O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas substanciais na bovinocultura, acarretando o uso intensivo de acaricidas. Problemas com os resíduos químicos presentes na carne e no leite, o custo dos acaricidas e a seleção de populações de carrapato resistentes, têm estimulado o desenvolvimento de métodos de controle alternativos não-químicos. Muito esforço tem sido despendido para o desenvolvimento de uma vacina contra o carrapato, no entanto, seu desenvolvimento depende da identificação de moléculas e caracterização de seus papéis na fisiologia do carrapato. Nesse sentido, entender melhor os processos envolvidos no desenvolvimento embrionário pode ajudar na identificação de alvos para o controle desse ectoparasita. Foi sugerida previamente a participação da Tick Heme-binding Aspartic Proteinase (THAP), uma aspártico-endopeptidase dos ovos do carrapato, na degradação da vitelina. Neste trabalho, nós avaliamos a função fisiológica e as características bioquímicas adicionais dessa proteína. Para identificar os sítios e o perfil de transcrição do gene da THAP, o RNA total foi extraído de intestino, ovário e corpo gorduroso de fêmeas parcialmente e completamente ingurgitadas e de ovos, e analisado por PCR quantitativo. Esta análise revelou que o gene da THAP é transcrito nos três tecidos, porém maior quantidade de mRNA foi detectada no corpo gorduroso e intestino de fêmeas completamente ingurgitadas, onde o processo de vitelogênese já foi iniciado. Nos ovos, a transcrição do gene da THAP não foi detectada. Para investigar a presença da proteína nos tecidos e ovos foi realizado um westen-blot com soro anti-THAP, que revelou a presença, em pequena quantidade, da proteína na hemolinfa, no intestino e no corpo gorduroso. Maior concentração de proteína foi detectada no ovário de fêmeas completamente ingurgitadas e nos ovos durante todo o desenvolvimento embrionário. Também foi observado que a THAP é sintetizada na forma de pró-endopeptidase e depois do início da embriogênese é convertida à forma ativa por autoproteólise. Uma proteína recombinante (rTHAP) foi produzida pela clonagem da região codificadora no vetor de expressão pET43a e expressão em Escherichia coli. Depois da purificação, a rTHAP apresentou atividade enzimática sobre substrato sintético fluorogênico, sendo especificamente inibida por pepstatina A. Para investigar sua participação na degradação de vitelina (VT), VT purificadas de ovos coletados 1, 7 e 12 dias após a postura foram incubadas com a rTHAP em diferentes pH (3,5; 4,0; 4,5; e 5,0). A análise por SDS-PAGE mostrou que a rTHAP é capaz de hidrolisar VT purificada de ovos coletados 7 dias após a postura em pH 3,5 a 37 ºC. Esta atividade é sensível a heme e inibida por pepstatina A. VT purificadas de ovos coletados 1 e 12 dias após a postura não foram hidrolisadas e em outros pH a atividade da rTHAP não foi eficiente. Nossos resultados sugerem que a THAP é sintetizada principalmente em tecidos extra-ovarianos, estocada nos ovários e incorporada nos oócitos como pró-endopeptidase. Durante a embriogênese, a THAP é ativada a enzima na forma madura desenvolvendo papel no processamento da vitelina do carrapato. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a one-host tick that causes losses to bovine herds, leading intensive use of chemical acaricides. Problems of chemical residues in meat and milk, costs of acaricides, and development of resistance by ticks, have long been recognized and have helped to stimulate interest in tick control by immunological methods. Major efforts have been made to develop vaccines against tick; however, its development still depends on the identification of tick molecules and characterization of their roles in arthropod physiology. In this sense, to understand the processes involved in embryonic development can help in the identification of additional targets to control this ectoparasite. Previously, an aspartic endopeptidase from tick eggs, named THAP (Tick Heme-binding Aspartic Proteinase), was suggested to be involved in vitellin degradation. In this work, we have investigated the physiological role and additional chemical features of this protein. To identify the site and profiles of the THAP transcription, total RNA extracted from midgut, ovary and fat body from partially and fully engorged females and from eggs was analyzed by qRT-PCR. This analysis showed that THAP mRNA was transcripted in these three tissues. However, highest levels of transcriptions were found in fat body and midgut of fully engorged vitellogenic females. In eggs, THAP mRNA transcription was not detected. In order to investigate the presence of THAP protein in the tissues and eggs, an immunoblot analysis was conducted with an anti-nTHAP serum. The THAP protein was detected in the haemolymph, midgut and fat body and, in higher quantity, in the ovary of fully engorged females, and it was present throughout embryo development. The protein is synthesized as a higher molecular mass form (pro-endopeptidase) and after the onset of embryogenesis THAP is converted into an active form by autocatalysis. A recombinant THAP (rTHAP) was produced through cloning in pET43a vector and expression in Escherichia coli. After the purification the rTHAP was active upon fluorogenic substrate in a reaction specifically inhibit by pepstatin A. To investigate rTHAP vitellin-degradation activity, vitellin (VT) purified from 1-, 7- and 12-day-old eggs were incubated with rTHAP in a range of pHs (3.5, 4.0, 4.5 and 5.0). SDS-PAGE analysis showed that rTHAP is able to hydrolyze VT from 7-day-old eggs in pH 3.5 at 37ºC in a reaction that is heme-sensitive and inhibited by pepstatin A. Vitellins from eggs collected on the 1st and 12th days after oviposition were not hydrolyzed and in other pHs rTHAP activity was not efficient. These results suggest that THAP is synthesized in ovary and extra-ovarian site, stocked in ovary and incorporated by vitellogenic oocytes with a pro-endopeptidase. During embryogenesis, THAP was actived to the mature enzyme and play a role in tick vitellin processing.

A resistência aos acaricidas é um dos maiores desafios para o controle adequado do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Entender os mecanismos de resistência aos acaricidas pode ser fundamental para prolongar sua eficiência no controle desse parasita. Transportadores ABC são reconhecidos em um grande número de organismos, pela sua participação na destoxificação de drogas. Eles são proteínas transmembrana, responsáveis por remover da célula compostos tóxicos, endógenos ou exógenos. Desta forma, protegem os organismos e são associados à resistência a drogas em vários nematódeos, artrópodes parasitas e células cancerígenas. No presente trabalho, determinamos a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos tóxicos, com ênfase ao acaricida ivermectina, no carrapato R. microplus. O tratamento com inibidores de transportadores ABC aumentou a toxicidade da ivermectina em larvas e fêmeas adultas de populações de campo resistentes a este acaricida. Inibidores de transportadores ABC também aumentaram a toxicidade de abamectina, moxidectina e clorpirifós, em uma população multirresistente a acaricidas, indicando que estes transportadores são responsáveis pela destoxificação de um grande número de acaricidas estruturalmente não relacionados. Níveis de transcrição significativamente maiores do gene RmABCB10 foram identificados no intestino de fêmeas de populações resistentes à ivermectina e amitraz, comparado à população suscetível, importante indicativo da participação deste transportador ABC na resistência a acaricidas. A toxicidade da ivermectina foi também significativamente aumentada, em uma população de células embrionárias de carrapato resistentes a este acaricida, quando estas foram co-incubadas com um inibidor de transportadores ABC. Além disso, os níveis de transcrição do gene RmABCB10, foram também induzidos nesta mesma população, comparado às células parentais suscetíveis à ivermectina, indicando que mecanismos semelhantes são selecionados in vivo e in vitro, e confirmando a participação de transportadores ABC na resistência à ivermectina. Mostramos ainda, que transportadores ABC responsáveis pelo sequestro e, consequente, destoxificação da molécula heme para o interior dos hemossomos, presentes no intestino do carrapato, são importantes na destoxificação de acaricidas para o interior desta mesma organela. Sugerindo ser este um importante mecanismo de defesa contra os acaricidas no carrapato. O silenciamento gênico do RmABCB10 por RNAi reduziu a destoxificação do heme nos hemossomos e aumentou a toxicidade da ivermectina em uma população resistente, indicando que o mesmo transportador usado para destoxificar heme é responsável pela destoxificação de acaricidas no intestino. Em conjunto, estes resultados revelam a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos endógenos e exógenos no carrapato e sua implicação como um mecanismo de resistência à ivermectina e outros acaricidas. Os dados aqui apresentados representam uma via de destoxificação de acaricidas até então desconhecida. E podem servir como alvo para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico e monitoramento da resistência e para o desenvolvimento de drogas e vacinas, contribuindo para o controle do carrapato. / Acaricide resistance is one of the biggest challenges in the control of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Understanding the mechanisms of drug resistance in the cattle tick is critical to prolong the efficacy of acaricides to control this parasite. ABC transporters are recognized in a large number of organisms. They are membrane-integrated proteins responsible for pumping toxic compounds, either exogenous or endogenous, out of the cells, protecting these. In this sense, ABC transporters have been associated with drug resistance in several nematodes, parasitic arthropods and cancer cells. The present study reports on the participation of ABC transporters in the detoxification of toxic compounds, particularly ivermectin, in the tick R. microplus. ABC transporter inhibitors increased ivermectin toxicity in larvae and females of ivermectin-resistant populations. ABC transporter inhibitors also increased the toxicity of abamectin, moxidectin and chlorpyriphos in a multidrug resistant population, suggesting that ABC transporters are responsible for the detoxification of a large number of structurally unrelated acaricides. Increased transcription levels of RmABCB10 found in midgut of females from ivermectinand amitraz-resistant populations, compared to a susceptible tick population, indicated the participation of this ABC transporter in acaricide resistance. Increased ivermectin toxicity in a tick cell line resistant to this acaricide was observed when the cells were co-incubated with an ABC transporter inhibitor. Moreover, transcription levels of RmABCB10 were also increased in this cell line, compared to the parental susceptible cell line, suggesting that similar mechanisms are selected in vivo and in vitro and confirming the participation of ABC transporters in ivermectin resistance. We even showed that ABC transporters responsible for the sequestration and hence detoxification of the heme into the hemosomes present in the midgut of the tick, were also important for the detoxification of acaricides in the same organelle, suggesting this is an important defense mechanisms of the tick against acaricide. The down-regulation of RmABCB10 by RNAi reduced heme detoxification in the hemosomes and increased ivermectin toxicity in resistant females, showing that the same ABC transporter is used to detoxify heme and acaricides in the midgut. Together, these results provide evidence of the participation of ABC transporters in the detoxification of endogenous and exogenous compounds in the tick, and indicate the role of these transporters as a mechanism of resistance to ivermectin and other acaricides. The data reported herein shed light on a new acaricide detoxification mechanism that may be useful in the development of assays to monitor drug resistance and design new anti-tick drugs and vaccines, contributing to the development of novel cattle tick control strategies.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4415_1.pdf: 476089 bytes, checksum: bfff2f22f85990f6fb497864f0376cec (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / Atualmente o método de maior interesse adotado para o controle de Boophilus microplus, carrapato de um só hospedeiro que acarreta prejuízos globais de milhões de dólares anuais, baseia-se na utilização de fungos entomopatogênicos, sendo Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana os mais utilizados. Este trabalho avaliou a compatibilidade química dos carrapaticidas Cipermetrina High Cis técnica 100 (CHC) e Amitraz sobre M. anisopliae var. acridum. No ensaio químico as concentrações utilizadas foram: 0,20μg; 0,50μg; 1,00μg; 2,00μg; 5,00μg e 10,00μg. Para cada tratamento foram utilizadas cinco repetições e um controle. Os parâmetros analisados foram, a germinação de conídios, o crescimento linear, a esporulação e a condição nuclear. Foi determinada, também a toxicidade. Os menores percentuais de germinação, 49,50%, 58,07% e 51,06% foram observados nos tratamentos com Amitraz nas concentrações 0,20μg; 5,00μg e 10,00μg, respectivamente. O diâmetro da colônia foi afetado no terceiro dia de cultivo (66,67%) na concentração de 0,50μg de CHC. O carrapaticida Amitraz no sexto dia de cultivo na concentração de 10,00μg promoveu um menor percentual de esporulação (33,35%). M. anisopliae var. acridum não apresentou alterações citológicas quando crescido em meio com carrapaticidas. A toxicidade obtida de 46,98% no sexto dia de cultivo, segundo a metodologia utilizada determinou que o produto Amitraz na concentração de 10,00μg é moderadamente tóxico para este fungo. Os resultados obtidos contribuirão para um emprego futuro do controle integrado do B. microplus utilizando-se carrapaticidas químicos e fungos entomopatogênicos

Resumo: Os prejuízos causados à pecuária brasileira pelo carrapato (Rhipicephalus (B.) microplus) são significativos e, uma das estratégias utilizadas para aumentar a produtividade dos rebanhos nas regiões tropicais tem sido a utilização de raças mais resistentes a esse ectoparasita. O objetivo desse projeto foi aplicar a tecnologia de microarray de DNA para a prospecção de genes relacionados com os mecanismos de resistência/tolerância ao carrapato, mediante a análise da expressão gênica diferencial em linfonodos de bovinos suscetíveis (Aberdeen Angus) e resistentes (Nelore) infestados artificialmente com este parasita. Os bezerros foram mantidos livres de carrapato desde o nascimento e foram infestados artificialmente com larvas de carrapato aos quatro meses de idade. As biópsias de linfonodo foram realizadas antes e após a infestação e mantidas a -80°C até o seu processamento. Essas amo stras foram submetidas a extração de RNA, síntese de cDNA e marcação . Depois elas foram submetidas a hibridização pela técnica de microarray. Foram identificados 341 genes diferencialmente expressos nos bovinos da Raça Angus e 254 para bovinos da Raça Nelore, os quais foram agrupados em categorias funcionais. Foram identificadas diferenças no padrão de expressão de genes de resposta imune entre as raças, tais como: Moléculas CD, Imunoglobulinas, Fator de Necrose tumoral, Integrinas e Interferon-γ. Para validação dos resultados de expressão diferencial foi empregada a técnica de PCR em tempo real, onde se verificou a expressão dos genes das citocinas IL-5 e IL12p40 nas duas Raças estudadas. / Abstract: Significant losses are brought by ticks (Rhipicephalus (B.) microplus) to Brazilian beef farming. One of the strategies to increase yield in tropical regions is the use of resistant breeds. This study was undertaken to apply the DNA microarray technology for the prospection of genes related to tick resistance/tolerance mechanisms, through differential gene expression analysis in lymphonodes of susceptible (Aberdeen Angus) and resistant (Nelore) breeds artificially infested with the parasite. Calves were kept tick-free since birth and infested with tick larvae when they reached four months of age. Lymphonode biopsies were performed before and after infestation and kept at -80°C until analyses. Samples were subjected to RNA extraction, cDNA synthesis and labelling. Hybridization was then performed through the microarray technique. In Angus, 341 differentially expressed genes were found against 254 in Nelore, which were grouped in functional categories. Different expression patterns were identified immune response genes between breeds, such as: CD molecules, Immunoglobulines, Tumor Necrosis Factor, Integrins and Interferon-γ. Real-time PCR was used to validate results, which showed the expression of cytokines IL-5 and IL12p40 in both breeds. / Orientador: Luiz Roberto Furlan / Coorientador: Márcia Cristina de Sena Oliveira / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Maribel Elizabeth Funes Huacca / Mestre

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008 - Andreia Loureiro Musso Terra.pdf: 563785 bytes, checksum: 76a3e7d6481a0e5c675edb61b485bfab (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Rhipicephalus (Boophilus) microplus causes severe economic losses to the Brazilian cattle raising industry. In nowadays, the control of the cattle tick is especially based on the use of chemical acaricides. The inadequate use of these acaricides allows the development of tick s resistant strains and environmental contamination. Several entomopathogenic fungal species have been investigated to control arthropod populations and, therefore, minimize the damages caused by them. The current study investigates Nomuraea rileyi isolates (Nr 151 and Nr 177) to control the three developmental stages of R. (B.) microplus tick. The fungal isolates were cultivated on modified Sabouraud Maltose Agar with yeast extract (SMAY) at 25 ? 1 ?C and relative humidity (RH) higher or equal to 80% for 30 days. Conidia were harvested from the SMAY medium surface and suspended in sterile Tween 80 0.1% aqueous solution. The suspensions were adjusted to 108 conidia ml-1 using the hemacytometer, other conidial suspensions (107, 106 and 105 conidia ml-1) were obtained by serial dilution (1:10). The specimens were immersed in 1 ml of conidial suspension for three minutes, while control groups were immersed in Tween 80 0.1% aqueous solution (no conidia). Each treatment or control groups were composed of 10 repetitions. The effects of fungal isolates on engorged female ticks were investigated through the evaluation of the following parameters: pre-oviposition period, oviposition period, egg production, egg incubation and hatching period, and dead tick weight. These data were used to calculate the Nutrient Index and Egg Production Index. The effect of fungal isolates on egg and larva was evaluated by recording the hatchability daily, and mortality (at every 5-day intervals), respectively. In general, N. rileyi isolates did not cause significant alteration of engorged females parameters; however, the isolate Nr 177 at 108 conidia ml-1 significantly reduced larvae hatchability. The percentage of control of engorged females exposed to N. rileyi was 17.15 or 27.62% at 105 or 108 conidia ml-1, respectively. The percent hatchability of eggs exposed to N. rileyi isolates did not differ from control group. The best result with the isolate Nr 177 was observed on non-fed larvae, all conidial suspensions caused significant mortality rates. The isolate Nr 177 at 108 conidia ml-1 caused 14.5% and 69.5% larva mortality only at day 15 and day 20 after treatment, respectively. Other fungal suspensions caused significant larva mortality, but the results were not reasonable as the results observed with the fungal suspension with the highest conidia concentration. The isolate Nr 151 caused low non-fed larva mortality rates, 10% or 15%, at 107 or 108 conidial ml-1, respectively. These results demonstrate that the N. rileyi isolates investigated did not cause significant harmful effect to control R. (B.) microplus tick. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari:Ixodidae) ? respons?vel por grandes perdas econ?micas na pecu?ria brasileira e atualmente seu controle consiste basicamente no uso de acaricidas qu?micos. A sua utiliza??o inadequada tem favorecido o desenvolvimento de cepas resistentes e a contamina??o do meio ambiente. Diversos fungos entomopatog?nicos t?m sido estudados no intuito de minimizar os problemas ocasionados por esse artr?pode. O objetivo desse estudo foi testar in vitro os isolados Nr 151 e Nr 177 de Nomuraea rileyi sobre as diferentes fases de desenvolvimento do carrapato R. (B.) microplus. O fungo foi repicado em Sabouraud Maltose ?gar com extrato de levedura (SMAY) - modificado e mantido a 25 ? 1?C e umidade relativa ≥ 80% por 30 dias. Para o preparo das suspens?es, os con?dios da superf?cie da placa foram raspados, suspensos em solu??o de ?gua destilada est?ril e Tween 0,1% e quantificados em c?mara de Neubauer. Ap?s preparo da suspens?o 108 con?dios ml-1, as concentra??es 107, 106 e 105 con?dios ml-1 foram obtidas por dilui??o seriada. Cada tratamento foi constitu?do pela imers?o dos esp?cimes em 1 ml de suspens?o durante tr?s minutos enquanto o grupo controle foi exposto apenas ao diluente sem adi??o de con?dios. Cada grupo foi formado por 10 repeti??es. Para avalia??o do efeito dos isolados f?ngicos sobre as f?meas ingurgitadas, os seguintes par?metros biol?gicos foram observados: peso de postura, per?odos de pr?-postura, postura, incuba??o e eclos?o, al?m do peso da quen?gina, necess?rios para a realiza??o dos c?lculos do ?ndice nutricional e de produ??o de ovos. Os par?metros utilizados para avalia??o dos isolados sobre ovos e larvas foram: percentual di?rio de eclos?o das larvas e percentual de mortalidade (observado a cada cinco dias at? o 20? dia), respectivamente. Os isolados de N. rileyi n?o foram capazes de ocasionar altera??es significativas nos par?metros biol?gicos de f?meas ingurgitadas, exceto no percentual de eclos?o das larvas, quando a maior concentra??o de 108 con?dios ml-1 foi utilizada, e no percentual de controle onde se obteve 17,15% e de 27,62% nas concentra??es 105 e 108 con?dios ml-1, respectivamente. Os ovos tratados com as diferentes concentra??es dos isolados de N. rileyi n?o apresentou diferen?a significativa no percentual das larvas eclodidas. O melhor resultado obtido com o isolado Nr 177 foi sobre larvas n?o alimentadas, onde todas as concentra??es utilizadas demonstraram um percentual de mortalidade significativo. A concentra??o 108 con?dios ml-1 do isolado Nr 177 de Nomuraea rileyi foi capaz de promover um percentual de mortalidade das larvas de 14,5 e 69,5% somente no 15? e 20?dia ap?s o tratamento, respectivamente. As demais concentra??es apresentaram um percentual de mortalidade significativo, no entanto esses resultados n?o foram t?o satisfat?rios quanto aos obtidos com a maior concentra??o utilizada. O isolado Nr 151 de Nomuraea rileyi ocasionou baixo percentual de mortalidade das larvas n?o alimentadas, entre 10 e 15% quando as concenta??es 107 e 108 con?dios ml-1 foram utizadas. Dessa forma, esses resultados demonstram que os isolados de N. rileyi n?o apresentaram efeitos delet?rios significativos ao carrapato R. (B.) microplus.

O carrapato bovino Boophilus microplus está presente em áreas tropicais e subtropicais no mundo e é um ectoparasito hematófago que causa inúmeras perdas à bovinocultura, através da espoliação ao bovino ou das doenças que transmite como vetor. Atualmente, o principal método de controle empregado baseia-se em produtos químicos, que são onerosos e contaminam o ambiente. Estudos a respeito da ecologia, comportamento e fisiologia de B. microplus são importantes para o desenvolvimento de novos métodos de controle do carrapato. A resposta ao estresse oxidadivo e a morte celular programada, examinadas neste estudo, permitem compreender melhor os mecanismos fisiológicos usados pelo carrapato adulto e seus ovos e larvas para sobreviver no ambiente. A resposta a estresse oxidativo foi analisada em ovos e larvas. A atividade de GST e outras moléculas envolvidas em mecanismos de proteção contra estresse oxidativo variaram dependendo do tempo transcorrido após a postura e eclosão. A cinética do consumo de oxigênio apresentou correlação positiva com o aumento na atividade de GST durante a embriogênese. Um alto conteúdo de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico foi observado em extratos de ovos e larvas, indicando que carrapatos apresentam alto estresse oxidativo durante a embriogênese e desenvolvimento larval. Além disso, a atividade de GST apresentou forte correlação com peroxidação de lipídeos, uma indicação de seu papel na defesa antioxidante em ovos. Com o objetivo de melhor caracterizar o processo de morte celular, que elimina tecidos não mais necessários e leva à degeneração de glândulas salivares, ovários e singânglios, foi feita uma investigação usando ensaios de visualização de fragmentação de DNA em gel de agarose, teste cometa e TUNEL e a ativação da via apoptótica foi analisada usando ensaio de caspase. A fragmentação de DNA e a atividade enzimática de caspase-3 foram observadas em glândulas salivares e ovários 48 e 72 h após a remoção do carrapato do hospedeiro; em singânglios estes parâmetros foram mantidos em baixos níveis após 48 h. Estes resultados obtidos sugerem que há um controle refinado de manutenção de tecido através de apoptose. / The cattle tick Boophilus microplus is present in tropical and subtropical areas in the world and it is a haematophagous ectoparasite that causes several losses to cattle breeding, through the bovine exploiting and diseases transmitted. Currently, the main control method is based on chemicals, which are expensive and contaminate the environment. Studies about ecology, behavior and physiology of B. microplus are important to develop new methods for the tick control. The data examined in this study allow understanding the physiologic mechanisms used by the tick, eggs and larvae to survive in the environment. For this, the oxidative stress response in eggs and larvae and the cell death in different tissues of adult tick females during the pre-oviposition period were analyzed. The oxidative stress response was analyzed in eggs and larvae and the results showed that the GST activity and other molecules involved in mechanism of protection against oxidative stress varied depending on the time elapsed after oviposition and eclosion. A positive correlation was observed between the oxygen consumption kinetics and the increase in GST activity during embryogenesis. A high content of thiobarbituric acid reactive substances were observed in egg and larva extracts, indicating that ticks face high oxidative stress during embryogenesis and aging. In addition, GST activity presented strong positive correlation with lipid peroxidation, an indication that it plays a role in oxidant defences in eggs. In order to better characterize the cell death process that eliminates unnecessary tissues, the degeneration of salivary glands, ovaries and synganglia was investigated using DNA fragmentation in agarose gel, comet and TUNEL assays, and apoptosis activation pathway by the caspase assay. DNA fragmentation and enzymatic activity of caspase-3 were observed in salivary glands and ovaries at 48 and 72 h after tick removal from the host; in synganglia these parameters were maintained at low levels upon 48 h. These results obtained suggest that there is a refined control of tissue maintenance through apoptosis.

O carrapato bovino Boophilus microplus está presente em áreas tropicais e subtropicais no mundo e é um ectoparasito hematófago que causa inúmeras perdas à bovinocultura, através da espoliação ao bovino ou das doenças que transmite como vetor. Atualmente, o principal método de controle empregado baseia-se em produtos químicos, que são onerosos e contaminam o ambiente. Estudos a respeito da ecologia, comportamento e fisiologia de B. microplus são importantes para o desenvolvimento de novos métodos de controle do carrapato. A resposta ao estresse oxidadivo e a morte celular programada, examinadas neste estudo, permitem compreender melhor os mecanismos fisiológicos usados pelo carrapato adulto e seus ovos e larvas para sobreviver no ambiente. A resposta a estresse oxidativo foi analisada em ovos e larvas. A atividade de GST e outras moléculas envolvidas em mecanismos de proteção contra estresse oxidativo variaram dependendo do tempo transcorrido após a postura e eclosão. A cinética do consumo de oxigênio apresentou correlação positiva com o aumento na atividade de GST durante a embriogênese. Um alto conteúdo de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico foi observado em extratos de ovos e larvas, indicando que carrapatos apresentam alto estresse oxidativo durante a embriogênese e desenvolvimento larval. Além disso, a atividade de GST apresentou forte correlação com peroxidação de lipídeos, uma indicação de seu papel na defesa antioxidante em ovos. Com o objetivo de melhor caracterizar o processo de morte celular, que elimina tecidos não mais necessários e leva à degeneração de glândulas salivares, ovários e singânglios, foi feita uma investigação usando ensaios de visualização de fragmentação de DNA em gel de agarose, teste cometa e TUNEL e a ativação da via apoptótica foi analisada usando ensaio de caspase. A fragmentação de DNA e a atividade enzimática de caspase-3 foram observadas em glândulas salivares e ovários 48 e 72 h após a remoção do carrapato do hospedeiro; em singânglios estes parâmetros foram mantidos em baixos níveis após 48 h. Estes resultados obtidos sugerem que há um controle refinado de manutenção de tecido através de apoptose. / The cattle tick Boophilus microplus is present in tropical and subtropical areas in the world and it is a haematophagous ectoparasite that causes several losses to cattle breeding, through the bovine exploiting and diseases transmitted. Currently, the main control method is based on chemicals, which are expensive and contaminate the environment. Studies about ecology, behavior and physiology of B. microplus are important to develop new methods for the tick control. The data examined in this study allow understanding the physiologic mechanisms used by the tick, eggs and larvae to survive in the environment. For this, the oxidative stress response in eggs and larvae and the cell death in different tissues of adult tick females during the pre-oviposition period were analyzed. The oxidative stress response was analyzed in eggs and larvae and the results showed that the GST activity and other molecules involved in mechanism of protection against oxidative stress varied depending on the time elapsed after oviposition and eclosion. A positive correlation was observed between the oxygen consumption kinetics and the increase in GST activity during embryogenesis. A high content of thiobarbituric acid reactive substances were observed in egg and larva extracts, indicating that ticks face high oxidative stress during embryogenesis and aging. In addition, GST activity presented strong positive correlation with lipid peroxidation, an indication that it plays a role in oxidant defences in eggs. In order to better characterize the cell death process that eliminates unnecessary tissues, the degeneration of salivary glands, ovaries and synganglia was investigated using DNA fragmentation in agarose gel, comet and TUNEL assays, and apoptosis activation pathway by the caspase assay. DNA fragmentation and enzymatic activity of caspase-3 were observed in salivary glands and ovaries at 48 and 72 h after tick removal from the host; in synganglia these parameters were maintained at low levels upon 48 h. These results obtained suggest that there is a refined control of tissue maintenance through apoptosis.

O carrapato Riphicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grandes prejuízos à pecuária. O principal método de controle baseia-se nos acaricidas. No entanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle alternativo. A calreticulina (CRT) é uma proteína multifuncional presente em quase todas as células de animais. A secreção da CRT durante a alimentação pode estar relacionada a modulação da interação parasita hospedeiro. No presente estudo, as CRTs de R. microplus (rBmCRT) e do Haemophisalis longicornis (rHlCRT) foram expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia. As propriedades imunogênicas e antigênicas da BmCRT e HlCRT foram analisadas por diferentes métodos. In silico, foram comparandos os epítopos das CRTs pelo índice de Jamerson-Wolf, que mostrou 6 regiões com potenciais epítopos antigênicos diferentes entre as CRTs. Enquanto, a análise in silico, da rBmCRT e rHlCRT mostraram 6 regiões que podem interagir com a proteína C1q. In vitro, por Western blot, a rBmCRT, mas não a rHlCRT, foi reconhecida pelo soro de bovino infestado experimentalmente com R. microplus. Em Western blot de extrato de larvas, os soros do coelho imunizado com rBmCRT e bovinos imunizados com rBmCRT ou rHlCRT reconheceram a BmCRT, sugerindo que os anticorpos direcionados às proteínas recombinantes também reconhecem a proteína nativa BmCRT. Também a rBmCRT mostrou um efeito anticoagulante no teste de recalcificação plasmática. In vivo, a rBmCRT e rHlCRT induziram reações de hipersensibilidade cutânea imediata em bovinos imunizados com rBmCRT ou rHlCRT, mas não foi possível detectar alterações na análise histopatológica. Juntos, estes resultados sugerem, que a rBmCRT e rHlCRT são imunogênicas e pode ter funções imunomoduladoras sobre o sistema imune do hospedeiro, mas não suficiente para prevenir o desenvolvimento da imunidade humoral. / The tick Riphicephalus (Boophilus) microplus is a blood-sucking ectoparasite of bovines from tropical and subtropical regions, causing serious damages to the livestock production. The main method of control is based on the acaricides. However, the use of vaccines has been studied as a promising control method. The calretirulin (CRT) is a multifunctional protein present in almost all cells of animals. The secretion of CRT during feeding might be linked to the modulation of the parasite-host interaction. In the present study, recombinant CRTs of R. microplus (rBmCRT) and of Haemaphysalis longicornis (rHlCRT) were expressed in Escherichia coli and purified by ion exchange chromatography. The immunogenic and antigenic capacities of BmCRT e HlCRT were analyzed by different methods. In silico, were comparisons of the CRTs epitopes, identified by Jameson-Wolf antigenic index, indicates that there are three different regions between the tick CRTs. While, in silico analysis showed 6 regions in rBmCRT and in rHlCRT that could interact with C1q protein. In vitro, by Western blot, rBmCRT, but not rHlCRT, was recognized by the serum of bovine experimentally infested with R. microplus. In Western blot with extracts of larvae, the sera of a rabbit immunized with rBmCRT and bovines immunized with rBmCRT or rHlCRT recognized BmCRT; this suggests that antibodies directed to recombinant proteins also recognize native BmCRT. Also, the rBmCRT showed an anticoagulant effect in recalcification time. In vivo, the rBmCRT and rHlCRT induced reactions of immediate cutaneous hypersensitivity in bovines immunized with rBmCRT and rHlCRT, but it was not possible to detect alterations in histopathologic test. Together, these results suggest that the rBmCRT and rHlCRT are immunogenic and could have immunomodulatory functions on the immunity system of the host, but not enough to prevent the development of humoral immunity.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, e é um dos principais causadores de prejuízos econômicos à pecuária. O principal método de controle baseia-se no uso de acaricidas. No entanto, devido à crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do meio ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, métodos alternativos para o controle do R. microplus devem ser encontrados. Um dos métodos alternativos estudados é o uso de vacinas. As glutationa S-transferases (GST) são enzimas que estão presentes em organismos animais e vegetais e entre suas funções podem-se destacar transporte intracelular, participação em processos digestivos, síntese de prostaglandinas, e detoxificação de substâncias tóxicas e proteção contra estresse oxidativo. Neste estudo foi analisada a resposta imunológica comparativa de camundongos para a GST de R. microplus (GST-Bm) e para a GST de Haemaphysalis longicornis (GST-Hl). Ambas as proteínas foram expressas em Escherichia coli linhagem AD494, e purificadas por cromatografia de afinidade por glutationa utilizando a coluna GSTrap FF. Para verificar a imunogenicidade das proteínas, foram utilizados 25 camundongos Balb/c divididos em 12 grupos. As condições testadas foram as inoculações das proteínas GST-Bm e GST-Hl com os adjuvantes Montanide, saponina ou sem adjuvantes. Camundongos controle foram inoculados com extrato de E. coli ou somente com os adjuvantes. Foi coletado sangue de todos os animais com intervalos de sete dias durante 70 dias. Os soros foram analisados por ELISA para acompanhar a cinética da produção de anticorpos de todos os animais imunizados. Os camundongos inoculados com GST-Hl emulsificada com Montanide mostraram aumento dos níveis de anticorpos a partir do dia 21. O nível máximo de anticorpos foi detectado no dia 42, e diminuiu após o dia 56. Todos os outros animais não apresentaram aumento nos níveis de anticorpos. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick is a hematophagous ectoparasite that infests cattle in tropical and subtropical regions and is one of the principal causes of economic losses in the cattle farm. The principal method of control is the use of acaricides. However, due to increased worry about environmental chemical pollution, high costs and drugs toxicity and the selection of ticks resistant to acaricides, alternative methods for R. microplus control should be developed. One of these methods is vaccination. Glutathione S-transferases (GSTs) enzymes are present in animal and vegetal organisms and the functions are intracellular transport, participation in digestive process, synthesis of prostaglandins and detoxification of toxic substances and protection against oxidative stress. In this study the immunological response of mice inoculated with R. microplus GST (GST-Bm) and with Haemaphysalis longicornis GST (GST-Hl) was analysed. Both proteins were expressed in Escherichia coli strain AD494 and were purified by affinity chromatography using GSTrap FF columm. To verify the protein immunogenicity, 25 Balb/c mice divided into 12 groups were used. The tested conditions were inoculation of GST-Bm, GST-Hl proteins with Montanide and saponin adjuvants or without adjuvant. Control mice were inoculated with E. coli extract or the adjuvant alone. Blood from all animals were collected with intervals of seven days during seventy days, the sera were analyzed by ELISA to verify the kinetic of antibodies production of all immunized animals. Mice inoculated with GST-Hl emulsified with Montanide showed an increase in the antibodies levels from day 21. The maximum level of antibodies was detected on day 42 and decreased after day 56. The other animals did not show an increase in antibodies levels.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, e é um dos principais causadores de prejuízos econômicos à pecuária. O principal método de controle baseia-se no uso de acaricidas. No entanto, devido à crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do meio ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, métodos alternativos para o controle do R. microplus devem ser encontrados. Um dos métodos alternativos estudados é o uso de vacinas. As glutationa S-transferases (GST) são enzimas que estão presentes em organismos animais e vegetais e entre suas funções podem-se destacar transporte intracelular, participação em processos digestivos, síntese de prostaglandinas, e detoxificação de substâncias tóxicas e proteção contra estresse oxidativo. Neste estudo foi analisada a resposta imunológica comparativa de camundongos para a GST de R. microplus (GST-Bm) e para a GST de Haemaphysalis longicornis (GST-Hl). Ambas as proteínas foram expressas em Escherichia coli linhagem AD494, e purificadas por cromatografia de afinidade por glutationa utilizando a coluna GSTrap FF. Para verificar a imunogenicidade das proteínas, foram utilizados 25 camundongos Balb/c divididos em 12 grupos. As condições testadas foram as inoculações das proteínas GST-Bm e GST-Hl com os adjuvantes Montanide, saponina ou sem adjuvantes. Camundongos controle foram inoculados com extrato de E. coli ou somente com os adjuvantes. Foi coletado sangue de todos os animais com intervalos de sete dias durante 70 dias. Os soros foram analisados por ELISA para acompanhar a cinética da produção de anticorpos de todos os animais imunizados. Os camundongos inoculados com GST-Hl emulsificada com Montanide mostraram aumento dos níveis de anticorpos a partir do dia 21. O nível máximo de anticorpos foi detectado no dia 42, e diminuiu após o dia 56. Todos os outros animais não apresentaram aumento nos níveis de anticorpos. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick is a hematophagous ectoparasite that infests cattle in tropical and subtropical regions and is one of the principal causes of economic losses in the cattle farm. The principal method of control is the use of acaricides. However, due to increased worry about environmental chemical pollution, high costs and drugs toxicity and the selection of ticks resistant to acaricides, alternative methods for R. microplus control should be developed. One of these methods is vaccination. Glutathione S-transferases (GSTs) enzymes are present in animal and vegetal organisms and the functions are intracellular transport, participation in digestive process, synthesis of prostaglandins and detoxification of toxic substances and protection against oxidative stress. In this study the immunological response of mice inoculated with R. microplus GST (GST-Bm) and with Haemaphysalis longicornis GST (GST-Hl) was analysed. Both proteins were expressed in Escherichia coli strain AD494 and were purified by affinity chromatography using GSTrap FF columm. To verify the protein immunogenicity, 25 Balb/c mice divided into 12 groups were used. The tested conditions were inoculation of GST-Bm, GST-Hl proteins with Montanide and saponin adjuvants or without adjuvant. Control mice were inoculated with E. coli extract or the adjuvant alone. Blood from all animals were collected with intervals of seven days during seventy days, the sera were analyzed by ELISA to verify the kinetic of antibodies production of all immunized animals. Mice inoculated with GST-Hl emulsified with Montanide showed an increase in the antibodies levels from day 21. The maximum level of antibodies was detected on day 42 and decreased after day 56. The other animals did not show an increase in antibodies levels.