatment. The endoscopic treatment using sphincterotomy, balloon dilation and insertion of biliary stents by ERCP (Endoscopic Retrograde Cholangiopancreatography) is used as an initial endoscopic approach to treat these complications. Objectives: To compare different endoscopic techniques to treat post-liver transplantation biliary strictures. Method: It was performed a systematic review of the literature and meta-analysis and the search was carried out on MEDLINE, EMBASE, Scielo-LILACS and Cochrane Library databases until June, 2015. The meta-analysis was made using Review Manager, 2012 (RevMan) version 5.2 and OpenMetaAnalyst software and the calculations of the outcomes were made comparing the results from the included papers by using the difference in absolute risks, adopting a confidence interval of 95%. The studies were grouped comparing cadaveric liver donor versus living liver donor grafts; exclusive balloon dilation versus balloon dilation associated with plastic stents insertion; and plastic stents versus totally covered selfexpandable metal stents. The clinical outcomes were biliary stricture incidence, endoscopic treatment failure, stricture resolution, stricture recurrence and complications. Results: There were retrieved 1,100 articles. Ten clinical trials were analyzed, with just one Randomized Clinical Trial and nine Non-Randomized Clinical Trials, out of which seven were included in the meta-analysis. When comparing cadaveric liver donor transplantation to living liver donor transplantation, it was observed a decrease in the incidence of biliary strictures (p=0.0001), as well as in the technical failure rate of the endoscopic treatment (p=0.0009) and in the biliary stricture recurrence (p=0.03) in the cadaveric liver donor graft group. Two studies have compared the treatment of anastomotic biliary strictures after liver transplantation using balloon dilation exclusive to balloon dilation associated with the insertion of plastic stents, and no statistically significant differences in relation to endoscopic treatment failure, stricture recurrence or complications rates were observed. Only the clinical outcome complications had statistically significant result in a comparison between self-expandable metal stents versus plastic stents in the treatment of post-liver transplantation anastomotic biliary strictures (p=0.03). Conclusions: The treatment of post-liver transplantation anastomotic biliary strictures was equally effective when compared the use of self-expandable metal stents to plastic stents, but the use metallic stents was associated with a lower complication risk. The comparison between exclusive balloon dilation to balloon dilation associated with plastic stents presented similar results in relation to endoscopic treatment failure, complications and stenosis recurrence. The use of graft from cadaveric donor reduced the risk of biliary stenosis after liver transplantation and endoscopic treatment of biliary strictures in these patients were more effective when compared to biliary strictures after living liver donor transplantation