Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-01-19Bitstream added on 2015-05-14T16:59:08Z : No. of bitstreams: 1 000828398_20151120.pdf: 49172 bytes, checksum: 37877bd4281c51b89052cc8b1594b906 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-11-27T16:10:05Z: 000828398_20151120.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-11-27T16:10:44Z : No. of bitstreams: 1 000828398.pdf: 549205 bytes, checksum: c1d0695fe73602a07a20eab8411b29e4 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / BEPE-Itália / Esta pesquisa visou avaliar o perfil de expressão de determinados genes e o potencial de desenvolvimento in vitro de complexos cumulus-oócitos (COCs) de ovinos temporariamente bloqueados no estadio de vesícula germinativa (GV) com uso da roscovitina. Neste contexto, diferentes composições de meio (com e sem soro fetal bovino e gonadotrofinas), tempos (0, 6, 12 e 20 horas) e métodos de cultivo (com e sem cobertura de óleo mineral) foram testados com intuito de garantir a máxima eficiência de inibição meiótica promovida pela roscovitina a 75μM. A avaliação do grau de expansão das células do cumulus, em estereomicroscópio, e do estadio da maturação nuclear, por meio da coloração com Hoescht 33342, revelou que a presença ou ausência de LH, FSH e soro fetal bovino não interferiu no potencial de ação da roscovitina. No entanto, máxima eficiência inibitória foi observada em meio suplementado apenas com soro fetal bovino. Foi constatado ainda que, na ausência de óleo mineral, quantidade significativamente maior de oócitos tratados com roscovitina foi mantida em GV o que reforça a hipótese de lipossolubilidade do referido inibidor. Embora o potencial de inibição meiótica da roscovitina tenha se mantido nos diferentes tempos de cultivo, a exposição prolongada dos COCs ao inibidor afetou de maneira irreversível a expansão do cumulus. Em todas as situações, a inibição meiótica foi completamente reversível após cultivo por 18 horas em meio de maturação livre de inibidor. Sendo assim, para análise da expressão gênica e desenvolvimento embrionário in vitro, foi preconizado o tratamento com roscovitina a 75μM por 6 horas na presença de soro e sem óleo mineral. Nestas condições assim como após a reversibilidade por 18 h, a quantidade relativa da maioria dos genes investigados nas células do cumulus e nos oócitos foi similar ao observado nos COCs não inibidos (controle). Do mesmo modo, não foi ... / This study aimed to evaluate the expression profile of certain genes and the potential of in vitro development of sheep cumulus-oocytes complexes (COCs) temporarily arrested at germinal vesicle (GV) stage using roscovitine. In this context, different medium compositions (with and without fetal bovine serum and gonadotropins), times (0, 6, 12 and 20 hours) and methods of culture (with and without mineral oil overlay) were tested in order to ensure maximum efficiency of meiotic inhibition promoted by 75μM roscovitine. The evaluation of cumulus expansion degree, under stereomicroscope, and nuclear maturation stage, by staining with Hoechst 33342, revealed that the presence or absence of LH, FSH and fetal bovine serum did not influence the action potential of roscovitine. However, maximum efficiency of meiotic inhibition was observed in medium supplemented with fetal bovine serum. It was also found that, in the absence of mineral oil overlay, significantly higher quantity of oocytes treated with roscovitine was kept at GV, which reinforces the hypothesis of liposolubility of this inhibitor. Although the potential of meiotic inhibition of roscovitine had remained at different culture times, the prolonged exposure of COCs to inhibitor irreversibly affect the cumulus expansion. In all cases, the meiotic arrest was completely reversible after culture for a further 18 h in inhibitor-free medium. Therefore, for analysis of gene expression and in vitro embryo development, it was chosen the treatment with 75μM roscovitine for 6 h under serum-supplemented medium and without mineral oil overlay. Under these conditions as well as after the reversibility for 18 h, the relative amount of most investigated genes in cumulus cells and oocytes was similar to that observed in the uninhibited COCs (control). Similarly, no difference was found between roscovitine treatment and control with respect to blastocyst rate and quality of embryos obtained. Therefore, ... / FAPESP: 2011/14041-5 / BEPE-Itália: 2013/05564-0

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-04Bitstream added on 2015-05-14T16:58:53Z : No. of bitstreams: 1 000826973.pdf: 1421350 bytes, checksum: cb9046da915832bdb24f2e31bcc45a06 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi quantificar a abundância de genes associados com a competência de desenvolvimento em oócitos (GDF-9, BMP15 e OOSP1) e nas células do cumulus (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 e ADAM17), a partir de oócitos imaturos (VG), maturados in vivo (MIVO) e cultivados em meio de MIV com diferentes macromoléculas (SFB, BSA ou PVA), diferentes concentrações de EGF ou pré-cultivados com butirolactona I (BLI) antes da MIV. O delineamento experimental consistiu de três experimentos de MIV de oócitos bovinos, a saber: experimento 1, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo 10% de SFB ou 1 mg/mL de PVA ou 4 mg/mL de BSA; experimento 2, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo EGF (nas concentrações de 0, 10 e 100 ng/mL); e experimento 3, complexos cumulus-oócito maturados in vitro na ausência (BL0) ou presença de pré-maturação com 10 μM de BLI ( BL12, 12 horas de pré-maturação e 12 horas de MIV; BL24, 24 horas de prématuração e 24 horas de MIV). A quantidade relativa de transcritos para o gene GREM1, PTGS2, PFKP e AREG foi maior do que (P<0,05) nas células do cumulus de oócitos MIVO, nos experimentos 1 e 2 e para o gene GREM1 no experimento 3. No experimento 1, o grupo SFB exibiu maior (P<0,05) abundância de transcritos de GREM1 e AREG entre os grupos MIV. No experimento 2, a adição de 10 ng/mL ao meio de MIV propiciou uma regulação positiva de EREG. No experimento 3, BL12 apresentou maior (P<0,05) abundância de AREG e o BL24 de EREG e PTX3. Entre os grupos de MIV, o gene GREM1 foi expresso em maior quantidade (P<0,05) no BL12. Não houve diferença estatística nos experimentos 1, 2 e 3 entre os grupos de oócitos MIV, MIVO e VG para os genes GDF9, BMP15 e OOSP1. Conclui-se que, a utilização de diferentes macromoléculas, diferentes concentrações de EGF e a realização de précultivo com BLI altera a transcrição nas células ... / The aim of this study was to quantify the abundance of genes associated with the development of oocyte competence in oocytes (GDF-9, BMP15 and OOSP1) and in cumulus cells (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 and ADAM-17) of immature oocytes (GV), in vivo matured (IVMO) and cultured in IVM medium with different macromolecules (FCS, BSA or PVA), different EGF concentrations or pre-cultured with butyrolactone I (BLI) before IVM. The experimental design consisted of three IVM experiments of bovine oocytes, namely: experiment 1, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing 10% FCS or 1 mg/mL PVA or 4 mg/mL BSA; Experiment 2, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing EGF (at concentrations of 0, 10 and 100 ng/mL); and Experiment 3, cumulus-oocyte complex in vitro matured in the absence (BL0) or presence of pre-maturation with 10 μM de BLI (BL12, 12 hours of pre-maturation and 12 hours of IVM, BL24, 24 hours of pre-maturation and 24 hours of IVM). The relative amount of transcripts for GREM1, PTGS2, PFKP and AREG gene was larger than (P <0.05) in cumulus cells of IVMO oocytes in experiments 1 and 2 and for GREM1 gene in experiment 3. In experiment 1, the FCS group exhibited higher (P <0.05) abundance of transcripts of GREM1 and AREG among MIV groups. In experiment 2, the addition of 10 ng/ml to the IVM medium provided an upregulation of EREG. In experiment 3, BL12 showed higher (P <0.05) abundance of AREG and BL24 of EREG and PTX3. Among IVM groups, the GREM1 gene was expressed in larger quantities (P <0.05) in BL12. There was no statistical difference in experiments 1, 2 and 3 among groups of oocytes IVM, IVMO and GV for GDF9, BMP15 and OOSP1 genes. It was concluded that the use of different macromolecules, different EGF concentrations and the performance of pre-culture with BLI change the transcription in the cumulus cell of genes associated with oocyte competence / FAPESP: 2011/20514-3

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:34Z : No. of bitstreams: 1 000843878_20151231.pdf: 905384 bytes, checksum: 9b6eaf7fcedae316cec999a302400d52 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-04T10:26:30Z: 000843878_20151231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-04T10:28:26Z : No. of bitstreams: 1 000843878.pdf: 3505593 bytes, checksum: 74afed02afd55eb520396764b8c59504 (MD5) / A décadas a criobiologia busca a conservação do genoma materno em peixes por meio da conservação de gametas, porém as técnicas disponíveis atualmente esbarram em problemas como a baixa permeabilidade das membranas, o grande volume de vitelo e a sensibilidade dos gametas ao frio. Trabalhos acerca do assunto vem sendo realizados, contudo de forma não sistemática e de forma majoritária com espécies de clima temperado a frio. Devido a carência de informações sobre o tema com peixes neotropicais, objetivou-se neste trabalho desenvolver um protocolo para o congelamento de oócitos de Prochilodus lineatus, para isso, foi avaliado o uso de diferentes soluções salinas (solução de Ringer e Ringer lactato, solução salina balanceada de Hank (HBSS) com e sem cálcio, e solução para ovos de salmonídeos) como meio de manutenção e extensão da viabilidade dos oócitos. Também foi avaliado a toxicidade de três agentes crioprotetores (ACPs) o Dimetilsulfóxido (DMSO), Propilenoglicol (PG), e Metanol (MET), visando (1) a elaboração de protocolos de vitrificação, com exposição de 2,5, 5 e 7,5 min. em molaridades de 6 M, 8 M e 10 M de ACP; e (2) para a construção de protocolos de congelamento lento com incorporação dos ACPs em banhos crescentes avaliado os efeitos tóxicos sobre a fertilização em 0,5 M, 1 M, 2 M e 4 M. Avaliou-se a sensibilidade dos oócitos a baixa temperatura (2,5°C) em quatro tempos de estocagem 30, 60, 90 e 120 minutos. Oócitos foram submetidos ao congelamento lento em vapor de nitrogênio avaliando as injúrias morfológicas geradas pela exposição aos ACPs e ao congelamento. Os resultados obtidos mostraram que somente a HBSS com e sem cálcio foram capazes de manter o estado não ativado dos gametas, porém, as mesmas não proporcionaram a extensão da viabilidade dos oócitos, permitindo a que estes continuassem a sofrer a degradação pelo tempo de estocagem, de forma similar aos oócitos mantidos... / The decades cryobiology seeks to conserve the maternal genome in fish through gamete preservation, but the techniques currently available run into problems such as low permeability of the membranes, the large the amount of yolk and the sensitivity of gametes to cold. Work on the subject has been carried out, however unsystematically and majority form with cold temperate species. Due to lack of information on the subject with Neotropical fish, the aim of this work is to develop a protocol for the freezing of Prochilodus lineatus oocytes for this, was evaluated using different salt solutions (Ringer and Ringer's lactate solution, Hank's balanced salt solutions (HBSS) with and without calcium, and the solution for salmonid eggs) as a means of maintaining and extending the viability of oocytes. We also assessed the toxicity of three cryoprotectants agents (ACPs) the Dimethyl sulfoxide (DMSO), Propylene glycol (PG), and Methanol (MET), to (1) the development of vitrification protocols with exposure, 2.5, 5.0 and 7.5 min. in molarities the 6 M 8 M 10 M CPA; and (2) for the construction of slow cooling protocols with CPAs with increasing incorporation of the baths evaluated toxic effects on fertility in 0.5 M, 1 M, 2 M and 4 M. It was evaluated the lower the sensitivity of oocytes temperature (2.5 ° C) storage on four 30, 60, 90 and 120 minutes. Oocytes underwent slow cooling in nitrogen steam evaluating the morphological injuries due to exposure to the CPAs and freezing. The results showed that only with HBSS without calcium and were able to maintain the state of gametes not activated, however, they do not provide the extent of viability of oocytes, allowing that they continue to suffer from degradation by storage time, similarly to the oocytes retained only in ovarian fluid. The high sensitivity of oocytes to the CPAs and the cold was found. The toxicity of the higher molarities of CPAs (6 M, 8 M and 10 M) at all exposure times, precludes ...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-11-29Bitstream added on 2014-11-10T11:58:47Z : No. of bitstreams: 1 000790225.pdf: 849889 bytes, checksum: ea42408a16377fb6d95fbec0bcbb46cc (MD5) / O sêmen ovino congelado e descongelado sofre alterações morfofuncionais que impossibilitam ou diminuem a eficiência na fecundação. Os métodos de seleção espermática visam melhorar a qualidade e viabilidade do material fecundante. Quatro métodos de seleção espermática utilizando duas soluções de sílica coloidal revestida por silano (silica coloidal-silano) ou por polivinilpirrolidona (silica coloidal-PVP), variando o volume de solução coloidal. Foram testados a cinética espermática no CASA e a recuperação espermática. Os protocolos utilizando silica coloidal-silano apresentaram maior motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e porcentagem de espermatozoides rápidos (%RAP) quando comparado aos métodos utilizando a silica coloidal-PVP e às amostras antes da seleção espermática. A silica coloidal-PVP teve maior recuperação espermática quando comparado à silica coloidal-silano. Somente o método utilizando 4mL de silica coloidal-PVP não foi eficiente na seleção de amostras com melhor qualidade quando comparado às amostras analisadas antes da seleção espermática. Os métodos utilizando menores volumes de solução coloidal não diferiram dos métodos de maior volume, sendo a silica coloidal-silano com 1 mL o método que apresentou os melhores resultados. Como conclusão os resultados encontrados no trabalho apontaram a maior eficiência da silica coloidal-silano em selecionar sêmen ovino congelado e descongelado quando comparado à seleção em silica coloidal-PVP. O método utilizando 1mL de silica coloidal-silano foi igualmente eficiente ao método com maior volume, sendo uma alternativa para processar amostras com baixa concentração espermática / Frozen and thawed ovine semen undergo morphofunctional changes that prevent or decrease the efficiency of fertilization. Sperm selection methods have beneficial effects on the selected sperm, improving sperm quality and viability. Four methods of sperm selection were tested using two colloidal silica solutions coated with silane (silica colloid- silane) ou povinilpirrolidone (silica colloid-PVP), varying the volume of colloidal solution. Furthermore, analyses of sperm kinetics in CASA and sperm recovery were carried out. The protocols using silica colloid-silane resulted in greater MT, MP, and %RAP when compared to the methods using silica colloid-PVP and the semen before selection. Silica colloid-PVP had higher sperm recovery when compared to silica colloid-silane. Only the method using 4mL of silica colloid-PVP was not efficient in the selection of best quality samples when compared to the semen before selection. The methods using lower volumes of colloidal solutions did not differ from the methods with higher volumes, being the method with 1mL of silica collois-silane better than the 4mL method. In conclusion the results of the study indicate the superiority of silica colloid-silane in selecting frozen and thawed ovine semen when compared to silica colloid-PVP. The method using 1mL of silica colloid-silane was equally efficient to the standard method and has lower costs, being an interesting alternative to process samples with low sperm concentration

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-01-29Bitstream added on 2014-11-10T11:57:43Z : No. of bitstreams: 1 000786360.pdf: 1222171 bytes, checksum: 62128e228f9f36f81eb96b431ec790e9 (MD5) / O objetivo deste estudo foi avaliar a influência das fases de anestro e diestro no diâmetro oocitário, na configuração da cromatina em VG e na competência de oócitos caninos, assim como analisar a cinética da atividade quinase p34cdc2 durante a maturação in vitro de oócitos caninos após 24, 48 e 72 horas de cultivo in vitro. Os ovários foram obtidos de cadelas submetidas à ovário-salpingo-histerectomia eletiva (OSH). Para avaliar o diâmetro e a configuração da cromatina em VG, os complexos cumulus-oócitos (COCs) foram submetidos à solução de hialuronidase 0,2% para a remoção das células do cumulus e corados com Hoechst. A avaliação da configuração nuclear dos oócitos caninos foi realizada após 72h de maturação in vitro. Para a realização do ELISA, foi realizado um extrato de proteínas dos oócitos após 24, 48 e 72 horas de cultivo in vitro. Quanto ao diâmetro médio oocitário, os resultados não demonstraram diferença (p>0,05) entre as fases de anestro e diestro (77,62 μm x 78,64 μm). Comparando-se as fases reprodutivas, maior frequência de oócitos nos estágios de M-I (19,1%) e M-II (14%) foi observada na fase de diestro. Entretanto, essas diferenças não foram significativas (p>0,05). Foram classificados quatro estágios de configuração da cromatina identificados como VG-1, VG-2, VG-3 e VG-4. As alterações observadas na configuração da cromatina foram caracterizadas como, transição de uma cromatina dispersa (VG-1, VG-2) para parcialmente condensada (VG-3) até atingir um estágio totalmente condensado (VG-4). Os resultados evidenciaram diferença (p< 0,05) entre as fases de anestro e diestro, com maior proporção de VG-1 e VG-2 durante o anestro e de VG-3 e VG-4 durante o diestro. A atividade quinase p34cdc2 mostrou-se tempo-dependente, atingindo o pico máximo em 48h de MIV (p<0,01). Após 72h, a atividade demonstrou um decréscimo. Dessa forma, a identificação de fatores ... / The aim of this study was to evaluate the influence of stages of anestrus and diestrus in oocyte diameter, configuration of chromatin in GV stage and competence of canine oocytes, as well as analyze the kinetics of p34cdc2 kinase activity during in vitro maturation of canine oocytes after 24, 48 and 72 hours of in vitro culture. Ovaries were obtained from bitches after elective ovariohysterectomy (OSH). To evaluate the diameter and configuration of chromatin in GV stage, cumulus-oocyte complexes (COCs) were subjected to 0,2% hyaluronidase solution for removal of cumulus cells and stained with Hoechst. The assessment of nuclear configuration of canine oocytes was analysed after 72 hours in vitro maturation. To perform the ELISA was performed an extract of proteins from oocytes after 24, 48 and 72 hours of in vitro culture. For the mean oocyte diameter, the results showed no difference (p> 0.05) between phases of anestrus and diestrus (77,62 μm x 78,64 μm). Comparing the reproductive phases, higher frequency of oocytes in stages of MI (19,1%) and M-II (14%) was observed in the diestrus phase. However, these differences were not significant (p> 0.05). Four stages of chromatin configuration identified as GV-1, GV-2, GV-3 and GV-4 were classified. The observed changes in chromatin configuration been characterized as a transition dispersed chromatin (GV-1, GV-2) for partially condensing (GV-3) until it reaches a fully condensed phase (GV-4). The results showed difference (p<0.05) between phases of anestrus and diestrus, with a higher proportion of GV-1 and GV-2 during anestrus and GV-3 and GV-4 during diestrus. The p34cdc2 kinase activity was shown to be time-dependent, reaching a peak at 48h of IVM (p<0,001). After 72h, the activity showed a decrease. Thus, identification of factors related to the resumption and progression of meiosis in vivo is critical for making appropriate adjustments and improvement of culture conditions

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-01-15Bitstream added on 2015-01-26T13:30:37Z : No. of bitstreams: 1 000793455.pdf: 1026631 bytes, checksum: 75839ed402bbcfadbc2cf50211762f0f (MD5) / A perfusão vascular do folículo pré-ovulatório vem sendo positivamente correlacionada com a fertilidade. De forma similar, o aumento da perfusão vascular do útero pode resultar em menores taxas de perda embrionária. A ultrassonografia Doppler permite uma avaliação não invasiva e em tempo real da hemodinâmica de tecidos e órgãos. Estudos recentes em éguas, assim como em outras espécies, demonstraram que o aminoácido L-arginina (Arg) aumenta a perfusão vascular do sistema reprodutivo. Os objetivos do presente estudo foram: a) comparar a perfusão vascular folicular, luteal e uterina e o perfil hormonal entre éguas jovens e idosas; b) avaliar o efeito da suplementação do aminoácido L-arginina sobre a perfusão vascular folicular, luteal e uterina, e sobre o perfil hormonal de éguas de diferentes idades. Para tanto, foram utilizadas 10 éguas jovens (4-10 anos de idade) e 12 éguas idosas (≥ 20 anos). Amostras de sangue foram coletadas diariamente para análise de FSH, LH, P4 e E2, por radioimunoensaio. A perfusão vascular folicular, luteal e uterina não diferiu entre éguas jovens e idosas no ciclo controle. As concentrações plasmáticas de FSH e LH foram maiores em éguas jovens; as concentrações plasmáticas de P4 foram superiores em éguas idosas, e não houve diferença nas concentrações plasmáticas de E2 entre os grupos no ciclo controle. A suplementação com o Arg apresentou um efeito positivo na vascularização uterina de éguas jovens entre o D-1 e D3 e no D6, e na vascularização do CL de éguas idosas no D8. Conclui-se que a suplementação com Arg não apresentou efeito, na maioria dos parâmetros avaliados sobre a perfusão vascular folicular, luteal e uterina tanto de éguas jovens como de idosas, tendo sido observado um efeito positivo em alguns momentos na perfusão vascular uterina de éguas jovens, e na perfusão vascular luteal de éguas idosas. A suplementação com Arg também apresentou um ... / Vascular perfusion of preovulatory follicles has been positively correlated with the fertility. Similarly, increased uterine vascular perfusion can result in lower rates of embryonic loss. Doppler ultrasonography allows a noninvasive and real-time hemodynamic assessment of tissues and organs. Recent studies in mares, as well as in other species, have demonstrated that the amino acid L-arginine (Arg) increases vascular perfusion of the reproductive system. The aims of this study were: a) to compare follicular, luteal and uterine vascular perfusion and hormonal profile between young and old mares; b) to evaluate the effect of supplementation of the amino acid L-arginine on the follicular, luteal and uterine vascular perfusion and on the hormonal levels of mares of different ages. For this, 10 young mares (4-10 years old) and 12 old mares (≥ 20 years) were used. Blood samples were collected daily for analysis of FSH, LH, E2 and P4 by RIA. The follicular, luteal and uterine blood flow did not differ between young and old mares in the control cycle. Plasma concentrations of FSH and LH were higher in young mares; P4 plasma concentrations were higher in older mares, and there was no difference in plasma concentrations of E2 between groups in the control cycle. Arg supplementation had a positive effect on the uterine vascularization of young mares between the D-1 and D3 and D6, and CL vascularization of the old mares in the D8. In conclusion, supplementation with Arg had no effect on most parameters assessed related with follicular, luteal and uterine vascular perfusion in both young and old mares, however a positive effect have been observed in some moments in uterine vascular perfusion of young mares and in the luteal vascular perfusion of old mares. Supplementation with Arg also had a positive effect on hormonal status of the mares

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-03Bitstream added on 2015-01-26T13:30:31Z : No. of bitstreams: 1 000795832.pdf: 314304 bytes, checksum: b6077bd7a50cb6eb686277acd319024f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O oviduto possui papel essencial na reprodução de mamíferos, promovendo um microambiente favorável para a maturação oocitária, estocagem e capacitação do espermatozoide, fertilização, transporte dos gametas e desenvolvimento inicial do embrião. Anatomicamente e funcionalmente, o oviduto é dividido em três regiões principais: infundíbulo, ampola e istmo. O oócito e o espermatozoide entram nos lados opostos do oviduto, respectivamente no infundíbulo e istmo, e são transportados até a ampola, local onde ocorre a fertilização. O sucesso reprodutivo está diretamente ligado a temporização apropriada do transporte dos gametas ao local da fertilização, bem como, a precisão no tempo de transporte do embrião até o útero, para a aquisição da capacidade de implantação. A coordenação e regulação das funções do oviduto são complexas e estão sob efeitos endócrinos, parácrinos e autócrinos, os quais alteram temporalmente e espacialmente a transcrição e tradução de diversos fatores. Diante disso, o presente trabalho visou avaliar o efeito de biotecnologias reprodutivas, especificamente da superestimulação ovariana, bem como de características genéticas e fisiológicas reprodutivas no perfil transcricional de diversos fatores no oviduto bovino. Para tanto, foram avaliados os efeitos da indução de múltiplas ovulações em vacas da raça Nelore (dados apresentados no primeiro manuscrito), bem como os efeitos da influência da seleção genética de animais com alta contagem folicular em novilhas da raça Nelore e Aberdeen Angus, no período inicial pós ovulação (dados apresentados no segundo manuscrito), na expressão de genes relacionados ao transporte de gametas e fertilização. Os resultados demonstram que a superestimulação ovariana modula a expressão de alguns genes relacionados à contratilidade do oviduto em vacas da raça Nelore e que a ovulação é principal fator responsável por controlar ... / The oviduct has an important role in mammal reproduction, promoting a favorable microenvironment for oocyte maturation, sperm storage and capacitation, fertilization, transport of gametes and early embryo development. Anatomically and functionally, the oviduct is divided in three regions: infundibulum, ampulla and isthmus. The oocyte and the sperm enter in opposite sides of the oviduct, respectively infundibulum and isthmus, and are transported to the fertilization site, the ampulla. Reproductive success is directly related to appropriate timing of gamete transport to the fertilization site, as well as a precise time of embryo transport to the uterus, to obtain the capacity of implantation. The coordination and regulation of oviductal functions are complex and under endocrine, paracrine and autocrine effects, which temporally and spatially alter the transcription and translation of several factors. Therefore, this study aimed to evaluate the effect of reproductive biotechnologies, specifically ovarian superstimulation, as well as genetic and physiological reproductive characteristics in the transcriptional profile of several factors in the bovine oviduct. To do so, we evaluated the effects of inducing multiple ovulation in Nelore cows (data presented in the first manuscript), and the effects of the influence of genetic selection of animals with high follicle count in Nellore and Aberdeen Angus heifers, in the initial period post-ovulation (data presented in the second manuscript), in gene expression related to gametes transport and fertilization. The results demonstrated that ovarian superstimulation modulates the expression of some genes related to oviductal contractility in Nelore cows and ovulation is the main factor responsible for transcriptional control in bovine oviduct, with less or no impact of breed and ovarian follicle count / FAPESP: 12/09498-9

Made available in DSpace on 2018-07-27T18:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-10-15. Added 1 bitstream(s) on 2018-07-27T18:30:20Z : No. of bitstreams: 1 000866903.pdf: 3382135 bytes, checksum: 11a5cbaf65eb2a51c8ece933b2603115 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Apesar da citometria ser um método eficiente para sexagem espermática, nos cães pode ser considerada de difícil aplicação, em vista do alto custo da aplicação da técnica e da baixa recuperação espermática após a separação. Por esta razão, o presente trabalho visou avaliar a viabilidade espermática, a taxa de recuperação e a porcentagem de espermatozoides de cães contendo o cromossomo X ou Y após a centrifugação em três gradientes descontínuos de densidade e estudou três técnicas de extração de DNA espermático para determinar a % de células X ou Y pela PCR quantitativa (qPCR). Foram avaliadas 30 amostras de sêmen canino (10 cães) utilizando os protocolos de centrifugação em gradiente descontínuo de densidade (Percoll® - 30 a 90% associado ao Nycodenz® e Ficoll). Os espermatozoides foram avaliados pré e pós-centrifugação quanto à motilidade (CASA - Computer-Aided Semen Analyzer), concentração inicial e concentração recuperada, morfologia espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal, e função mitocondrial. Após a separação, as células foram submetidas a três protocolos de extração de DNA, um não comercial (fenol:clorofórmio, M1) isolado ou associado a um kit preparatório (M2) e dois comerciais com mini-colunas de extração (M3 e M4) e, posteriormente, à qPCR com os primers contra os genes SRY (AF_107021.1) e Fator IX (NM_001003323.2). O protocolo M1 recuperou maior concentração de DNA e com maior qualidade permitindo a execução da qPCR. Dentre os gradientes de densidade, o Ficoll manteve maior qualidade espermática após a centrifugação, embora o enriquecimento de X ou Y não tenha sido observado em nenhum dos métodos estudados. A extração de DNA utilizando o fenol:clorofórmio foi o método que extraiu maior quantidade e de maior qualidade para a aplicação na qPCR / Despite cytometry to be an effective method for sperm sexing, in dogs can be considered of difficult application, given the high cost of the technical implementation and low sperm recovery after separation. Therefore, this study aimed to evaluate the sperm viability, recovery rate and the percentage of sperm dogs containing the X or Y after centrifugation three discontinuous density gradients. Furthermore, aimed to study three DNA extraction techniques for sperm cells to determine the percentage of bearing cells of the X or Y chromosome for quantitative real-time PCR (qPCR). Thirty samples (10 dogs) of canine semen were evaluated using centrifugation discontinuous density gradient protocols (Percoll® - 30 to 90% associated to Nycodenz® and Ficoll). The sperm were evaluated before and after centrifugation for motility (CASA - Computer Aided Semen Analyzer), initial concentration and recovered concentration, sperm morphology, integrity of plasma and acrosomal membranes, and mitochondrial function. After separation, the cells were subjected to three DNA extraction protocols, a non-commercial using phenol:chloroform (M1) alone or combined with a preparatory kit (M2) and two commercial with extraction mini-columns (M3 and M4). Next, the DNA samples were subjected to qPCR using two primers (SRY - AF_107021.1 and Factor IX - NM_001003323.2). M1 protocol recovered greater concentration of DNA with higher quality and allowing the execution of qPCR. Among the density gradients, Ficoll maintained higher sperm quality after centrifugation, although the X or Y enrichment was not observed in any of the studied methods

Orientador: Alexandre Ninhaus Silveira / Banca: Cristiele da Silva Ribeiro / Banca: George Shigueki Yasui / Resumo: A décadas a criobiologia busca a conservação do genoma materno em peixes por meio da conservação de gametas, porém as técnicas disponíveis atualmente esbarram em problemas como a baixa permeabilidade das membranas, o grande volume de vitelo e a sensibilidade dos gametas ao frio. Trabalhos acerca do assunto vem sendo realizados, contudo de forma não sistemática e de forma majoritária com espécies de clima temperado a frio. Devido a carência de informações sobre o tema com peixes neotropicais, objetivou-se neste trabalho desenvolver um protocolo para o congelamento de oócitos de Prochilodus lineatus, para isso, foi avaliado o uso de diferentes soluções salinas (solução de Ringer e Ringer lactato, solução salina balanceada de Hank (HBSS) com e sem cálcio, e solução para ovos de salmonídeos) como meio de manutenção e extensão da viabilidade dos oócitos. Também foi avaliado a toxicidade de três agentes crioprotetores (ACPs) o Dimetilsulfóxido (DMSO), Propilenoglicol (PG), e Metanol (MET), visando (1) a elaboração de protocolos de vitrificação, com exposição de 2,5, 5 e 7,5 min. em molaridades de 6 M, 8 M e 10 M de ACP; e (2) para a construção de protocolos de congelamento lento com incorporação dos ACPs em banhos crescentes avaliado os efeitos tóxicos sobre a fertilização em 0,5 M, 1 M, 2 M e 4 M. Avaliou-se a sensibilidade dos oócitos a baixa temperatura (2,5°C) em quatro tempos de estocagem 30, 60, 90 e 120 minutos. Oócitos foram submetidos ao congelamento lento em vapor de nitrogênio avaliando as injúrias morfológicas geradas pela exposição aos ACPs e ao congelamento. Os resultados obtidos mostraram que somente a HBSS com e sem cálcio foram capazes de manter o estado não ativado dos gametas, porém, as mesmas não proporcionaram a extensão da viabilidade dos oócitos, permitindo a que estes continuassem a sofrer a degradação pelo tempo de estocagem, de forma similar aos oócitos mantidos... / Abstract: The decades cryobiology seeks to conserve the maternal genome in fish through gamete preservation, but the techniques currently available run into problems such as low permeability of the membranes, the large the amount of yolk and the sensitivity of gametes to cold. Work on the subject has been carried out, however unsystematically and majority form with cold temperate species. Due to lack of information on the subject with Neotropical fish, the aim of this work is to develop a protocol for the freezing of Prochilodus lineatus oocytes for this, was evaluated using different salt solutions (Ringer and Ringer's lactate solution, Hank's balanced salt solutions (HBSS) with and without calcium, and the solution for salmonid eggs) as a means of maintaining and extending the viability of oocytes. We also assessed the toxicity of three cryoprotectants agents (ACPs) the Dimethyl sulfoxide (DMSO), Propylene glycol (PG), and Methanol (MET), to (1) the development of vitrification protocols with exposure, 2.5, 5.0 and 7.5 min. in molarities the 6 M 8 M 10 M CPA; and (2) for the construction of slow cooling protocols with CPAs with increasing incorporation of the baths evaluated toxic effects on fertility in 0.5 M, 1 M, 2 M and 4 M. It was evaluated the lower the sensitivity of oocytes temperature (2.5 ° C) storage on four 30, 60, 90 and 120 minutes. Oocytes underwent slow cooling in nitrogen steam evaluating the morphological injuries due to exposure to the CPAs and freezing. The results showed that only with HBSS without calcium and were able to maintain the state of gametes not activated, however, they do not provide the extent of viability of oocytes, allowing that they continue to suffer from degradation by storage time, similarly to the oocytes retained only in ovarian fluid. The high sensitivity of oocytes to the CPAs and the cold was found. The toxicity of the higher molarities of CPAs (6 M, 8 M and 10 M) at all exposure times, precludes ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-06Bitstream added on 2014-06-13T19:49:57Z : No. of bitstreams: 1 brenner_mpc_me_araca.pdf: 350193 bytes, checksum: 3a33f5c5edd18147c32800c3b76b95e8 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia da reprodução aplicada rotineiramente no melhoramento genético da espécie bovina. No entanto, ainda não está determinado até que ponto sua utilização pode implicar na disseminação de patógenos, como por exemplo, do Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5), considerado um α-herpesvirus neuro- virulento, potencialmente patogênico em bovinos. Para avaliar o impacto da exposição de oócitos bovinos ao BoHV-5 este estudo avaliou as taxas de desenvolvimento dos embriões bovinos produzidos in vitro, a atividade mitocondrial, a ação antioxidante e a resposta ao estresse em dois grupos distintos; grupo controle e grupo expostos ao BoHV-5. A qualidade dos embriões bovinos produzidos in vitro, não foi afetada pela exposição ao BoHV- 5, a taxa de produção foi de 54,6 % no controle e 49,7% no exposto. O DNA viral correspondente ao gene US9 foi identificado em embriões bovinos no D7 após a fecundação in vitro e confirmado por reação imunofluorescência indireta. Os resultados revelaram diferenças (p<0,05) entre embrião do grupo de expostos e controle pelo MitoTracker Green FM, e pelo Jc-1. Não existiu diferença significativa nos índices de Hoechst 33342. Os embriões expostos produziram proteína antioxidante tipo 1 (AOP-1). Nenhum dos grupos produziram a proteína do choque térmico heat shock protein (Hsp 70.1). Ambos os grupos produziram a superóxido desmutase (SOD1), revelando atividade mitocondrial intensa, sem interferir na quantidade e qualidade dos embriões produzidos. Esses achados podem ajudar a entender a habilidade do α- herpesvirus em prevenir a apoptose / The in vitro production of embryos is a biotechnology of reproduction routinely applied in the improvement of the bovine specie. However, it is not yet determined the extent to which its use may result in the spread of pathogens, such as the bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5), considered an α-herpesvirus neuro-virulent, potentially pathogenic in cattle. To assess the impact of exposure of bovine oocytes to BoHV-5 we studied the developmental rates of bovine in vitro produced, mitochondrial activity, antioxidant effects, stress response into two distinct groups, control group and group exposed to BoHV-5. The quality of bovine embryos produced in vitro was not affected by exposure to BoHV-5, the production rate was 54.6% in the control and 49.7% in the exposure. The viral DNA corresponding to the US9 gene was identified in the D7 bovine embryos after in vitro fertilization and confirmed by indirect immunofluorescence reaction. The results revealed differences (p <0.05) between embryo exposed group and control by MitoTracker Green FM, and the Jc-1. There was no significant difference in rates of Hoechst 33342. The exposed embryos produced antioxidant protein type 1 (AOP-1). None of them produced heat shock protein (Hsp 70.1). Both groups produced the superoxide dismutase (SOD1), revealing intense mitochondrial activity, without interfering in the quantity and quality of embryos produced. These findings may help understand the ability of α-herpesvirus in preventing apoptosis