Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-05-05T17:45:23Z No. of bitstreams: 1 2009_JosedeOliveiraCarvalhoNeto.pdf: 892538 bytes, checksum: d6830e182d5bd383c67b689fda62bdc3 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-19T06:07:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_JosedeOliveiraCarvalhoNeto.pdf: 892538 bytes, checksum: d6830e182d5bd383c67b689fda62bdc3 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-19T06:07:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_JosedeOliveiraCarvalhoNeto.pdf: 892538 bytes, checksum: d6830e182d5bd383c67b689fda62bdc3 (MD5) Previous issue date: 2009-05 / Estudos utilizando sêmen sexado por citometria de fluxo têm demostrado uma menor fertilidade deste quando comparado ao não sexado. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade estrutural e funcional da célula espermática após sexagem por citometria de fluxo. Amostras de sêmen congelado de quatro touros foram utilizadas. Um ejaculado de cada touro foi coletado e fracionado em três partes, sendo: não sexado (NS), contendo espermatozóide sexado X (SX) e Y (SY). Uma palheta de sêmen foi descongelada sendo uma amostra retirada para avaliação da cinética espermática por sistema computadorizado (CASA computer-assisted semen analysis), aglutinação de cabeça, alterações morfológicas, integridade das membranas plasmáticas e acrossomal, capacitação espermática e integridade da cromatina. O restante foi depositado em gradiente de Percoll de 90:45% (NS90) ou 60:45% (NS60, SX e SY). Após centrifugação em gradiente de Percoll, o pellet resultante foi homogeneizado, sendo utilizado para avaliação espermática ou PIV. Cada procedimento foi repetido três vezes em manipulações diferentes. Para PIV, 2271 ovócitos maturados in vitro foram utilizados, sendo avaliada taxa de fecundação por coloração lacmóide 18 horas pi, clivagem avaliada em D2 (48 hpi) e a taxa de produção de blastocisto avaliada em D6, D7, D8 e D9 de cultivo. Os dados foram analizados usando procedimento GLIMMIX do programa SAS(R) (p < 0,05). Nas características espermáticas avaliadas antes ou após a passagem pelo gradiente de Percoll, nenhuma diferença foi observada entre os grupos SX e SY para todas as variáveis estudadas. As avaliações realizadas antes e após a passagem pelo gradiente de Percoll mostraram que o sêmen não sexado apresentou maior motilidade, maior porcentagem de células com membrana íntegra e células vivas com acrossoma intacto do que o sêmen sexado. Foi observado um efeito do gradiente de Percoll nas amostras de sêmen não sexado, sendo que aquelas submetidas ao gradiente de 90:45% apresentaram maior motilidade, maior porcentagem de células com membrana intacta e menor taxa de recuperação do que as submetidas ao gradiente de 60:45%. Para taxa de fecundação não foi encontrada diferença entre os grupos. O grupo NS90 apresentou maior taxa de clivagem do que o grupo SY, enquanto que os grupos NS60 e SX foram semelhantes aos demais. A taxa de produção de blastocisto dos dias 6, 7, 8 e 9 de cultivo foi maior no grupo NS90 do que no NS60, SX e SY. Com relação à cinética de desenvolvimento embrionário, não foi observado diferença entre os grupos no estágio do embrião nos dias 6, 7, 8 e 9 pi. Os resultados indicam que o processo de sexagem afeta as características espermáticas, mas não causa diminuição da fertilidade in vitro. No entanto, a diferença nas taxas de blastocisto entre os grupos NS60 e NS90 indica que há um efeito do protocolo de seleção espermática na produção de embriões. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Several studies using sex-sorted sperm by flow cytometry have shown that sexed sperm has lower fertility than the non-sexed. Therefore, the objective of the present study was to evaluate structural and functional characteristics of sperm sexed by flow cytometry. In addition, in vitro embryo production and development was assessed when sexed and non-sexed sperm were used for in vitro fertilization. Frozen sexed and non-sexed semen from four sires were used. One ejaculate from each bull was obtained and separated into three portions, being non-sexed (NS), sexed for X (SX) and sexed for Y (SY). Frozen-thawed semen from each sample was analyzed for motility by computer-assisted semen analysis (CASA), sperm head agglutination, sperm morphology, plasma membrane integrity, acrosome integrity, capacitation and chromatin integrity. Then, the samples were placed in 90:45% (NS90) or 60:45% (NS60, SX e SY) Percoll gradient. After Percoll centrifugation, the pellet was used for sperm analysis or IVF. All sperm quality tests and IVF experiments were repeated three times in independent replicates. For IVF a total of 2271 in vitro matured oocytes were used. To assess fertilization rate presumptive zygotes were fixed and stained with lacmoid at 18 hpi. Cleavage was evaluated at D2 (48 hpi) and blastocyst at D6, D7, D8 and D9 of culture. Data were analyzed using proc GLIMMIX of SAS(R) (p < 0.05). No differences were observed between SX and SY groups for any of the sperm variables evaluated either before or after Percoll centrifugation. The evaluations performed before and after Percoll treatment showed that non-sexed sperm had higher motility, higher percentage of cells with intact membrane and higher percentage of live cells with intact acrosome than sexed sperm. An effect of Percoll gradient was observed in the non-sexed samples, with those submitted to 90:45% gradient presenting higher motility, higher percentage of cells with intact membrane and lower recovery rate than those submitted to a 60:45% gradient. No differences among groups were observed for fertilization rate. NS90 group showed higher cleavage rate than the SY group, while groups NS60 and SX had similar rates to the others. Blastocyst rates at D6, D7, D8 and D9 of culture was greater for group NS90, and similar among NS60, SX and SY groups. Regarding embryo development kinetics, all groups showed similar developmental stages on D6, D7, D8 and D9. The results suggest that although the sex-sorting procedure by flow cytometry affected sperm characteristics, it did not cause a decrease on in vitro fertility. In addition, differences in blastocyst rates between groups NS60 and NS90 indicated an effect of sperm selection protocol on embryo production.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T17:19:01Z No. of bitstreams: 1 2010_AlliceRodriguesFerreira.pdf: 493312 bytes, checksum: 38d77029716a151f89050eea62646bad (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T17:19:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AlliceRodriguesFerreira.pdf: 493312 bytes, checksum: 38d77029716a151f89050eea62646bad (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-17T17:19:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AlliceRodriguesFerreira.pdf: 493312 bytes, checksum: 38d77029716a151f89050eea62646bad (MD5) / O cultivo in vitro de embriões afeta mecanismos epigenéticos envolvidos no controle da expressão de genes relacionados ao desenvolvimento embrionário e inativação do cromossomo X. Fêmeas de mamíferos têm dois cromossomos X, e machos somente um. Isto levou à criação de um mecanismo evolutivo de compensação de dose, chamado inativação do cromossomo X. Durante a embriogênese, um dos dois cromossomos X é aleatoriamente inativado em cada célula da massa celular interna, e preferencialmente o paterno no trofoblasto. O objetivo deste estudo foi estabelecer o padrão de inativação do cromossomo X, avaliando a expressão alelo específica do gene MAO-A (monoamina oxidase tipo A) em embriões bovinos produzidos in vitro nos estádios de quatro células, oito a dezesseis células, mórula, blastocisto e blastocisto expandido. Um total de 100 embriões foi produzido in vitro (PIV), utilizando ovócitos aspirados de nove novilhas da raça Nelore homozigotas para o alelo A, inseminados com sêmen de um touro Holandês homozigoto para o alelo G sexado para fêmea, previamente genotipados para o gene MAO-A. Dois pools com 10 embriões cada, dos estágios de 4 células, 8-16 células, mórula, blastocisto e blastocisto expandido foram coletados. Esses pools de embriões foram congelados a -80°C para posterior extração de RNA total. Um pool de 15 ovócitos maturados e 5 palhetas de espermatozóides foi utilizado para extração de RNA. Para a fenotipagem do gene MAO-A nos pools de embriões foi utilizada a técnica de RT-PCR-RFLP. Para isso foram desenhados dois pares de primers flanqueando uma região específica do gene (GenBank accession number NM_181014.2) com um polimorfismo, permitindo assim a detecção da expressão alelo específica (Bos taurus taurus X Bos taurus indicus), ou seja, permitindo detectar qual alelo, se paternal ou maternal estava sendo expresso. Um produto de amplificação foi gerado por RT-PCR com os primers externos de cada pool de embriões de cada estágio de desenvolvimento e purificado. xv Posteriormente, os fragmentos foram sequenciados pela metodologia de dideoxy em um sequenciador ABI 3130xl (Applied Biosystem) usando os primers internos foward. O RNA total extraído das células espermáticas e ovócitos maturados foram utilizados para a detecção da presença do RNA mensageiro do gene MAO-A por RT-PCR. Os resultados mostraram que ambos os alelos estão expressos em embriões de 4-células, 8-16-células, blastocisto e blastocisto expandido, com a expressão do X paterno desaparecendo em mórula. Pode-se especular que ambos os cromossomos X estão ativos nos dois estádios iniciais, sendo inativados posteriormente e reativados em blastocisto. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Embryo culture system may affect epigenetic mechanisms involved in controlling gene expression related to embryo development and X chromosome inactivation. Female mammal has two X chromosomes, and male only one. This led to the creation of an evolutionary mechanism of dosage compensation, called X chromosome inactivation. During embryogenesis, one of two X chromosomes is randomly inactivated in each cell of the inner cell mass, and preferably the paternal chromosome in trophoblast cells. The objective of this study was to characterize the allele-specific expression of the Monoamine Oxidase type A (MAO-A) X-linked gene, during preimplantational development of bovine embryos produced in vitro. One hundred in vitro embryos were produced using oocytes aspirated from nine heifers, homozygous for the MAO-A A allele, which were inseminated using X-semen sexed from a Holstein bull homozygous for the G allele. Two pools of 10 embryos each of 4 cell, 8- 16 cell, morula, blastocyst and expanded blastocyst stages were collected. Embryos were frozen at -80 °C until total RNA extraction. Total RNA from sperm and oocytos were also isolated. For phenotyping of the MAO-A gene in the pools of embryos the RT-PCR-RFLP technique was used. Two pairs of primers, flanking a specific region of the gene (GenBank accession number NM_181014.2) carrying a single nucleotide polymorphism, were designed. Thus, the allele-specific expression was detected, identifying paternal and maternal MAO-A mRNA. Amplicons of each pool of embryos were produced by using RT-PCR, and they were sequenced by the dideoxy method using an ABI 3130 xl sequencer (Applied Biosystem). Total RNA isolated from sperm cells was used to detect MAO-A mRNA by using RT-PCR. Results showed the presence of mRNA from both alleles in 4-cell, 8-16-cell, blastocyst and expanded blastocyst embryos, and only from the maternal allele in morula. We can speculate xvii that both X chromosomes are active in the two earliest stages, being inactivated and subsequently reactivated in blastocyst.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-10-07T14:47:24Z No. of bitstreams: 1 2011_DeniseFerreiraCaldeira.pdf: 838817 bytes, checksum: 8324f7a9f376b731e330a1af342b8f6e (MD5) / Approved for entry into archive by Camila Mendes(camila@bce.unb.br) on 2011-10-16T17:25:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_DeniseFerreiraCaldeira.pdf: 838817 bytes, checksum: 8324f7a9f376b731e330a1af342b8f6e (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-16T17:25:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_DeniseFerreiraCaldeira.pdf: 838817 bytes, checksum: 8324f7a9f376b731e330a1af342b8f6e (MD5) / A utilização de nanopartículas magnéticas no sêmen permite o incremento de técnicas de reprodução assistida para a realização transgênese e seleção espermática. Para tanto, é importante conhecer o comportamento da celular espermática em contato com as nanopartículas magnéticas para que possam ser utilizadas em larga escala nas diferentes biotécnicas da reprodução. A resposta espermática após contato com fluído magnético contendo nanopartículas de maghemita recoberta com DMSA foi avaliada com o intuito de determinar a toxicidade do nanomaterial. Sêmen bovino descongelado, após passagem pelo gradiente de Percoll, foi incubado a 37,5 ºC em meio SP-TALP+ (BSA 1,5%)adicionado de fluido magnético (FM) com concentrações finais de 0,06, 0,03 e 0,015 mg de Fe/mL. O grupo controle, sem adição de FM, foi incubado apenas com meio SP-TALP+. Durante a incubação avaliou-se a cinética espermática através do sistema CASA a cada 15 minutos durante duas horas, bem como na terceira e quarta horas de incubação. No início da incubação (zero hora), na segunda e na quarta horas também foram avaliadas a integridade da membrana plasmática e a reação acrossomal por meio da associação de corantes fluorescentes (iodeto de propídio e FITC-PNA). Ao final do período de incubação, o sêmen remanescente de cada tratamento foi fixado para análise em microscópio eletrônico de transmissão (MET). Observou-se que para os parâmetros do CASA, integridade da membrana e reação acrossomal não houve influencia da nanopartícula na resposta do sêmen ao longo do período de incubação, independente da concentração utilizada. Na análise da MET não foram observados danos ultraestruturaisàs células espermáticas após contato com o FM. Também não foi observado internalização das nanopartículas em nenhum grupo tratado com FM. Desta forma, o FM contendo nanopartículas de maghemita recobertas com DMSA pode ser utilizado em contato direto com o sêmen para o incremento das técnicas de reprodução assistida, uma vez que não há alteração na função e estrutura espermática nas condições testadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The use of magnetic nanoparticles in semen allows the improvement of assisted reproduction techniques to achieve transgenesis and sperm selection. Therefore, it is important to know the sperm cell behavior after exposure to magnetic nanoparticles, to achieve their use in different biotechnologies of reproduction in large scale. The sperm response after exposure to magnetic fluid containing maghemite nanoparticles coated with DMSA was evaluated in order to determine the toxicity of the nanomaterial. After passage through the Percoll gradient, frozenthawed bull semen was incubated at 37.5 °C in SP-TALP+ medium (1.5% BSA) added to the magnetic fluid (MF) with final concentrations of 0.06, 0.03 and 0.015 mg Fe/mL. The control group, without MF, was just incubated with SP-TALP+ medium. During incubation the sperm kinetic pattern was assessed using CASA system, the assessments were performed every 15 minutes during two hours, as well as in the third and fourth hours of incubation. At the beginning of the incubation (hour zero), as well as in the second and fourth hours the sperm plasma membrane integrity and acrosome reaction were evaluated through the combination of fluorescent dyes (propidium iodide and FITC-PNA).In the ETM analysis, sperm cells ultrastructural damage were not observed after exposure to the MF. The uptake of nanoparticles by the spermatozoa was also not observed in any group treated with MF. Thus, the MF containing maghemite nanoparticles coated with DMSA can be used in semen in order to improve the assisted reproduction techniques, since there is no change in sperm function and structure under the conditions tested.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-11-01T11:35:24Z No. of bitstreams: 1 2011_IsabelaReboucasBessa.pdf: 1322125 bytes, checksum: 4474d6fb57a2955d26b304bb4411576e (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-12-13T11:20:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_IsabelaReboucasBessa.pdf: 1322125 bytes, checksum: 4474d6fb57a2955d26b304bb4411576e (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-13T11:20:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_IsabelaReboucasBessa.pdf: 1322125 bytes, checksum: 4474d6fb57a2955d26b304bb4411576e (MD5) / O objetivo do presente estudo foi estudar o perfil da expressão de genes candidatos para a aquisição da competência durante o crescimento ovocitário em bovinos utilizando ovócitos de diferentes tamanhos provenientes de várias categorias de folículos. Os genes candidatos foram selecionados por estarem possivelmente envolvidos com a aquisição da competência (BMP15, OOSP1, H1FOO, H2A, H3A, H4, SLBP, DNMT1, DNMT3B, HAT, HDAC e SUV39H1). Para determinar o tamanho dos ovócitos a serem utilizados, foi realizado um pré- experimento, em que os folículos pré-antrais foram classificados orfologicamente, agrupados em diferentes categorias em primordial, primário, secundário inicial e secundário final. Após a classificação, os ovócitos de cada folículo foram individualmente isolados e medidos. Folículos pré-antrais e antrais foram isolados de ovários de vacas Nelore (Bos taurus indicus), por dissociação mecânica utilizando o Tissue Chopper. Para o isolamento dos ovócitos, os folículos foram expostos à colagenase tipo II (0,5 mg/ml) e então submetidos a sucessivas pipetagens. Os ovócitos foram medidos através do programa Motic images Plus 2.0 e classificados de acordo com seu diâmetro nas seguintes categorias: 1) ovócitos de folículos primordiais: diâmetro de até 20 μm; 2) ovócitos de folículos primários: 25 a 35 μm; 3) ovócitos de folículos secundários iniciais: 40 a 60 μm e 4) ovócitos de folículos secundários finais; 65 a 85 μm. Para a obtenção dos ovócitos oriundos de folículos antrais incompetentes e competentes, foram utilizadas as medidas de 100 a 120 μm e acima de 128 μm respectivamente. O RNA total foi extraído de 4 pools de 25 ovócitos, de cada categoria de folículo, e os transcritos dos genes foram quantificados por qPCR. Os valores de expressão dos genes alvos foram normalizados pela expressão do gene constitutivo CYC A. Os resultados foram analisados através do teste não paramétrico Kruskall Wallis, para comparar os tamanhos de folículos e ovócitos e avaliar o efeito do tamanho do ovócito na quantidade de expressão gênica. O nível de significância considerado foi P<0,05. Os resultados mostraram que os transcritos da H2A, H3, H4 e SUV39H1 não diferiram (P>0,05) entre os grupos de ovócitos de folículos antrais e pré-antrais. A expressão da OOSP1, SLBP, BMP15, H1FOO, DNMT1, DNMT3B e HAT foram menores (P<0,05) em ovócitos préantrais quando comparados com os de folículos antrais. A H3A foi o único gene em que foi detectado a expressão de RNAm em ovócito de folículo primordial. De todos os genes estudados, apenas a HDAC apresentou diferença significativa entre ovócitos de folículos antrais competentes e incompetentes. Os resultados sugerem que o acúmulo dos estoques dos genes analisados ocorre antes do estágio final da folículogênese e provavelmente não são marcadores para a competência. A HDAC foi o único gene que pode estar relacionado à competência do ovócito, pois mostrou uma diminuição (P<0,05) no nível de transcrito nos grupos de ovócitos competentes quando comparados com o grupo de antrais iniciais (1a 3mm). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this present study was investigate the expression profile of candidates genes for the acquisition of competence during oocyte growth in bovine using oocytes from different sizes obtained from several follicle categories. The candidate genes were selected to be possibly involved in competence (BMP15, OOSP1, H1FOO, H2A, H3A, H4, SLBP, DNMT1, DNMT3B, HAT, HDAC e SUV39H1). A pre-experiment was conducted to classify the follicles according to their categories in primordial, primary, small secondary and final secondary follicles. Then the oocytes were individually isolated and measured. Preantral and antral follicles were isolated from ovaries of Nelore (Bos taurus indicus) cows by mechanical dissociation using a Tissue Chopper. To isolate the oocytes, follicles were exposed to collagenase type II solution (0.5 mg/ml) and then submitted to successive pipetting. The oocytes were measured with Motic Images Plus 2.0 program and classified according to their diameter into the following categories: 1) oocytes from primordial follicle: diameter < 20 μm; 2) oocytes from primary follicles: 25 to 35 μm; 3) oocytes from small secondary follicles: 40 to 60 μm; 4) oocytes from final secondary follicles: 65 to 85 μm; 5) oocytes from early antral follicles: 100 to 120 μm; and 6) oocytes from final antral follicles: > 128 μm. Total RNA was extracted from 4 pools of 25 oocytes from each category of follicles using Rneasy Plus® kit, subjected to reverse transcription reaction and genes quantified by qPCR. Target gene expression was normalized using CYC A. Data were analyzed using Kruskal-Wallis test for values which were not normally distributed. Level of significance was considered P<0.05. The results show that the transcripts of H2A, H3A, H4 e SUV39H1 did not differ significantly between groups, showing the same pattern from preantral to antral follicles. For OOSP1, SLBP, BMP-15, H1FOO, DNMT1, DNMT3B and HAT, the pattern of expression was lower in oocytes from preantral follicles when compared to antral follicles. The H3A was the only gene in which expression was detected in oocytes from primordial follicles. From all the studied genes, only HDAC differed significantly between incompetent and competent oocytes. These results suggest that the stocks of transcripts of the studied genes are accumulated before the final phase of folliculogenesis. The HDAC was the only gene in which expression could be related to oocyte competence since it showed a decrease (P<0.05) in transcript levels from final antral oocytes (competent) compared to small antral group.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-24T14:15:01Z No. of bitstreams: 1 2009_LauraVanessaMouraoGulart.pdf: 1864176 bytes, checksum: e06ce0b2306cd34aa7c2580745746aca (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-24T14:15:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_LauraVanessaMouraoGulart.pdf: 1864176 bytes, checksum: e06ce0b2306cd34aa7c2580745746aca (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-24T14:15:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_LauraVanessaMouraoGulart.pdf: 1864176 bytes, checksum: e06ce0b2306cd34aa7c2580745746aca (MD5) / Condições de cultivo in vitro também afetam a produção de embriões e a expressão de importantes genes, podendo alterar a competência de oócitos para a produção de embriões futuros. O FSH em baixas concentrações pode afetar a produção desses embriões. A busca por melhores condições de cultura e um sistema in vitro que seja menos variável e ao mesmo tempo em que simule o animal in vivo, levou ao desenvolvimento de vários sistemas de cultura para a maturação in vitro de oócitos bovinos. Para comparar a eficiência dos sistemas de MIV foram utilizados quatro grupos: 1) TCM-199 controle; 2) ?-MEM, 3) ?-MEM 1 FSH 4) ?-MEM 10 FSH. O meio de cultura do grupo 1, é um meio não definido, devido a presença de soro fetal bovino utilizado. Os grupos dois, três e quatro são definidos, onde foi usado o polyvinilalcohol-PVA como doador de macromolécula sintética. FSH de suíno foi usado nos grupos 1, 3 e 4. No 1 º e 3 grupo o a concentração de FSH foi de 1 ng /mL e no 4 grupo a concentração foi 10ng/mL. Ovários bovinos foram coletados em um abatedouro. Oócitos com citoplasma homogêneo e com mais de três camadas de células da granulosa foram utilizados. Oócitos maturos dos quatro tratamentos foram fertilizados in vitro com sêmen preparado pelo método de gradiente Percoll. Prováveis zigotos com até duas ou três camadas de células do cumulus foram cultivados em gotas de 50 ml de meio SOF, acrescido de 10% de SFB e 1 mg /mL BSA sob óleo mineral em uma atmosfera úmida 5% CO2 a 38,5 ° C. A taxa de clivagem foi avaliada 72 horas após a FIV, taxa de blastocisto foi avaliada 168-192 horas pós FIV. As taxas de clivagem e blastocisto foram calculados com base no número de oócitos. A expressão dos seguintes genes (Bax, Bcl-2 e Conexina 43) foram avaliadas, em blastocistos por RT-PCR. O teste de ANOVA foi utilizado para comparar o número de blastocistos. Não houve diferença na proporção de embriões com mais de oito blastômeros em todos os grupos testados, indicando que a taxa de desenvolvimento durante as primeiras 72h pós FIV, foi semelhante nos oócitos maturados em meio quimicamente definido e de oócitos maturados no meio contendo soro. O gene Bax é um marcador pró-apoptóticas e o Bcl um marcador anti-apoptótico. A conexina 43 (Cx43) pode ser um marcador de competência do embrião. GAPDH foi utilizado como controle interno. O gene Bax não foi expresso em nenhum grupo. Os genes Bcl-2 e da conexina 43 foram expressos, principalmente no ?-MEM 10. Resultados inéditos mostram que não foram observadas diferenças na taxa de blastocisto em nenhum dos grupos (30% a 40%), a forte expressão de BCL2 e da Cx43 no grupo contendo 10 ng / mL de FSH podem indicar que FSH pode melhorar a qualidade do embrião, sob condições definidas.

Orientador: Ciro Moraes Barros / Resumo: O desvio ou divergência folicular é um momento importante da seleção folicular, onde pela primeira vez, nota-se uma diferença significativa na taxa de crescimento entre os dois maiores folículos ovarianos. A seleção folicular tem sido estudada intensamente em raças européias (Bos taurus taurus), porém pouco estudada em raças zebuínas (Bos taurus indicus). Objetivou-se com o presente trabalho determinar as características morfológicas do desvio associadas a primera onda folicular do ciclo estral de vacas da raça Nelore. A partir do dia da ovulação, os três maiores folículos (F1, F2 e F3) tiveram seu desenvolvimento acompanhado por ultra-sonografia transretal, realizada a cada 12 h, até o sexto dia após a ovulação. Em cada animal (n= 11), o momento do desvio foi determinado graficamente usando inspeção visual do perfil de crescimento dos F1, F2 e as vezes F3 (desvio observado) e matematicamente, usando análise de regressão linear segmentada para comparar as diferenças de diâmetro entre F1 e F2, e as vezes F3 (desvio calculado). Os resultados da determinação do momento do desvio usando os métodos matemático e observado, não foram significativamente diferentes. Utilizando-se a média dos resultados dos dois métodos, o momento do desvio ocorreu 2,4 dias após a ovulação, quando o F1 atingiu 6,1 mm. Concluiu-se que, o diâmetro do futuro folículo dominante no momento do desvio folicular foi de aproximadamente 6,1 mm em vacas da raça Nelore, cerca de 2,4 dias após a ovulação. / Abstract: Follicle diameter deviation is defined as the beginning of the differential change in growth rates between the largest and next largest follicles subsequent to wave emergence and is considered a key component of follicle selection. Follicle selection has been extensively studied in European breeds of cattle (Bos taurus) but has not been critically studied in Zebu breeds (Bos indicus). The objective of the present study was to determine the morphological characteristics of deviation associated with the first post-ovulatory wave (Wave 1) of the estrous cycle in nonlactating cows. Beginning on the day of ovulation (day 0), the three largest follicles (F1-F3, respectively) were individually tracked every 12 h for 6 d using transrectal ultrasonography. In individual animals (n=11), deviation was determined graphically using visual inspection of the diameter profiles of F1, F2 and sometimes F3 (observed deviation) and mathematically using segmented regression analysis of the diameter differences between F1 and F2 or sometimes F3 (calculated deviation). The results of determining the beginning of deviation in cows using the observed and calculated methods were not significantly different. Averaged over both methods, diameter deviation occurred 2.4 d after ovulation when F1 reached 6.1 mm in cows. It is concluded that the future dominant follicle has 6.1 mm at the time of deviation in Nelore cows, 2.4 days after ovulation. / Mestre

Orientador: José Luiz Moraes Vasconcelos / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da suplementação com monensina, em vacas nelore paridas a pasto, em anestro, nas concentrações plasmáticas de AGNE, IGF-1, no diâmetro de maior folículo e na capacidade de resposta desse folículo a um estímulo ovulatório hormonal (GnRH). Nesse estudo foram usadas 302 vacas (123 primíparas e 179 multíparas) que foram divididas em dois tratamentos, proporcionalmente, onde o lote controle recebeu apenas suplementação mineral e o lote tratado recebeu suplementação monensina (110mg/vaca/dia). Os tratamentos se iniciaram 30 dias pré-parto, onde avaliou-se o ECC pré-parto, até 90 dias pós-parto. Todas as vacas, em média aos 54 dias pós-parto, receberam um estímulo hormonal ovulatório (administração de 50 mcg de GnRH), foram avaliadas para o escore de condição corporal (escala de 1 a 5), colhido sangue para análise de IGF-1 e AGNE e foram avaliadas para o do diâmetro folicular através de ultra-sonografia (US). Após 7 dias nova US foi realizada para verificar a taxa de ovulação. As variáveis foram submetidas à análise de variância pelo GLM do SAS. O ECC pós-parto foi maior (p<0,01) em vacas tratadas com monensina (3,11) que vacas controle (3,00); além disso, vacas tratadas não perderam ECC no período periparto enquanto vacas controle perderam 0,19 pontos. Vacas suplementadas com monensina (883,9 mmol/l) tiveram concentração plasmática de AGNE menor (p<0,01) que vacas controle (1013,8 mmol/l), caracterizando, junto com a ECC, menor mobilização de reservas. Já a concentração plasmática de IGF-1 foi maior (p<0,01) nas vacas tratadas (118,5 ng/ml) que vacas controle (85,1 ng/ml). Primíparas (118,0 ng/ml) apresentaram IGF-1 maior (p<0,01) que multíparas (84,8 ng/ml). Vacas tratadas (10,07mm) apresentaram folículo maior que vacas controle (9,58mm) e multíparas (10,35mm) maior que primíparas (9,30mm)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this trial was to evaluate the effects of monensin supplementation in suckled anestrous Nellore cows on IGF-1 and NEFA concentrations, follicular diameter and GnRH ovulatory response. In this trial were used 302 cows (123 primiparous and 179 multiparous) divided in two treatments. The control group received only mineral supplementation and the treated group received monensin supplementation (110 mg/cow/day). The treatments began 30 days prepartum to 90 days postpartum. All cows, at average of 54 days postpartum, received hormonal ovulatory stimulation (50 mcg GnRH), BCS were evaluated (1 to 5 scale), blood samples were collected to IGF-1 and NEFA analysis and follicular diameter was measured by ultrasound (US). Seven days later ovulation rate was evaluated. Cows that received monensin had higher postpartum BCS (3.11) and lost less BCS at peripartum than control cows (3.00). Treated cows had lower (P<0.01) NEFA plasmatic concentration (883.9 mmol/l) than control cows (101.8 mmo/l), which associated with BCS suggests less reserve mobilization. IGF-1 plasmatic concentration was higher in treated cows (11.5 ng/ml) than control cows (85.1 ng/ml). Primiparous (118.0 ng/ml) had higher IGF-1 than multiparous (84.8 ng/ml). Treated cows had higher follicular diameter (10.07mm) than control cows (9,58mm) and multiparous (10.35mm) higher than primiparous (9.30mm). The hormonal ovulatory stimulation (GnRH) response is follicle diameter dependent and treated cows had higher response (35.9%) than control cows (31.5%). Monensin supplementation is a good strategy to improve energy status due to decrease in BCS loss and reduction of NEFA concentration. Monensin supplementation also increased IGF-1 plasmatic concentration, follicular diameter and hormonal (GnRH) ovulatory response. / Mestre

Orientador: Lucia Galvão de Albuquerque / Banca: Henrique Nunes de Oliveira / Banca: Fernando Sebastián Baldi Rey / Banca: Arione Augusti Boligon / Banca: Fabyano Fonseca e Silva / Resumo: As características reprodutivas são importantes para o sistema produtivo de carne bovina e, algumas delas, como a idade ao primeiro parto (IPP), dias para o segundo parto (DPP) e longevidade produtiva (LONG), são de fácil mensuração e não oneram o sistema produtivo para a obtenção fenotípica de sua expressão. Porém, estas características reprodutivas apresentam herdabilidade de baixa magnitude e, uma das razões, pode ser o fato de estas serem mensuradas apenas nas fêmeas consideradas férteis, pois no momento da avaliação genética, uma porção das fêmeas, normalmente, não apresentam fenótipos devido a falhas reprodutivas, descarte voluntário e involuntário anterior à estação de monta e, em alguns casos, por registros inconsistentes. Estes registros parciais ou desconhecidos são denominados informações censuradas. De acordo com alguns estudos, a inclusão adequada das informações censuradas poderiam evitar distorções nas inferências e melhoria na predição dos valores genéticos. Algumas metodologias têm sido utilizadas para lidar com a censura nas avaliações genéticas como modelos com penalização, modelos hierárquicos Bayesianos para dados censurados, modelo linear-limiar e o de análise de sobrevivência. Porém no Brasil, essas abordagens não vêm sendo muito utilizadas. Este estudo tem como objetivo avaliar as características reprodutivas de idade ao primeiro parto, dias para o segundo parto e longevidade produtiva, de fêmeas da raça Nelore, utilizando modelos que tratam as expressões fenotípicas destas características como não censuradas e censuradas, com a finalidade de encontrar modelos adequados para avaliação genética dos animais para estas características. Foram utilizadas fêmeas nascidas entre 1993 a 2007, da região sudeste e centro-oeste do Brasil, as quais fazem parte da base de dados Aliança Nelore. Para IPP, os grupos de ... / Abstract: Reproductive traits are very important to beef cattle production system and, some of them, such as age at first calving (AFC), days to calving (DC), and longevity (LONG) are easy to measure and do not bring further measurement costs to the production system. However, these reproductive traits show low heritabilities and, one of the reasons might be the fact that only fertile females have phenotypic records, because when the genetic evaluation is performed some cows have missing records due to reproductive failure, as well as due to voluntary and involuntary culling, which are made before the breeding season, and, in some cases, due to inconsistent phenotypic informations. These partially or unobserved phenotypes are termed as censored records. According to some studies, properly accounting for censored records in genetic analysis could avoid distorted inferences and better genetic breeding value predictions. Several methodologies have been proposed to cope with censored records in genetic evaluations, such as models in which censored records are penalized, Bayesian hierarchical models to deal with censored data, threshold-linear models, and frailty survival models. However, these approaches have not been widely applied in Brazil. The objectives of this study were to evaluate age at first calving, days to calving, and longevity, of the Nellore breed females, applying models which handle phenotypic informations as uncensored and censored, aiming to find appropriate models to genetic evaluation for these traits. Data were provided by Nellore Alianca and reproductive records of animals born from 1993 to 2007, in farms located in south-east and middle-west of Brazil, were considered in the study. Contemporary groups (CG) for AFC were defined by the combination of farm, month, and year of birth, farm and management group at weaning, and farm and management group at long-yearling. For DC and LONG ... / Doutor

Orientador: Lucia Galvão de Albuquerque / Coorientador: Gerardo Alves Fernandes Júnior / Banca: Ricardo Vieira Ventura / Banca: Joslaine Noely dos Santos Gonçalves / Banca: Maria Eugênia Zerlotti Mercadante / Banca: Diercles Francisco Cardoso / Resumo: O uso intensivo de biotecnologias reprodutivas tem feito com que se eleve a taxa de nascimento de progênies com maior grau de parentesco (maior taxa de nascimento de meio-irmãos e irmãos completos). Assim, o conhecimento sobre o coeficiente da endogamia média do rebanho torna-se relevante para a eficiência do sistema de produção. Com o advento da genômica, o coeficiente de endogamia (F) pode ser estimado com base na informação de milhares de marcadores do tipo polimorfismos de base única (SNPs), espalhados por todo o genoma. No presente estudo, informações de 3.785 animais da raça Nelore (1,760 machos e 2,025 fêmeas) genotipados para 777.962 SNPs do BovineHD BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) foram utilizadas com o objetivo de avaliar a taxa de endogamia em rebanhos comerciais da raça Nelore, bem como investigar o seu efeito (depressão endogâmica) sobre a expressão fenotípica de características reprodutivas (idade ao primeiro parto (IPP), ocorrência de prenhez precoce (OPP) e reconcepcão de novilhas (REC)). A estimativa do valor de F, bem como da depressão endogâmica, foi feita utilizando diferentes metodologias: (i) matriz de parentesco genômica com frequências alélicas obtidas da população base (FG); (ii) matriz de parentesco genômica com frequências alélicas fixadas em 0,5 (FGRM); (iii) com base no excesso de SNPs em homozigose (FSNP); e (iv) corrida de homosigose (FROH). Os resultados da corrida de homosigose também foram utilizados para identificar os padrões (... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The intensive use of reproductive biotechnologies has increased the birth rate of progenies with high degree of relationships (higher birth rate of half- and full-sibs). Thus, the control of herd inbreeding becomes relevant for the efficiency of the production system. With genomics, the inbreeding coefficient can be estimated using thousands of single nucleotide polymorphisms (SNPs), spread throughout the genome. In the present study, information of 3,785 Nelore animals (1,760 males and 2,025 females) genotyped with 777,962 SNP markers of BovineHD BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) was used with the objective of evaluating the inbreeding rates of Nelore commercial herds, as well as to investigate the effects of inbreeding (inbreeding depression) on the phenotypic expression of reproductive traits (age at first calving (AFC), heifer early pregnancy (EP), and heifer rebreeding (HR)). The inbreeding coefficient (F) and inbreeding depression were estimated based on (i) genomic relationship matrix considering allele frequencies estimated from the base population (FG); (ii) genomic relationship matrix considering allele frequencies fixed at 0.5 (FGRM); (iii) excess of homozygous SNPs (FSNP); and (iv) runs of homozygosity (FROH). The runs of homozygosity results were also used to identify the pattern (size and distribution) of ROH segments as well as to identify ROH islands (ROH segments shared by more than 50% of the population). In total, there were identified 210,636 RO... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Flavia Lombardi Lopes / Coorientador: Daniel Robert Arnold / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Luiz Sérgio de Almeida Camargo / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Naiara Zoccal Saraiva / Resumo: Modificações pós-translacionais de histonas são importantes componentes do código epigenético, e contribuem para o controle da transcrição gênica de cada célula. O presente trabalho descreve a participação de duas modificações de histonas no desenvolvimento embrionário pré-implantacional: a acetilação de lisinas e a citrulinização de argininas. No capítulo 1, avaliamos a presença de duas modificações de histona H3, K9ac (permissiva) e K27me3 (repressiva) em embriões bovinos no ciclo de ativação do genoma embrionário (AGE), por imunofluorescência. Ambas as marcas estão presentes e apresentam alto coeficiente de correlação, e dois perfis de embriões (com alta e baixa variação dos níveis das modificações entre blastômeros) foram descritos. A acetilação de histonas está relacionada à ativação da expressão gênica, portanto no capítulo 2 hipotetizamos que a manipulação de seus níveis em embriões bovinos poderia influenciar a ativação do genoma embrionário, o desenvolvimento de blastocistos e a inativação do cromossomo X em fêmeas. Foram testadas concentrações do inibidor das histona desacetilases tricostatina A variando de 5 a 50nM, aplicadas por 12 a 144h, iniciando 70h após a FIV. Três protocolos foram selecionados: 5nM 48h, 5nM 144h e 15nM 48h. Após, foi utilizado sêmen sexado para estudar os efeitos da TSA sobre embriões fêmeas e machos separadamente. Por imunofluorescência para H3K9ac, foi observado aumento na acetilação de histonas em ambas as concentrações (5 e 15nM), sendo 5nM mais eficaz em fêmeas do que machos. O tratamento com 15nM 48h reduziu a produção de blastocistos em machos e fêmeas, e 5nM 144h em machos. A taxa de apoptose, avaliada pelo ensaio TUNEL, foi elevada em embriões fêmeas (grupos 5nM144h e 15nM48h), e em machos (grupo 15nM48h), mas tal aumento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Histone post translational modifications are important components of the epigenetic code, and contribute to the control of gene transcription in each cell. This work describes the participation of two histone modifications in embryonic preimplantation development: acetylation of lysines and citrullination of arginines. In chapter 1, we evaluated the presence of two modifications of histone H3, K9ac (permissive) and K27me3 (repressive) in bovine embryos in the cycle of embryonic genome activation (EGA), by immunofluorescence. Both marks are present and show a high correlation coefficient, and two profiles of embryos were described, displaying high and low variation of modifications level between blastomeres. The acetylation of histones is related to gene expression activation, so in Chapter 2 we hypothesized that the manipulation of acetylation levels in bovine embryos could influence embryonic genome activation, blastocyst development and X chromosome inactivation in females. Five concentrations of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA), ranging from 5 to 50nM beginning 70 hours after FIV were applied per 12 to 144h. Three protocols were selected: 5nM 48h, 5nM 144h and 15nm 48h. After, sexed semen was used to study the effects of TSA on male and female embryos separately. Immunofluorescence of H3K9ac showed increased histone acetylation at both concentrations (5 and 15nM). 5nM TSA was more effective in females than in males. Treatment with 15nM 48h reduced male and female blastocyst yield, and 5nM 144h reduced male blastocyst yield. Apoptosis rate was measured by the TUNEL assay. Female 5nM144h and 15nM48h groups, and male 15nM48h group displayed higher apoptosis levels, but this increase was not observed in low quality embryos. In female embryos, TSA did not affect... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor