Neue aussichtsreiche Pharmazeutika scheitern regelmäßig in späten Entwicklungsphasen1 und stehen somit nicht als wertvolle Wirkstoffe zur Verfügung. Ein Grund hierfür ist die komplexe Pharmakinetik und der Mangel an geeigneten in-vitro Modellen. Daher befasst sich diese Dissertation mit der Entwicklung neuartiger in-vitro Membranmodelle am Beispiel der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Zu diesem Zweck wird der aktuelle Stand der Technik vorgestellt und anschließend das Konzept eines Mikrofluidikchips, in welchem mittels Dielektrophorese an eine zuvor erstellte Polyamidmembran CaCo-2-Zellen assembliert wurden. Die Auslegung und Optimierung des Chip-Designs, die Entwicklung der in-situ Membran sowie die Ermittlung der Randbedingungen sind wesentliche Bestandteil dieser Arbeit. Es konnte mittels FEM-Simulationen und Assemblierungsversuchen ein Modell erzeugt werden, mit dem ein Chipdesign entwickelt werden konnte, dass zum einen ein günstigeres Verhältnis von Zellflächen- und Abluminalen Volumen aufweist und zum anderen möglichst wenig Zellen für den Aufbau benötigt. Dieses System bietet somit ein hohes Potenzial für die Herstellung verbesserter in-vitro Modelle. Jedoch konnte auch durch die Charakterisierung mit Rhodamin, Fluorescein und FITC-Dextran aufgezeigt werden, dass dieser Vorteil durch spezifische und unspezifische Bindungen an der größeren Oberfläche z.T. reduziert wird, abhängig vom verwendeten Chipmaterial und untersuchten Wirkstoff. Als neuartig kann die in-situ Herstellung einer vertikalen Polyamidmembran in einem Polymerchip bezeichnet werden, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde. Für diese wurden die Parameter zur optimale Collagenbeschichtung für die Zelladhäsion ermittelt, sowie der Einfluss auf die Zellvitalität untersucht. Des Weiteren wurde das Medium zur Dielektrophorese und zur Kultivierung der Zellen ohne CO2-Begasung optimiert.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Formelzeichen 3 Einleitung 4 Grundlagen 5 Chipdesign 6 Herstellung und Charakterisierung der Stützmembran 7 Entwicklung des Zellkulturmodells 8 Zusammenfassung 9 Ausblick 10 Anhang 11 Literaturverzeichnis 12 Abbildungsverzeichnis / New promising pharmaceuticals regularly fail at late stages of development1 and thus do not become available as valuable active substances. Two of the main reasons for such failures are the complex pharmacokinetics and the lack of adequate in-vitro models. Therefore, this dissertation focuses on the development of novel in-vitro membrane models at the example of the blood-brain-barrier (BBB). It starts by presenting current investigations and the state-of-the-art technology and continues with the concept for a microfluidic chip in which CaCo-2 cells were assembled with dielectrophoresis on an in-situ membrane. The essential part of this work was to design and optimize this microfluidic chip, to develop an in-situ membrane to catch the assembled cells and to investigate the required boundary conditions. FEM simulations and assembling experiments conducted to the creation of a model to develop a chip design with a better ratio between cell area and abluminal volume, as well a low number of cells needed for the creation of this model. Such system might have a high potential to establish more sensitive in-vitro models than the current Transwell model. However, it was also demonstrated that this advantage is reduced by specific and nonspecific binding on the larger surface, depending on the chip material and the investigated test substance, shown during the chip characterization by using Rhodamine, Fluorescein and FITC-Dextran. Furthermore, the creation of a vertical polyamide in-situ membrane in a polymer chip like in this work, can be described as novel. To assemble cells on this supporting membrane, a protocol for a collagen coating as well for the dielectrophoresis medium were developed. Also, a modified culture medium was investigated, to allow the cultivation on standard atmospheric conditions.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Formelzeichen 3 Einleitung 4 Grundlagen 5 Chipdesign 6 Herstellung und Charakterisierung der Stützmembran 7 Entwicklung des Zellkulturmodells 8 Zusammenfassung 9 Ausblick 10 Anhang 11 Literaturverzeichnis 12 Abbildungsverzeichnis

Polymere Nanopartikel sind ein vielversprechender Ansatz für die Diagnose und Therapie von Krankheiten. Sie ermöglichen den Einsatz von schwerlöslichen oder instabilen Wirkstoffen. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit das Targetings, durch gezielte Modifikationen des Nanopartikels wird der Wirkstoff zum Zielort transportiert und kann dort in der gewünschten Form freigesetzt werden; dadurch könnten bei erhöhter Wirksamkeit die Nebenwirkungen von Medikamenten reduziert werden. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von physikalischen und biochemischen Eigenschaften von Nanopartikeln bestehend aus einem abbaustabilen Polystyren- Kern und einer biologisch abbaubaren Schale aus Polybutylcyanoacrylat. Es werden Methoden beschrieben, um die Größe, Struktur und den Abbau dieser Wirkstoffträger zu untersuchen. Die untersuchten Nanopartikel zeigen RAYLEIGH-Streuung, sowohl Größe als auch Abbau können durch Messung des Absorptionsspektrums bestimmt werden. Weiterhin konnten diese Eigenschaften mit Hilfe von dynamischer und statischer Lichtstreuung sowie Neutronenkleinwinkelstreuung untersucht werden. Bei letzterer Methode konnte gezeigt werden, dass die Schale größtenteils abgebaut werden kann, während der Kern intakt bleibt. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke durch polymere Nanopartikel untersucht. Dabei wurde der fluoreszierende Thioflavine als Modellwirkstoffe eingesetzt. Das Durchdringen der Blut-Hirn-Schranke konnte nur mit Nanopartikeln erreicht werden, an deren Oberfläche ein Apolipoprotein E-Peptid gekoppelt war. Es konnte gezeigt werden, das die Nanopartikelschale im Gehirn abgebaut wird, der Wirkstoff freigesetzt wird und an Amyloid β, einem Marker der Alzheimer-Krankheit, bindet.

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A serious opioid crisis is affecting public health and economics, eroding people’s quality of life. 80% of patients who receive opioids suffer from adverse effects such as Opioid-induced constipation (OIC). However, there is no efficient medicine for these adverse effects. Notably, mainstream theory supports that analgesia effects are mainly controlled by CNS while OIC is predominately controlled by peripheral. In addition, the sites of action of opioid was based on the assumption that mu-opioid receptor antagonists (PAMORAs), did not cross the blood-brain barrier (BBB). Unfortunately, the BBB crossing of PAMORAs mislead the understanding of the role of the central nervous system (CNS) and gastrointestinal tract playing in the adverse effects such as opioid-induced constipation (OIC). Here, we developed a novel technology platform to prevent drugs from crossing the BBB. By applying this technology, naloxone- and oxycodone conjugates demonstrated superior potency, peripheral selectivity, pharmacokinetics, and effectiveness in rats compared to currently clinically used PAMORAs. By the help of these probes, it is revealed for the first time to that the mu-opioid receptors in the CNS played more important role in OIC than the peripheral receptors, which overturned the old theory. And the new theory points the way to better future PAMORAs drug design.

Contexte et objectifs : L'encéphalopathie hépatique (EH) est un trouble neuropsychiatrique, une complication majeure de la maladie hépatique chronique (MHC). L'EH se manifeste par un large éventail de symptômes, allant d'un léger manque d'attention et de troubles de la mémoire à une léthargie sévère et un coma. L'hyperammoniémie est centrale dans la pathogenèse de l'EH puisque l'ammoniac est neurotoxique et que l'ammoniac dérivé du sang traverse facilement la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cependant, d'autres facteurs pathogènes sont également impliqués dans l'EH, notamment le stress oxydatif. Au cours de la MHC, le muscle joue un rôle compensatoire essentiel dans l'élimination de l'ammoniac par l'action de l'enzyme glutamine synthétase (GS), qui transforme le glutamate en glutamine. Étant donné que les cellules endothéliales de la BHE sont l'interface entre le sang et le cerveau, il est plausible qu'elles métabolisent l'ammoniac pour protéger le cerveau de la neurotoxicité induite par l'ammoniac. Cependant, cela n'a jamais fait l'objet d'études. Les thérapies de réduction de l'ammoniac sont les traitements courants de l'EH. Cependant, les réponses des patients aux traitements sont hétérogènes, et les différences de sexe pourraient en être la cause. Par conséquent, nos objectifs étaient 1) d'explorer le métabolisme de l'ammoniac dans les cellules endothéliales de la BHE par la présence de GS et 2) d'évaluer l'impact du sexe sur la MHC et ses complications, y compris la sarcopénie et l'EH. Méthodes : Pour le premier objectif, nous avons évalué l'expression et l'activité de la protéine GS in vitro et ex vivo chez des rats naïfs. Nous avons également évalué l'impact de l'ornithine, du glutamate et du α-kétoglutarate sur l'activité de la GS dans les cellules endothéliales de la BHE via la génération de glutamine 5-13C marquée. Pour le deuxième objectif, nous avons évalué l'impact du sexe sur le neurophénotype (anxiété, mémoire, coordination motrice et activité) chez des rats ligaturés des voies biliaires (BDL) (et contrôles respectifs) ainsi que sur le développement d'une EH sévère (léthargie/perte du réflexe de redressement). Nous avons également évalué les marqueurs des lésions hépatiques, l'hyperammoniémie, le stress oxydatif systémique, la masse et la fonction musculaire et la clairance de l'ammoniac musculaire. Résultats : Nous avons trouvé l'activité et l'expression de la GS in vivo et ex vivo dans les cellules endothéliales de la BHE. L'analyse au microscope confocal a montré que la GS dans les cellules endothéliales est moins abondante que dans les astrocytes. L'exposition de cellules endothéliales cultivées à des substrats marqués a révélé que l'ornithine est la plus efficace pour générer de la glutamine. Chez les femmes, la chirurgie BDL a provoqué une MHC (augmentation des enzymes hépatiques circulantes et de la bilirubine) et de l'EH (altération de la coordination motrice et de l'activité nocturne) par rapport aux rats contrôles respectifs. De plus, le degré d'hyperammoniémie et la clairance musculaire de l'ammoniac étaient similaires entre les sexes. Contrairement aux mâles, les rats femelles n'ont pas développé de perte musculaire, d'œdème cérébral et de perte de mémoire à court terme. De plus, les femelles présentaient un stress oxydatif plus faible et étaient complètement protégées contre les EH sévères précipitées par l'ammoniac par rapport aux mâles BDL. Conclusions : Nous concluons que la GS est exprimée dans les cellules endothéliales de la BHE, jouant peut-être un rôle dans l'atténuation ou le retard de l'entrée de l'ammoniac dans le cerveau et que la supplémentation en ornithine améliore l'activité de la GS en fournissant du glutamate pour la détoxification de l'ammoniac. De plus, nous concluons que le sexe a un impact sur les complications des maladies du foie, y compris la sarcopénie et l'EH, le stress oxydatif systémique jouant un rôle vital dans la susceptibilité à l'EH sévère induite par l'ammoniac. / Background and aims: Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric disorder and a major complication of chronic liver disease (CLD). HE manifests with a wide range of symptoms, from mild lack of attention and memory impairments to severe lethargy and coma. Hyperammonemia is central in the pathogenesis of HE since ammonia is neurotoxic, and blood-derived ammonia easily crosses the blood-brain barrier (BBB). However, other pathogenic factors are also implicated in HE, including oxidative stress. During CLD, muscle plays an essential compensatory role in removing ammonia by the action of the enzyme glutamine synthetase (GS), which amidates glutamate into glutamine. Since the endothelial cells of the BBB are the interface between the blood and the brain, it is plausible that they metabolize ammonia to protect the brain from ammonia-induced neurotoxicity. However, this has never been investigated. Ammonia lowering therapies are the mainstream treatments for HE. However, patients' response to treatments are heterogeneous, and sex differences might be the cause. Therefore, our aims were 1) To explore ammonia metabolism in BBB’s endothelial cells through the presence of GS and 2) to assess the impact of sex on CLD and its complications, including sarcopenia and HE. Methods: For the first aim, we assessed GS protein expression and activity in vitro and ex vivo in naïve rats. We also evaluated the impact of ornithine, glutamate, and α-ketoglutarate on GS activity in endothelial cells of the BBB via the generation of labeled 5-13C glutamine. For the second aim, we assessed the impact of sex on the neurophenotype (anxiety, memory, motor coordination, and activity) in bile-duct ligated (BDL) rats (and respective SHAMs) as well as on the development of an ammonia-precipitated severe HE (lethargy/loss of righting reflex). We also assessed liver injury markers, hyperammonemia, systemic oxidative stress, muscle mass and function, and muscle ammonia clearance. Results: We found GS activity and expression in vivo and ex vivo in endothelial BBB cells. The confocal microscope analysis showed that GS in endothelial cells is less abundant than astrocytes. Exposing cultured endothelial cells to labeled substrates revealed that ornithine is the most efficient in generating glutamine. In females, BDL surgery caused CLD (increased hepatic enzymes and bilirubin) and HE (impaired motor coordination and night activity) vs. respective SHAMs. Furthermore, the degree of hyperammonemia and muscle ammonia clearance was similar between sexes. Contrary to males, female rats did not develop muscle loss, brain edema, and short-term memory loss. In addition, females had lower oxidative stress and were completely protected against ammonia-precipitated severe HE compared to male BDLs. Conclusions: We conclude that GS is expressed in endothelial cells of the BBB, possibly playing a role in attenuating or delaying ammonia entry into the brain and, ornithine supplementation enhances GS activity by providing glutamate for ammonia detoxification. In addition, we conclude that sex impacts the complications of liver disease, including sarcopenia and HE, with systemic oxidative stress playing a vital role in the susceptibility to ammonia-induced overt HE.

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La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire et démyélinisante caractérisée par la formation de lésions multifocales à travers le système nerveux central. Les lymphocytes pro- inflammatoires CD4 Th1 et Th17 sont considérés pathogéniques en sclérose en plaques et dans son modèle animal, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale. L’obésité et la composition du microbiome intestinal sont associées à une exacerbation de l’inflammation et à la progression de la sclérose en plaques, faisant des approches thérapeutiques métaboliques une méthode de choix afin d’améliorer l’évolution de cette maladie. La méthionine est un acide aminé essentiel métabolisé en S-adénosylméthionine (SAM), considéré comme le donneur universel de groupements méthyl, influençant l’expression génique. La restriction en méthionine est quant à elle associée à une diminution de la prise de poids et de l’inflammation, et in vitro, permet de réduire l’expansion des cellules Th17. Notre hypothèse est donc que diminuer l’activité du cycle de la méthionine permettrait de limiter la progression de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale en modulant le métabolisme des cellules T, la barrière hémo-encéphalique et le microbiome intestinal. Pour ce faire, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale est induite chez des souris mâles et femelles exposées à une diète réduite en méthionine ou contrôle afin d’effectuer une évaluation clinique quotidienne. Des expériences de cytométrie en flux, d’immunofluorescence et de séquençage d’ADN ribosomal 16S sont effectuées afin de déterminer l’activité des cellules immunitaires, la perméabilité de la barrière hémo-encéphalique et la composition du microbiome intestinal. Nos résultats montrent que la diète réduite en méthionine est associée à un délai significatif de l’apparition des symptômes neurologiques, avec une évolution clinique différente entre les mâles et les femelles. Ceci est associé à une diminution du nombre de cellules immunitaires infiltrant le système nerveux central, en plus d’influencer la composition du microbiome intestinal, suggérant des changements vers un profil plutôt anti-inflammatoire. La diète réduite en méthionine semble donc améliorer la progression de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale de manière différente selon les sexes et pourrait représenter une nouvelle voie thérapeutique contre la sclérose en plaques. / Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system with a sex bias towards women. Proinflammatory Th1 and Th17 cells are considered pathogenic in multiple sclerosis and its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis. Obesity, western diet and gut dysbiosis increase inflammation and influence the course of this disease. Contrarily, dietary methionine restriction is associated with lower weight gain and reduced inflammation. In vitro, T cells upregulate components of methionine metabolism, including S- adenosylmethionine, upon activation and proliferation, while methionine restriction in the milieu reduces the expansion of Th17 cells. Thus, we hypothesized that limiting the activity of the methionine cycle will improve experimental autoimmune encephalomyelitis course by modulating Th17 cells through sex-specific epigenetic mechanisms and modification of the gut microbiome. To test this hypothesis, active experimental autoimmune encephalomyelitis is induced in male and female mice exposed to a methionine restricted or control diet. Clinical scores, flow cytometry, immunofluorescence and 16S rRNA sequencing are used to characterize the properties of immune cells, the blood-brain barrier, and the gut microbiome. Our results show that dietary methionine restriction is associated with a significantly delayed onset of neurological symptoms, with clinical differences in disease evolution between males and females. This is associated with a reduced number of immune cells and pathogenic proinflammatory T cells in periphery, then in the central nervous system. Methionine restricted diet is moreover associated with modification of the gut microbiome, suggesting a shift towards an anti-inflammatory profile. Finally, methionine restriction also influences the expression of adherence molecules such as VCAM-1, present in the blood-brain barrier, suggesting a neuro-protective effect. Our data reveal that methionine restricted diet ameliorates the clinical course and neuroinflammatory processes in experimental autoimmune encephalomyelitis in a sex-dependent manner and could represent a new therapeutic avenue to improve multiple sclerosis course.

Primäre und sekundäre Lymphome des zentralen Nervensystems (ZNS), PCNSL und SCNSL, sind schwer behandelbar und mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. Der ZNS-Tropismus dieser Lymphome hängt mit einer Dysregulation von Genen zusammen, die für Immunabwehr, Chemotaxis, Zellmigration und die Blut-Hirn-Schranke (BBB) relevant sind. Zur Untersuchung der molekularen Mechanismen wurde das Eμ-myc-Mausmodell genutzt, um die Faktoren zu analysieren, die zur ZNS-Tropie beitragen, insbesondere jene, die die BBB destabilisieren und die Immunantwort beeinflussen. Eμ-myc-Lymphome wurden in C57BL/6-Mäuse transplantiert und ZNS-positive von ZNS-negativen Lymphomen histologisch unterschieden. RNA-Sequenzierungen identifizierten Signalwege, die mit dem ZNS-Tropismus korreliert sind. Der NF-κB-Signalweg zeigte hierbei besondere Relevanz: Seine Hemmung in ZNS-positiven Lymphomen verringerte die ZNS-Tropie und stabilisierte die BBB durch den Erhalt der Tight-Junction-Proteine. Zudem ergab sich eine Hochregulation von Gfrα-1 in ZNS-positiven Lymphomen, was eine verstärkte Zellmigration zu hirn-konditioniertem Medium bewirkte. Durch die Aktivierung von Astrozyten und GDNF-Hochregulation wurde die BBB zusätzlich destabilisiert. ZNS-trope Lymphome induzierten Immunmodulationen benachbarter Zellen, wie Mikroglia und Astrozyten, und verstärkten den ZNS-Tropismus durch post-seneszente Signaturen. Das Zusammenspiel zwischen Lymphomzellen und Astrozyten, die Aktivierung der GDNF/Gfrα-1/RET-Signalachse und die BBB-Störung gelten als zentrale Mechanismen der ZNS-Tropie bei DLBCL-ähnlichen Lymphomen. Die gezielte Modulation dieser molekularen Pfade könnte die ZNS-Beteiligung bei aggressiven B-Zell-Lymphomen reduzieren. Weitere Untersuchungen könnten therapeutische Ansätze zur Minderung der ZNS-Tropie und Verbesserung der klinischen Ergebnisse bieten. / Primary and secondary CNS lymphomas (PCNSL and SCNSL) are difficult to treat, with a poor prognosis. CNS tropism in these lymphomas involves immune evasion, chemotaxis, cell migration, and blood-brain barrier (BBB) integrity. This study aimed to identify factors behind CNS tropism using the Eμ-myc mouse lymphoma model to compare CNS-tropic and non-tropic lymphomas. Methods: Eμ-myc lymphomas were transplanted into immunocompetent mice, classified as CNS (+) or CNS (-) by histology. RNA sequencing identified pathways linked to CNS tropism, focusing on NF-κB, which was suppressed using IκBα∆N in CNS (+) lymphomas in vitro and in vivo. BBB disruption was assessed through astrocyte activation and ZO-1 degradation, while BBB permeability was evaluated with the Evans Blue assay. Lymphoma migration towards GDNF-conditioned medium was tested via Boyden chambers, with GDNF/Gfrα-1/RET pathway involvement assessed by knockdown and RET inhibition. Immune modulation was analyzed by PD-L1 expression in astrocytes and microglia co-cultured with CNS lymphomas. Results: RNA sequencing showed upregulation of NF-κB targets, pro-inflammatory cytokines, and SASP in CNS (+) lymphomas. NF-κB inhibition prevented CNS tropism and preserved BBB integrity by blocking ZO-1 degradation. CNS (+) lymphomas displayed Gfrα-1 upregulation and migration toward brain-conditioned medium. Astrocyte activation and GDNF upregulation by CNS (+) lymphomas further impaired BBB stability. CNS (+) lymphomas induced immune modulation in neighboring astrocytes and microglia, with a post-senescence signature linked to CNS tropism. Interactions between lymphoma cells, astrocytes, the GDNF/Gfrα-1/RET axis, and BBB disruption are key to CNS tropism in DLBCL-like lymphomas. Targeting these pathways may help prevent CNS involvement in aggressive B-cell lymphomas, offering potential therapeutic avenues to improve patient outcomes.

Die bakterielle Meningitis ist trotz der Anwendung modernster Antibiotika mit einer hohen Letalität und neurologischen Spätkomplikationen verbunden. Ein entscheidendes Ereignis ist dabei der Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die genauen Mechanismen, die zu ihrer Schädigung führen, sind bis heute unklar. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob lebende Pneumokokken in einem Zellkulturmodell der BHS zu einer apoptotischen Zellschädigung von zerebralen Endothelzellen, als wichtigstem zellulären Bestandteil der BHS, führen und damit zu ihrer strukturellen Schädigung beitragen. Mittels verschiedener Detektionsmethoden (TUNEL, Fluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie) konnte nachgewiesen werden, daß Streptococcus pneumoniae zu einem apoptotischen endothelialen Zelltod führt. Eine Beteiligung von Caspasen konnte weder mit direkter Aktivitätsmessung noch mittels Inhibitionsexperimenten oder dem Nachweis von Caspase-spezifischen Substraten gezeigt werden. Insgesamt sind die Morphologie der Zellkerne und die spezifische Degradation der endothelialen DNS hinweisend für einen Apoptosis-Inducing-Factor-vermittelten Zelltod ohne Caspasenbeteiligung. Diese Form des Zelltodes ist bereits in anderen Zellmodellen, bisher jedoch nicht bei zerebralen Endothelzellen beschrieben worden. Auf Seiten des Bakteriums konnten Wasserstoffperoxid und Pneumolysin als Auslöser der Apoptose identifiziert werden. Die zytotoxische Potenz des Pneumolysins ist dabei an dessen Poren-formende Aktivität gebunden. Die Ergebnisse sind von potentieller klinischer Relevanz, da es bei einer Bakteriämie und während der Invasion der Pneumokokken in das ZNS zu einem direkten Kontakt zwischen Bakterien und zerebralen Endothelzellen kommt und sich daraus eine Möglichkeit zur Entwicklung adjuvanter Therapien ergeben könnte. / Despite sufficient antibiotic treatment, pneumococcal meningitis has remained a disease associated with high mortality and neurological sequelae. The disruption of the blood brain barrier (BBB) is regarded a key event in the initial phase of pneumococcal meningitis. However, the exact molecular mechanisms involved in this process are still unknown. The aim of this study was to determine if living pneumococci are able to induce apoptosis in cerebral endothelial cells - the main cellular component of BBB - and therefore might contribute to its damage. Using several different detection methods (TUNEL, fluorescence and electron microscopy), induction of apoptotic cell death of endothelial cells by pneumococci could be verified. An accompanying activation of caspases was not detectable, despite the use of specific detection techniques such as inhibition experiments, direct enzyme measurements and detection of caspase-specific protein cleavage. These results as well as the specific nuclear morphology and degradation of endothelial DNA suggest an involvement of the mitochondrial protein Apoptosis inducing factor (AIF). This is the first time this specific form of apoptotic, AIF-driven cell death has been described to be engaged in endothelial cells. On the part of the bacterium, pneumolysin and hydrogen peroxide were identified as the two main inducers of apoptosis. The cytotoxic potency of pneumolysin is related to its pore-forming activity. These results are of clinical relevance since pneumococci are known to reside in close proximity to cerebral endothelial cells during bacteriemia and their entry into the CNS. These findings could contribute to the development of adjuvant treatment of bacterial meningitis.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.