Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica / Cyclovirus (CyCV) es un agente infeccioso, recientemente descubierto, con un pequeño material genético de DNA circular de hebra simple que codifica para una proteína asociada a la replicación (Rep) y otra a la capside viral (Cap). Infecta diversos organismos eucariontes, incluyendo humanos, donde se han descrito variantes genéticas con prevalencia de hasta 15,7% en niños con parálisis flácida aguda. El genoma del CyCV se ha detectado en distintas muestras biológicas de población enferma y asintomática, desconociéndose su rol patogénico. En Chile, sólo se ha estudiado en aspirado nasofaríngeo de niños con enfermedad respiratoria aguda baja (ERA), detectándose en el 3,3% y describiéndose una nueva cepa viral denominada CyCV-ChileNPA. El objetivo de esta tesis fue detectar y genotipificar variantes de la cepa chilena de cyclovirus en niños y adultos, con y sin enfermedad respiratoria. En 101 menores de un año hospitalizados por ERA, 105 mayores de 18 años hospitalizados por neumonía adquirida en la comunidad (NAC), 104 niños y 104 adultos sin sintomatología respiratoria, por al menos un mes previo al enrolamiento, cuyas muestras respiratorias se obtuvieron entre 2012-2016 en Santiago, se amplificó un fragmento del gen Rep de cyclovirus mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real con el reactivo Kapa PROBE® a partir de extractos de ácidos nucleicos totales obtenidos con el kit MasterPure (Epicenter®). Los amplificados se purificaron con el kit GEL/PCR Purification (FAVORGEN®) y se secuenciaron en Macrogen® (Corea). Las muestras secuenciadas se alinearon con BLAST y con el programa BioEdit® generándose una secuencia consenso. Se detectó CyCV en un 54,3% (57/105) de los adultos NAC; 17,3% (18/104) en adultos sin sintomatología respiratoria; 14,9% en niños con ERA (15/101) y en 48,1% (50/104) de niños sin ERA. Los 79 (84%) amplificados de 149pb tuvieron un 99% de identidad con la secuencia nucleotídica correspondiente de la proteína Rep de CyCV-ChileNPA. Por primera vez se detecta CyCV en muestra respiratoria de adultos, con una frecuencia significativamente mayor en pacientes con NAC que en adultos sin enfermedad respiratoria, lo que sugeriría la presencia de este virus en adultos con enfermedad respiratoria. Por otra parte, la detección en niños fue mayor a la publicada y similar entre casos con y sin ERA / Cyclovirus (CyCV) is a recently discovered infectious agent, with little DNA simple strand genetic material that codifies for a protein associated to the replication (Rep) and to the viral capside (Cap). It infects different eukaryotic organisms, including humans, where it has been described genetic variants with up to 15,7% prevalence in children with acute flaccid paralysis. CyCV genome has been detected in different biological samples in illness and asymptomatic population, with an unknown pathogenic role. In Chile, it has been studied in nasopharyngeal aspirate only in children with lower respiratory tract infections, detected in 3,3% and being described a new viral strain named CyCV-ChileNPA. The objective of this thesis was to detect and genotype the Chilean cyclovirus strain variants in children and adults, with and without respiratory infections. In 101 children under 1 year hospitalized by acute respiratory infection (ARI), 105 adults over 18 years hospitalized by community-acquired pneumonia (CAP), 104 children and 104 adults without respiratory symptomatology, for at least 1 month prior to enrollment, whose samples were obtained between 2012 and 2016 in Santiago, a fragment of the Rep gene of cyclovirus was amplified through a chain reaction of the polymerase in real time using Kapa PROBE® reagent from total nucleic acid extracts obtained with MasterPure kit (Epicenter®). The amplifiers were purified with the GEL/PCR Purification kit (FAVORGEN®) and sequenced in Macrogen® (Corea). The sequenced samples were aligned with BLAST and using BioEdit® program, generating a consensus sequence. CyCV was detected in 54,3% of adults with CAP; 17,3% (18/104) in adults without respiratory symptomatology; 14,9% in children with ARI (15/101) and 48,1% (50/104) children without ARI. All of the 79 amplified (84%) of 149pb had 99% of identity with nucleotide sequence corresponding to CyCV-ChileNPA Rep protein. It is the first time that CyCV is detected in respiratory samples in adults, with a significantly higher frequency in patients with CAP than in adults without respiratory disease, and it would suggest the presence of this virus in adults with respiratory disease. On the other hand, the detection in children was higher than the previously published and similar to cases with and without ARI

Ras é uma proteína G monomérica que converte estímulos extracelulares em sinais bioquímicos intracelulares e controla uma variedade de processos biológicos, tais como, proliferação, diferenciação, adesão e morte celular por apoptose. Além da ativação mediada por fatores de crescimento e hormônios, Ras pode ser ativado pela interação com o óxido nítrico (NO·), um radical capaz de mediar processos de sinalização. Essa interação resulta na S-nitrosação do resíduo de cisteína 118 de Ras. Assim, propusemo-nos avaliar a participação da proteína Ras e das MAP quinases: ERK1/2, JNK e p38 no processo de apoptose de células THP-1 induzida pelo doador de NO·, S-nitrosoglutationa (SNOG). Para tanto, transfectamos células THP-1 com o plasmídeo que carrega o gene que codifica para a proteína Ras mutada, na qual o resíduo de cisteína 118 foi trocado por um resíduo de serina, o que tornou Ras não responsiva ao NO·. A apoptose foi evidenciada através da formação de corpos apoptóticos, exposição de fosfatidilserina e ativação de caspase-3. A modulação da apoptose via reação de S-nitrosação foi demonstrada através da diminuição estatisticamente significativa da exposição de fosfatidilserina nas células transfectadas com o plasmídeo p21 RasC118S quando comparadas com as células selvagens e parentais. A ativação da proteína Ras ocorreu após 5, 15 e 30 minutos da adição de SNOG nas células parentais; entretanto, nas células transfectadas com o plasmídeo p21 RasC118S não observamos resposta de ativação de Ras. A avaliação das MAP quinases revelou ativação de máxima de ERK após 4 horas e ativação máxima de JNK e p38 após 2 horas de incubação com SNOG. Em relação as MAP quinases nas células transfectadas, as células p21 RasC118S apresentaram diminuição apenas da ativação ERK, quando comparadas com as células p21RasWt. A utilização dos inibidores específicos de MEK, JNK e p38; PD09895, CEP11004 e SB22004, respectivamente demonstrou que apenas a inibição de ERK diminuiu significativamente a apoptose nas células THP-1. Concluímos que na apoptose de células THP-1 estimulada por NO·, o radical livre ativa Ras via S-nitrosação, que por sua vez, recruta ERK, MAP quinase participante desta cascata de sinalização. Finalmente, demonstramos que ERK exerce papel fundamental na condução do sinal de apoptose no modelo que estudamos. / Ras is a monomeric small G protein that converts intracellular stimulus into intracellular biochemical signals. Ras controls a myriad of biological processes such as, proliferation, differentiation, adhesion and cell death by apoptosis. In addition to growth factor-mediated activation of Ras, nitric oxide (NO·) directly interacts with and activates Ras via S-nitrosation on a single cysteine residue (Cys118). Therefore, we investigated the participation of Ras and of the MAP kinases (ERK, JNK and p38) in the apoptosis of THP-1 cells induced by the NO· donor S-nitrosoglutathione (SNOG). For that, we transfected THP-1 cells with a plasmid that contains the gene that codifies for the mutated Ras protein, in which the cysteine residue 118 was replaced by a serine. Apoptosis was evidenced by apoptotic bodies formation, phosphatidylserine exposition and caspase-3 activation. Parental and wild type Ras transfected-THP-1 cells (Wt) exposed phosphatidylserine upon treatment with 1.0 mM SNOG. The importance of the S-nitrosation reaction in the process was evidenced by a decrease on phosphatidylserine exposition in the cells transfected with the plasmid p21RasC118S, as compared to parental and wild type cells. Ras activation occurred within the first 30 minutes after SNOG addition to parental cells. However in p21RasC118S transfected cells, we were unable to detect activation of Ras. Regarding the MAP kinases located downstream on the Ras-mediated signaling cascade, ERK activity was maximum after 4 hours incubation with the NO· donor. JNK and p38 MAP kinase followed different kinetics, displaying maximum activity after 2 hours incubation with SNOG. The use of specific inhibitors to MEK, JNK and p38; PD09895, CEP11004 and S822004 respectively has shown that only ERK inhibition has significantly decreased THP-1 cells apoptosis. We concluded that NO· induced apoptosis in THP-1 cells activating Ras by S-nitrosation and recruiting the MAP kinase ERK, a downstream element of this signaling cascade. Furthermore, our findings support a major role for ERK in the NO· mediated apoptosis of THP-1 cells.

A fase aguda é caracterizada pela mudança significativa nos níveis de váriasproteínas plasmáticas. As proteínas amilóide sérica A (SAA) e proteína C reativa (PCR), chamadas de proteínas de fase aguda positivas, têm sua concentração plasmática aumentada em até 1000 vezes durante a inflamação. Espera-se que estas proteínas exerçam um papel importante em algumas etapas do processo inflamatório. Para a PCR existem sólidas evidências de sua participação na ativação do sistema complemento, entretanto para a SAA, a função biológica ainda está para ser esclarecida. No plasma, a SAA encontra-se ligada à lipoproteína de densidade alta (HDL), especialmente a fração HDL3. A SAA associa-se à HDL3 através do deslocamento das apolipoproteínas,- preferencialmente a AI e pouco a AlI. Neste trabalho nos propusemos a avaliar a eficiência da passagem de SAA sérica para os focos inflamatórios. Para este fim doseamos, em 20 exsudatos pleurais e 10 exsudatos ascíticos, e respectivos soros, os seguintes parâmetros: proteínas totais (PT), SAA, PCR, apolipoproteína AI, AlI, 8, colesterol total (CT) e triacilgliceróis (TG). As relações exsudato/soro encontrados para estes parâmetros foram: SAA, 0,11 ± 0,14; PCR 0,31 ± 0,20; AI, 0,48 ± 0,26; AlI, 0,63 ± 0,29; 8, 0,46 ± 0,19; PT, 0,67 ± 0,18; CT, 0,34 ± 0,21; TG, 0,36 ± 0,22. Observamos uma forte correlação entre os níveis séricos de PCR versus SAA e entre AI versus All. Para o exsudato foi mantida a correlação forte somente entre AI versus AlI. Nas correlações entre exsudato e soro observamos correlações moderadas apenas para SAA, AlI e PT. Em função dos nossos resultados, concluímos que a proteína de fase aguda SAA tem acesso ao foco inflamatório e que o conteúdo desta proteína em exsudatos é, pelo menos em sua maioria, originário do soro .. A julgar pelos níveis de apo All encontrados no exsudatos, a permeabilidade das membranas que recobrem as cavidades pleurais e ascíticas é maior para HDL3 do que para HDL2 e LDL, fato es e que garante uma passagem eficiente de SAA para as cavidades. A SAA que tem acesso à cavidade deve sofrer extensa proteólise e/ou associar-se eficientemente às células pois a relação de concentrações exsudato/soro encontrada para SAA é menor que para as demais proteínas analisadas. / Inflammation is characterized by profound changes in the serum leveis of acute phase proteins. The huge increase (up to a 1000 fold) in protein serum amyloid A (SAA) and C reactive protein (CRP) suggests that both proteins exert an important role in the inflammatory processo Although it is known the participation of CRP in the activation of the complement complex, the biological role of SAA is not clear yet. In plasma, SAA is associated to the high density lipoprotein (HDL), especially the HDL3 fraction. The association of SAA to HDL3 causes the displacement of the apolipoproteins A-ll and, especially, A-I. The goal of this study was to evaluate the efficiency of the SAA passage from serum to the inflammatory focus. With this purpose we determined total protein (TP), SAA, PC R, A-I, A-ll, apolipoprotein B (B), total cholesterol (TC) and triglicerides (TG) in 20 samples of pleural exudates and 10 samples of ascitic exudates, and respective serum samples. The ratio exudate/serum found were: SAA, 0, 11±0, 14; CRP 0,31±0,20; A-I, 0,48±O,26; A-ll, 0,63±O,29; 8, 0,46±0, 19; TP, 0,67±0,18; TC, 0,34±0,21; TG, 0,36±0,22. There was a high correlation of the serum leveis of CRP versus SAA and AI versus A-ll. A high correlation in the exudate was only found for AI versus All. The correlation between exudate and serum were moderate and were found only for SAA, A-ll and TP. In conclusion we observed that SAA has access to the exudate and that the content of SAA in the exudate is mainly originated from serum. Considering the leveis of A-ll found in the exudates, we supposed that the permeability of the membranes that cover the pleural and ascitic cavities is higher for HDL3 than for HDL2 and LDL. SAA in the inflamed pleural cavity might suffer an extensive proteolysis and/or efficient association to cells because the ratio exudate/serum found for SAA was lower than for other proteins

Com o objetivo de avaliar a influência do puerpério fisiológico e da fase pós-puerperal de vacas sadias na função hepática e no lipidograma , bem como avaliar as suas inter-relações com alguns distúrbios reprodutivos do puerpério recente (endometrite puerperal aguda e retenção dos anexos fetais); do puerpério tardio (catarros genitais de graus I e II e graus III e IV) e da fase pós puerperal (cisto ovariano e número de inseminações artificiais necessárias para que a vaca ficasse prenhe) foram colhidas 378 amostras de sangue por punção da veia coccígea de vacas da raça Holandesa criadas no Estado de São Paulo. A função hepática foi avaliada por meio da determinação dos teores séricos de proteína total, albumina, alfa-, beta- e gama-globulinas; da atividade enzimática sérica da aspartato-aminotransferase (AST), gama-glutamiltransferase (GGT), creatina-quinase (CK) e determinação dos níveis séricos das bilirrubinas indireta, direta e total enquanto o lipidograma foi avaliado por meio da determinação dos teores séricos de colesterol, triglicérides, ácidos graxos não esterificados e beta-hidroxibutirato e teores plasmáticos de glicose. A análise dos resultados obtidos na presente dissertação bem como a sua discussão evidenciou que a função hepática de fêmeas bovinas sadias da raça Holandesa sofreu influência do puerpério, pois no puerpério recente ? em animais com até 10 dias após o parto - os teores séricos de proteína total, de albumina e das globulinas, bem como das frações beta- e gama-globulinas foram significativamente menores do que os observados no puerpério tardio e fase pós puerperal enquanto a relação albumina/globulinas e a atividade enzimática sérica da aspartato-aminotransferase foram significativamente maiores do que os observados no puerpério tardio e fase pós puerperal. Relativo a influência do puerpério e da fase pós ?puerperal no lipidograma observou-se que os teores séricos de colesterol aumentaram gradativamente com a evolução do puerpério, enquanto os teores de ácidos graxos não esterificados diminuíram gradativamente com a evolução do puerpério, sendo que na fase pós-puerperal (grupo entre 45 e 60 dias pós-parto e no grupo de animais com mais de 60 dias pós-parto) ocorreu a estabilização dos valores de colesterol e de ácidos graxos não esterificados. O puerpério e a fase pós-puerperal não influenciaram os teores séricos e/ou plasmáticos dos seguintes constituintes da função hepática e do lipidograma: alfa-globulinas, gama-glutamiltransferase, creatina-quinase, bilirrubinas, beta-hidroxibutirato e glicose. Dentre os distúrbios da reprodução diagnosticados durante o puerpério recente (endometrite puerperal aguda e retenção dos anexos fetais) e durante o puerpério tardio (catarro genital de graus I e II e catarro genital de graus III e IV) avaliados na presente pesquisa verificou-se que a retenção dos anexos fetais determinou uma hipoalbuminemia, enquanto nos catarros genitais observou-se que os teores séricos de proteína total foram menores do que os observados nos animais sadios, sendo esta alteração decorrente à hipoalbuminemia. A hipoalbuminemia, por sua vez, determinou a diminuição dos valores da relação albumina/globulinas nos animais com catarro genital. Os valores de triglicérides obtidos em animais com endometrite puerperal aguda e com catarro genital de grau III e IV foram significativamente menores do que os observados em animais sadios. Os demais constituintes da função hepática (teores séricos de globulinas e suas frações alfa-, beta- e gama-globulinas; atividade enzimática sérica da aspartato-aminotransferase, gama-glutamiltransferase e creatina-quinase e os níveis séricos das bilirrubinas indireta, direta e total) e do lipidograma (colesterol, ácidos graxos não esterificados, beta-hidroxibutirato e glicose) não sofreram influência dos distúrbios inflamatórios do endométrio que seja diagnosticada no puerpério recente quer seja diagnosticada no puerpério tardio. Desta forma, os resultados obtidos permitem afirmar as seguintes inter-relações entre a função hepática e as endometrites dos bovinos: os valores de albumina de animais com endometrite puerperal aguda, retenção dos anexos fetais e endometrite puerperal crônica são menores do que os obtidos em animais sadios, sendo esses dados sugestivo que a existência da hipoalbuminemia possa estar relacionada a existência de lesões no fígado, possivelmente, associadas a processos endotóxicos. A ocorrência de cisto ovariano durante o período pós-puerperal não influenciou a função hepática e o lipidograma de bovinos. Ao se avaliar as inter-relações entre a função hepática, o lipidograma e o número de inseminações artificiais necessárias para que a vaca ficasse prenha, verificou-se que os teores séricos de colesterol em vacas que precisaram de 5 ou mais inseminações artificiais para ficarem prenhes são significativamente menores do que os observados em animais que ficaram prenhes após a 1ª inseminação artificial. A redução dos teores séricos de colesterol poderia estar relacionados à presença de esteatose hepática ou lesões no fígado que interfiram na sua produção e, conseqüentemente, com a produção de hormônios esteróides como a progesterona e o estrógeno. Os baixos níveis de colesterol poderiam, ainda, afetar a qualidade dos oócitos, pois se demonstrou que a presença de esteróide ativador da meiose (MAS ? meiosis activating sterols), substância precursora do colesterol, é fundamental para que ocorra, in vitro, a reinicialização da meiose em oócitos e in vivo, para que ocorra a progressão da meiose bem como que a qualidade e a viabilidade do oócito seja mantida. Dessa forma, a redução nos teores desse lípide poderia influenciar negativamente a viabilidade dos oócitos, resultando em menor sucesso da inseminação artificial. Relativo às inter-relações entre a função hepática e o número de inseminações artificiais necessárias para que a vaca ficasse prenhe, observou-se na presente pesquisa que a fração beta-globulina sofrem influência do número de inseminações artificiais necessárias para que a vaca ficasse prenhe, visto que os níveis séricos de beta-globulinas foram maiores para o grupo de animais prenhes após a 5ª ou mais inseminação artificial. Nos livros clássicos de patologia clínica são descritos o aumento da fração beta-globulinas em animais com doença hepática ativa. Apesar dos resultados desta pesquisa não terem evidenciado a possibilidade da ocorrência de insuficiência hepática crônica dos animais estudados, as alterações observadas para a fração beta-globulinas associada ao aumento da atividade enzimática da aspartato-aminotransferase observado para animais que ficaram prenhes após a 4ª inseminação artificial, poderia indicar a ocorrência de uma doença hepática ativa, insuficiente para determinar aumentos significativos das enzimas, porém capaz de alterar os valores de beta-globulinas. / Aiming to assess the influence of physiological puerperium and post-puerperal phase on the hepatic function and lipid profile of health cows, as well as to assess their connection with some reproductive disorders of early puerperium (Acute postpartum endometritis and placental retention); late puerperium (genital catarrhal discharges level I and II, and level III and IV) and postpuerperal phase (ovarian cyst and number of artificial inseminations for pregnancy), 378 blood samples were collected by coccygeal vein puncture of Holstein cows raised in the State of São Paulo.Hepatic function was assessed by total serum protein, albumin, α-, β- and γ-globulins; serum enzyme activity of aspartate aminotransferase (AST), gamma glutamyl transpeptidase (GGT), creatine kinase (CK) levels measurement; direct, indirect and total serum bilirubin measurement, and while lipid profile assessment was measured by serum levels of cholesterol, triglycerides, nonesterified fatty acids, β-hydroxybutyrate and plasma glucose level.The results analyses evidenced that puerperia influenced the hepatic function of health Holstein cows due to significant lower levels of total serum protein, albumin, β- and γ-globulins during the early puerperium (up to 10 days postpartum) than in the late puerperal phase whereas significant higher albumin/globulin ratio and serum enzyme activity of aspartate aminotransferase than in late puerperium and post-puerperal phase were observed. With regard to puerperium and post-puerperal phase influence on the lipid profile, gradual increase of serum cholesterol level and decrease of nonesterified fatty acids were observed with puerperal evolution. The values of cholesterol and nonsterified fatty acids were stabilized during post-puerperal phase (from 45-60 days and greater than 60 day postparturm). There was not puerperal and post-puerperal phase influence on serum and/or plasmastic levels of α-globulin, gamma glutamyl transpeptidase, creatine kinase, bilirubin, β-hydroxybutyrate and glucose.Among the reproductive disorders diagnosed during early puerperium (acute puerperal endometritis and placental retention) and late puerperium (genital catarrhal discharges level I and II, and level III and IV) are: hypoalbuminemia caused by placental retention, whereas in cows presenting genital catarrhal discharges there was a lower total serum protein than in health ones, that was due to hypoalbuminemia. Hence, this albumin imbalance determined a decrease in albumin/globulin ratio in cows with genital catarrhal discharges. The triglycerides values in cows with acute postpartum endometritis and genital catarrhal discharges of levels III and IV were significant lower than in health cows. The hepatic function and lipid profile variables measured were not influenced by endometrium inflammatory disorders diagnosed during early and late puerperia. Therefore, the results indicate the following relationship between hepatic function and bovine endometritis: albumin values of cows presenting acute postpuerperal endometritis, placental retention, and chronic puerperal endometritis are lower than those of health cows, and these data suggest that hypoalbuminemia might be related to the existence of hepatic lesions, and possibly, associated with endotoxic processes. Ovarian cyst occurrence during post-puerperal phase did not influence the bovine hepatic function and lipid profile.While assessing the connection among hepatic function, lipid profile and the number of artificial inseminations needed for pregnancy, there were significant lower serum cholesterol levels in cows pregnant after the fifth artificial insemination (A.I.) than in those pregnant after the first A.I. The cholesterol levels decrease might have been related to hepatic steatosis or liver lesions that interfered on its production and, consequently, on the steroid hormone synthesis as progesterone and estrogens. Low cholesterol levels could have also affected the quality of oocytes for being demonstrated meiosis activating sterols (MAS) presence, a cholesterol precursor, that is essential to meiosis restart for oocyte formation in vivo, and to meiosis progression as well as to maintain oocyte quality and viability in vitro. Therefore, these lipids levels decrease could negatively influence on oocytes viability, yielding lower artificial insemination rates. Pertaining to the relationship between hepatic function and number of artificial insemination needed for pregnancy, β-globulin functions were influenced by the latter, considering that serum β-globulin levels were higher in the group of cows pregnant after the fifth than at the first artificial insemination. In classical clinical pathology literature, serum β-globulin levels increase are reported in animals that have active hepatic disease. These results, however, did not evidence chronic hepatic insufficiency; and the observed alterations on the serum β-globulin levels associated to an enzymatic activity increase of aspartate aminotransferase in cows pregnant after the fourth artificial insemination could indicate an active hepatic disease, that was insufficient to determine significant increases of enzyme levels although it altered β-globulin values

Introdução: Os efeitos do treinamento físico sobre o metabolismo de lípides têm sido bastante estudados, mas a situação diametralmente oposta, qual seja, a de pacientes acamados sob cuidados prolongados, tem sido pouco investigada. A avaliação de possíveis impactos derivados da imobilização é importante, pois o período de restrição ao leito pode gerar fatores de risco aterogênicos. Outro ponto relevante é a concentração e o aspecto funcional da HDL, que é fator de proteção anti-aterogênico e estudos têm mostrado a concentração diminuída em indivíduos sedentários. Objetivo: Investigar os efeitos da imobilização prolongada sobre o perfil de lípides, apolipoproteínas e a transferência de lípides para a HDL em pacientes acamados. Métodos: Foram estudados 23 pacientes acamados por um período maior que 90 dias de internação no Hospital Auxiliar de Suzano do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. Foram avaliados o perfil lipídico, a concentração das apolipoproteínas, CETP, LCAT e LDL oxidada. No ensaio de transferência de lípides, as amostras de plasma foram incubadas com a nanopartícula artificial marcada com 3H-éster de colesterol, 14C-fosfolípides, 3H-triglicérides e 14C-colesterol livre. A quantificação da transferência de lípides da nanopartícula foi feita após a precipitação da fração não HDL. Os dados dos pacientes acamados foram comparados com os obtidos de 26 voluntários sedentários saudáveis, pareados por idade e sexo. Resultados: A média de internação dos acamados foi de 817 dias. As concentrações de colesterol não-HDL (148 ± 36 vs 125±40 mg/dL, p<0,05), LDL-C (124±31 vs 96±36 mg/dL, p<0,01), HDL-C (45±10 vs 36±13 mg/dL, p<0,01) foram menores no grupo acamado, enquanto que os triglicérides foram iguais entre os grupos. A apo A-I (134±20 vs 111±24 mg/dL) foi menor nos acamados (p<0,01), e a apo B não apresentou diferença entre os grupos. A LDL oxidada (53±13 vs 43±12 mg/dL) foi menor no grupo acamado (p<0,05), enquanto que a CETP e LCAT não diferiu entre os grupos. As transferências para HDL de éster de colesterol (6,24±1,1% vs 4,80±1,2%), colesterol livre (4,04±1,1% vs 3,05±1,1%), fosfolípides (19,06±1,3% vs 17,32±2,0%) e triglicérides (3,65±0,7% vs 3,06±0,6%) estavam diminuídas nos acamados comparado ao grupo sedentário (p<0,01). Conclusões: O sedentarismo extremo dos pacientes acamados afetou a concentração do HDL-C, apo A-I e as transferências lipídicas da nanopartícula para HDL. Mesmo a menor atividade física exercida no dia-a-dia dos sedentários pode ser determinante na concentração e no metabolismo da HDL. Apesar da menor concentração do LDL-C e os triglicérides não serem diferentes dos sedentários, o status de HDL mostrou-se alterado nos acamados. Devido à importante função anti-aterogênica da HDL, essas alterações metabólicas devem ser um motivo de atenção adicional na assistência a esses pacientes para a prevenção de eventos cardiovasculares. / Introduction: The effects of physical training on lipid metabolism have been deeply studied, but the diametrically opposite situation such as the long-term care bedridden patients, has been little investigated. The evaluation of immobilization impacts is important, because the bedridden period may take to atherogenic risk factors. Another relevant point is the concentration and functional aspects of HDL, that is an anti-atherogenic protection factor and studies have shown lower concentration in sedentary subjects. Objective: To investigate the effects of long-term immobilization on lipid profile, apolipoproteins and lipid transfer to HDL in bedridden patients. Methods: Twenty-tree bedridden patients under a period over than 90 days from the Auxiliary Hospital of the University of São Paulo Medical School in the city of Suzano, state of São Paulo were selected for the study. The lipid profile, apolipoproteins, CETP, LCAT and oxidized LDL concentration were evaluated. In the lipid transfer assay, the plasma samples were incubated with an artificial nanoparticle labeled with 3H-cholesteryl-esters, 14C-phospholipids, 3H-triglycerides and 14C-unesterified cholesterol. The lipids transferred from nanoparticle to HDL were quantified in the supernatant after chemical precipitation of non-HDL fractions. Data from bedridden patients were compared with those obtained from 26 healthy sedentary volunteers, paired for age and sex. Results: The average of hospitalization period of the bedridden was 817 days. The concentration of non-HDL cholesterol (148±36 vs 125±40 mg/dL, p<0.05), LDL-C (124±31 vs 96±36 mg/dL, p<0.01), HDL-C (45±10 vs 36±13 mg/dL, p<0.01), were lower in bedridden group, whereas the triglycerides were equal between the groups. The apo A-I (134±20 vs 111±24 mg/dL) was lower in bedridden (p<0.01), and the apo B was not different between the groups. The oxidized LDL (53±13 vs 43±12 mg/dL) was lower in bedridden group (p<0.05), whereas the CETP and LCAT was not different between the groups. The lipid transfer to HDL of cholesteryl-esters (6.24±1.1% vs 4.80±1.2%), unesterified cholesterol (4.04±1.1% vs 3.05±1.1%), phospholipids (19.06±1.3% vs 17.32±2.0%) and triglycerides (3.65±0.7% vs 3.06±0.6%) were decreased in bedridden patients compared to sedentary group (p<0.01). Conclusions: The extreme sedentary of bedridden patients affected the HDL-C and apo A-I concentration and the lipid transfer from nanoparticle to HDL. Even the low levels of physical activity exerted in the day-to-day life of sedentary subjects can be determinants of HDL concentration and metabolism. Despite their lower LDL-C and the triglycerides not different from sedentary subjects, the HDL status was clearly further altered in the bedridden. Due to the important anti-atherogenic functions of HDL, those metabolic alterations should be an additional matter of concern in the management of those patients to prevent cardiovascular events.

A redução da biodisponibilidade óxido nítrico (&#8226;NO) tem sido responsável por complicações vasculares em algumas doenças, incluindo Diabetes Mellitus tipo 2 (DMII). A disfunção endotelial (DE) pode ser ocasionada pela baixa biodisponibilidade do &#8226;NO e estudos indicam que a hiperglicemia pode estar contribuindo para esse evento. Outro fato importante é que grande parte dos indivíduos que apresentam Intolerância à Glicose (IG) evolui para DMII. Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar de que forma o estado hiperglicêmico poderia interferir sobre os metabólitos do &#8226;NO (S-nitrosotióis, nitrato + nitrito e nitrotirosina), inibidores endógenos da &#8226;NO sintase (ADMA e SDMA), homocisteína e a DE através da medida da atividade da n-acetil-&#946;-glicosaminidase (NAG). Neste estudo participaram 140 voluntários: 12 controles (C), 32 IG e 96 DMII. A concentração de glicose foi superior nos grupos IG (109&#177;10mg/dL) e DMII (165&#177;66mg/dL) em relação ao grupo C (88&#177;11mg/dL) (p<0.05). Somente o grupo DMII (8,5&#177;1,9%; 4,57&#177;2,78mg/dL) apresentou níveis elevados de hemoglobina glicada e frutosamina em relação ao grupo C (6,0&#177;0,9%; 2,31&#177;0,27mg/dL). Entretanto, os metabólitos do &#8226;NO (nitrato+nitrito, S-nitrosotióis e nitrotirosina) apresentaram concentrações elevadas nos grupos IG (35,1&#177;12,9&#181;M; 137&#177;45nM; 352&#177;104nM) e DMII (39,2&#177;18,0&#181;M; 143&#177;73nM 472&#177;231nM) em relação ao grupo C (26,6&#177;6,2&#181;M; 78&#177;46nM; 260&#177;74nM). A função endotelial também esteve alterada nos grupos IG (28,0&#177;7,3U/L) e DMII (29,4&#177;8,7U/L) em relação ao grupo C (21,7&#177;3,9U/L), como indicado pela atividade da NAG. O mesmo comportamento foi observado com os inibidores endógenos de &#8226;NO (ADMA e SDMA). A concentração de homocisteína plasmática não apresentou diferença significativa entre os grupos. Os dados demonstraram que os indivíduos IG apresentaram alterações bioquímicas, relacionadas ao estresse oxidativo e à disfunção endotelial, semelhantes aos pacientes com DMII, as quais poderiam contribuir para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. / The nitric oxide (NO) has been responsible for vascular complications in some diseases, including Diabetes Mellitus type 2 (DMII). Endothelial dysfunction (ED) may be caused by NO low bioavailability and studies indicate that the hyperglycemia may be contributing to this event. Other important fact is that a large number of individuals who present Glucose Intolerance (GI) develop DMII. Therefore, the objective of this study was to evaluate the way the hyperglycemic state could interfere upon the NO metabolites (S-nitrosotiois, nitrate + nitrite and nitrotirosine), endogen inhibitors of NO synthase (ADMA, and SDMA) and the DE using n-acetyl-&#946;-glicosaminidase (NAG) activity measure. In this study, 140 volunteers participated: 12 as controls (C), 32 GI and 96 DMII. Glucose concentration was superior in GI group (109&#177;10 mg/dL) and DMII group (165&#177;66mg/dL) in relation to group C (88&#177;11mg/dL) (p<0.05). Only DMII group (8,5&#177;1.9%; 4,57&#177;2,78mg/dL) showed high leveIs of glicade hemoglobin and frutosamine in relation to group C (6,0&#177;0,9%; 2,31&#177;0,27mg/dL). However, NO metabolites (nitrate + nitrite, S-nitrosotiois and nitrotirosine) showed high concentrations in groups GI (35,1&#177;12,9&#181;M; 137&#177;45nM; 352&#177;104nM) and DMII (39,2&#177;18,O&#181;M; 143&#177;73nM; 472&#177;231nM) in relation to group C (26,6&#177;6,2&#181;M; 78&#177;46nM; 260&#177;74nM). The endothelial function was aIso altered in groups GI (28,0&#177;7,3U/L) and DMII (29,4&#177;8,7U/L) in relation to group C (21,7&#177;3,9U/L), as indicated by NAG activity. The same behavior was observed with endogen inhibitors of NO (ADMA and SDMA). Plasmatic homocystein concentration has not shown significant difference between the groups. Data has shown that the individuaIs IG presented biochemistry alterations, related to the oxidative stress and the endothelial dysfunction, similar to the patients with DMII, which could contribute to the development of cardiovascular diseases.

A diabetes mellitus (DM) é uma das endocrinopatias mais comuns nos cães, apresentando grande complexidade, caracterizada por hiperglicemia crônica devido à incapacidade total ou relativa de produção e secreção de insulina por parte das células βpancreáticas, ou ainda, não responsividade celular ao hormônio. Existem importantes fatores predisponentes a esta doença em cães, como ação de progestágenos e glicocorticoides e fatores genéticos. A partir do seu diagnóstico, se faz necessário atento e permanente cuidado por parte dos tutores para com o paciente, devido a inúmeras possíveis complicações e consequências causadas pela doença que vão ser expressas em importantes alterações metabólicas. Este estudo objetivou avaliar os aspectos epidemiológicos e clínico-patológicos de pacientes caninos diabéticos, sob tratamento insulínico, entre os anos de 2006 e 2015, atendidos e acompanhados em um hospital veterinário universitário, desde o diagnóstico, incluindo a evolução da doença e tratamento. A partir dessa população, ficou evidenciado que a DM acometeu, em maioria, cães adultos, de meia-idade a geriátricos, sobretudo fêmeas e teve maior incidência nos exemplares da raça Poodle e cães sem raça definida. Como principais alterações laboratoriais observadas, tem maior relevância o aumento da atividade da enzima ALT e parâmetros relacionados a funcionamento renal: creatinina e ureia. Por outro lado, valores de triglicerídeos, colesterol, fructosamina, glicose, albumina e fosfatase alcalina demonstraram diminuição na mensuração desde o início do tratamento insulínico, quando comparados ao exame inicial.

A atividade dos receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR) e receptor X hepático (LXR) são regulados por ácidos graxos. Entretanto, o papel do LNO2, um produto endógeno da nitração do ácido linoléico por espécies reativas derivadas de óxido nítrico (&#8226;NO), na via de sinalização que regula a ativação destes receptores ainda não está elucidada. Assim, considerando a propriedade do LNO2 como doador de &#8226;NO, nós investigamos a participação da via de sinalização p21Ras/Raf/ERK na ativação de PPAR e LXR por LNO2. Os resultados obtidos demonstraram que LNO2, na concentração de 0.01&#181;M, foi um potente ativador de PPAR quando comparado ao ligante natural ácido linoléico, o qual apresentou ativação equivalente do PPAR na concentração de 10&#181;M. O LNO2, contudo não teve efeito na ativação de LXR. LNO2 foi um potente ativador de p21Ras quando comparado ao ácido linoléico. A ativação de Ras ocorreu após 5 minutos de incubação com LNO2 em células parentais. Entretanto, em células transfectadas com p21RasC118S, o LNO2 não foi capaz de ativar Ras. A ativação de Ras e PPAR foi dependente da liberação de &#8226;NO a partir de LNO2, o que foi evidenciado na presença de C-PTIO, um seqüestrador de &#8226;NO. LNO2 ativou ERK, mas não demonstrou efeito relevante na ativação de p38 MAP kinase. A utilização de um inibidor específico de MEK, PD09895, inibiu a ativação de ERK induzida por LNO2, sugerindo que existe uma conexão entre ERK e a ativação de PPAR. Nós concluímos que a ativação do receptor nuclear PPAR por LNO2 é dependente de &#8226;NO e da via de sinalização p21Ras/Raf/ERK, a qual é capaz de ativar os subtipos &#945;, &$946; e &#947; do PPAR, modulando, desse modo, a expressão de genes responsivos a este fator de transcrição. / Fatty acids bind to and regulate the activity of peroxissome proliferator-activated (PPAR) and liver X receptors (LXR). However, the role of LNO2, an endogenous product of the nitration of linoleic acid by nitric oxide (&#8226;NO)-derived reactive species, on signalling pathways regulating these nuclear receptors is poorly understood. Thus, considering the properties of LNO2 as &#8226;NO donor, we investigated the role of p21RasMAP kinases signaling pathway in the activation of PPARs and LXR by LNO2. LNO2 at physiologically relevant concentrations (0.01 &#181;M) activates PPAR. By contrast, linoleic acid, a natural ligand for PPAR, only activated the receptor at much higher concentrations (10&#181;M). However, it did not affect LXR activation. LNO2 is a more potent activator of p21 Ras than linoleic acid at the same conditions. Ras activation occurred within the first 5 minutes after LNO2 addition to parental cells. However, in p21RasC118s transfected cells, were unable to detect activation of Ras. Ras and PPAR activation depends on &#8226;NO released from LNO2 as evidenced by the inhibitory effect of C-PTIO, a &#8226;NO scavenger. LNO2 activated ERK but displayed no effects relevant on p38 MAP kinase. In addition, the use of specific inhibitors to MEK, PD09895, blocked PPAR activation and ERK phosphorylation by LNO2, suggesting a connection between ERK and the activation of PPAR. We conclude that LNO2 induced THP-1 cells activating Ras by S-nitrosation and recruiting the MAP kinase ERK, a downstream element of this signalling cascade and activated PPAR (&#945;, &#946; and &#947;).

Com o objetivo de avaliar o envolvimento da resposta imune humoral no desenvolvimento da anemia e das alterações quantitativas e qualitativas das plaquetas na erliquiose canina, sete cães adultos, livres de infecção, foram inoculados com E. canis e acompanhados durante 10 semanas. Três cães permaneceram como controles. Os animais foram submetidos a exame físico diário e avaliação laboratorial (hemograma, contagem de plaquetas, mielograma, bioquímica sangüínea, fragilidade osmótica eritrocitária e teste de Coombs), reação em cadeia da polimerase (PCR), pesquisa de anticorpos anti-E. canis, antiplaquetários e antimegacariocíticos (IFI), e teste da atividade de agregação plaquetária, em diferentes momentos durante o período de observação. Febre, esplenomegalia, linfadenomegalia, trombocitopenia, anemia não regenerativa, aumento das atividades séricas da ALT, AST e FA foram as principais alterações clínicas e de patologia clínica observadas, com pico máximo entre o 21&ordm; e 28&ordm; dias pós-infecção. Houve diminuição da capacidade de agregação plaquetária dos animais infectados (p<0,05) nos dias 14, 21, 28 e 35 pós-infecção e aumento do número das células megacariocíticas, principalmente seus precursores (megacarioblastos e pró-megacariócitos) no 14&ordm; dia pós-infecção. Não foram detectados anticorpos antiplaquetários ou antimegacariocíticos. O teste de Coombs, bem como a fragilidade osmótica eritrocitária, mantiveram-se inalterados, comprovando não ter ocorrido hemólise imunomediada. Conclui-se que a anemia desenvolvida durante a fase aguda da infecção experimental por E. canis, de característica eritroregenerativa, ainda que tardia, pelo menos nos animais estudados, não teve envolvimento de mecanismo imunológico direcionado contra as hemácias, e ainda, que a causa da trombocitopenia e da hipofunção plaquetária observada durante esta fase da doença não parece estar relacionada ao desenvolvimento de mecanismos imunológicos direcionados contra as plaquetas ou seus precursores. / In order to determine the involvement of humoral and immune response on development of anemia and quantitative and qualitative platelets disorders in experimental canine ehrlichiosis, seven adult naïve dogs were inoculated with E. canis and followed during 10 weeks. Three dogs were remained as control. Daily clinical evaluation and laboratorial exams (hematological, platelet counts, bone marrow evaluation, biochemistry, erythrocyte osmotic fragility and Coombs? test) polymerase chain reaction assay (PCR), anti-E.canis, antiplatelet and antimegakaryocyte antibodies detection (IFA) and platelet aggregation studies were evaluated at different moments during all the experimental period. Fever, splenomegaly, lymphadenomegaly, thrombocytopenia, non-regenerative anemia and increase on liver?s enzymes serum activity (ALT, AST and ALP) were the main clinical and laboratorial findings observed, with the highest point between days 21 and 28 post-infection. The infected animals showed a decrease in platelet aggregation responses (p<0.05) on days 14, 21, 28 and 35 post-infection and increase of megakaryocytic cells, mainly its precursors (megakaryoblasts and promegakaryocytes) on day 14 post-infection. It weren?t detected any antiplatelet or antimegakaryocyte antibodies, as well as, there were no variations on erythrocyte osmotic fragility and Coombs? tests results, which confirms the absence of immune-mediated hemolysis. It is concluded that the anemia observed during the experimental acute phase of the E. canis infection, with regenerative pattern, even though late, at least in the studied animals, wasn?t related with immune mechanism against the red blood cells, and that, the thrombocytopenia and platelet dysfunction observed during this phase of the disease don?t seen to be related with immune mechanisms against platelets or its precursors.

O estresse oxidativo pode desempenhar um papel importante na etiologia das complicações no diabetes mellitus. O aumento da produção de espécies oxidantes promove modificações em moléculas endógenas, incluindo o colesterol. Os óxidos de colesterol (Cox) são formados a partir da oxidação do colesterol, por processos enzimáticos e por processos mediados por radicais livres, apresentando importantes efeitos biológicos que podem contribuir para o desenvolvimento do processo aterosclerótico no diabetes. Nesse estudo determinou-se as concentrações dos Cox, em pacientes diabéticos e indivíduos intolerantes à glicose, para estabelecer se os COx são marcadores sensíveis da lipoperoxidação na intolerância à glicose e no diabetes As concentrações plasmáticas dos COx foram determinadas por GC-FID nos seguintes grupos: diabéticos tipo 1 (DM1), diabéticos tipo 2 (DM2), intolerantes à glicose (IGT) e normoglicêmicos (controles). As concentrações dos óxidos de colesterol totais foram mais elevadas nos grupos DM1 e DM2 em relação aos controles normoglicêmicos (p<0,05). As concentrações plasmáticas do 7&#945;- hidroxicolesterol (7&#945;-OH), 7&#946;-hidroxicolesterol (7&#946;-OH) e 25- hidroxicolesterol (25-OH) foram mais elevadas no grupo DM1 comparado ao grupo DM2 (p<0.05). A comparação entre os grupos controle, IGT e DM 2 indicou aumento significativo das concentrações de 7&#946;-OH, colesterol-&#946;- epóxido e colesterol-&#945;-epóxido no grupo DM 2 (p<0.05). Portanto, os óxidos de colesterol podem ser considerados como um biomarcador sensível da lipoperoxidação para indicar a intensidade de modificação oxidativa dos lípides em pacientes diabéticos. / Oxidative stress can play an important role in the etiology of the complications of diabetes mellitus. The increase in the production of oxidant species promotes alterations in endogenous molecules, including cholesterol. Cholesterol oxides (COx) are formed by the oxidation of cholesterol by enzymatic processes or by processes involving free radicals. They present important biological effects that can contribute to the development of the atherosclerotic process in diabetes. In this study, the concentrations of the COx in diabetic patients and individuals who are intolerant to glucose was determined in order to establish whether the Cox are sensitive markers of lipoperoxidation in glucose intolerance and diabetes. Serum concentrations of the COx were determined by GC-FID in the following groups: Type 1 diabetics (DM1), type 2 diabetics (DM2), patients intolerant to glucose (IGT) and normoglycemic subjects (controls). The concentrations of total cholesterol oxides were found to be elevated in the DM1 and DM2 groups with respect to the normoglycemic subjects (p<0.05). The serum concentrations of 7&#9465- hydroxicholesterol (7&#945;-OH), 7&#946;-hydroxicholesterol (7&#$946;-OH) and 25-hydroxicholesterol (25-OH) were found to be increased in the DM1 group with respect to the DM2 group (p<0.05). The comparison between the control, IGT and DM2 groups indicated a significant increase in the concentrations of 7&#946;-OH, cholesterol-&#946;-epoxide and cholesterol-&#945;-epoxide in the DM2 group (p<0.05). In conclusion, cholesterol oxides could serve as suitable biomarker of lipoperoxidation to indicate the intensity of lipid oxidative mofications in diabetic patients.