[pt] A utilização de drogas à base de platina é o tratamento de primeira linha para diversos tipos de câncer. Pacientes tratados com estas drogas apresentam resultados melhores que os obtidos com outros regimes de quimioterapia para os mesmos tipos de malignidades. As principais limitações para a utilização destes compostos são os efeitos colaterais severos e a resistência dos tumores ao tratamento. A cisplatina foi a primeira droga dessa categoria a ser empregada. Desde o final dos anos 70 até hoje, esta droga vem sendo amplamente utilizada e com sucesso substancial. Acredita-se que o principal mecanismo de ação desta classe de medicamentos seja a ligação de dois sítios ativos da platina com o DNA das células tumorais, impedindo sua multiplicação e finalmente induzindo a apoptose, o que provoca a redução, e em alguns casos a eliminação, dos tumores. Entretanto, devido à complexidade dos mecanismos envolvidos, uma descrição clara da atuação intracelular destas drogas ainda não foi estabelecida. A combinação de técnicas de separação como eletroforese ou cromatografia líquida de alta performance com técnicas de espectrometria atômica tem se apresentado como uma poderosa alternativa para investigação de fenômenos biológicos que envolvem, de alguma maneira, espécies metálicas. A hifenação destas técnicas permite a separação e detecção em linha de biomoléculas contendo metais, possibilitando a obtenção de informações únicas sobre os processos biológicos. O presente trabalho apresenta o desenvolvimento de métodos analíticos utilizando eletroforese em gel de agarose (GE), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) para a determinação de biomoléculas contendo platina em materiais biológicos. O principal objetivo do trabalho é fornecer ferramentas analíticas para o estudo dos mecanismos de ação de drogas à base de platina em humanos. Foram utilizados diversos materiais biológicos, como sangue, urina e culturas de células. A cromatografia líquida em fase reversa foi usada na determinação das drogas intactas e de seus produtos de hidrólise; a cromatografia de exclusão por tamanho foi empregada para a avaliação de proteínas presentes nas amostras enquanto a cromatografia de par iônico para separação de fragmentos de DNA. A detecção de platina nos eluatos por ICP-MS permitiu a obtenção de cromatogramas limpos apresentando claramente as moléculas contendo platina. A evidência da aplicabilidade dos métodos desenvolvidos foi avaliada com a prospecção de biomarcadores de eficiência do tratamento com cisplatina. Diversas linhagens celulares foram expostas a diferentes tratamentos com cisplatina e tiveram seus comportamentos avaliados. A determinação de adutos de DNA contendo platina apresentou-se como uma interessante perspectiva para a obtenção de um biomarcador de resistência ao tratamento com cisplatina. / [en] The use of platinum-based drugs is the first line treatment for many cancers. Patients treated with these drugs present better outcome when compared with other chemotherapy regimens for the same types of malignancies. The major limitations to the use of these drugs are the severe side effects and resistance tumors present to the treatment. Cisplatin was the first platinum-based drug to be approved for human use. Since the late 1970 s until today, this drug has been widely used with great success. It is believed that the major mechanism of action of these drugs is the binding of two active sites of platinum complexes with the DNA of the tumor cells, preventing their multiplication and finally inducing apoptosis, that leads to a reduction, and in some cases eliminating, tumors. However, due to the complexity of the mechanisms involved, a clear description of the intracellular action of these drugs has not been established. The combination of separation techniques such as electrophoresis or high performance liquid chromatography with atomic spectrometric techniques has emerged as a powerful alternative for investigation metal-related biological phenomena. The so called hyphenation of these techniques allows the separation and detection of biomolecules containing metals, making possible to obtain unique information about biological processes. This work presents the development of analytical methodologies using agarose gel electrophoresis (GE), high performance liquid chromatography (HPLC) and inductively coupled plasma with mass spectrometry (ICP-MS) for the determination of platinum-containing biomolecules in biological materials. The main objective of this work is to provide analytical tools for the study of the mechanisms of action of platinum-based drugs in humans. Various biological materials such as blood, urine and cell cultures were used. Reverse phase liquid chromatography was used for the determination of intact drugs and its hydrolysis products; size exclusion chromatography was used to assess the protein profile in samples while the ion-pair chromatography for separation of DNA fragments. The detection of platinum in the eluates by ICP-MS allowed the obtention of clean chromatograms clearly presenting the platinum-containing molecules. The evidence of the applicability of the developed methods was assessed with the search for biomarkers of efficacy of treatment with cisplatin. Several cell lines were exposed to different treatments of cisplatin and their behavior were evaluated. The determination of DNA adducts containing platinum presented an interesting approach for obtaining a marker of resistance to cisplatin treatment.

Angiogênese é o processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir dos vasos existentes. É um processo vital, mas muitas doenças também dependem deste mecanismo para obter nutrientes e progredir. Estas \"doenças dependentes de angiogênese\" incluem cânceres, retinopatias e degeneração macular. Alguns inibidores da angiogênese foram desenvolvidos na última década, com o objetivo de auxiliar no manejo dessas doenças e melhorar a qualidade de vida dos pacientes. A maioria destes compostos funciona inibindo a ligação de VEGFA/VEGFR2, que também é um elemento importante para a sobrevivência de células endoteliais quiescentes; e isso pode explicar parcialmente eventos adversos observados em alguns ensaios clínicos. Nossa hipótese é que a melhoria das terapias anti-angiogênicas depende de uma compreensão melhor e mais ampla desse processo, especialmente quando relacionada à progressão das doenças. Utilizando RNA-Seq e um modelo animal bem aceito de angiogênese, o modelo murino de Retinopatia Induzida por Oxigênio, exploramos o transcritoma e identificamos 153 genes diferencialmente expressos durante a angiogênese. Uma extensiva validação de vários genes realizada por qRT-PCR e hibridização in-situ confirmou a superexpressão de Esm1 em células endoteliais de tecidos com angiogênese ativa. A análise de enriquecimento desta lista de genes confirmou a ligação da angiogênese com genes frequentemente mutados em tumores, consistente com a conhecida ligação entre câncer e angiogênese, e forneceu sugestões de fármacos já aprovados que podem ser reutilizados para controlar a angiogênese em circunstâncias patológicas. Finalmente, com base neste panorama amplo da angiogênese, fomos capazes de criar um biomarcador molecular com poder prognóstico para a predição da recidiva de câncer de mama, com aplicações clínicas promissoras. Em resumo, este trabalho revelou com sucesso genes relacionados à angiogênese e forneceu novas alternativas terapêuticas, incluindo potenciais fármacos para reposicionamento. Esse conjunto de genes diferencialmente expressos é também um recurso valioso para investigações futuras. / Angiogenesis is the process of formation of new blood vessels based on existing vessels. It is a vital process but many diseases also rely on this mechanism to get nourishment and progress. These so called angiogenesis-dependent diseases include cancers, retinopathies and macular degeneration. Some angiogenesis inhibitors were developed in the past decade, aiming to help the management of such diseases and improve patients quality of life. Most of these compounds work by inhibiting VEGFA/VEGFR2 binding, which is also a key element to the survival of quiescent endothelial cells; this may partly explain unanticipated adverse events observed in some clinical trials. We hypothesize that the improvement of anti-angiogenesis therapies hinges on a better and broader understanding of the process, especially when related to diseases\' progression. Using RNA-seq and a well accepted animal model of angiogenesis, the murine model of Oxygen Induced Retinopathy, we have explored the transcriptome landscape and identified 153 genes differentially expressed in angiogenesis. An extensive validation of several genes carried out by qRT-PCR and in-situ hybridization confirmed Esm1 overexpression in endothelial cells of tissues with active angiogenesis, providing confidence on the results obtained. Enrichment analysis of this gene list endorsed a narrow link of angiogenesis and frequently mutated genes in tumours, consistent with the known connection between cancer and angiogenesis, and provided suggestions of already approved drugs that may be repurposed to control angiogenesis under pathological circumstances. Finally, based on this comprehensive landscape of angiogenesis, we were able to create a prognostic molecular biomarker for prediction of breast cancer relapse, with promising clinical applications. In summary, this work successfully unveiled angiogenesis-related genes, providing novel therapeutic alternatives, including potential drugs for repositioning. The set of differentially expressed genes is also a valuable resource for further investigations.

Angiogênese é o processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir dos vasos existentes. É um processo vital, mas muitas doenças também dependem deste mecanismo para obter nutrientes e progredir. Estas \"doenças dependentes de angiogênese\" incluem cânceres, retinopatias e degeneração macular. Alguns inibidores da angiogênese foram desenvolvidos na última década, com o objetivo de auxiliar no manejo dessas doenças e melhorar a qualidade de vida dos pacientes. A maioria destes compostos funciona inibindo a ligação de VEGFA/VEGFR2, que também é um elemento importante para a sobrevivência de células endoteliais quiescentes; e isso pode explicar parcialmente eventos adversos observados em alguns ensaios clínicos. Nossa hipótese é que a melhoria das terapias anti-angiogênicas depende de uma compreensão melhor e mais ampla desse processo, especialmente quando relacionada à progressão das doenças. Utilizando RNA-Seq e um modelo animal bem aceito de angiogênese, o modelo murino de Retinopatia Induzida por Oxigênio, exploramos o transcritoma e identificamos 153 genes diferencialmente expressos durante a angiogênese. Uma extensiva validação de vários genes realizada por qRT-PCR e hibridização in-situ confirmou a superexpressão de Esm1 em células endoteliais de tecidos com angiogênese ativa. A análise de enriquecimento desta lista de genes confirmou a ligação da angiogênese com genes frequentemente mutados em tumores, consistente com a conhecida ligação entre câncer e angiogênese, e forneceu sugestões de fármacos já aprovados que podem ser reutilizados para controlar a angiogênese em circunstâncias patológicas. Finalmente, com base neste panorama amplo da angiogênese, fomos capazes de criar um biomarcador molecular com poder prognóstico para a predição da recidiva de câncer de mama, com aplicações clínicas promissoras. Em resumo, este trabalho revelou com sucesso genes relacionados à angiogênese e forneceu novas alternativas terapêuticas, incluindo potenciais fármacos para reposicionamento. Esse conjunto de genes diferencialmente expressos é também um recurso valioso para investigações futuras. / Angiogenesis is the process of formation of new blood vessels based on existing vessels. It is a vital process but many diseases also rely on this mechanism to get nourishment and progress. These so called angiogenesis-dependent diseases include cancers, retinopathies and macular degeneration. Some angiogenesis inhibitors were developed in the past decade, aiming to help the management of such diseases and improve patients quality of life. Most of these compounds work by inhibiting VEGFA/VEGFR2 binding, which is also a key element to the survival of quiescent endothelial cells; this may partly explain unanticipated adverse events observed in some clinical trials. We hypothesize that the improvement of anti-angiogenesis therapies hinges on a better and broader understanding of the process, especially when related to diseases\' progression. Using RNA-seq and a well accepted animal model of angiogenesis, the murine model of Oxygen Induced Retinopathy, we have explored the transcriptome landscape and identified 153 genes differentially expressed in angiogenesis. An extensive validation of several genes carried out by qRT-PCR and in-situ hybridization confirmed Esm1 overexpression in endothelial cells of tissues with active angiogenesis, providing confidence on the results obtained. Enrichment analysis of this gene list endorsed a narrow link of angiogenesis and frequently mutated genes in tumours, consistent with the known connection between cancer and angiogenesis, and provided suggestions of already approved drugs that may be repurposed to control angiogenesis under pathological circumstances. Finally, based on this comprehensive landscape of angiogenesis, we were able to create a prognostic molecular biomarker for prediction of breast cancer relapse, with promising clinical applications. In summary, this work successfully unveiled angiogenesis-related genes, providing novel therapeutic alternatives, including potential drugs for repositioning. The set of differentially expressed genes is also a valuable resource for further investigations.

The main expansion of the discovery of genetic variants associated with complex diseases has occurred during the last decade. This expansion has been accompanied, and in some sense motivated, by the desire to use this information to improve the predictive capacity of many diseases with an unidentified familial component, including coronary heart disease (CHD), with the aim of translating this genetic knowledge into clinical practice. This doctoral thesis is structured in two lines of investigation that address distinct aspects of this issue, first to evaluate the possible role of genetic variation in a candidate gene in modulating CHD risk, and second to evaluate whether genetic information can be used to improve risk assessment tools used in clinical practice. In the first research line (described in Part I), we investigate the contribution of genetic variation in one of the most widely-studied genes in cardiovascular genetics, ESR1, which encodes the Oestrogen receptor α protein. We provide a solid meta-analysis of evidence regarding the most widely-studied variant in this gene and we further explore the role of a broad range of common and uncommon variants in this gene in CHD risk. Using these approaches, we find no evidence of association between the genetic variants studied and CHD risk. However, although we can confidently accept that common genetic polymorphisms are not associated with cardiovascular disease, we cannot discard the possibility that other types of variation in this gene (for instance epigenetic variation) could modify susceptibility to cardiovascular disease, or that other elements of this pathway are associated with an increased risk of CHD. In this research I have provided a reliable answer to this long running unanswered question in cardiovascular genetics, allowing research to re-focus on other elements of this system or other pathways. In the second line, we explored the possible utility of genetic information obtained from genome-wide association studies (GWAS) in prediction of 10-year risk of CHD events by adding this information to cardiovascular risk functions. We have followed the recommendations proposed by the American Heart Association for evaluating the utility of novel biomarkers in clinical practice, and have demonstrated that although the magnitudes of the effects of these genetic variants on CHD risk are modest, there is a tendency towards improvement in the capacity of the risk functions to predict future CHD events. The translation of genetic information into clinical practice was one of the main motivations for the investment in genome-wide association studies, and my research represents one of the first efforts to explore this possibility. / L’expansió principal pel que fa al descobriment de variants genètiques associades amb malalties complexes s’ha dut a terme durant la última dècada. Aquesta expansió ha estat acompanyada, i d’alguna forma motivada, pel desig d’usar aquesta informació per millorar la capacitat de predicció d’aquelles malalties on hi és present un cert component familiar però en les que no es coneixien les variants que conferien un major risc de patir la malaltia, entre elles la cardiopatia isquèmica (CI). La present tesis doctoral està estructurada en dues línies d’investigació que avaluen el possible rol d’un gen candidat en la susceptibilitat de la CI i també avalua la millora en la capacitat de predicció d’un esdeveniment coronari de les eines usades habitualment en la pràctica clínica mitjançant la inclusió d’informació genètica. Més concretament, la primera línea d’investigació es centra en la contribució de la variació genètica en un dels gens més estudiats en relació amb CI: el gen que codifica pel receptor d’estrogens alfa (ESR1). En aquesta línea hem proveït un sòlid meta-anàlisis entre la variant més àmpliament estudiada d’aquest gen i risc coronari i també hem explorat el paper de la majoria de les variants comunes descrites en aquest gen i risc de CI. Mitjançant cap dels anàlisis hem trobat evidència d’associació entre les variants genètiques en aquest gen i el risc de CI. No obstant això, i encara que podem acceptar que les variants genètiques comunes d’aquest gen no estan associades amb esdeveniments coronaris, no podem descartar que altres tipus de variació en aquest gen (com per exemple variació epigenètica) pugui estar modificant la susceptibilitat a patir un esdeveniment coronari, ni tampoc que altres elements de la mateixa cadena de senyalització estiguin associats amb la malaltia. En la segona línea d’investigació, hem explorat el possible paper de les variants genètiques, obtingudes mitjançant estudis d’associació global del genoma (GWAS), en la millora de la capacitat de predicció a 10 anys dels esdeveniments coronaris, mitjançant la seva addició en les funcions de risc cardiovascular clàssiques. Hem seguit les recomanacions proposades per la American Heart Association per l’avaluació en la pràctica clínica de nous biomarcadors, i hem demostrat que, tot i que la magnitud de l’associació d’aquestes variants és modesta, hi ha una tendència cap a la millora de la capacitat de predicció de les funcions de risc.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:29:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5307.pdf: 3018065 bytes, checksum: 4a4ed79b44dafeeb1204798dc8f70256 (MD5) Previous issue date: 2013-06-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / This thesis aimed to evaluate the use of cholinesterases (ChE) of the cladoceran species Pseudosida ramosa and Daphnia magna as a biochemical biomarker of the presence and effects of anatoxin-a(s) at different levels of biological organization (molecular, individual and population), besides the combined effects of the mixtures of the hepatotoxic (microcystins) and neurotoxic (anatoxin-a(s)) extracts in D. magna. A microplate assay was adapted and optimized for measuring the ChE activity of P. ramosa, in order to produce an assay protocol for this species. The analysis on the performance of ChE assays in P. ramosa showed that these are suitable for the quantifying of enzymatic activity in this species. P. ramosa showed to be an adequate alternative to the exotic cladoceran D. magna. Thus, it was proposed an assay protocol, which it meets the best combination of parameters for the using of ChE activity of P. ramosa as a biochemical biomarker. The ChE activity of P. ramosa and D. magna were specific for the indication of the presence of anatoxin-a(s), since no effect on the enzymatic activity of these species was observed when they were exposed to the microcystins. In the acute exposures (48-h) to the anatoxin-a(s) extract and to the paraoxon-methyl, P. ramosa was more sensitive than D. magna for ChE activity and survival endpoints. Also, P. ramosa was more sensitive than D. magna when exposed to the anatoxin-a(s) extract for 7 days. When the relationships between the ChE inhibition and individual and populational endpoints were evaluated, different responses were observed for the studied species. The ChE inhibition in P. ramosa had a very close relationship with the survival in the acute exposures to the anatoxin-a(s) extract and to the paraoxon-methyl. For D. magna, on the other hand, this relationship was not linear, being high levels of ChE inhibition associated with almost no mortality. The ChE activity in P. ramosa was also a good predictor of the chronic effects of anatoxin-a(s) extract at higher levels of biological organization, since ChE inhibition (48 h) was linearly linked to the sub-lethal effects on the reproduction (21 days) and on the population growth rate (21 days). For D. magna, these relationships could not be established, possibly due to species-specific differences in the affinities of both acetylcholinesterase and pseudocholinesterases to the toxicants. Thus, for the using of ChE as a biochemical biomarker in the risk assessments of neurotoxic cyanobacteria blooms in tropical regions, it is recommended the use of native species, especially of P. ramosa, since the model species D. magna could overestimate the risk to the local species. When the effects of the mixtures of the hepatotoxic and neurotoxic extracts were evaluated on the survival and feeding rates of D. magna, additive and synergistic responses were only observed on the feeding rates. Therefore, since different types of cyanotoxins are found in the natural environments in combination, the risks of these toxins on the zooplanktonic community should be evaluated not only individually, but also as mixtures. / Esta tese teve como objetivo avaliar o uso das colinesterases (ChE) das espécies de cladóceros Pseudosida ramosa e Daphnia magna como um biomarcador bioquímico da presença e dos efeitos de anatoxina-a(s) em diferentes níveis de organização biológica (molecular, individual e populacional), além dos efeitos combinados das misturas dos extratos hepatotóxicos (microcistinas) e neurotóxicos (anatoxina-a(s)) em D. magna. Um ensaio de microplacas foi adaptado e otimizado para medir a atividade de ChE da P. ramosa, a fim de produzir um protocolo de ensaio para esta espécie. A análise sobre o desempenho dos ensaios de ChE em P. ramosa mostrou que estes são adequados para a quantificação da atividade enzimática nesta espécie. P. ramosa mostrou ser uma alternativa adequada para o cladócero exótico D. magna. Assim, foi proposto um protocolo de ensaio, o qual reúne a melhor combinação de parâmetros para a utilização da atividade de ChE da P. ramosa como um biomarcador bioquímico. A atividade de ChE da P. ramosa e da D. magna foram específicas para a indicação da presença de anatoxinaa( s), uma vez que nenhum efeito sobre a atividade enzimática dessas espécies foi observado quando elas foram expostas às microcistinas. Nas exposições agudas (48 h) ao extrato de anatoxina-a(s) e ao paraoxon-metil, P. ramosa foi mais sensível do que D. magna para os parâmetros atividade de ChE e sobrevivência. Também, P. ramosa foi mais sensível do que D. magna quando exposta ao extrato de anatoxina-a(s) por sete dias. Quando as relações entre a inibição de ChE e os parâmetros individuais e populacionais foram avaliados, diferentes respostas foram observadas para as espécies estudadas. A inibição de ChE em P. ramosa teve uma relação muito próxima com a sobrevivência nas exposições agudas ao extrato de anatoxina-a(s) e ao paraoxon-metil. Para D. magna, por outro lado, esta relação não foi linear, sendo níveis altos de inibição de ChE associados com quase nenhuma mortalidade. A atividade de ChE em P. ramosa foi também um bom preditor dos efeitos crônicos do extrato de anatoxina-a(s) em níveis mais elevados de organização biológica, uma vez que a inibição de ChE (48 h) foi associada linearmente aos efeitos sub-letais na reprodução (21 dias) e na taxa de crescimento populacional (21 dias). Para D. magna, essas relações não puderam ser estabelecidas, possivelmente devido a diferenças espécie-específicas nas afinidades da acetilcolinesterase e das pseudocolinesterases aos tóxicos. Assim, para a utilização de ChE como um biomarcador bioquímico nas avaliações de risco de florescimentos de cianobactérias neurotóxicas em regiões tropicais, recomenda-se o uso de espécies nativas, especialmente da P. ramosa, uma vez que a espécie modelo D. magna poderia superestimar o risco para as espécies locais. Quando os efeitos das misturas dos extratos hepatotóxicos e neurotóxicos foram avaliados sobre a sobrevivência e as taxas alimentares da D. magna, respostas aditivas e sinergísticas foram observadas apenas nas taxas alimentares. Portanto, uma vez que diferentes tipos de cianotoxinas são encontrados nos ambientes naturais em combinação, os riscos dessas toxinas sobre a comunidade zooplanctônica deveriam ser avaliados não apenas individualmente, mas também como misturas.

[ES] El curso natural de los tumores va acompañado de la acumulación progresiva de alteraciones genómicas, propiciando una cadena de eventos que resultan en inestabilidad genómica (IG). Éste fenómeno, caracterizado por alteraciones en el número de copias, constituye un hallmark genómico con impacto pronóstico más allá de la histología y otras características moleculares del tumor. En el ámbito de la investigación en oncología ginecológica, la IG ha ganado fuerza en los últimos años, permitiendo la estratificación de pacientes de acuerdo al pronóstico y la respuesta a agentes que dañan el ADN, como las terapias basadas en platinos y los inhibidores de PARP. En el cáncer de ovario, en particular, se ha descrito un subgrupo molecular caracterizado por alta incidencia de alteraciones en el número de copias relacionado con un mejor pronóstico y respuesta a quimioterapia. Esta correlación presenta la IG como un buen marcador predictivo y pronóstico. Así, un modelo basado en la IG trasladable a la práctica clínica constituirá una herramienta útil para la optimización de la toma de decisiones. La era de la medicina personalizada llegó de la mano de los estudios integrativos, donde las técnicas de alto rendimiento se aplican de manera combinada para obtener una visión molecular global de los tumores, completando y complementando la caracterización clásica a nivel anatómico e histológico. Esta tesis propone un estudio global de la IG como biomarcador pronóstico y predictivo de respuesta en cáncer ginecológico, haciendo hincapié en el cáncer de ovario seroso de alto grado y cáncer de endometrio. A través de la aplicación de estrategias basadas en NGS con la adaptación de pipelines de análisis disponibles obtuvimos los perfiles de IG de muestras de tejido fijadas en formol y embebidas en parafina, de una manera fiable, portable y coste efectiva, combinando herramientas de machine learning para ajustar modelos predictivos y pronósticos. Partiendo de esta premisa, ajustamos y validamos, en cohortes clínicas bien caracterizadas, tres modelos a partir de los datos ómicos individuales y un modelo integrativo (Scarface Score) que demostró la capacidad de predecir la respuesta a agentes que dañan el ADN en un escenario clínico concreto de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado. Paralelamente, desarrollamos y validamos un algoritmo basado en el perfil de mutaciones, con impacto pronóstico, en cáncer de endometrio. Este algoritmo consiguió una estratificación que respondía al perfil de IG de los pacientes. Finalmente, se caracterizó un panel de líneas celulares de cáncer de ovario a nivel de respuesta, genético y genómico. Se interrogó el estatus de la vía de recombinación homóloga y su asociación a patrones de IG, completando el perfil molecular y estableciendo las bases para futuros estudios preclínicos y clínicos. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral presentan herramientas de gran valor para el manejo clínico en cuanto a la búsqueda de una medicina personalizada. Adicionalmente, diferentes estudios para trasladar el modelo predictivo a otros escenarios clínicos pueden ser explorados, usando como base el planteado, pero restableciendo puntos de corte nuevos y específicos. / [CA] El curs natural dels tumors va acompanyat de l'acumulació progressiva d'alteracions genòmiques, propiciant una cadena d'esdeveniments que resulten en inestabilitat genòmica (IG). Aquest fenomen, caracteritzat per la presencia de alteracions en el nombre de cópies, constitueix un hallmark genòmic amb impacte pronòstic més enllà de la histologia i altres característiques moleculars del tumor. En l'àmbit de la recerca en oncologia ginecològica, la IG ha guanyat força en els últims anys, permetent l'estratificació de pacients d'acord amb el pronòstic i la resposta d'agents que danyen l'ADN, com les teràpies basades en platins i els inhibidors de PARP. En el càncer d'ovari en particular, s'ha descrit un subgrup molecular caracteritzat per una alta incidència d'alteracions en el nombre de còpies relacionat amb un millor pronòstic i resposta a quimioteràpia. Aquesta correlació presenta la IG com un marcador predictiu i pronòstic adeqüat. Així, un model basat en la IG traslladable a la pràctica clínica constituirà una eina útil per a l'optimització de la presa de decisions. L'era de la medicina personalitzada va arribar de la mà dels estudis integratius, on les tècniques d'alt rendiment s'apliquen de manera combinada per a obtenir una visió molecular global dels tumors, completant i complementant la caracterització clàssica a nivell anatòmic i histològic. Aquesta tesi proposa un estudi global de la IG com a biomarcador pronòstic i predictiu de resposta en càncer ginecològic, posant l'accent en el càncer d'ovari serós d'alt grau i càncer d'endometri. A través de la aplicación d'estratègies basades en NGS amb l'adaptació de pipelines d'anàlisis disponibles, vam obtenir els perfils de IG de mostres de teixit fixades en formol i embegudes en parafina d'una manera fiable, portable i cost efectiva, combinant eines de machine learning per a ajustar models predictius i pronòstics. Partint d'aquesta premissa, vam ajustar i validar, en cohortes clíniques ben caracteritzades, tres models a partir de les dades omiques individuals i un model integratiu (Scarface Score) que va demostrar la capacitat de predir la resposta a agents que danyen l'ADN en un escenari clínic concret de pacients amb càncer d'ovari serós d'alt grau. Paral·lelament, desenvoluparem i validarem un algoritme basat en el perfil de mutacions amb impacte pronòstic en càncer d'endometri. Aquest algoritme va aconseguir una estratificació que responia al perfil de IG dels pacients. Finalment, es va caracteritzar un panell de línies cel·lulars de càncer d'ovari a nivell de resposta, genètic i genòmic. Es varen interrogar l'estatus de la via de recombinació homòloga i la seua associació a patrons de IG, completant el perfil molecular i establint les bases per a futurs estudis preclínics i clínics. Els resultats obtinguts en aquesta tesi doctoral presenten eines de gran valor per al maneig clínic en quant a la cerca d'una medicina personalitzada. Addicionalment, diferents estudis per a traslladar el model predictiu a altres escenaris clínics poden ser plantejats, usant com a base el propost però restablint punts de tall nous i específics. / [EN] The natural course of tumors matches the progressive accumulation of genomic alterations, triggering a cascade of events that results in genomic instability (GI). This phenomenon includes copy number alterations and constitutes a genomic hallmark that defines specific outcomes beyond histology and other molecular features of the tumor. In the context of gynaecologic oncology research, GI has gained strength in the last years allowing the stratification of patients according to prognosis and response to certain DNA-damaging agents, such as platinum-based therapies and PARP inhibitors. Particularly in ovarian and endometrial cancers, it has been described a molecular subgroup characterized by high copy number alterations (CNA) related to good prognosis and better response to chemotherapy. This relationship highlights GI as a predictive and prognostic biomarker. Hence, a GI-based model translated into clinical practice would constitute a tool for optimizing clinical decision-making. The era of personalised medicine arrived together with the coming of integrative studies, where results of high-throughput techniques are combined to obtain a comprehensive molecular landscape of the diseases, bringing a new paradigm to characterize the tumors beyond classical anatomic and histological characteristics. This thesis proposes a global study of the phenomenon of GI as a prognostic and predictive biomarker of treatment response in gynaecological cancers, mainly focused on high-grade ovarian cancer and endometrial cancer. Through the development of an NGS-based strategy with the adaptation of available pipelines of analysis, we obtained GI profiles on formalin-fixed paraffin-embedded samples in a reliable, portable, and cost-effective approach, with the combination of Machine Learning tools to fit prognostic and predictive models based on the integration of omic data. Based on that premise, we fit and validated, in well-characterized clinical cohorts, three single-source models and an integrative ensemble model (Scarface Score) that proved to be able to predict response to DNA-damaging agents in a clinical scenario of High-Grade Serous Ovarian Cancer. In addition, a mutational-based algorithm (12g algorithm) with prognostic impact was developed and validated for endometrial cancer patients. This algorithm achieved a GI-based stratification of patients. Finally, a panel of ovarian cancer cell lines was characterized at the response, genetic and genomic level, interrogating homologous recombination repair pathway status and its associated GI profiles, completing the molecular landscape, and establishing the basis and breeding ground of future preclinical and clinical studies. The results reported in this Doctoral Thesis provide valuable clinical management tools in the accomplishment of a reliable tailored therapy. Additionally, future studies in different tumor types and drugs for implementation of the predictive model can be planned, using as a base the defined one but re-establishing new and specific cut-offs. / The present doctoral thesis was partially funded by GVA Grants “Subvencions per a la realització de projectes d’i+d+i desenvolupats per grups d’investigació emergents (GV/2020/158)” and “Ayudas para la contratación de personal investigador en formación de carácter predoctoral” (ACIF/2016/008), “Beca de investigación traslacional Andrés Poveda 2020” from GEICO group and Phase II clinical trial (POLA: NCT02684318, EudraCT 2015-001141-08, 03.10.2015). This study was awarded the Prize “Antonio Llombart Rodriguez-FINCIVO 2020” from the Royal Academy of Medicine of the Valencian Community / López Reig, R. (2023). Genomic instability as a predictive biomarker for the application of DNA-damaging therapies in gynecological cancer patients [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/199026

Introdução - A intoxicação por chumbo é um conhecido problema de saúde pública e o envenenamento por este metal pode causar danos a vários órgãos, especialmente ao Sistema Nervoso Central de crianças em desenvolvimento. Objetivo geral- estudar a associação entre exposição a chumbo e comportamento anti-social (CAS) em adolescentes brasileiros. Objetivos específicos: a) analisar a associação entre exposição a chumbo e CAS / cometimento de atos infracionais (CAI); b) estudar potenciais fontes de exposição domiciliar a chumbo que mais estão associadas a altas concentrações de chumbo no esmalte dentário (CCED) e; c) avaliar o impacto de alterações metodológicas na técnica de microbiópsia ácida de esmalte dentário superficial (MAEDS) sobre CCED e profundidade da bíópsia. Métodos- Um estudo transversal foi conduzido com 173 jovens (Bauru, SP). MAEDS foram realizadas nestes jovens por dois diferentes protocolos metodológicos. Além disso, questionários sobre comportamento dos adolescentes e exposição a possíveis fontes de contaminação por chumbo foram aplicados a pais e adolescentes. Análises de regressão logística, testes de Wilcoxon e testes t pareados foram aplicados aos dados. Resultados- Odd ratios ajustados para covariáveis indicaram que alta CCED está associada a risco aumentado de exceder o escore clínico para queixas somáticas, problemas sociais, comportamento de quebrar regras e problemas externalizantes (IC 95%). Alta CCED não foi associado com escores elevados de CAI. Os fatores de risco mais associados com alta CCED foram residir em área contaminada ou até 2 km da área contaminada e trabalhar na fabricação de tintas, pigmentos, cerâmicas ou baterias. A profundidade da biópsia, calculada pela fórmula da altura do cilindro, para um dos protocolos, levou a resultados errôneos de profundidade da biópsia, confirmados por testes de perfilometria. Conclusões- A exposição a altos níveis de chumbo parece disparar o estabelecimento de CAS, o que alerta para a necessidade de desenvolvimento e implantação de políticas públicas de saúde que previnam o envenenamento da população por chumbo. Adolescentes foram expostos ao chumbo por algumas fontes estudadas, no Brasil. O esmalte dentário é um marcador fidedigno e a MAEDS é bastante útil e confiável. No entanto, CCEDs não podem ser comparadas entre resultados de pesquisas diferentes quando houver qualquer variação metodológica entre os estudos, havendo a necessidade da padronização do procedimento. / Introduction - Lead poisoning is a long known public health problem. Thus, lead exposure may cause damage to diverse organs, especially in the Central Nervous System of children in developing process. Objectives- a) to analyze the association between lead exposure and antisocial / delinquent behavior; b) to study the potential sources of lead home exposure more associated to high dental enamel lead levels (DELL) and c) to evaluate two distinct enamel biopsy protocols in relation to biopsy depth and DELL. Methods- A cross-sectional study was conducted with 173 adolescents (Bauru, SP, Brazil). Surface dental enamel (SDE) etch-acid microbiopsies were performed in upper central incisors of these youths by two different methodological protocols. In addition, questionnaires about adolescents behavior and about possible sources of lead contamination were responded by youths and their parents. Logistic regression, Wilcoxon and paired t tests were applied to data. Results- Odd ratios adjusted for familial and social covariates indicated that high DELL is associated with increased risk of exceeding the clinical score for somatic complaints, social problems, rulebreaking behavior (T70) and externalizing problems (T63) (CI 95%). High DELL was not found to be associated with elevated SRD scores. The risk factors associated to high DELL were residing in contaminated area or close proximity and working in paints, pigments, ceramic or batteries manufacturing. The biopsy depth, calculated by the cylinder formula, for Protocol II induced misleading results, as confirmed by profilometry tests. Conclusions- It seems that exposure to high lead levels can indeed trigger antisocial behavior, which claims for public policies to prevent lead poisoning. Adolescents were exposed to lead, by some studied sources, in Brazil. SDE, measured by etch-acid microbiopsy, is a reliable biomarker, but DELL could not be compared when there is some methodological variation among the studies. A standardization of the procedure is necessary.

Introdução - A intoxicação por chumbo é um conhecido problema de saúde pública e o envenenamento por este metal pode causar danos a vários órgãos, especialmente ao Sistema Nervoso Central de crianças em desenvolvimento. Objetivo geral- estudar a associação entre exposição a chumbo e comportamento anti-social (CAS) em adolescentes brasileiros. Objetivos específicos: a) analisar a associação entre exposição a chumbo e CAS / cometimento de atos infracionais (CAI); b) estudar potenciais fontes de exposição domiciliar a chumbo que mais estão associadas a altas concentrações de chumbo no esmalte dentário (CCED) e; c) avaliar o impacto de alterações metodológicas na técnica de microbiópsia ácida de esmalte dentário superficial (MAEDS) sobre CCED e profundidade da bíópsia. Métodos- Um estudo transversal foi conduzido com 173 jovens (Bauru, SP). MAEDS foram realizadas nestes jovens por dois diferentes protocolos metodológicos. Além disso, questionários sobre comportamento dos adolescentes e exposição a possíveis fontes de contaminação por chumbo foram aplicados a pais e adolescentes. Análises de regressão logística, testes de Wilcoxon e testes t pareados foram aplicados aos dados. Resultados- Odd ratios ajustados para covariáveis indicaram que alta CCED está associada a risco aumentado de exceder o escore clínico para queixas somáticas, problemas sociais, comportamento de quebrar regras e problemas externalizantes (IC 95%). Alta CCED não foi associado com escores elevados de CAI. Os fatores de risco mais associados com alta CCED foram residir em área contaminada ou até 2 km da área contaminada e trabalhar na fabricação de tintas, pigmentos, cerâmicas ou baterias. A profundidade da biópsia, calculada pela fórmula da altura do cilindro, para um dos protocolos, levou a resultados errôneos de profundidade da biópsia, confirmados por testes de perfilometria. Conclusões- A exposição a altos níveis de chumbo parece disparar o estabelecimento de CAS, o que alerta para a necessidade de desenvolvimento e implantação de políticas públicas de saúde que previnam o envenenamento da população por chumbo. Adolescentes foram expostos ao chumbo por algumas fontes estudadas, no Brasil. O esmalte dentário é um marcador fidedigno e a MAEDS é bastante útil e confiável. No entanto, CCEDs não podem ser comparadas entre resultados de pesquisas diferentes quando houver qualquer variação metodológica entre os estudos, havendo a necessidade da padronização do procedimento. / Introduction - Lead poisoning is a long known public health problem. Thus, lead exposure may cause damage to diverse organs, especially in the Central Nervous System of children in developing process. Objectives- a) to analyze the association between lead exposure and antisocial / delinquent behavior; b) to study the potential sources of lead home exposure more associated to high dental enamel lead levels (DELL) and c) to evaluate two distinct enamel biopsy protocols in relation to biopsy depth and DELL. Methods- A cross-sectional study was conducted with 173 adolescents (Bauru, SP, Brazil). Surface dental enamel (SDE) etch-acid microbiopsies were performed in upper central incisors of these youths by two different methodological protocols. In addition, questionnaires about adolescents behavior and about possible sources of lead contamination were responded by youths and their parents. Logistic regression, Wilcoxon and paired t tests were applied to data. Results- Odd ratios adjusted for familial and social covariates indicated that high DELL is associated with increased risk of exceeding the clinical score for somatic complaints, social problems, rulebreaking behavior (T70) and externalizing problems (T63) (CI 95%). High DELL was not found to be associated with elevated SRD scores. The risk factors associated to high DELL were residing in contaminated area or close proximity and working in paints, pigments, ceramic or batteries manufacturing. The biopsy depth, calculated by the cylinder formula, for Protocol II induced misleading results, as confirmed by profilometry tests. Conclusions- It seems that exposure to high lead levels can indeed trigger antisocial behavior, which claims for public policies to prevent lead poisoning. Adolescents were exposed to lead, by some studied sources, in Brazil. SDE, measured by etch-acid microbiopsy, is a reliable biomarker, but DELL could not be compared when there is some methodological variation among the studies. A standardization of the procedure is necessary.

Las hormonas recombinantes eritropoyetina (EPO) y hormona de crecimiento (GH), prácticamente iguales a las endógenas y de corta vida media en circulación, son de difícil detección directa en el control antidopaje. Se determinaron los valores poblacionales de los biomarcadores indirectos EPO, receptor soluble de la transferrina, insulin-like growth factor-I (IGF-I) y procolágeno tipo III péptido (P-III-P), en poblaciones seleccionadas de deportistas, y el efecto del ejercicio y los distintos tipos de entrenamiento sobre su concentración sérica. La comparación de resultados obtenidos mediante distintos ensayos demostró la necesidad de una validación exhaustiva previa a su utilización. A excepción del P-III-P, los biomarcadores séricos propuestos para la detección de rhEPO y rhGH no se encuentran directamente afectados por el nivel atlético, el ejercicio o la distinta carga de entrenamiento realizada a lo largo de la temporada deportiva. La edad es la principal influencia sobre las concentraciones séricas de IGF-I y P-III-P. / Direct detection of recombinant peptidic hormones erythropoietin (EPO) and growth hormone (GH), very similar to endogen molecules and with a short half life in blood, is difficult in antidoping control. The main objective of this work is to determine indirect biomarkers' values of EPO, soluble transferrin receptor, insulin-like growth factor-I (IGF-I) and procollagen type III peptide (P-III-P), in selected populations of athletes, and the effect of exercise and different types of training on their concentration in serum. The comparison of results obtained by the different assays showed the need of extensive validation of the analytical techniques before their use in the antidoping field. Excepting P-III-P, proposed biomarkers for the detection of rhEPO and rhGH abuse are not directly influenced by the athletic level, exercise or different training workload along the sport season. Age is the main factor affecting IGF-I and P-III-P concentrations in serum.

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:36:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Todos os animais com células nervosas e musculares possuem a enzima acetilcolinesterase (EC 3.1.1.7, AChE) e essa seqüência de aminoácidos está presente em muitas outras proteínas, com ou sem atividade catalítica, fato que permite que essa proteína seja utilizada em estudos de filogenia e de evolução. A grande diferença de afinidade entre substratos e inibidores é utilizada como um biomarcador para estudos genéticos de vários grupos de animais, especialmente insetos. Peixes possuem uma grande diferença na sensibilidade da AChE ao metil-paraoxon (MP) em relação aos animais terrestres e essa diferença pode estar relacionada à evolução. As constantes cinéticas de inibição (CCI) para o mecanismo de inibição progressivamente irreversível da AChE cerebral ao MP foram determinadas em duas fontes de AChE como um modelo para avaliação do potencial de uso das CCI como biomarcador para estudos evolucionários e filogenéticos. As CCI da AChE cerebral de seis exemplares de tainha (Mugil liza), coletados em duas lagoas da costa do Estado do Rio de Janeiro (Araruama e Saquarema), em tempos diferentes (2005 e 2007, respectivamente), foram determinadas em dois laboratórios distintos (CESTEH - FIOCRUZ e Dept. Bioquímica - UERJ). As CCI, medidas separadamente em cada exemplar, indicaram que essas constantes são preservadas em todos os exemplares de uma mesma espécie e que a metodologia empregada pode ser conduzida em laboratórios distintos sem grandes variações. A AChE cerebral de tainha foi tomada como um exemplo de enzima menos sensível (IC50 = 2118nM) e a de galinha comercial (Gallus gallus domesticus) como um exemplo de uma enzima muito mais sensível ao MP (IC50 = 26nM). Alguns testes foram feitos para a validação dessa metodologia. A AChE cerebral dessas duas fontes de enzima foi parcialmente purificada descartando o sobrenadante do homogeneizadoe solubilizando o sedimento com o detergente Triton X-100. A inibição da atividade de AChE nessas preparações pelo substrato acetiltiocolina, comportamento típico da AChE, comprovou a homogeneidade dessa atividade enzimática como representativa da AChE verdadeira em cada animal. A utilização do MP permitiu aferir as soluções de inibidorcom métodos colorimétricos no momento do uso e a preparação solúvel de AChE eliminou artefatos insolúveis que atrapalham a quantificação da enzima. Algumas características matemáticas do cálculo das CCI foram discutidas e um modelo foi validado para ser utilizado em estudos de evolução e filogenia de peixes marinhos da costa brasileira. Como a AChE cerebral de todos os animais terrestres, cujos resultados estão disponíveis, é muito mais sensível ao MP, exemplares de uma espécie de baiacu (baiacu-arara, Lagocephaluslaevigatus) foram testados como um exemplo de peixe mais jovem na escala evolutiva. Os resultados das CCI da AChE cerebral para essa espécie (IC50 = 2243nM) indicaram que entre os peixes a idade evolutiva não está correlacionada com a sensibilidade aos organofosforados. A AChE mais sensível entre os peixes testados foi a de um tipo de bagre (bagre-branco, Genidens barbus, IC50 = 606nM) e a enzima do cação-frango (Rhizoprionodonporosus), exemplo de um peixe mais antigo na evolução, apresentou uma sensibilidade intermediária (IC50 = 1280nM). Estudos com outras espécies correlacionadas com aquelas que se mostraram mais sensíveis ao MP terão que ser feitos para uma resposta mais adequada sobre o uso das CCI de inibição da AChE cerebral por MP como possível marcador evolutivo e filogenético. / The enzyme acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7, AChE) is present in all animals with neurons and muscle cells, and many other proteins have the same sequence, with or without catalytic activity, allowing them to be used for phylogenetic and evolutionary studies. The great difference between substrates and inhibitor affinities makes it useful as a biomarker for genetic studies of various animals groups, especially insects. There are great differences among fish in AChE sensitivity to methyl-paraoxon (MP) in relation to terrestrial animals, and these differences can be related to evolution. The inhibition kinetic constants (IKC) for progressive irreversible inhibition of brain AChE with MP were determined in these two AChE sources as models for evaluating IKC as potential biomarkers in evolutionary and phylogenetic studies, especially among fish. IKC of brain AChE from six specimens of Mugil liza, a very common coastal fish, was collected from two of Brazil's lagoons in Rio de Janeiro State during 2005 at Araruama and 2007 at Saquarema. First samples were assayed at CESTEH - Fundação Oswaldo Cruz and the latter at Dept. Bioquímica - Universidade do Estado do Rio de Janeiro. The IKC was measured separately for each fish showing that these constants were maintained for all animals of the same species and that this methodology can be used in different laboratories without variations. The cerebral AChE of tainha was used as an example of a less sensitive enzyme (Concentration which inhibits 50% of enzyme activity after 30 minutes of incubation, or IC50, = 2118nM). The commercial hen (Gallus gallus domesticus) was used an example of a very highly sensitive enzyme to MP (IC50 = 26nM). Some tests were carried out to validate this methodology. The cerebral AChE of these two sources of enzyme was partially purified discarding the supernatant of the homogenate and solubilizing the pellet with Triton X-100 detergent. The AChE activity inhibition in these preparations by excess of the substrate acetylthiocholine, a typical AChE behaviour, proved the homogeneity of this preparation and that it is representative of the real AChE of each animal. Using MP allows checking out the solutions of inhibitor with colorimetric methods in the moment of use. The preparation of soluble AChE eliminates insoluble matters which confound the enzyme quantification. Some characteristics of mathematical calculations of IKC were defined to create a valid model that is able to be used for evolutionary and phylogenic studies of fish and other animals. The cerebral AChE of all terrestrial animals, whose results are available, is highly sensitive to MP. To compare with a similar recently evolved fish, a sample of baiacu (baiacu-arara, Lagocephalus laevigatus) was tested for IKC and the results (IC50 = 2243nM) indicated that evolutionary age of the fish does not correlate with sensitivity to organophosphorus compounds. The most sensitive AChE among the fish tested was a type of catfish (bagre-branco, Genidens barbus, IC50 = 606nM) and the enzyme of an older evolved fish, a small shark (cação-frango, Rhizoprionodon porosus), had an intermediate sensitivity (IC50 = 1280nM). Studies with other species correlated to those being more sensitive to MP have to be made to get adequate answers about the use of IKC for cerebral AChE inhibition by MP as a possible evolutionary and phylogenetic marker.