Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Gabriel Padilla Maldonado / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Resumo: As PKSs tipo II são complexos enzimáticos envolvidos na produção de policetídeos. Estes são metabólitos secundários que possuem papel-chave no desencadeamento das respostas bioquímicas que levam à diversificação fisiológica frente a fatores adversos, fazem parte da composição de pigmentos de esporos microbianos, além de comporem a estrutura química de importantes antibióticos explorados pela indústria farmacêutica. Foi feita a prospecção de novos "clusters" gênicos para PKSs tipo II em uma biblioteca metagenômica de 9.320 clones, através de amplificação por PCR com "primers" degenerados para uma região gênica conservada. Dentre três clones encontrados, um foi sequenciado pela estratégia de shotgun, resultando em um consensus de 22.988 pares de bases. Foi feita a predição funcional de ORFs por homologia obtida com a ferramenta Blast (NCBI) e também a identificação de domínios enzimáticos pelo PRODOM e PFAM. Dentre os resultados da predição por homologia de domínios enzimáticos foi possível identificar ORFs homologas à: reguladores gênicos (LacI e LuxR); carboidrases (Lacases, β-glucosidases, Quitinases/Celulases); transferases (O-metil-transferases, Acíl-transferases); pks mínima; ciclases, aromatases, hidroxilases, mono-oxigenases e transportadores ABC. Alguns "clusters" enzimáticos podem ainda atuar em degradação de celulose e lignina. As enzimas candidatas ao core biossíntético do "cluster" (pks mínima) foram submetidas à modelagem de estrutura tridimensional in silico. Os modelos 3D foram avaliados quanto a acurácia, utilizando as ferramentas: Verify3D, Qmean, Procheck, Rampage e Swiss-Model. Uma vez validados, as KSA e CLF foram submetidas a simulações de "docking" enzimático / Abstract: The type II PKSs are enzyme complexes involved in the production of polyketides. These are secondary metabolites that have key role in triggering the biochemical responses that lead to physiological diversification against adverse factors are part of the pigment composition of microbial spores, and compose the chemical structure of most antibiotics exploited by the pharmaceutical industry. Some clusters could act in enzymatic degradation of cellulose and lignin. It was made a prospection for new clusters gene for type II PKSs in a metagenomic library of 9320 clones by PCR amplification with degenerate primers for a conserved gene region. Among three clones found, one was sequenced by subcloning and shotgun strategy, resulting in a consensus of 22,988 base pairs. It was made the prediction of functional homology ORFs by Blast (NCBI) and also identifying areas for enzymatic Prodom and PFAM. Among them were found homologous to: ABC transporters; minimal PKS, cyclasea; Aromatasea; Hydroxylases; Mono-oxygenases; O-methyl-transferases; Multicopper oxidase/laccase, β-glucosidase, chitinase/ Cellulases; Peptidases; Acyl-transferases, in addition of gene regulators similar to LacI and LuxR. The biosynthetic enzymes candidates for the core of the cluster (minimal pks) underwent three-dimensional structure modeling in silico. The 3D models were evaluated for accurate, using the tools of 'Assessing "Verify3D, Qmean, Procheck, Rampage and Swiss-Model. Once validated, the KSA and CLF were subjected to simulated docking enzyme between them / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5243_1.pdf: 854827 bytes, checksum: fb13a669eb1c6cefe0fff9ed7f1d9ffe (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / O câncer de cólon uterino é apontado mundialmente como o mais incidente em mulheres, e o HPV tem sido descrito como o principal causador dessa patogenia. Durante o processo patogênico, o HPV interfere nos mecanismos gênicos da célula, daí a grande importância dos estudos desenvolvidos com a técnica de microarranjos que têm apresentado à comunidade científica diversos genes relacionados à infecção. Como os polimorfismos de base única (SNPs) vêm sendo associados a susceptibilidade ou não a doença, o presente trabalho descreve o programa SNP8, o qual foi desenvolvido para a análise de SNPs que possam ocorrer em regiões codificadoras (CDS) do genoma humano. O programa SNP8 é de livre acesso pela internet e requer apenas informações a respeito do gene que se pretende estudar, como nome, ID e símbolos oficiais. Em seguida o programa inicia a busca e alinha as seqüências RefSeq Exons, encontradas no banco público do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e das ESTs, encontradas no banco público do UCSC Genome Browser (genome.ucsc.edu). Os SNPs encontrados entre essas seqüências são armazenados para posteriores análises. Em um processo passo, o programa busca as seqüências de SNPs já anotadas no banco público do NCBI e as compara com os SNPs previamente armazenados pelo programa. As comparações que coincidem são descartadas e as que não coincidem são propostas como potenciais novos SNPs, os quais são alinhados com a seqüência CDS do gene em estudo para a determinação da posição desses potenciais novos SNPs no CDS. Durante a validação do programa foram encontrados muitos potenciais novos SNPs em regiões CDS, dos quais 53,12% foram não sinônimos e 46,88% foram sinônimos. Esses SNPs foram confirmados por 30 70% do total de ESTs analisadas para cada gene. Com a descoberta desses potenciais novos SNPs para genes importantes relacionados a patogenia do HPV, nós sugerimos uma análise de confirmação desses potenciais SNPs encontrados pelo programa SNP8, o que acarretaria numa ampliação do banco dbSNP, de onde os dados foram retirados. Devido ao programa SNP8 trabalhar com dados atualizados dos bancos de dados do NCBI e do UCSC Genome Browser, a comunidade científica está melhor informada dos diferentes SNPs que podem ser encontrados exclusivamente em regiões CDS do genoma humano

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-06-21T19:25:56Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Luiz Felipe Gomes Rebello Ferreira.pdf: 10574681 bytes, checksum: 88fb46b2af0638e486a62e4ca28fdd89 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-21T19:25:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Luiz Felipe Gomes Rebello Ferreira.pdf: 10574681 bytes, checksum: 88fb46b2af0638e486a62e4ca28fdd89 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / FACEPE / Estima-se que o uso de métodos in silico pode reduzir os custos associados ao desenvolvimento de um novo fármaco em até 50%. Esta redução ocorre porque o número de moléculas que precisam ser testadas e sintetizadas experimentalmente passa a ser drasticamente reduzido devido a alta confiabilidade dos métodos computacionais. Porém, estes métodos podem apresentar uma alta demanda computacional quando o número de moléculas a ser testados é alto e quando se busca maior precisão nos resultados numéricos. Sendo assim, este trabalho apresenta o desenvolvimento do programa GriDoMol, uma plataforma unificada para realizar cálculos de docking molecular em um sistema distribuído, através de um grid computacional, com foco em alto desempenho e precisão. Utilizando o GriDoMol e configurações avançadas de docking, foi possível realizar o docking molecular de um conjunto de 213 complexos em um tempo até 9,91 vezes mais rápido e encontrando soluções de docking mais estáveis, com reduções de até 1,3 Kcal/mol, quando comparado com a execução sequencial deste mesmo conjunto em um único computador, utilizando apenas um núcleo de processamento e a configuração padrão de docking. O GriDoMol também oferece a opção de realizar estudos de vacinologia reversa permitindo cálculos de docking molecular entre candidatos a epítopos e alelos de MHCs de Classe I e II humanos com o intuito de encontrar epítopos que possuam uma boa afinidade por estes alelos, aumentando as chances de apresentar uma resposta imunológica significativa. / It is estimated that the use of in silico methods can reduce the costs spent at the development stage of a new drug by up to 50%. This happens because the number of molecules that need to be experimentally synthesized and tested becomes drastically reduced due to the high predictability and reliability of the computational methods. Nevertheless, these methods may present a high computational demand when the number of molecules to be tested is high and when it’s seeking for a higher precision in the numerical results. Therefore, this work presents the development of the program GriDoMol, a unified platform for performing molecular docking calculations in a distributed system, through a computational grid environment, with focus in high performance and precision. By using GriDoMol and higher docking settings values, it was possible to execute the molecular docking of a set containing 213 complexes in a time up to 9.91 times faster and finding more stable complexes, with energy reduction by up to 1.3 Kcal/mol, when compared with the sequential execution of this same set on a single computer, using a single processor core and the default docking settings values. The program GriDoMol also offers a reverse vaccinology option, allowing the molecular docking of candidate epitopes on selected human MHC’s Class I and II alleles, in order to find the most promising epitopes which have a good binding affinity on a large set of alleles and, thus, better chances of having a significant immunogenic response.

Workflows científicos são projetados para realizar experimentos in silico com o intuito de processar e analisar uma grande quantidade de dados usando simulação computacional. Os experimentos são organizados como uma sequência de etapas que caracterizam um fluxo de execução, onde em cada etapa utilizam-se diferentes softwares. Estes softwares não possuem um modelo de representação de dados comum. Por isto, quando um workflow científico é construído com o objetivo de integrar e processar dados, cada etapa precisa analisar a estrutura dos dados, processá-los e preparar os mesmos de acordo com a estrutura necessária para a execução da próxima etapa do workflow. Desta maneira, os workflows científicos usam diferentes algoritmos provenientes das áreas da matemática e da ciência da computação, os quais são capazes de processar, armazenar e transformar os dados utilizados em informação útil para diferentes análises de pesquisadores de biologia. Adicionalmente, a biologia de sistemas é uma subárea da bioinformática que ajuda a compreender as interações observadas entre populações de moléculas, células e organismos resultantes do aumento da complexidade biológica. Assim, nesta tese de doutorado, buscou-se desenvolver workflows científicos utilizando-se ferramentas de bioinformática e biologia de sistemas para comparar processos biológicos através da geração de redes de interação proteínaproteína. Para tanto, o programa Dis2PPI foi gerado por meio de um workflow científico que possibilitou integrar os bancos de dados de doenças monogênicas OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) com o programa de metabuscas STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins). O objetivo desta integração foi gerar uma rede de interação proteína-proteína associada com doenças de natureza monogênica. Como prova de conceito, o programa Dis2PPI foi utilizado para a obtenção de redes de interação para as síndromes xeroderma pigmentosa e de Cockayne, duas doenças monogênicas raras e cujos fenótipos estão associados com acúmulos de danos de DNA, câncer, progeria e neurodegeneração. Uma vez geradas, estas redes foram avaliadas com o uso ferramentas de biologia de sistemas para análise de ontologia gênica e de centralidade no programa Cytoscape. Da mesma forma, o programa Net2Homology foi gerado através de um desenho de um workflow científico que possibilitasse integrar o resultado de um alinhamento de sequências de proteínas, usando o programa NCBI PSI-BLAST, com o programa de metabuscas STRING. Neste sentido, o programa Net2Homology possibilitou recuperar duas redes de interação proteína-proteína associada a dois organismos diferentes. Este mesmo programa foi utilizado para a obtenção de redes de interação para a doença xeroderma pigmentosa e para a enzima ciclo-oxigenase-1 cruzando as informações dos organismos Homo sapiens e Mus musculus. As redes de interação obtidas foram comparadas visando obter os processos biológicos evolutivamente conservados. / Scientific workflows can be used to design in silico experiments to process and analyse a great amount of data using computational simulation. In this sense, all in silico experiments are organized as a sequence of steps that characterize an execution flow, where each steps employ different softwares. It is important to note that these softwares do not employ a common structure or model to represent data. Thus, taking into account the diversity of softwares and data representation, a scientific workflow should be built to integrate and process data, where each step must be able to analyse the data structure, to process these data and finally generate a new data structure that provide the requirements needed to execute the next step of the workflow. It is important to note that scientific workflows use mathematics and computer sciences methods capable to process, storage, and transform these data into useful information. In addition, a subarea of Bioinformatics termed Systems biology helps to understand the interactions observed between populations of molecules, cells and organisms as the result of the increase of biological complexity. Thus, the purpose of this work was to develop scientific workflows using bioinformatics and system biology softwares with the purpose to compare different biological processes from the generation of proteinprotein interaction (PPI) networks. In this sense, the Dis2PPI software was design as a scientific workflow to integrate OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) database with metasearch program STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) in order to retrieve protein-protein interaction networks associated to monogenic diseases. The Dis2PPI was used to generate PPI networks for xeroderma pigmentosum and cockayne syndromes, two rare monogenic diseases associated with DNA damage, cancer, progeria, and neurodegeneration. The PPI networks generated were analyzed with Cytoscape program and specific plugins that evaluate gene ontologies and centrality analysis. By its turn, Net2Homology program was designed as a scientific workflow to integrate NCBI PSI-BLAST sequence alignments with STRING metasearch program to recovery PPI networks associate with two different species. In this sense, Net2Homology was used to obtain PPI network for xeroderma pigmentosum disease and cyclooxigenase-1 enzyme by crossing Homo sapiens and Mus musculus information. A comparison between these networks was realized to verify the major evolutively conserved biological process.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo892_1.pdf: 4743586 bytes, checksum: eae92dbe2a7cf093e03b863301aadbbc (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os papilomavírus formam um grupo de vírus altamente diverso e específico que infectam mamíferos, aves e répteis. O conhecimento acerca da sua diversidade genética e evolução ainda é pobre, não existindo um cenário compreensivo que elucide as relações filogenéticas desses vírus. Assim, um estudo que visa ao entendimento da variabilidade genética entre os papilomavírus é fundamental para o aumento do conhecimento de sua complexa história evolutiva. Esse trabalho consistiu na análise de 53 sequências genômicas completas de papilomavírus, representando toda sua diversidade conhecida. Estudos de genômica comparativa foram realizados analisando o tamanho dos genomas; conteúdo gênico; variabilidade genética; estatística de códons; pressão seletiva; e recombinação. Regiões de baixa entropia foram utilizadas para a construção de ávores filogenéticas baseadas em quatro métodos diferentes. A metodologia empregada permitiu a identificação de regiões que são conservadas entre os papilomavírus que infectam hospedeiros diferentes, ajudando a entender suas relações evolutivas. Isto é muito importante porque, apesar da grande variação existente entre os genomas dos papilomavírus, fomos capazes de encontrar regiões que são claramente compartilhadas, apresentando baixos níveis de complexidade de informação, com o objetivo de fazer predições. Topologias coerentes foram obtidas com altos valores de confiança, apesar de não haver consistência em alguns nós internos. Esses resultados indicaram que tais regiões são bons marcadores para realização de inferências filogenéticas com menor custo computacional, resultando em um incremento na compreensão da diversificação dos papilomavírus

El avance de la informática y el poder de proceso de los computadores han posibilitado la aparición de una disciplina emergente, la Bioinformática; cuyos objetivos son una visión amplia de los procesos biológicos y el entendimiento de grupos complejos de datos. En esta tesis, el uso de herramientas bioinformáticas en datos de hipermetilación de promotores de genes en cáncer gástrico difuso reveló asociaciones con características clínicas y 2 genes que se asocian a mal pronóstico (APC y p73). Por otro lado, el análisis de librerías de SAGE de estómago con estas herramientas mostró genes diferencialmente expresados en adenocarcinomas gástricos y diferencias étnicas en la transcriptómica de estas células neoplásicas

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Orientador : Prof. Dr. Leonardo Magalhães Cruz / Co-orientador : Prof. Dr. Roberto Tadeu Raittz / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/03/2014 / Inclui referências / Resumo: O Herbaspirillum lusitanum P6-12 foi isolado de nódulos de raiz da planta Phaseolus vulgaris (feijão) em Portugal. O genoma foi obtido através do programa CLCWorkbench utilizando a combinação de leituras de sequências SOLiD e Illumina. Utilizando o programa RAST e posterior revisão manual, a anotação do genoma obteve 4488 genes, cobrindo 87% do genoma, 51 tRNA e um operon ribosomal na ordem 16S rRNA-23S rRNA-5S rRNA. O H. lusitanum P6-12 possui as vias metabólicas Entner-Doudoroff, pentoses fosfato, ácidos tricarboxílicos Embden Meyerhof-Parnas, com exceção da enzima 6-fosfofrutoquinase (EC 2.7.1.11). Não foram encontrados os genes responsáveis pela fixação de nitrogênio, mas foi encontrado o gene que codifica a 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) deaminase, relacionada ao desenvolvimento da planta sob condições de estresse. Também foi encontrada a sequência parcial do gene que codifica para a proteína Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (RuBisCO), ligada a fixação do carbono, embora os outros genes desta via não tenham sido identificados. Análises na diferença de cobertura global em relação à cobertura na região do operon, sinalizaram a presença de mais um operon ribosomal. Foram desenvolvidos métodos de tratamento das regiões de gap que permitiram a finalização do draft em 30 supercontigs, totalizando 4.919.496 pb. A análise do gene 16S rRNA confirmou que a espécie de Herbaspirillum sequenciada foi a de H. lusitanum estirpe P6-12. Foram utilizadas duas metodologias de agrupamento para as proteínas, a ligação simples e a ligação completa. Os grupos de genes ortólogos foram determinados como a intersecção entre os três métodos empregados nas análises OrthoMCL, INPARANOID e BBH, identificando 5218 grupos de genes ortólogos entre as 12 espécies estudas: Herbaspirillum sp. JC206, CF444, GW103, YR522, H. seropedicae SmR1, Os45, Os34, AU14040, H. rubrisubalbicans M1, H. frisingense GSF30 e H. huttiense subsp putei 7-2. Dentro dos 5218 grupos de ortólogos, 768 estiveram presentes em todos os genomas e foram definidos como core genoma. As análises filogenéticas baseadas nos grupos ortólogos sinalizaram uma possível classificação das estirpes Herbaspirillum sp. CF444 como Herbaspirillum lusitanum CF444 e Herbaspirillum sp. GW103 como H. huttiense subsp. putei GW103. Palavras-chave: Herbaspirillum lusitanum P6-12, anotação, grupos ortólogos, bioinformática, genômica. / Abstract: The Herbaspirillum lusitanum P6 -12 was isolated from root nodules of the Phaseolus vulgaris plant (beans) in Portugal. The genome was assembled in CLCWorkbench program using the combination of SOLiD and Illumina reads. Using the RAST program and subsequent manual review, the genome annotation obtained 4.488 genes, covering 87 % of the genome, 51 tRNA and one ribosomal operon 16S rRNA-23S rRNA-5S rRNA. H. lusitanum P6-12 has the Entner- Doudoroff, pentose phosphate, citric acid and Embden Meyerhof-Parnas metabolic pathways, with the exception of the enzyme 6-phosphofructokinase (EC 2.7.1.11). The presence of genes responsible for nitrogen fixation have not been found, but the gene encoding 1- aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase was present. This gene is related with plant development under stress conditions. Another finding was the partial sequence from the carbon fixation protein, Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco). Analysis of the difference in overall genome coverage compared to the operon coverage, showed the presence of another ribosomal operon. Methods of treating regions of gap were developed and allowed the completion of the draft in 30 super-contigs and 4.919.496 bp. The analysis confirmed that the 16S rRNA gene of the species Herbaspirillum lusitanum was sequenced strain P6-12. Orthologous analysis showed the difference in prediction between three methods evaluated, OrthoMCL, INPARANOID and BBH. Two methods of clustering, simple and complet link were used. Groups of orthologous genes were determined as the intersection between the three methods identifying 5218 clusters of orthologous genes among the 12 species studied: Herbaspirillum sp. JC206, CF444, GW103, YR522, H. seropedicae SMR1, Os45, Os34, AU14040, H. rubrisubalbicans M1, H. frisingense GSF30 and H. huttiense subsp. putei 7-2. Within the groups of orthologous, 768 were present in all genomes being defined as core genome. Phylogenetic analysis based on orthologous groups showed a possible classification of Herbaspirillum CF444 as Herbaspirillum lusitanum CF444 and Herbaspirillum GW103 as H. huttiense subsp. putei GW103. Keywords: Herbaspirillum lusitanum P6-12, annotation, orthologous clustering, bioinformatics, genomics.

Orientador : Prof. Dr. Alessandro Brawerman / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Educação Profissional e Tecnológica, Programa de Pós-Graduação em Bioinformática. Defesa: Curitiba, 09/05/2013 / Inclui referências / Área de concetração: Bioinformática / Resumo:No desenvolvimento de software para a área de Bioinformática, pesquisadores consideram vários fatores para definir as tecnologias e metodologias utilizadas em um determinado projeto, não sendo raro encontrar soluções com finalidades iguais ou similares utilizando diferentes tecnologias. Com a proposta de fortalecer a comunidade de Bioinformática, o framework BAK4BIO - Brazilian Army Knife for Bioinformatics é um conjunto de ferramentas para a construção de aplicativos para a plataformaWeb e Mobile. É composto por uma série de subsistemas, os quais possibilitam ao usuário final buscar informações nos principais bancos de dados biológicos; iniciar e supervisionar processos de Bioinformática em ambiente computacional de alto desempenho - BAK4BIO Cluster; e gerenciar arquivos relacionados a entrada e saída de processos nas nuvens - BAK4BIO BOX. Tudo isto provendo a mobilidade necessária para seus usuários, ao permitir com que todos os processos sejam iniciados a partir de um aplicativo desenvolvido para Android - o BAK4BIO Droid. Existe também módulo BAK4BIO Server, responsável por centralizar o recebimento de requisições do módulo Droid e encaminhar para o destino correto, atuando como um proxy. Finalmente, o BAK4BIO Web, criado para interagir com as soluções do framework via Web. A carência de frameworks para o desenvolvimento de ferramentas em Bioinformática encontrada na literatura demonstra que, a existência do BAK4BIO contribui para a integração entre diferentes trabalhos científicos e o coloca em destaque por seu pioneirismo em âmbito nacional na área de mobilidade. Com destaque ao módulo BAK4BIO Droid, disponível na Google PlayStore e utilizado pela comunidade científica em vários países desde o seu lançamento. Palavras-chave: Framework; Dispositivos Móveis; Integração de sistemas; Acesso a bases biológicas; Ferramentas Biológicas. xiii / Abstract: Software development for Bioinformatics, researchers consider several factors to dene the technologies and methods used in a given project, it isn't uncommon nd solutions with similar purposes using diferent technologies. With the proposal to strengthen the Bioinformatic's community, the framework BAK4BIO - Brazilian Army Knife for Bioinformatics is a set of tools for building applications for the Web and Mobile platforms. It consists of a number of subsystems, which enable the user to retrieve information on major biological databases; initiate and supervise Bioinformatics processes in highperformance computing environment - BAK4BIO Cluster, and manage related to input and output processes in clouds - BAK4BIO BOX. All this providing the necessary mobility to users by allowing that all processes start from an application developed for Android - BAK4BIO Droid. There is also BAK4BIO Server module, responsible for centralizing the receipt of requests from the Droid module and forward to the correct destination, acting as a proxy. Finally, the Web BAK4BIO designed to interact with the framework via Web solutions The lack of frameworks for the development of Bioinformatics tools found in the literature shows that the existence of BAK4BIO contributes to the integration of dierent scientic studies and highlights in for his pioneering nationwide in the area of mobility. Highlighting the BAK4BIO Droid unit, available in Google PlayStore and used by the scientic community in several countries since its launch. Key-words: Framework, Mobile Devices, System's Integration, Access to biological bases; Biological Tools. xiv

A família das serino proteases inclui diversas proteínas envolvidas em uma variedade de processos fisiológicos, como digestão protéica, regulação da pressão arterial e da coagulação sanguínea, entre outros. Quando disfuncionais, relacionam-se à condições patológicas graves como trombose vascular, embolismo pulmonar, infarto agudo do miocárdio, isquemia cerebral, bem como com o quadro da hemofilia B, ocasionada pela deficiência de fator IX. A investigação dos mecanismos de ação e a compreensão do funcionamento de serino proteases e de seus inibidores, as serpinas, é essencial para desvendar mecanismos de doenças e para a modelagem de fármacos mais específicos e eficientes. A pesquisa de fármacos anti-trombóticos busca desenvolver produtos capazes de interferir no processo hemostático que pode resultar no grave quadro trombo-embólico. A nitroforina-2 (NP-2), produzida na secreção salivar do inseto barbeiro Rhodnius prolixus, é uma proteína dotada de potente ação anti-hemostática, atuando como um inibidor específico do complexo tenase intrínseco (TF/FVIIa/FIX). Em trabalho anterior, nosso grupo identificou que o fragmento correspondente ao segmento 90-110 de NP-2 possui atividade anticoagulante. Um modelo do complexo fator IXa (fIXa)-NP-2 foi gerado a partir do “docking” do peptídeo de NP-2 na provável região de ligação com fIXa. Este complexo foi usado como ponto de partida para a simulação por dinâmica molecular e refinamento da estrutura. Novos peptídeos foram propostos como o objetivo de gerar estruturas com maior afinidade por fIXa. Identificamos o hexapeptídeo LKEADE como apresentando melhor afinidade por fIXa, o qual sugerimos como “template” para o planejamento racional de fármacos com ação anticoagulante e anti-trombótica. Numa outra vertente de nosso trabalho, estudamos a superfamília de proteínas denominada serpinas (serpins, ou “SERine Protease INhibitors”) que engloba um grande conjunto de proteínas dotadas de estruturas similares e provenientes de vários e distintos organismos. A função inicialmente identificada para as serpinas foi de inibição de serino proteases da coagulação sangüínea; entretanto, muitas serpinas perderam esta função.Nestes estudos foram usados modelos ocultos de Markov para criar modelos e descrições possibilitando classificar as serpinas em relação à sua função biológica. Foram criadas assinaturas para cada grupo: seqüências consenso e padrões de aminoácidos distintos para cada modelo/função correspondente. Um modelo específico para serpinas da coagulação sangüínea foi criado. Para este modelo, foi gerada a expressão regular [IVTLM]-[FLVA]- F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV] que descreve tal função. Além disso, ela codifica a seqüência de uma importante região envolvida na mudança conformacional e no funcionamento da serpina. Tanto esta seqüência quanto a estrutura secundária correspondente podem ser melhor investigadas, por sugerirem um alvo para inibição ou ativação. / The protein family of serine proteases comprises molecules involved in a wide range of physiological processes, such as regulation of blood pressure and coagulation. Dysfunctional serine proteases are related to pathological conditions such as embolism, heart failure, cerebral ischemia and also hemophilia B (the latter being a consequence of factor IX deficiency). The understanding of serine proteases mechanism of action, as well as of their inhibitors is a key step to the discover and develop new drugs. In the study of homeostasis, the search for anti-thrombotic drugs seek to avoid thrombosis and related conditions. The protein nitrophorin-2 (NP-2), found in the salivary glands of the hematophagous insect Rodnius prolixus, is a specific inhibitor of the intrinsic tenase complex (TF/fVIIa/fIX). In previous studies, we identified the NP-2 fragment (amino acid sequence 90-110) showing anticoagulant activity. Models of the complex factor IXa (fIXa) – NP-2 were created. This complex was used as a starting point for the molecular dynamic simulations and structure refinement. New NP-2 peptides were suggested, in order to achieve higher affinity complexes. We identified the hexapeptide LKEADE as showing higher affinity for fIXa, which we suggest to be used on rational drug design studies for anticoagulant drugs. The superfamily of proteins known as serpins (“Serine Protease Inhibitors”) involve a number of similar structures, found in a wide variety of organisms. Its function was initially identified as an inhibitor of blood clotting serine proteases. However, many serpins have lost that function in the course of natural evolution. Hidden Markov models were then used to create profiles classifying those proteins due to their biological function. We created signatures for each group of functional serpins in the form of consensus sequences and distinct amino acid patterns. A blood clotting-specific model was generated, which has yielded the regular expression [IVTLM]-[FLVA]-F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV]. Such pattern also codes for a region of the structure involved in an extensive conformational change. The change is related to the activation of the serpin, and, therefore, both pattern and sequence should be investigated. Combined, these information suggest a powerful target for blood clotting inhibition.