Glicose é o principal substrato energético no SNC de mamíferos adultos, contudo o cérebro também é capaz de utilizar outros substratos, incluindo manose, frutose, galactose, glicerol, corpos cetônicos e lactato. Glicose é quase totalmente oxidada a CO2 e H2O, mas ela também é precursora de neurotransmissores, tais como glutamato, GABA e glicina. O metabolismo energético do SNC varia ontogeneticamente, visto o fato de que nas primeiras 2 horas após o nascimento, lactato é o seu principal substrato, glicose e corpos cetônicos servem como substratos nos 21 dias subseqüentes e, após este período, somente glicose predomina. A utilização de nutrientes é regulada de várias maneiras, tais como o transporte através das células endoteliais capilares, transporte através da membrana plasmática, variações na atividade enzimática e variações nas concentrações de nutrientes plasmáticos. Está bem estabelecido que a atividade funcional do SNC aumenta o metabolismo energético. Tal evento pode ser dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase, a qual é requerida para restabelecer a homeostase iônica. O aumento da concentração de potássio extracelular de um nível basal 8-12 mM provoca excitação neuronal fisiológica. A concentração de potássio pode atingir 50-80 mM durante convulsões, isquemia ou hipoglicemia. O potássio liberado pela atividade elétrica é captado nos astrócitos através de processos dependentes e não dependentes de ATP. Neste estudo, observamos o efeito de diferentes concentrações de potássio extracelular (2.7, 20 e 50 mM), sobre a oxidação de glicose, frutose, manose e lactato a CO2 e a conversão a lipídios em córtex cerebral de ratos jovens (10dias) e adultos (60 dias). Considerando que a captação de deoxiglicose está relacionada com a atividade glicolítica, testamos a influência do potássio extracelular sobre este parâmetro. Os efeitos da ouabaína sobre a oxidação de glicose e captação de deoxiglicose foram testados para determinar se a influência de potássio extracelular era dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase. Os efeitos da monensina (ionóforo de Na+) e bumetanide (inibidor do transportador de Na+/K+/2Cl-) foram também testados. O aumento da concentração de potássio extracelular aumentou a oxidação de glicose, frutose, e manose a CO2 em córtex cerebral de ratos adultos, contudo, este fenômeno não foi observado em ratos jovens. A oxidação de lactato aumentou com o aumento da concentração de potássio extracelular em ambos ratos jovens e adultos. Não houve diferença na oxidação de glicose e sobre a captação de deoxiglicose na presença de ouabaína. Monensina aumentou a captação de deoxiglicose em 2 minutos de incubação. Contudo, esta captação diminuiu em períodos de incubação de 1 hora e 10 minutos. Além disso, não houve efeito do bumetanide sobre o aumento causado pela alta concentração de potássio extracelular na oxidação de glicose.

A hiperprolinemia tipo II é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência severa na atividade da enzima D1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, o que resulta em acúmulo tecidual de prolina. Muitos pacientes afetados por essa doença apresentam epilepsia e retardo mental. Embora as manifestações neurológicas sejam encontradas em um considerável número de pacientes hiperprolinêmicos, os mecanismos pelos quais essas ocorrem são pouco compreendidos. Considerando que pouco se sabe a respeito dos altos níveis de prolina no cérebro, os objetivos do nosso estudo foram investigar os efeitos in vivo (agudo e crônico) e in vitro da prolina sobre alguns parâmetros bioquímicos (atividades da acetilcolinesterase e butirilcolinesterase em córtex cerebral e soro de ratos, respectivamente, citocromo c oxidase e Na+,K+-ATPase em córtex cerebral de ratos; captação do glutamato em fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos e hidrólise de nucleotídeos em sinaptossomas obtido de córtex cerebral e em soro de ratos).Também investigamos o efeito do pré-tratamento com as vitaminas E e C ou da administração concomitante desses antioxidantes durante a administração crônica de prolina sobre as alterações causadas pela prolina nos parâmetros de estresse oxidativo, nas atividades da acetilcolinesterase, citocromo c oxidase e Na+,K+- ATPase, na captação do glutamato e no déficit de memória espacial. Em adição, também investigamos o efeito da administração aguda de vitamina E, vitamina C, LNAME e melatonina sobre a alteração causada pela prolina na atividade daacetilcolinesterase, a fim de verificar se esses antioxidantes e o L-NAME seriam capazes de prevenir tal efeito. Os resultados mostraram que a administração aguda de prolina reduziu a atividade da acetilcolinesterase e aumentou a atividade da butirilcolinesterase em homogeneizado e soro de ratos, respectivamente. Verificamos também que a administração aguda e crônica de prolina reduziu a atividade da citocromo c oxidase em córtex cerebral de ratos e que a administração aguda de prolina reduziu a atividade da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral de ratos. Além disso, também observamos que a prolina in vitro reduziu a captação do glutamato em córtex cerebral e hipocampo e que a prolina in vivo reduziu a captação do glutamato somente em córtex cerebral. Os efeitos relatados possivelmente ocorreram pela geração de radicais livres, visto que antioxidantes importantes como as vitaminas E e C preveniram esses efeitos, exceto a redução da captação do glutamato. Tais antioxidantes também preveniram o déficit de memória e as alterações de vários parâmetros de estresse oxidativo causados pela prolina, como o aumento da quimiluminescência, a redução do potencial antioxidante total não-enzimático (TRAP) e as alterações nas atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-Px). Cabe ressaltar que a administração aguda de vitamina E, vitamina C, L-NAME e melatonina também preveniu a ação da prolina causada sobre a acetilcolinesterase. Verificamos também que a administração aguda e crônica de prolina alterou a hidrólise de nucleotídeos adenínicos em sinaptossomas de córtex cerebral e em soro de ratos. Nossos resultados, em conjunto, mostram que a hiperprolinemia tipo II causa uma série de alterações neuroquímicas, as quais podemcontribuir para as disfunções neurológicas características da doença. Além disso, se esses resultados também ocorrerem em humanos, nossos dados referentes à utilização de antioxidantes (vitaminas E e C) poderão ser usados como uma estratégia para o tratamento de alguns sintomas associados com a hiperprolinemia tipo II. / Hyperprolinemia type II is an autosomal recessive disorder caused by the severe deficiency of D1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase activity, resulting mainly in tissue accumulation of proline. Most patients detected so far show epilepsy and mental retardation. Although neurological dysfunction is commonly found in a considerable number of hyperprolinemic patients, the mechanisms by which this occurs are poorly understood. Considering that very little is known about the role of high sustained levels of proline in brain, the geral objective of the present study was to investigate the in vivo (acute and chronic) and in vitro effects of proline on some biochemicals parameters (activities of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in cerebral cortex and serum of rats, respectively, cytochrome c oxidase and Na+,K+-ATPase in cerebral cortex of rats; glutamate uptake in cerebral cortex and hippocampus slices of rats and nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of rats and in serum of rats). We also investigated the effect of pretreatment with antioxidants (vitamins E and C) or concomitant administration of these antioxidants during chronic proline treatment on the effects elicited by proline on some parameters of oxidative stress, on the activities of acetylcholinesterase, cytochrome c oxidase and Na+,K+-ATPase, on glutamate uptake and on the deficit of spatial memory. In addition, we also evaluated the influence of acute administration of vitamin E, vitamin C, L-NAME and melatonin on the effects elicited by proline on acetylcholinesterase activity, with the propose to verify if these antioxidants and L-NAME will be able to prevent such effect. The results showed that acute administration of proline reduced acetylcholinesterase activity and increased butyrylcolinesterase activity in homogenate of cerebral cortex and serum of rats, respectively. We also verified that acute and chronic administration of proline reduced the activity of cytochrome c oxidase in cerebral cortex of rats and that acute administration of proline reduced the activity of Na+,K+-ATPase in cerebral cortex of rats. In addition, proline in vitro reduced glutamate uptake in cerebral cortex and hippocampus slices of rats and proline in vivo reduced glutamate uptake just in cerebral cortex. The effects related here possibly occured by the generation of free radicals, since important antioxidants such as vitamins E and C prevented these effects, except the reduction on glutamate uptake. The memory deficit and the alterations on various parameters of oxidative stress caused by proline [increase of chemiluminescence, reduction of total radical-trapping parameter (TRAP) and alterations on the activities of antioxidants enzymes catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px)] were also prevented by these antioxidants. Acute administration of vitamin E, vitamin C, L-NAME and melatonin also prevented the reduction caused by proline on acetylcholinesterase activity. Besides, we also showed that acute and chronic administration of proline altered the adenine nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of rats and in serum of rats. Our group´s results show that hyperprolinemia type II causes various neurochemical alterations, which may contribute to the neurological dysfunction characteristic of this disease. Furthermore, if these findings also occur in humans, we can suggest that the supplementation with antioxidants should be used as a strategy to the treatment of hyperprolinemia typo II.

As células estreladas hepáticas (HSCs) são a principal fonte de componentes de matriz extracelular em doenças crônicas do fígado e, por esta razão, exercem um papel fundamental no desenvolvimento e na manutenção da fibrose hepática. Os nucleotídeos e nucleosídeos são moléculas sinalizadoras que regulam diversos processos no fígado e têm um importante papel na patogênese da fibrose hepática. As ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotídeo pirofosfatase fosfodiesterases (E-NPPs), ecto-5’-nucleotidase (eNT/CD73) e a fosfatase alcalina tecido inespecífica (TNALP) são enzimas localizadas na superfície celular que regulam a concentração dos nucleotídeos no meio extracelular e, desse modo, modulam os efeitos biológicos mediados por eles via ativação dos receptores P1 e P2. Assim, neste estudo nós comparamos o metabolismo extracelular de nucleotídeos e o nível transcricional das ectoenzimas em HSCs quiescentes e ativadas usando uma linhagem de células estreladas hepáticas murina GRX. Estas células expressam o fenótipo miofibroblástico em meio basal e o tratamento com retinol ou indometacina induz a mudança das células GRX para o fenótipo quiescente das HSCs. Os dois fenótipos das células GRX expressam as NTPDase3 e 5, NPP1, 2 e 3, ecto-5’- nucleotidase e TNALP. Entretanto, apenas as HSCs ativadas expressam a NTPDase6. Nas HSCs quiescentes, a hidrólise de nucleosídeos trifosfatados foi significativamente mais alta e foi correlacionada com o aumento na expressão do mRNA da Entpd3 e ENPP3. Os nucleosídeos difosfatados foram hidrolisados de maneira similar pelos dois fenótipos das células GRX e esta atividade foi associada com o aumento da expressão do mRNA da Entpd5 nas células quiescentes e com a expressão da Entpd6 apenas nas HSCs ativadas. A atividade AMPásica foi maior nas células quiescentes do que nas células ativadas e foi relacionada com o aumento da atividade e da expressão do mRNA da ecto-5’-nucleotidase. O tratamento com retinol também envolve a ativação transcricional da TNALP. Para analisar o papel fisiológico da eNT/CD73 nas HSCs, o mRNA e a expressão desta proteína foram reduzidos nas células GRX utilizando a técnica de RNAi. O knockdown da eNT/CD73 aumentou a expressão do mRNA da TNALP e do colágeno I e alterou a adesão e a migração celular através de um mecanismo independente da hidrólise de nucleotídeos. Nós também avaliamos o efeito da adenosina na regulação de marcadores de ativação das HSCs. Este nucleosídeo diminuiu a proliferação, a migração, a transcrição de colágeno I e das metaloproteinases 2 e 9 e diminuiu a transcrição da eNT/CD73. As diferenças na atividade e expressão das ectonucleotidases entre os dois fenótipos das células GRX sugerem que estas enzimas modulam a concentração de nucleotídeos/nucleosídeos e geram efeitos distintos na sinalização purinérgica nos dois fenótipos e podem ser importantes alvos na regulação das funções das HSCs. / Hepatic stellate cells (HSC) are recognized as a primary cellular source of matrix components in chronic liver disease and, therefore, play a critical role in the development and maintenance of liver fibrosis. Nucleotides and nucleosides are signaling molecules that regulate a variety of activities within the liver and play a role in the pathogenesis of hepatic fibrosis. Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases (E-NPPs), ecto- 5’-nucleotidase (eNT/CD73) and tissue non-specific alkaline phosphatase (TNALP) are enzymes that are located at the cell surface and regulate the concentration of extracellular nucleotides, thereby modulating their biological effects by the activation of P1 and P2 receptors. Thus, in the study we compared the extracellular metabolism of nucleotides and transcriptional levels of ectoenzymes in activated and quiescent HSC of the mouse hepatic stellate cell line GRX. This cell line expresses a myofibroblast phenotype in basal medium and both retinol and indomethacin treatment induced a phenotypic change of GRX cells to quiescent HSC. Two phenotypes of GRX cells expressed NTPDase3 and 5, NPP1, 2 and 3, ecto-5’-nucleotidase/CD73 and TNALP. However, only activated HSC expressed NTPDase6. In quiescent HSC, the hydrolysis of triphosphonucleosides was significantly higher and was related to an increase in Entpd3 and ENPP3 mRNA expression. The diphosphonucleosides were hydrolyzed at a similar rate by two phenotypes of GRX cells and this hydrolysis was associated with an up-regulation of Entpd5 mRNA expression in quiescent-like HSC, whilst Entpd6 mRNA expression was observed only in activated HSC. The AMPase activity in quiescent HSC was higher than myofibroblasts and was related to an increase in ecto-5’-nucleotidase activity and its mRNA expression. The treatment with retinol also involves transcriptional activation of TNALP. To analyze the biological significance of eNT/CD73 in HSC, the expression of eNT/CD73 mRNA and protein was reduced in GRX cell line using the technique of RNAi. ENTCD73 knockdown leads to an increase in mRNA expression of TNALP and collagen I, and a clear alteration of cell adhesion and migration by a mechanism not dependent of changes in nucleotide metabolism. We also tested the effect of adenosine on the regulation of activation markers of in HSCs. This nucleotide decreased proliferation, migration, transcription of collagen I and matrix metalloproteinases 2 e 9 and increased transcription of eNT/CD73. The differential ectonucleotidases activities and expressions in two phenotypes of GRX cells suggest that these enzymes modulate the concentration of nucleotides/nucleosides and affect purinergic signaling differently in the two phenotypes and may play a role in the regulation of HSC functions.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. / Made available in DSpace on 2013-07-16T01:34:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2015-03-18T19:59:10Z : No. of bitstreams: 1 222389.pdf: 14571128 bytes, checksum: 7a6673422409697a3a8993d87a614d27 (MD5) / A embriogênese somática é uma técnica biotecnológica amplamente utilizada para propagação massal e conservação de diversas espécies de coníferas como é o caso da Araucaria angustifolia. Além disso, esta técnica se configura como um modelo referência para estudos da biologia do desenvolvimento in vitro. A principal limitação da embriogênese somática em coníferas encontra-se associada a dificuldades durante a fase de maturação. No presente trabalho foram estudados aspectos da regulação fisiológica e bioquímica da embriogênese zigótica e somática de A. angustifolia, visando o estabelecimento de um protocolo in vitro para esta espécie. Foram estabelecidas as condições in vitro para a indução, multiplicação e obtenção de embriões somáticos cotiledonares, assim como determinados a variação de componentes do metabolismo endógeno destas culturas em diferentes fases da embriogênese zigótica e somática. Embriões zigóticos pré-cotiledonares inoculados em meio de cultura BM suplementados com 2,4- D (5 µM), BAP e Kin (2 µM cada), e maltose ou sacarose (3%) resultaram em uma taxa de indução de 66,7%. A indução, multiplicação e a morfologia das culturas embriogênicas foram significativamente influenciadas pela fonte de carbono. As culturas embriogênicas suplementadas com maltose apresentaram morfologia bipolar e também os maiores conteúdos de proteínas amido e ABA. O conteúdo de AIA durante a multiplicação foi incrementado pela presença de 2,4-D e sacarose no meio de cultura. Culturas embriogênicas mantidas em suspensões celulares em que o meio de cultura foi suplementado com sacarose e 2,4-D (5 µM), BAP e Kin (2 µM cada) apresentaram um volume celular sedimentado de 50 mL após 42 dias de cultivo. A multiplicação das culturas embriogênicas em meio de cultura líquido foi observada tanto para suplementação com maltose ou sacarose. O conteúdo endógeno de poliaminas durante a multiplicação em meio líquido ou sólido foi correlacionado à multiplicação das culturas embriogênicas e os maiores valores foram observados em meio de cultura suplementados com sacarose e 2,4- D (5 µM), BAP e Kin (2 µM cada). Embriões somáticos globulares e cotiledonares foram obtidos em meio de cultura BM suplementado com PEG (7%), maltose (9%) e ABA (150 µM) e isto foi associado a mudanças endógenas no conteúdo de AIA, ABA e proteínas. Contudo estes valores foram inferiores aqueles observados no embrião zigótico, o qual apresentou um acúmulo de proteínas e amido durante os estágios embriogênicos tardios. A suplementação exógena de poliaminas durante a multiplicação influenciou o metabolismo endógeno e a multiplicação das culturas embriogênicas. A Put foi relacionada à multiplicação das culturas embriogênicas, a Spd e a Spm promoveram o acúmulo de matéria seca e de substâncias de reserva. Foi possível identificar como alguns componentes do meio de cultura afetaram a morfogênese e o metabolismo endógeno das culturas embriogênicas de A. angustifolia. Os resultados aqui obtidos dão suporte a alternativas que permitirão o estabelecimento de um protocolo para embriogênese somática nesta espécie.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biologicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T06:32:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290250.pdf: 1651252 bytes, checksum: 16dd2b4c210960ba463863c566109f87 (MD5) / Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Esta doença afeta de 15 a 16 milhões de pessoas na América Latina e, mesmo após um centenário de sua descoberta, ainda não se conseguiu desenvolver uma vacina e nem tratamentos totalmente eficazes. O presente trabalho apresenta a caracterização de uma arsenato redutase de T. cruzi. Esta enzima, apesar de ter significante homologia com fosfatases de dupla-especificidade, apresenta uma baixa capacidade de defosforilar o substrato p-nitrofenilfosfato. Quando testada em um sistema de oxi-redução, a PTP putativa de T. cruzi é capaz de reduzir o arsenato [As(V)] à arsenito [As(III)] e esta redução requer a presença da enzima glutaredoxina. Este é o primeiro trabalho que descreve uma arsenato redutase de T. cruzi. A fosfotirosina fosfatase YopH é um fator de virulência relevante na patogenicidade das bactérias Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. A YopH tem a capacidade de modular a resposta inflamatória à bactéria através de processos que envolvem a quebra de adesões focais, liberação de fator de necrose, inibição da fagocitose, além de também impedir a função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. Devido à sua importância, a YopH emerge como um potencial alvo terapêutico. Neste trabalho foram analisados 265 compostos sintéticos, dos quais 4 apresentaram valores de IC50 inferiores a 50 µM, sendo eles L46 (38,55 µM), P4 (15,08 µM), P11(9,92 µM) e R28 (20,29 µM). Estes compostos são chalconas e atuam como inibidores competitivos da YopH com Ki de 11,01 µM (L46), 3,13 µM (P4), 2,41 µM (P11) e 14,93 µM (R28). / Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas' disease. This illness affects 15 to 16 million people in Latin America and even after a century of its discovery,it has not managed to develop a vaccine and effective treatment. This work presents the characterization of an harsenate reductase from T. cruzi. This enzyme, despite having a significant homology with dual specificity phosphatases, has a low capacity to dephosphorylate the substrate p-nitrophenyl phosphate. When tested in an oxi-reduction system, the putative PTP from T. cruzi is able to reduce arsenate to arsenite and this reduction requires the presence of glutaredoxin. This is the first study that describes an arsenate reductase from T. cruzi. The phosphotyrosine phosphatase YopH is a relevant virulence factor in the pathogenicity of the bacteria Yersinia pestis; Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica. YopH is able to modulate the inflammatory response to the bacteria through processes that involves the disruption of focal adhesion, release of tumor necrosis factor , inhibition of phagocytosis and also block the fuction of T and B lymphocyte preventing the adaptive immune response. Due to its importance, YopH emerges as a potencial therapeutic target. In this work, it was analysed 265 synthetic compounds, among these 4 presented IC50 values below 50 ìM which are L46 (38.55 ìM), P4 (15.08 ìM), P11(9.92 ìM) and R28 (20.29 ìM). These four compounds are chalcones and act as competitive inhibitors. They present the following Ki values: 11.01 ìM (L46), 3.13 ìM (P4), 2.41 ìM (P11) and 14.93 ìM (R28).

CARNEIRO, Victor Alves. Inibição de formação de biofilme bacteriano através de lectinas vegetais. 2007. 89 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-15T13:40:45Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_vacarneiro.pdf: 1083928 bytes, checksum: e8c87c7ccb243cae82022d5153e98560 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:25:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_vacarneiro.pdf: 1083928 bytes, checksum: e8c87c7ccb243cae82022d5153e98560 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:25:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_vacarneiro.pdf: 1083928 bytes, checksum: e8c87c7ccb243cae82022d5153e98560 (MD5) Previous issue date: 2007 / Natural and complementary medicine, especially phytotherapy, is becoming more and more useful to fulfill the needs of great part of the population when it comes to oral health, particularly in the developing countries. Among the phytotherapics, lectins may be valuable as anti-plaque and antimicrobial agents, since they can be intimately related with inference in biofilm formation, given that these proteins recognize carbohydrates in a specific and reversible way. Within that context, this study aimed to test the ability of five lectins (extracted from Canavalia ensiformis, Canavalia maritima, Cymbosema roseum, Acacia farnesiana and Hypnea cervicornis) in inhibiting the formation of biofilm and killing oral microorganisms(Streptococcus sanguis ATCC10556 e S. mutans UA159). The antimicrobial activity of the five lectins tested was determined by the convetional test of microdilution in polystyrene plaques. The lectin concentrations assayed against the microorganisms varied from 2mg/mL to 31. 5μ g/mL. To evaluate the adherence, a semi -quantitative assay was perfomed within microtitulation plaques (96 wells), to where were added 100μL of each lectin, and then 100μL of bacterial suspension (108 CFU/mL). This material was incubated in 10% CO 2 atmosphere at 37ºC. Adherence was revealed and quantified by violet crystal staining. Absorption of violet crystal was determined by spectophotometry (595nm). Only ConA presented bactericide or bacteriostatic activity against the strains tested. The assay of inhibition of biofilm formation revealed that almost all lectins had this kind of activity, reducing the adherence in a significant way (p<0.05). ConA had no effect on the formation of biofilm for any bacteria tested. / A medicina natural e complementar, especialmente a fitoterapia, se torna cada vez mais utilizada no combate as necessidades de grande parte da população em saúde bucal, particularmente nos países em desenvolvimento. Dentre os fitoterápicos, as lectinas podem ter um valor como agentes antiplaca e antimicrobianos, uma vez que podem estar intimamente relacionadas com a interferência da formação do biofilme dos microrganismos, já que se tratam de proteínas que reconhece carboidratos de forma específica e reversível. O objetivo deste estudo foi testar in vitro a capacidade de inibição das lectinas isoladas das espécies de Canavalia ensiformis, Canavalia maritima, Cymbosema roseum, Acacia farnesiana e Hypnea cervicornis, na formação de biofilmes bacterianos e atividade antimicrobiana contra microrganismos orais (Streptococcus sanguis ATCC10556 e S. mutans UA159). A atividade antimicrobiana das cinco lectinas testadas foi determinada pelo teste convencional da microdiluição em placas de poliestireno, sendo testada as concentrações de 2mg/mL à 31,5μg/mL contra os microrganismos em estudo. Para avaliação de aderência foi feito um ensaio semiquantitativo de aderência em placas de microtitulação de poliestireno (96 poços), onde foi adicionado 100 μL de cada uma das lectinas, em seguida adicionada 100 μL de suspensão bacteriana (108 UFC/mL) e incubado a 37ºC em uma atmosfera de 10% de CO2. A aderência foi revelada e quantificada por tintura com cristal violeta. A absorção do cristal violeta foi determinada através da leitura no espectrofotômetro (595nm). Somente a lectina de ConA apresentou a atividade bactericida ou bacteriostática contra os microorganismos estudados. No teste de inibição da formação do biofilme, todas as lectinas testadas foram favoráveis na inibição, reduzindo significativamente a aderência (p< 0,05). A lectina de ConA não teve ação sobre a formação do biofilme de nenhumas das bactérias testadas.

ELOY, Ygor Raphael Gomes. Papel do peróxido de hdrogênio na interação do feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp] com o fungo Colletotrichum gloesporioides (Penz.) Penz. & Sacc. [Teleomorfo Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld. & Von Schrenk]. 2007. 158 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T11:58:23Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_yrgelooy.pdf: 1787072 bytes, checksum: bcc6cf1a3dc36c9e16fb8e0e1485b9e0 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:27:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_yrgelooy.pdf: 1787072 bytes, checksum: bcc6cf1a3dc36c9e16fb8e0e1485b9e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_yrgelooy.pdf: 1787072 bytes, checksum: bcc6cf1a3dc36c9e16fb8e0e1485b9e0 (MD5) Previous issue date: 2007 / Cowpea is an important legume of the Northeast of Brazil and its yield is affected by Colletotrichum fungi. These fungi are known to occur on and cause disease anthracnose on the broad range of plants. In addition, the rapid and transient accumulation of reactive oxygen species, termed ‘oxidative burst’, is one of the earliest observable reaction of plant cells to microbial infection. As plant H2O2 is believed to have direct antimicrobial effects on pathogens it was raised the hypothesis that alteration of H2O2 concentrations by pharmacological compounds could confer differences in susceptibility of the cowpea genotype BR-3-Tracuateua to C. gloeosporioides attack. Thus, seeds were germinated on humid Germitest® paper and after four days seedlings were transferred to hydroponic solution. Eight days later, the primary leaves were excised, infiltrated with glucose oxidase (GO+G), salicylic acid (AS), catalase (CAT) and diphenyleneiodonium chloride (DPI) transferred to Petri dishes and inoculated with 2.0 x 105 spores mL-1 fungal suspension on the adaxial surface. After, leaves were placed in darkness and collected at 12, 24, 48 and 72 hours. By GO+G and SA leaf treatments showed 144.96 and 186.05 nmol H2O2 g-1 fresh mass (FM), respectively, and the fungus presented a subcuticular, intramural necrotrophic strategy, forming secondary hyphae associated with a quick spread and a rapid killing of the host cells. On the leaves treated with SA, it was observed lipid peroxidation and the absence of melanized appresoria. However, CAT and DPI treatment leaves presented 55.50 nmol H2O2 g-1 FM and the fungus showed hemibiotrophic infection-type, with globular vesicles and primary and secondary hyphae formation. All results suggest that despite H2O2 influenced directly the fungal infection process-type it does not confer resistance of cowpea to C. gloeosporioides. / Feijão-de-corda é um importante legume presente na região Nordeste do Brasil e sua produção é afetada por fungos do gênero Colletotrichum. Estes fungos são conhecidos por causar antracnose em uma grande variedade de plantas. Além disso, o acúmulo rápido e transiente de espécies reativas de oxigênio, nomeado de ‘oxidative burst’, é uma das primeiras reações observáveis em células de plantas diante infecção microbiana. Como H2O2 produzido por plantas é considerado por apresentar efeitos antimicrobianos diretos, foi levantada a hipótese que alterações nas concentrações de H2O2 por substâncias farmacológicas poderiam conferir diferenças na susceptibilidade do genótipo de feijão-de-corda, BR-3-Tracuateua, ao ataque do fungo C. gloeosporioides. Deste modo, sementes foram germinadas em papéis Germistest® umedecidos e, depois de 4 dias, plântulas foram transferidas para solução hidropônica. Passados oito dias, as folhas primárias foram cortadas, infiltradas com glucose oxidase (GO+G), ácido salicílico (AS), catalase (CAT) e cloreto de difenilenoiodônio (DPI), transferidas para placas de Petri e inoculadas com suspensão do fungo ajustada para concentração de 2,0 x 105 esporos mL-1. Em seguida, as folhas foram mantidas no escuro e foram coletadas em 12, 24, 48 e 72 horas. Folhas tratadas com GO+G e AS mostraram 144,96 e 186,05 nmol H2O2 g-1 de massa fresca (MF), respectivamente, e o fungo apresentou estratégia subcuticular, intramural necrotrófica, formando hifas secundárias associadas com ágil crescimento e rápida morte das células hospedeiras. Nas folhas tratadas com AS, foi observada peroxidação de lipídios e ausência de apressórios melanizados. Contudo, folhas tratadas com CAT e DPI apresentaram 55,50 nmol H2O2 g-1 MF e, o fungo, mostrou modo de infecção hemibiotrófico, com vesículas globulares e formação de hifas primárias e secundárias. Todos os resultados sugerem que, apesar do H2O2 tenha influenciado diretamente o modo de infecção do fungo, este não conferiu resistência no feijão-de-corda ao C. gloeosporioides.

SOUSA, Bruno Lopes de.Caracterização estrutural das formas silvestre e recombinante de uma lectina de sementes de Vatairea macrocarpa Benth e análise das suas bases moleculares de ligação ao antígeno Tn. 2014. 119 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-20T12:14:08Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_blsousa.pdf: 4344064 bytes, checksum: 784bc6294f0c6ff7014ef6c5ecece099 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:33:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_blsousa.pdf: 4344064 bytes, checksum: 784bc6294f0c6ff7014ef6c5ecece099 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:33:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_blsousa.pdf: 4344064 bytes, checksum: 784bc6294f0c6ff7014ef6c5ecece099 (MD5) Previous issue date: 2014 / Lectins are a very diverse class of proteins able to bind specific sugar structures reversibly and with high specificity, but without enzymatically modifying them, triggering several important cellular processes. Among the different lectin families, legume lectins are the most thoroughly studied and have been widely reported to exhibit a number of links to many pathological processes, including carcinogenesis. The remarkable anti-tumor properties of some legume lectins, resulting from their ability to induce programmed cell death and/or autophagocytosis in cancer cells have attracted much attention for biomedical applications. Moreover, a few galactose/N-acetylgalactosamine (Gal/GalNAc)-binding lectins from this group have proven to be useful markers for cancer histochemistry, and the structural characterization of these lectins bound to specific cancer epitopes has been carried out successfully. The seed lectin isolated from the legume tree Vatairea macrocarpa (VML) is a well characterized Gal/GalNAc-binding protein able to specifically recognize naturally occurring O-mucins presenting the carcinoma epitope Tn antigen (GalNAc-α-O-Ser). The crystal structures of VML in complex with Tn antigen and GalNAc have been determined at the resolution of 1.4 and 1.7 Å, respectively. Unfortunately, most of lectins obtained from natural sources consist in a mixture of forms, which is an undesired feature for biomedical applications. Thus, the recombinant form of VML (rVML) was expressed in Escherichia coli, being obtained soluble and wih high yielding. The crystal structure for rVML, as well as for the complex with Tn antigen, GalNAc and α-Lactose have been determined at resolutions of 1.7, 2.7, 2 and 1.8 Å, respectively, presenting the same overall structure and binding patterns as the wild lectin. Molecular docking analysis of this new structure and other Tn-binding legume lectins to O-mucin fragments differently decorated with this antigen provides a comparative binding profile among these proteins, stressing that subtle alterations that may not influence monosaccharide binding can, nonetheless, directly impact the ability of these lectins to recognize naturally occurring antigens. In addition to the specific biological effects of VML, the structural and binding similarities between it and other lectins commonly used as histological markers (e.g., VVLB4 and SBA) strongly suggest that VML can be used as a new tool for cancer research. This is the first report of crystal structures of a Gal/GalNAc-binding legume lectin from the Dalbergieae tribe. / As lectinas consitem em uma classe diversificada de proteínas, capazes de reconhecer estruturas glicídicas de forma reversível e com alta especificidade, no entanto sem alterar suas estruturas químicas, participando de vários processos celulares importantes. Dentre as diferentes famílias de lectinas, as isoladas a partir de leguminosas são as mais extensivamente estudadas, havendo sido relatada a influências dessas moléculas sobre diversos processos patológicos, incluindo a carcinogênese. Notáveis propriedades antitumorais têm sido detectadas para algumas lectinas de leguminosas, resultantes da sua habilidade em induzir a morte celular ou a autofagia em células cancerígenas, o que atraído atenção para suas possiveis aplicações biomédicas. Além disso, algumas lectinas desse grupo especificas para galactose/N-acetil-D-galactosamina (Gal/GalNAc) têm se mostrado úteis como marcadores histoquímicos na pesquisa do câncer e a caracterização estrutural dessas lectinas em complexo com diferentes epítopos cancerígenos vem sendo realizada com sucesso. A lectina isolada a partir das sementes da leguminosa Vatairea macrocarpa (VML) é uma lectina bem caracterizada específica para Gal/GalNAc capaz de reconhecer especificamente o antígeno Tn (GalNAc-α-O-Ser), naturalmente encontrado em O-mucinas presentes em diferentes tipos de câncer. As estruturas cristalográficas para a VML em complexo com o antígeno Tn e GalNAc foram determinadas com resoluções de 1.4 e 1.7 Å, respectivamente. A maioria das lectinas obtidas a partir de fontes naturais consiste em misturas de diferentes isoformas, uma característica indesejada para aplicações biomédicas. Com base nisso, uma construção recombinante para VML (rVML) foi expressa em Escherichia coli, sendo obtida de forma solúvel em com alto rendimento. A estrutura cristalina para a rVML, bem como para seus complexos com o antígeno Tn, GalNAc e α-Lactose foram determinadas com resoluções de 1.7, 2.7, 2 e 1.8 Å, respectivamente, apresentando a mesma estrutura geral e padrões de interação que a lectina silvestre. Com o intuito de gerar um perfil comparativo entre a VML e outras lectinas de leguminosas capazes de reconhecer o antígeno Tn, foram realizadas análises de docking molecular utilizando fragmentos de O-mucinas diferentemente decorados com o antígeno Tn. Esse perfil ressalta como alterações sutis no elenco ou disposição dos aminoácidos constituintes do sítio de ligação a carboidrato, que talvez não influenciem a capacidade de ligação a monossacarídeo, podem impactar diretamente a habilidade dessas lectinas em reconhecer antígenos em condições naturais. Adicionalmente aos já caracterizados efeitos biológicos relatados para VML, a similaridade entre sua estrutura e perfis de interações quando comparadas a outras lectinas comumente utilizadas como marcadores histoquímicos (e.g., VVLB4 e SBA), sugerem fortemente a possível utilização da VML como uma nova ferramenta na pesquisa do câncer. Esse trabalho consiste no primeiro relato de estruturas cristalográficas para uma lectina de leguminosa específica para Gal/GalNAc da tribo Dalbergieae.

Glicose é o principal substrato energético no SNC de mamíferos adultos, contudo o cérebro também é capaz de utilizar outros substratos, incluindo manose, frutose, galactose, glicerol, corpos cetônicos e lactato. Glicose é quase totalmente oxidada a CO2 e H2O, mas ela também é precursora de neurotransmissores, tais como glutamato, GABA e glicina. O metabolismo energético do SNC varia ontogeneticamente, visto o fato de que nas primeiras 2 horas após o nascimento, lactato é o seu principal substrato, glicose e corpos cetônicos servem como substratos nos 21 dias subseqüentes e, após este período, somente glicose predomina. A utilização de nutrientes é regulada de várias maneiras, tais como o transporte através das células endoteliais capilares, transporte através da membrana plasmática, variações na atividade enzimática e variações nas concentrações de nutrientes plasmáticos. Está bem estabelecido que a atividade funcional do SNC aumenta o metabolismo energético. Tal evento pode ser dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase, a qual é requerida para restabelecer a homeostase iônica. O aumento da concentração de potássio extracelular de um nível basal 8-12 mM provoca excitação neuronal fisiológica. A concentração de potássio pode atingir 50-80 mM durante convulsões, isquemia ou hipoglicemia. O potássio liberado pela atividade elétrica é captado nos astrócitos através de processos dependentes e não dependentes de ATP. Neste estudo, observamos o efeito de diferentes concentrações de potássio extracelular (2.7, 20 e 50 mM), sobre a oxidação de glicose, frutose, manose e lactato a CO2 e a conversão a lipídios em córtex cerebral de ratos jovens (10dias) e adultos (60 dias). Considerando que a captação de deoxiglicose está relacionada com a atividade glicolítica, testamos a influência do potássio extracelular sobre este parâmetro. Os efeitos da ouabaína sobre a oxidação de glicose e captação de deoxiglicose foram testados para determinar se a influência de potássio extracelular era dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase. Os efeitos da monensina (ionóforo de Na+) e bumetanide (inibidor do transportador de Na+/K+/2Cl-) foram também testados. O aumento da concentração de potássio extracelular aumentou a oxidação de glicose, frutose, e manose a CO2 em córtex cerebral de ratos adultos, contudo, este fenômeno não foi observado em ratos jovens. A oxidação de lactato aumentou com o aumento da concentração de potássio extracelular em ambos ratos jovens e adultos. Não houve diferença na oxidação de glicose e sobre a captação de deoxiglicose na presença de ouabaína. Monensina aumentou a captação de deoxiglicose em 2 minutos de incubação. Contudo, esta captação diminuiu em períodos de incubação de 1 hora e 10 minutos. Além disso, não houve efeito do bumetanide sobre o aumento causado pela alta concentração de potássio extracelular na oxidação de glicose.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:53:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 325623.pdf: 1743791 bytes, checksum: 2451f517c04db4814e51c299345708d6 (MD5) Previous issue date: 2014 / Os tratamentos farmacológicos disponíveis para a depressão demandam semanas para surtir efeito e podem causar efeitos adversos aos pacientes. Assim, há uma constante necessidade de desenvolver terapias alternativas de ação mais rápida, segura e efetiva. O exercício físico apresenta efeitos benéficos sobre diversas doenças e distúrbios neurológicos como Parkinson, Alzheimer, depressão e declínio de funções cognitivas. A creatina, um composto endógeno ou obtido pela ingestão de alguns alimentos possui propriedade antidepressiva. Nosso grupo demonstrou que a administração aguda de creatina em camundongos apresentou efeito tipo-antidepressivo num teste preditivo (Teste do Nado Forçado, TNF). O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito tipo-antidepressivo da terapia combinada de creatina com exercício físico e avaliar a expressão de neurotrofinas no hipocampo de camundongos. Para alcançar este objetivo, foram desenvolvidas as seguintes etapas: i) investigar o efeito tipo-antidepressivo do tratamento crônico por 14 dias com creatina ou fluoxetina; ii) analisar amostras do hipocampo destes animais para verificar seus efeitos sobre a expressão de neurotrofinas (BDNF, VEGF e FGF-2); iii) verificar o efeito tipo-antidepressivo em camundongos submetidos ao exercício físico prolongado (14, 21 e 28 dias); iv) investigar o efeito tipo-antidepressivo do tratamento crônico (14 dias) da terapia combinada de creatina ou fluoxetina junto com exercício físico (14 dias); v) analisar amostras do hipocampo dos animais tratados com a terapia combinada de antidepressivos e exercício físico para determinar a expressão das neurotrofinas. O tratamento (por via oral) de camundongos durante 14 dias com fluoxetina (1 e 10 mg/kg) ou creatina (0,1 e 1 mg/kg) apresentou efeito tipo-antidepressivo no TNF. Fluoxetina na dose de 10 mg/kg ou creatina na dose de 1 mg/kg administradas por 14 dias aumentaram o imunoconteúdo de BDNF, mas não alteraram o de VEGF e FGF-2. A expressão gênica de BDNF (RNAm, determinada por Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real, qRT-PCR) foi aumentada somente pela fluoxetina. O tratamento com fluoxetina ou creatina não alterou significativamente a expressão gênica de VEGF e de FGF-2. Para avaliar os efeitos do exercício físico, os animais foram submetidos por 14, 21 e 28 dias a uma esteira durante 40 minutos/dia, em velocidades de 6, 8, 10 e 12 metros/minuto, na primeira, segunda, terceira e quarta semana, respectivamente. Os animais exercitados durante 21 e 28 dias apresentaram um efeito tipo-antidepressivo no TNF. Na última etapa, os camundongos foram submetidos à terapia combinada de fluoxetina ou creatina associada ao exercício físico durante 14 dias, em doses e tempos que não mostraram efeito tipo-antidepressivo. A terapia combinada de exercício físico com doses subativas de fluoxetina (0,1 mg/kg) ou creatina (0,01 mg/kg) produziram um efeito sinérgico comportamental no TNF. Assim, estes dados sugerem que o tratamento com doses menores de fluoxetina com exercício físico pode ser uma terapia alternativa no tratamento da depressão. Adicionalmente, a terapia combinada de exercício e creatina aumentou a expressão protéica e gênica de BDNF no hipocampo. Os resultados indicam que a creatina associada ao exercício físico poderia atuar aumentando a transcrição, tradução e clivagem de BDNF. Em conclusão, estes dados mostram que a creatina aumenta a expressão de BDNF e que as terapias combinadas poderiam ser alternativas potenciais para o tratamento da depressão.<br> / Abstract : Pharmacological treatments available for depression require weeks to produce effect and may cause adverse effects. Thus, there is a constant need to develop alternatives therapies more fast, safe and effective. The exercise has beneficial effects on many diseases and neurological disorders such as Parkinson's, Alzheimer's, depression and decline of cognitive functions. Creatine, an endogenous compound or obtained by the ingestion of certain foods has antidepressant property. Our group demonstrated that acute administration of creatine in mice showed antidepressant-like effect in predictive test (Forced Swimming Test, FST). The aim of this study was to investigate the antidepressant-like effect of combined therapy of physical exercise with creatine and evaluate the expression of neurotrophins in the mice hippocampus. To accomplish this, the following steps were taken: i) investigate the antidepressant-like effect of chronic treatment for 14 days with creatine or fluoxetine; ii) analyze samples from the hippocampus of these animals for their effects on the expression of neurotrophins (BDNF , VEGF and FGF-2); iii) investigate the antidepressant-like effect in mice subjected to prolonged physical exercise (14, 21 and 28 days); iv) to investigate the antidepressant-like effect of chronic treatment (14 days) of combined therapy of physical exercise with creatine or fluoxetine (14 days); v) analyzing samples of the hippocampus of animals treated with the combined therapy of antidepressants and exercise to determine the expression of neurotrophins. The treatment (per oral) of mice for 14 days with fluoxetine (1 and 10 mg/kg) or creatine (0.1 and 1 mg/kg) showed antidepressant-like effect in the FST. Fluoxetine (10 mg/kg) or creatine (1 mg/kg) administered for 14 days increased the immunocontent BDNF but did not alter the VEGF and FGF-2. The gene expression of BDNF (mRNA, determined by Real-Time Polymerase Chain Reaction qRT-PCR) was increased only by fluoxetine. Treatment with fluoxetine or creatine did not significantly alter the gene expression of VEGF and FGF-2. To assess the effects of physical exercise, the animals were subjected to 14, 21 and 28 days at a treadmill for 40 minutes/day at speeds of 6, 8, 10 and 12 meters/minute in the first, second, third and fourth week, respectively. The animals exercised for 21 and 28 days showed an antidepressant-like effect in the FST. In the last step, the mice were subjected to combined therapy of fluoxetine or creatine associated with physical exercise for 14 days at doses and times that did not show antidepressant-like effect. The combination of physical exercise with subeffective doses of fluoxetine (0.1 mg/kg) or creatine (0.01 mg/kg) produced synergistic behavioral effects in the FST. Thus, these data suggest that treatment with fluoxetine at lower doses with physical exercise may be an alternative therapy in the treatment of depression. Additionally, the combined therapy of exercise and creatine increased the protein and gene expression of BDNF in the hippocampus. The results indicate that creatine associated with physical exercise could act by increasing transcription, translation and cleavage of BDNF. In conclusion, these data show that creatine increases the expression of BDNF and that combined therapies could be potential alternatives for the treatment of depression.