El bioetanol es un combustible complementario a las gasolinas, producido mediante fermentación de azúcares simples derivados de sacarosa, almidón o celulosa. Debido a su gran abundancia el material celulósico es particularmente atractivo como fuente de combustible. La hidrólisis de la celulosa puede realizase utilizando métodos químicos (ácidos o bases) o enzimáticos. La hidrólisis enzimática genera productos más puros y consume menos energía; sin embargo, debido a su bajo rendimiento se requiere usar grandes cantidades de enzima, lo cual eleva considerablemente los costos de producción. Las endoglucanasas son glicosil hidrolasas que rompen enlaces β-1,4 en polímeros de glucosa. Actúan sobre enlaces internos de la celulosa amorfa generando su despolimerización. La estructura de las celulasas incluye un módulo catalítico, unido a un dominio que actúa como centro de anclaje a la celulosa, por lo que se le ha denominado Modulo de Unión a Carbohidrato (CBM por su sigla en Inglés). Estudios previos han demostrado que una alta afinidad a celulosa se correlaciona con un aumento en la hidrólisis de ésta. En el presente trabajo se proponen mutaciones en el CBM de la endo β-1,4 glucanasa de Trametes versicolor (TvEG), que aumenten la adsorción de la enzima sobre celulosa, buscando de este modo aumentar la hidrólisis de ésta. Se generó un modelo tridimensional del CBM de la endoglucanasa de T. versicolor mediante modelación comparativa. La estructura obtenida está formada por tres hojas beta antiparalelas unidas entre sí mediante dos puentes disulfuro. El modelo generado se utilizó para llevar a cabo estudios de Docking Molecular, para identificar regiones de interacción celulosa–CBM. Usando los resultados de la simulación computacional de la interacción CBM-celulosa, se identificaron dos zonas de unión. La primera concuerda con la reportada previamente para CBM’s de la familia I, mientras que no existen reportes en la literatura sobre interacción de la celulosa con la segunda zona identificada. A continuación se simuló mediante Docking Molecular, la interacción de celulosa con variantes de CBM que contenían diferentes aminoácidos en las posiciones clave de la segunda zona de interacción; los valores de energía libre de unión entregados por la simulación permitieron sugerir tres variantes de secuencia de CBM. Las variantes seleccionadas fueron: variante 1 (G7Y, F10W), variante 2 (G7Y, F10W, G12Q) y variante 3 (G7Y, G9Q, F10W, G12Q), donde G es glicina, Y tirosina, F fenilalanina, W triptófano y Q glutamina. Se generó un sistema de expresión recombinante de TvEG mediante clonamiento del gen silvestre de la enzima en el vector pET22b(+) y transformación en E. coli BL21(DE3); la proteína se acumuló intracelularmente en forma activa. Las mutaciones planteadas fueron construidas exitosamente mediante mutagénesis sitio dirigida, utilizando la metodología de mutación por extensión de superposición. De esta forma, se deja planteado un sistema de expresión recombinante de las variantes construidas, de modo de en el futuro cuantificar experimentalmente la adsorción de los CBM mutados y validar los resultados del análisis realizado in sílico. Se concluye que la estrategia utilizada permitió simular apropiadamente la interacción CBM-celulosa. Los resultados permitieron proponer en base a los estudios de DM, una estrategia de doble anclaje del CBM a celulosa, que si bien es cierto debe ser comprobado experimentalmente, resulta ser novedoso. Además, permitió proponer variantes del CBM de TvEG que potencialmente se adsorberán con mayor afinidad sobre celulosa. Si bien estas mutaciones deben ser validadas experimentalmente, fueron planteadas a partir de un diseño racional lo que aumentaría la probabilidad que éstas presenten mayor afinidad a celulosa.

El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico a una enzima, en particular una cutinasa, en la producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para realizar este estudio, se escogieron 3 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P), y se realizaron mutaciones en la enzima, mediante la técnica de “Polymerase Chain Reaction” (PCR). Se obtuvieron satisfactoriamente las mutantes CutinasaWPWP y Cutinasa-YYY, y en el caso de la combinación YPYPYP se obtuvo una secuencia más larga en 32 aminoácidos que la diseñada, denominada YPY*. Como resultado se obtuvo que dichos extremos aumentaron la hidrofobicidad superficial global teórica de la proteína en un 12,4% en el caso de la Cutinasa-YYY, en un 16,6% en el caso de la Cutinasa-WPWP y en el caso de una correcta construcción de la Cutinasa-YPYPYP, se hubiera incrementado en un 14,1%. En el caso de la Cutinasa-YPY* se estima que la hidrofobicidad superficial teórica es mayor a este último valor, aunque no pudo ser calculado, debido a que no fue posible aplicar los supuestos que permitían determinarla. Las cepas recombinantes de E. coli que expresan estas proteínas se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas, y se les extrajo desde la región periplasmática de la célula, obteniéndose una gran variabilidad (> 50 % en algunos casos) en los resultados en cuanto a actividad y proteína total presentes en las muestras. En el caso de la cutinasa mutada con la secuencia YYY se observó una disminución drástica de la concentración de proteína, en comparación con la cepa nativa, al igual que escasa actividad cutinasa. Esto tendría relación con la ausencia de prolina en el extremo adicionado, ya que este aminoácido, más que otorgar hidrofobicidad a la secuencia, le otorgaría estabilidad, debido a que permite la total exposición del extremo al medio y evita que interactúe con otras regiones de la proteína. Se descartó esta mutante durante el proceso de purificación, debido a la casi nula recuperación de proteína.

Ingeniero en Biotecnología Molecular / Las células madre mesenquimales (MSC) son un grupo heterogéneo de células multipotentes que han adquirido gran importancia en el último tiempo debido a su potencial aplicación en el desarrollo de terapias celulares. La principal limitante para estos tratamientos ha resultado ser la dificultad para el aislamiento de un número suficiente de células para los procedimientos propuestos. Recientemente, se ha identificado una población de estas células en el fluido menstrual, lo que permitiría superar esta dificultad. Las células madre aisladas desde fluido menstrual (MenSC) son una población de MSC cuyo aislamiento poco invasivo y regularidad de obtención las ubican en una posición ideal para el desarrollo de terapias celulares. Entre las características más destacadas de este tipo celular se encuentran una alta tasa proliferativa, una alta estabilidad cariotípica y buenas propiedades pro-angiogénicas y migratorias. Sin embargo, aún se desconocen gran parte de las propiedades y funciones de las MenSC, especialmente las relacionadas al nicho en donde se encuentran. Con respecto a este nicho, es posible hipotetisar que uno de los procesos en el cual las MenSC podrían tener un rol regulatorio correspondería a la implantación embrionaria, que a su vez está regulada por los cambios hormonales del ciclo menstrual que generan un endometrio receptivo, capaz de interactuar con el embrión y permitir la implantación. Por lo tanto, se investigaron los efectos de los cambios hormonales del ciclo menstrual sobre las MenSC aisladas de pacientes sanas, con el fin de evaluar cambios fenotípicos, especialmente los referidos (directa o indirectamente) al proceso de la implantación embrionaria. Para esto se cultivaron MenSC en condiciones que imitan el contexto hormonal que ocurre durante el ciclo menstrual, es decir, las concentraciones de Estrógeno y Progesterona tanto de la ovulación como del periodo de máxima 2 receptividad uterina, conocido como “ventana de implantación”. Los primeros genes analizados fueron aquellos que han sido reportados repetidamente como importantes para la ventana de implantación, tal es el caso del factor inhibidor de leucemia (LIF), Factor de Crecimiento Vascular Endotelial A (VEGFa), Factor de Crecimiento Transformante beta 1 (TGF-β), y Homeobox A-10 (HOXA-10). De los cuatro marcadores investigados solo LIF presentó diferencias significativas respecto al control al tratar a las MenSC con las concentraciones de Progesterona y Estradiol que imitan la ovulación y la ventana de implantación. Las segundas características evaluadas, fueron las propiedades pro-migratorias y pro-angiogénicas de las MenSC en respuesta a las hormonas del ciclo menstrual. Las MenSC estimuladas con las diferentes concentraciones de hormonas no presentaron diferencias significativas en su capacidad migratoria independientemente del tratamiento realizado. Por el contrario, tanto la capacidad de las MenSC de inducir la generación túbulos en células endoteliales de cordón umbilical, como la expresión de los marcadores pro-angiogénicos Endoglina (CD105) y Factor de Crecimiento de Fibroblastos 2 (FGF-2) presentaron diferencias significativas respecto al control al tratar a las MenSC con las concentraciones de Progesterona y Estradiol que se suceden desde la ovulación hasta la ventana de receptividad del ciclo menstrual. Estos resultados apoyan la posibilidad de que las MenSC podrían estar participando en procesos relevantes para la implantación del embrión como son los procesos de angiogenesis. Este conocimiento podría ser importante para entender de mejor manera el rol de las MenSC en la regulación del proceso fisiológico de la implantación, como su participación en los procesos fisiopatológicos relacionados con ella, abriendo la puerta a potenciales usos como marcadores de enfermedades relacionadas a la implantación o a la generación de terapias celulares basadas en sus propiedades. / Mesenchymal stem cells (MSCs) are a heterogeneous group of multipotent cells that have acquired great importance in recent years due to their potential application in the development of cellular therapies. The main limitation for these treatments has been the difficulty in isolating enough cells for the proposed procedures. Recently, a population of these cells has been identified in the menstrual fluid, which would allow to overcome this difficulty. Stem cells isolated from menstrual fluid (MenSC) are a population of MSCs whose minimally invasive isolation and regularity of collection place them in an ideal position for the development of cellular therapies. Among the most outstanding features of this cell type are a high proliferative rate, high karyotype stability and good proangiogenic and migratory properties. However, much of the properties and functions of the MenSC, especially those related to the niche in which they are found, are still unknown. Regarding this niche, it is possible to hypothesize that one of the processes in which the MenSC could have a regulatory role would correspond to the embryonic implantation, which in turn is regulated by the hormonal changes of the menstrual cycle that generate a receptive endometrium, capable of interacting with the embryo and allowing implantation. Hence, the effects of the hormonal changes of the menstrual cycle on the MenSC isolated from healthy patients were investigated to evaluate for phenotypic changes, especially those referred (directly or indirectly) to the process of embryo implantation. For this, MenSC were cultured in conditions that mimic the hormonal context that occurs during the menstrual cycle, i.e. the estrogen and progesterone concentrations of both the ovulation and the period of maximum uterine receptivity, known as the "implantation window". The first genes analyzed were those that have been repeatedly reported as important for the implantation window, such as Leukemia 4 Inhibitory Factor (LIF), Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGFa), Transforming Growth Factor beta 1 (TGF -β) and Homeobox A-10 (HOXA-10). Of the four markers investigated, only LIF showed significant differences compared to the control when treating the MenSC with the concentrations of Progesterone and Estradiol that mimic the ovulation and the implantation window. The following characteristics evaluated were the pro-migratory and pro-angiogenic properties of MenSC in response to menstrual cycle hormones. MenSC stimulated with the different concentrations of hormones did not present significant differences in their migratory capacity regardless of the treatment performed. In contrast, both the ability of MenSC to induce tubule generation in umbilical cord endothelial cells (HUVEC) and the expression of the pro-angiogenic markers Endoglin (CD105) and Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2) showed significant differences in respect of the control when treating the MenSC with the concentrations of Progesterone and Estradiol that transpire since the ovulation to the window of receptivity of the menstrual cycle. These results support the possibility that the MenSC could be involved in processes relevant to the implantation of the embryo such as the process of angiogenesis. This knowledge could be important to better understand the role of the MenSC in the regulation of the physiological process of implantation, as well as its participation in the pathophysiological processes related to it, opening the door to potential uses as markers of diseases related to implantation or the generation of cellular therapies based on their properties.

Ingeniería en Biotecnología Molecular / El sistema nacional de investigación posee financiamiento a través de fondos concursables principalmente individuales como los proyectos FONDECYT y proyectos colaborativos (entre distintas instituciones de educación superior que requieren de trabajo multi e interdisciplinario)como lo son los Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia. En Chile existen tres programas de Centros de Excelencia: Programa de Financiamiento Basal, FONDAP e Institutos Milenio, los cuales deben cumplir con ciertos estándares tales como la producción científica de excelencia, formación de redes internacionales, formación de capital humano avanzado, difusión del conocimiento generado al medio, entre otros. Estos centros poseen una duración limitada, dada la inexistencia de una política nacional de centros de investigación que de sustentabilidad a este tipo de proyectos. El objetivo de este seminario de título es evaluar qué factores afectan a la sustentabilidad de los Centros de Excelencia a través de una metodología de carácter mixto. Para ello se revisaron en una primera instancia fuentes primarias para obtener información del estado del arte de estos centros. Luego se elaboraron indicadores de los objetivos que estas instituciones deben cumplir, los cuales fueron utilizados en las entrevistas realizadas a 17 directores de Centros de Excelencia nacionales. Además se llevó a cabo un análisis cuantitativo en relación al presupuesto en ciencia, tecnología, innovación y emprendimiento, además del número de proyectos FONDECYT concursados y adjudicados entre los años 2009-2016. Al evaluar qué factores afectan la sustentabilidad de los Centros de Excelencia se encontró que elementos externos del sistema nacional de investigación, tal como la disgregación entre los distintos fondos de financiamiento, la competitividad al momento de postular a proyectos de investigación individual y deficiencias en el diseño de la 2 política pública de inserción del capital humano avanzado, afectan en una escala más particular a la sustentabilidad de los Centros de Excelencia, a través de elementos como la disgregación entre las agencias que coordinan los programas, la competitividad entre los grupos de investigadores insertos en distintas instituciones de educación superior y una falta de política pública de sustentabilidad más allá del financiamiento estatal. / The national research system has funding through mainly individual funds, such as FONDECYT projects, to collaborative projects between different institutions of higher education that require multidisciplinary and multidisciplinary work, such as the scientific and technological centers of excellence. In Chile, there are three centers of excellence programs: Basal Financing Program, FONDAP and Institutes Millennium, which must meet certain standards such as scientific production of excellence, international networking, advanced human capital formation and dissemination of knowledge generated at, among others. These centers have a limited duration, without there being a national policy of research centers that sustainability to this type of projects. The objective of this seminar is to assess what factors affect the sustainability of centers of excellence and the methodology used is mixed. For this purpose, primary sources were reviewed in order to obtain information on the state of the art of these centers, and then to elaborate indicators of the objectives that these institutions must meet, which were used in interviews with 17 directors of national excellence centers. In addition, a quantitative analysis was carried out in relation to the budget for science, technology, innovation and entrepreneurship, as well as the number of FONDECYT projects awarded and awarded between 2009-2016. In assessing which factors affect the sustainability of centers of excellence, it was found that external elements of the national research system, such as the disaggregation between different financing funds, competitiveness when applying for individual research projects and design gaps of the public policy of insertion of advanced human capital, affect on a more particular scale the sustainability of the centers of excellence, through elements such as the disintegration between the agencies that coordinate the 4 programs, the competitiveness among the groups of researchers inserted in different institutions of higher education and a lack of public policy of sustainability beyond state funding. / Enero 2018

Ingeniera en Biotecnología Molecular. / Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en el mundo. Desregulaciones en el flujo autofágico y en la desdiferenciación de células musculares lisas vasculares (VSMC) se han asociado con diferentes enfermedades cardiovasculares. En la aterosclerosis, una de las patologías cardiovasculares más importante, las VSMC desempeñan un papel fundamental cuando cambian su fenotipo desde uno contráctil y quiescente a otro proliferativo, migratorio y sintético. Se ha descrito que el cambio fenotípico de las VSMC es un proceso dependiente de autofagia. Por lo tanto, encontrar nuevos mecanismos que regulen este cambio fenotípico es fundamental para generar nuevas alternativas para tratar las enfermedades cardiovasculares. Dentro de esta búsqueda, el péptido similar a glucagón 1 (GLP-1), una hormona de la familia de las incretinas, surge como un potencial inhibidor de este proceso. Nuestro laboratorio ha descrito que esta incretina, al unirse a su receptor, activa a la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico (PKA). Se ha descrito a la PKA como un regulador negativo de la autofagia, ya que fosforila e inhibe a la proteína asociada a microtúbulo 1A/1B cadena liviana 3B, conocida también como LC3, una proteína autofágica esencial que también se usa como marcadora de la autofagia. Además, tanto en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 como en pacientes sanos, se ha comprobado la acción beneficiosa de GLP-1 sobre la aterosclerosis. Por estos antecedentes, proponemos que GLP-1 inhibe la autofagia a través de la fosforilación de LC3 por PKA en VSMC. La línea celular de aorta de rata, A7r5, se cultivó en condiciones basales en medio completo suplementado con 10% suero fetal bovino. La autofagia se indujo con un medio de cultivo carente de glucosa, el RPMI 1640. Además, las células A7r5 se estimularon con GLP-1 y/o H-89 [(E)-N-(2-(3-(4-bromofenil)alilamino)etil)-isoquinolin-5- sulfonamida], inhibidor de PKA. La autofagia se evaluó midiendo los niveles proteicos de LC3 I y LC3 II por western blot y por la formación de autofagosomas. Los autofagosomas se visualizaron mediante la transducción de VSMC con un adenovirus que sobreexpresa xii LC3 acoplada a la proteína fluorescente verde con una multiplicidad de infección de 180 y microscopía confocal. El flujo autofágico se determinó usando cloroquina. Nuestros resultados sugieren que GLP-1 disminuye el flujo autofágico en condiciones basales y de privación de glucosa. Además, GLP-1 disminuyó el número de autofagosomas por célula en la autofagia basal, pero no durante la privación de glucosa. Asimismo, se determinó que PKA participaría en los efectos generados por GLP-1 en la autofagia basal, pero no en la autofagia inducida por privación de glucosa. Finalmente, GLP-1 no aumenta la fosforilación de LC3. Este resultado sugiere que la inhibición de la autofagia por GLP-1 mediante PKA no ocurría por fosforilación de LC3. Por lo tanto, el efecto de GLP-1 en la inhibición de la autofagia en VSMC vía PKA, se suma a los antecedentes que postulan a GLP-1 como un promisorio regulador de la aterosclerosis y de otras enfermedades cardiovasculares. / Autophagy regulation by GLP-1 in vascular smooth muscle cells (VSMC) Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world. Deregulation in both autophagic flux and vascular smooth muscle cell (VSMC) dedifferentiation have been associated with different cardiovascular diseases. In atherosclerosis, one of the most important cardiovascular pathology, VSMC play a critical role when they change from a contractile and quiescent phenotype to a proliferative, migratory and synthetic phenotype. It was described that this phenotypic change is an autophagy-dependent process. Hence, finding new mechanisms to regulate this phenotypic change is critical to generate new alternatives to treat cardiovascular diseases. In this investigation, glucagon like peptide 1 (GLP-1) arises as a potential inhibitor of this process. Our laboratory has described that this incretin, upon binding to its receptor, activates the cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA). PKA was described as a negative autophagy regulator, because it phosphorylates and inhibits the microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B, also known as LC3, an essential autophagic protein also used as an autophagy marker. Besides, in both diabetic patients and healthy patients, the beneficial effects of GLP-1 on atherosclerosis has been demonstrated. Taking the above in consideration, we proposed that GLP-1 inhibits autophagy through a PKA induced LC3 phosphorylation in VSMC. The aortic VSMC cell line A7r5 were cultivated in basal condition with complte culture medium + 10% fetal bovine serum. Autophagy was induced with a glucose deprived culture medium, RPMI 1640. Also, A7r5 cells were stimulated with GLP-1, and/or H-89 [(E)-N-(2-(3-(4-bromophenyl)alylamino)ethyl)-isoquinoline-5- sulfonamide], a PKA inhibitor.). Autophagy was assessed by LC3 I and LC3 II levels using by western blot and by autophagosome formation. Autophagosomes were visualized by adenoviral transduction of LC3 coupled to green fluorescent protein using a xiv multiplicity of infection of 180 and confocal microscopy. Autophagic flux was evaluated using chloroquine. Our results suggest that GLP-1 inhibits autophagic flux under basal and glucose deprivation conditions. In addition, GLP-1 decreased the number of autophagosomes per cell in basal autophagy, but not in glucose deprivation-induced autophagy. Moreover, a PKA participation was demonstrated in the GLP-1-dependent effects on basal autophagy, but not on glucose deprivation-induced autophagy. Finally, GLP-1 did not increase LC3 phosphorylation. This result suggest that the GLP-1-dependent autophagy inhibition would not occur through LC3 phosphorylation. Therefore, the GLP-1 effect on autophagy inhibition in VSMC via PKA adds to the background information which suggests GLP-1 as a promising regulator of atherosclerosis and other cardiovascular diseases. / Enero 2018

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La proteína RfaH de E. coli es un regulador transcripcional perteneciente a la ampliamente conservada familia NusG, que incrementa la expresión de genes distales en operones estrechamente relacionados con virulencia. Esta expresión controlada toma lugar de manera posterior al reclutamiento específico de RfaH a una hebra de ADN expuesta en la superficie del complejo de elongación de transcripción, pausado en la secuencia nucleotídica ops. RfaH posee un dominio C-terminal plegado en forma de α-hélice (αCTD) compactada contra la superficie de unión a polimerasa de ARN (ARNP) del dominio N-terminal e inhibiéndolo, mientras que el de su parálogo NusG corresponde a un plegamiento barril-β (βCTD) sin interacción a la ARNP y con alta movilidad. Sin embargo, cuando ambos dominios de RfaH se disocian (evento necesario para unirse a la ARNP), el dominio C-terminal sufre un cambio de plegamiento desde α-hélice a un barril-β idéntico estructuralmente al de NusG, permitiendo la activación del NTD, y además reclutando la proteína ribosómica S10 para acoplar la transcripción con la traducción. RfaH es la primera proteína metamórfica cuyo cambio estructural está asociado a un cambio funcional. Debido a la escasa estabilidad de RfaH en solución la mayoría de los estudios termodinámicos han sido computacionales, sugiriendo la presencia de un intermediario que conecta ambos estados; sin embargo, a la fecha no se ha realizado un análisis profundo que conecte las dinámicas observadas computacionalmente con datos experimentales contrastables. En este trabajo de tesis se evaluó si el plegamiento del dominio C-terminal de RfaH ocurre previo al desplegamiento del NTD, con especial énfasis en las características termodinámicas de aquél proceso. Esto se realizó mediante distintos enfoques computacionales incluyendo modelos basados en estructura y dinámica molecular de confinamiento. Computacionalmente, se utilizaron modelos nativo-céntricos para simular el desplegado mecánico de RfaH en ambos estados nativos. A pesar de que estos modelos se han usado consistentemente para estudiar fenómenos de plegamiento, las magnitudes computacionales o “reducidas” no se encuentran calibradas respecto a su contraparte experimental. Por ello, inicialmente se estudió el desplegado mecánico de 35 proteínas depositadas en el PDB para poder estimar la capacidad de estos modelos de reproducir características experimentales. Utilizando ponderación por orden de contacto, se obtuvo una aproximación lineal de las fuerzas estimadas/experimentales (R=0,934) con un error estándar de 56 pN. Al realizar simulaciones de estiramiento de RfaH en estas condiciones, se observó consistentemente que el CTD se despliega independiente del NTD. A una velocidad de 100 nm∙s-1, la disociación y desplegado del αCTD ocurre a 43 ± 6 pN, mientras que el βCTD se despliega a los 35 ± 5 pN dando lugar a la formación de un intermediario β-extendido, que expone su núcleo hidrofóbico y se despliega a los 29 ± 4 pN. Utilizando este enfoque también se modeló el replegamiento del CTD en ambos estados. Mostrando alta histéresis para el caso del αCTD, y distribuciones de trabajo solapantes con las del desplegamiento para ambos pasos de desplegamiento del βCTD, permitiendo estimar un ΔG de 12,0 y 8,7 kcal mol-1 para la reacción βCTD ⇄ I ⇄ desplegado, respectivamente. Por otro lado, se calculó la estabilidad de ambos estados mediante dinámica molecular de confinamiento, entregando un ΔG = 6,5 kcal∙mol-1 para la reacción αRfaH ⇄ βRfaH. Una descomposición a nivel de residuo de esta diferencia de energía muestra alta correlación con la estabilidad relativa calculada a partir de espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio. Esto permitió identificar una estabilidad diferencial de segmentos al interior de RfaH, en la cual los residuos 129-146 están altamente estabilizados en el αCTD asociado al NTD, mientras que las otras dos regiones 115-128 y 147-162 favorecen enormemente un plegamiento βCTD, y apoyan la predicción energética predicha por las dinámicas de confinamiento. Este trabajo corresponde a la primera investigación termodinámica de la transición de RfaH, dando luces además de los directores en secuencia de esta transformación, y caracterizando su estabilidad y vía por la cual se conecta con el estado desplegado / The idea of a singular native state has been overruled by metamorphic proteins such as RfaH. This is a transcription factor composed of two domains: The N-terminal (NTD, 100 residues) and C-terminal (52 residues) domains. In solution this protein is autoinhibited, and it becomes activated by completely refolding its C-terminal domain from its initial α-hairpin to a β-barrel when binding to the transcriptional machinery. Through multiple molecular dynamics approaches, it was possible to computationally characterize and predict the folding pathways of both RfaH states, and estimate the free-energy difference required for converting them. Using structure-based models, the single-molecule mechanical unfolding of α-folded RfaH was simulated, which takes place by two sequential events: the simultaneous dissociation and unfolding of its α-helical C-terminal domain (αCTD), and a secondary unfolding of the NTD. On the other hand, when starting from the β-folded C-terminal domain (βCTD), RfaH unfolding occurs mediated by two different intermediates: first, the β-barrel opens and becomes solvent exposed turning into an extended-β intermediate. In a tertiary transition, this intermediate is unfolded and only the NTD remains structured, which shares the same folding characteristics as when unfolding from the α-state RfaH. Analysis of the unfolding of 35 different proteins using structure-based models allowed for estimation of forces from simulations. Using this approach, reversible unfolding of CTD was performed, yielding high hysteresis between the un- and refolding of the αCTD; and overlapping work distributions for such processes in the βCTD, enabling equilibrium free energy calculation through Crooks fluctuation theorem. Thus, the predicted ΔG° values for the reaction βCTD ⇄ Intermediate ⇄ unfolded are 12.0 and 8.7 kcal mol-1 respectively. By using confinement molecular dynamics, it was possible to estimate the free energy of the RfaH metamorphosis (αRfaH ⇄ βRfaH) calculated to be 6.5 kcal mol-1. The further decomposition of this free energy is highly correlated with thermodynamic analysis of hydrogen-deuterium mass spectrometry experiments performed for both CTD states. Altogether, this research provides insights into the folding mechanism and thermodynamics of the metamorphic RfaH protein, constituting a significant step forward in understanding the molecular determinants behind the duality of metamorphic proteins

El presente trabajo tiene como principal objetivo mostrar usos y aplicaciones de la biotecnología en tres actividades económicas importantes para Chile. Pese a lo relativamente novedoso de estos temas en el debate nacional, pensamos que el impacto que esta herramienta tiene en el aparato productivo chileno, amerita una exploración más detallada. En primer lugar, el estudio examina las distintas fases por las que ha transitado el estudio de lo biotecnológico en la historia de la humanidad. Luego, se efectúa una reseña de su desarrollo en Chile, relacionándola con temas de la innovación y las políticas de desarrollo productivo. Esto nos permite ver qué tan avanzados estamos en estos temas en el país, con en relación a otros países más desarrollados. Posteriormente examinamos tres casos importantes para la actividad productiva nacional, la biolixiviación del cobre, vacunas en acuicultura y levaduras en el campo de la vitivinicultura. Tras la presentación de los estudios de casos, resumimos las proyecciones y desafíos que conlleva el avance de las biotecnologías en Chile, para llegar así a las conclusiones finales del trabajo, donde se discute el potencial que las mismas podrían llegar a tener en el sendero del desarrollo económico de largo plazo de Chile.

Ingeniería en Biotecnología Molecular / Orestias agassii Valenciennes 1846, es la especie de peces del género Orestias, de mayor distribución del género en el Altiplano, abarcando desde el norte del lago Titicaca (Perú) hasta el sur del salar de Uyuni (Bolivia). El parque Nacional Volcán Isluga, región de Tarapacá, presenta una serie de poblaciones de Orestias cf. agassii, cuya distribución se presenta a lo largo de la cuenca del río Isluga. Este río fluye desde territorio chileno hacia el salar de Coipasa ubicado en Bolivia, formando un sistema continuo con ambientes alternados de pequeños bofedales y lagunas. Dado la geografía del río, se propone que la pendiente y su flujo unidireccional influirían en la magnitud de la diferenciación genética de las poblaciones de Orestias encontradas en él. El objetivo de este estudio fue evaluar la existencia de estructuración genética de las poblaciones de Orestias cf. agassii ubicadas en el río Isluga, Parque Nacional Volcán Isluga. Para evaluar la estructuración genética entre localidades ubicadas en un gradiente altitudinal, se tomaron muestras de individuos en un transecto desde el origen del río (4.200 m s. n. m.), hasta un bofedal cercano al pueblo de Isluga (3.740 m s. n. m.). De cada sitio de recolecta se extrajo DNA genómico de los individuos, de éste se amplificó la región control (D-Loop; mtDNA) y 7 microsatélites (nDNA). Los resultados indican que las poblaciones genéticamente menos diversas corresponden a las más cercanas al inicio del río Isluga y las más diversas a las poblaciones que se encuentran al final del río, además existiría una correlación positiva entre la diferencia genética de las poblaciones y la diferencia de altitud. Se observó que las diferencias de altitud encontradas en el río Isluga generan una pendiente con un flujo unidireccional del agua, por lo que las poblaciones río abajo pueden recibir individuos arrastrados desde río arriba. Los análisis realizados con la región D-loop muestran tres grupos genéticos: el primero incluye sólo individuos de la zona alta del río (localidad Punto xi 42), el segundo grupo formado por las localidades de zonas medianas (localidades de Taipicollo, Arabilla y Enquelga) y el tercer grupo incorpora a las zonas bajas (localidades de Isluga II e Isluga). De la misma manera, el análisis con microsatélites sugiere una estructuración genética de tres grupos en las poblaciones de Orestias similar a la obtenida con el marcador D-loop. Sin embargo, la conformación de los grupos sería diferente: el primer grupo estaría conformado por localidades de la zona alta del río (localidades de Punto 42 y Taipicollo), el segundo por las localidades de zonas medianas (localidades de Arabilla y Enquelga), y el tercero conformado por las zonas bajas (localidades de Isluga II e Isluga). Finalmente, los individuos de Orestias de las localidades de Isluga II e Isluga fueron los que presentaron mayor diversidad genética y mayor diferencia haplotípica con las otras poblaciones del río, por lo que se sugiere podrían tener una historia evolutiva distinta, ligada a la existencia del paleolago Tauca acontecido durante el Pleistoceno tardío. / Orestias agassii Valenciennes 1846 is a fish species of the genus Orestias with the largest genus distribution in the Altiplano, covering from the north of Lake Titicaca (Peru) to the south of Salar de Uyuni (Bolivia). The Volcán Isluga National Park, in the Tarapacá region, has a number of Orestias cf. agassii populations whose distribution occurs along the basin of the Isluga River. This river flows from Chilean territory to the Coipasa salt flat located in Bolivia, forming a continuous system with alternating environments of small wetlands and lagoons. Due to the geography of the river, it is proposed that the slope and its unidirectional flow would influence the magnitude of the genetic differentiation of the Orestias populations found in it. The objective of this study was to evaluate the existence of genetic structuring of Orestias cf. agassii populations located in the Isluga River, in the Isluga Volcano National Park. Samples were taken from a transect from the river source (4.200 m a. s. l.) to a wetland near the town of Isluga (3.740 m a. s. l.) in order to evaluate the genetic structuring between localities situated along an altitudinal gradient. Genomic DNA was extracted from the specimens at each collection site from which the control region (D-Loop; mtDNA) and 7 microsatellites (nDNA) were amplified. The results suggest that the genetically less diverse populations correspond to the ones closest to the Isluga river source and the most diverse to the populations at the end of the river, and there would also be a positive correlation between the genetic difference of the populations and the difference in altitude. It was observed that the differences in altitude found in the Isluga River generate a slope with a unidirectional flow of water, so downstream populations can receive specimens carried from upstream. D-loop analyses show three genetic groups, the first group includes only specimens from the upper part of the river (Punto 42 locality), the second group is composed by species from the mid-zone localities (Taipicollo, Arabilla and Enquelga localities), and the xiii third group incorporates species from the low zones (Isluga II and Isluga localities). Likewise, microsatellite analysis suggests a genetic structuring of three groups for Orestias populations, similar to that obtained with the D-loop marker. However, the conformation of the groups would be different: the first group would be formed by localities in the upper river zone (Punto 42 and Taipicollo localities), the second by the mid-zone localities (Arabilla and Enquelga localities), and the third by the low zones (Isluga II and Isluga localities). Finally, the Orestias specimens from Isluga II and Isluga were the ones that showed greatest genetic diversity and haplotype difference with respect to the other river populations, therefore it is suggested that they could have a different evolutionary history, linked to the existence of the Tauca paleolake found during the late Pleistocene.

Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Las células animales son uno de los principales sistemas para la producción de biofármacos, sin embargo la mayoría de las estrategias para mejorar su productividad no están respaldadas por conocimiento específico para las líneas celulares usadas en la industria. En este trabajo se reconstruye un modelo a escala genómica para células CHO para ampliar el conocimiento de procesos celulares asociados con productividad en la síntesis de biofármacos. Para lograr este objetivo analizamos el modelo a escala genómica de ratón iMM1415 usando herramientas desarrolladas para explorar el efecto de knockout de genes y determinación de flujos en crecimiento celular. Nuestros resultados muestran que esta red metabólica está dominada por metabolismo de lípidos. Adicionalmente, confirmamos que un enfoque de sampleo, donde se explora el espacio de soluciones en vez de imponer un objetivo de optimización, es más apropiado para el estudio del metabolismo en sistemas complejos como células animales. Posteriormente, se desarrolla en estudio comparativo de las herramientas desarrolladas para la generación automática de modelos preliminares, donde los resultados obtenidos utilizando tres algoritmos (modelSEED, Pantograph y Pathway tools) muestran que Pantograph es la herramienta más apropiada para la generación de un modelo a escala genómica de células CHO. Este algoritmo produce un modelo basándose en un modelo previo y ortología entre ambos organismos, produciendo un modelo preliminar que hereda características como asociaciones de genes distintas para distintos organelos celulares lo que es crucial para potenciales aplicaciones de modelos para eucariontes. El modelo iNJ1301 para células CHO es reconstruido de acuerdo a la metodología propuesta basándose en iMM1415 y el modelo humano Recon 1. iNJ1301 tiene 3,709 reacciones asociadas a 1,301 genes y fue validado con información experimental para esta línea celular prediciendo correctamente el crecimiento celular en un 88% de los casos simulados. Adicionalmente, este modelo es reducido imponiendo cambios en expresión de genes reportados para representar un metabolismo ineficiente del carbono caracterizado por síntesis de lactato y el shift metabólico observado en esta línea celular, mostrando el potencial de este enfoque para ser usado en la integración de datos transcriptómicos. Al utilizar un nuevo enfoque basado en ortología se pudieron encontrar nuevas asociaciones de genes no incluídas en reconstrucciones creadas utilizando metodologías clásicas para la generación de modelos, por lo que los resultados de este trabajo fueron incorporadas en el modelo consenso iCHO1766. La identificación de marcadores asociados a productividad mejorada en células CHO ha sido abordada desde la perspectiva genómica, transcriptómica y proteómica. En este trabajo integramos datos transcriptómicos para dos clones de células CHO que muestran distintos perfiles de productividad en el modelo iNJ1301. Datos de un alto (HP) y bajo (LP) productor de IgG son integrados al modelo usando iMAT (integrative metabolic analysis tool) obteniéndose modelos reducidos que presentan una alta conservación de vías metabólicas de glutatión y azúcares nucleotídicos. Este enfoque es luego acoplado con sampleo de las redes metabólicas encontrándose que ambos modelos presentan comportamientos distintos, donde el clon HP está enfocado en el uso del ciclo del TCA y la vía pentosas fosfato. Finalmente, concluimos que este enfoque que combina distintas herramientas utilizadas en biología de sistemas es una nueva herramienta que permite el estudio exhaustivo de sistemas biológicos complejos tales como líneas celulares animales.

Ingeniero Civil Industrial / El proyecto PLA corresponde una investigación aplicada en el área biotecnológica que busca probar la producción de un bio plástico (ácido poli láctico) a través de organismos genéticamente modificados. De acuerdo a lo anterior, el presente trabajo busca orientar la actividad científica asociada al proyecto PLA, hacia un mercado atractivo que permita explotar la invención en favor de obtener beneficios. De esta forma se elabora una metodología que consta de 5 etapas: La primera etapa desarrolla un análisis del mercado global de los polímeros destinados a envases, valorado en 270 B de USD para el año 2014. Dentro de este mercado se destaca el segmento de los biopolímeros valorado en 3.5 billones de USD, en el cual participa el ácido poli láctico con un 12% de la producción. Se realizan dos análisis: fuerzas de Porter y análisis PEST donde se concluye que el segmento de biopolímeros es un mercado atractivo para explotar la tecnología pues posee altas tasas de crecimiento (respecto al mercado global), condiciones externas favorables de producción y un alto margen de crecimiento para los siguientes años. La segunda etapa desarrolla un análisis del estado del arte el cual se basa en el análisis de patentes. El análisis se basa en un flujo de trabajo diseñado por Abbas (2014) donde se elabora una base de datos de patentes, se estructuran y se extraen datos relevantes de las mismas. Luego se elabora un análisis sobre la competencia, predicciones de la tecnología y el nivel inventivo de los conceptos propuestos por el proyecto PLA. Así se determina que los conceptos no poseen nivel inventivo pues consideran réplicas de inventos desarrollados en 2008 y no resuelven los problemas de la técnica detectados para 2013. La tercera etapa implica un análisis FODA del equipo respecto a las condiciones planteadas a las etapas 1 y 2. Los resultados, indican que existe una clara desventaja del equipo respecto a la competencia detectada (tanto es aspectos técnicos como recursos). Esto involucra un alto riesgo debido a que la competencia logre desarrollar las soluciones a la técnica antes que el equipo. La cuarta etapa corresponde al diseño de una estrategia de propiedad intelectual, donde se elabora un modelo de negocios basado en un objeto tecnológico, el cual es licenciado a determinados clientes. Así se determina un valor de la tecnología estimado entre 0.023 y 1.698 millones de dólares (según distintos escenarios). Una quinta etapa que considera el desarrollo de una hoja de ruta para dar solución a los problemas de la técnica detectados en la segunda etapa. De esta forma se elabora una planificación que considera 3 etapas dentro de un periodo de 4 a 6 años y una inversión de hasta 380 Millones de pesos (568,096 dólares). Finalmente se evalúa financieramente mediante el criterio de costo-beneficio y la tasa interna de retorno, donde se obtiene que el proyecto es económicamente viable solo en un caso optimista. Así se concluye que el proyecto hoy no es viable en el corto plazo, pero puede ser gestionado por centros de investigación con una visión de largo plazo y financiado por fondos de alto riesgo.