Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-07T16:22:11Z No. of bitstreams: 1 2015_MateusNunesDiogenes.pdf: 1103328 bytes, checksum: 8cd40e41b96f59fa3592a60611351199 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-12T15:14:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MateusNunesDiogenes.pdf: 1103328 bytes, checksum: 8cd40e41b96f59fa3592a60611351199 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-12T15:14:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MateusNunesDiogenes.pdf: 1103328 bytes, checksum: 8cd40e41b96f59fa3592a60611351199 (MD5) / O presente estudo visou avaliar o efeito do FGF10 durante a pré-maturação e/ou maturação in vitro (MIV) de ovócitos na produção in vitro de embriões bovinos. No primeiro experimento, os ovócitos foram maturados na presença ou não de FGF10. No segundo experimento, foi avaliado o efeito da suplementação de FGF10 durante a pré-maturação e/ou maturação, utilizando cinco grupos: T1: ovócitos maturados por 22h (controle); T2: ovócitos pré-maturados por 22h e maturados por 22h; T3: ovócitos pré-maturados por 22h e maturados por 22h com FGF10; T4: ovócitos pré-maturados por 22h com FGF10 e maturados por 22h; T5: pré-maturados por 22h com FGF10 e maturados por 22h com FGF10. Em ambos os experimentos foram avaliadas a maturação nuclear, a expansão das células do cumulus, a produção embrionária e a expressão dos genes: KRT8, PLAC8, CD9, PAG2, HSPB1 e MSH6 em embriões no D7 (experimento 1) ou D8 (experimento 2). Os dados de maturação nuclear e desenvolvimento embrionário foram analisados pelo teste do Qui-quadrado, e os da expansão das células do cumulus e expressão gênica por análise de variância, sendo P<0,05 considerado significativo. No primeiro experimento, a suplementação com FGF10 durante a MIV não afetou (P>0,05) nenhum dos parâmetros avaliados. No segundo experimento, após a maturação, a expansão em todos os tratamentos submetidos à pré-maturação, independente da presença de FGF10 (P<0,05), foi menor do que no grupo controle. A presença de FGF10 na pré-maturação/maturação não aumentou a quantidade de embriões sendo a taxa de blastocisto em D7 similar (P>0,05) entre T2 (43,7%), T3 (38,7%), T4 (39,6%) e T5 (47,3%). Entretanto, nos grupos T2 e T5 a taxa de blastocisto no D7 foi similar ao controle (53,4%). Todos os grupos apresentaram taxas de embriões eclodidos do D8 semelhantes. O nível de transcritos para o PLAC8 foi superior no grupo T4 quando comparado ao T1, os demais grupos foram iguais entre si. Já para o gene MSH6, somente foi detecta diferença no nível de transcritos entre os grupos T5 e T1, sendo inferior no T5. Conclui-se que a presença de FGF10 durante a MIV e/ou pré-MIV não tem efeito benéfico na produção e a qualidade dos embriões. Da mesma forma, a pré-maturação, independente da presença do FGF10, afeta a expansão das célullas do cumulus mas não tem efeito na produção embrionária. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This study aimed to evaluate the effect of FGF10 during pre-maturation and in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on in vitro embryo production (IVP). In the first experiment oocytes were matured in the presence or not of FGF10. In the second experiment, the effect of FGF10 during prematuration and/or maturation was evaluated using 5 experimental groups: T1: oocytes matured for 22h (control); T2: oocytes prematured for 22h and matured for 22h; T3: oocytes prematured for 22h and matured for 22h with FGF10; T4: oocytes prematured with FGF10 for 22h and matured for 22h; T5: oocytes prematured for 22h with FGF10 and matured for matured 22h with FGF10. In both experiments, nuclear maturation, cumulus cells expansion, embryo production and the relative expression of genes: KRT8, PLAC8, CD9, PAGE2, HSPB1 and MSH6 were evaluated. Data of nuclear maturation and embryo development were analyzed by chi-square test and those of cumulus cells expansion and gene expression by analysis of variance. P <0.05 was considered statistically significant. There was no effect of FGF10 supplementation during IVM on any of the parameters evaluated in the first experiment. On the second experiment after maturation a lower cumulus expansion was observed in all treatments submitted to prematuration, irrespective of FGF10 presence, than the control. The supplementation of prematuration or maturation medium with FGF10 did not cause an increase in embryo production on D7, being the blastocyst rate similar among T2 (43.7%), T3 (38.7%), T4 (39.6%) e T5 (47.3%). However, blastocyst rate was similar between T2, T5 and control (53, 4%). All groups had similar hatching rates on D8. Transcripts level for PLAC8 was higher on T4 compared to T1, and similar for the other groups. For MSH6 gene, differences in transcripts level were only observed between T5 and T1. It can be concluded that presence of FGF10 during IVM and/or prematuration have not affected embryo production or quality. Prematuration, regardless presence of FGF10, affected cumulus expansion but not embryo production.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-11-01T15:41:16Z No. of bitstreams: 1 2013_ElisaRibeiroCunha.pdf: 46352581 bytes, checksum: f7df57fc98ce9a6fb4373fe126a86276 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-04T10:59:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_ElisaRibeiroCunha.pdf: 46352581 bytes, checksum: f7df57fc98ce9a6fb4373fe126a86276 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T10:59:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_ElisaRibeiroCunha.pdf: 46352581 bytes, checksum: f7df57fc98ce9a6fb4373fe126a86276 (MD5) / Apesar de todo o potencial para o uso da transferência nuclear (TN) em bovinos, vários parâmetros continuam limitantes para a melhor eficiência da técnica. Considerando essas limitações, este trabalho propõe o uso de modelos celulares que não passaram pela gastrulação, sob influência do cultivo in vitro por longos períodos e diferentes formas de criopreservação. Em seguida, o melhor tipo celular para a produção de embriões por TN e foi avaliado sob o efeito de tratamentos que otimizem reprogramação nuclear. Células do fluido amniótico (CFA) e do cordão umbilical (CCU) foram utilizadas em comparação aos fibroblastos da orelha (CFO) e foram submetidos ao cultivo celular por 20 passagens e criopreservação em diferentes soluções contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), 5% de dimetilformamida e 7% de glicerol. A viabilidade celular, ultraestrutura, fragmentação do DNA e estabilidade cromossomal foram avaliadas para determinar o tipo celular mais resistente. Em todos os animais, foi possível avaliar as CFA e CCU por 20 passagens com diferentes tempos de crescimento celular para atingir a fase de confluência. As soluções com 10% de DMSO garantiram a viabilidade de 90,33±5,58%, 90,56±4,40% e 81,90±3,31%, respectivamente para CFO, CCU e CFA, sendo significativamente mais eficiente e com menor variação para preservação que as outras soluções crioprotetoras. Não houve alterações no cariótipo e houve baixa fragmentação nuclear ao longo das passagens estudadas. Na avaliação ultraestrutural, as CFA se mostraram mais sensíveis à criopreservação em relação às CCU e CFO, e apresentaram uma baixa viabilidade em P20 (17,2± 8,87%). A partir deste experimento, as CCU foram usadas na TN e submetidas a três atamentos: (T1) CCU foram tratadas com 1,5 mM de procaína por dois ciclos de crescimento; (T2) tratadas com 50 nM de tricostatina A (TSA) por 4h na ativação e 20 h no cultivo embrionário; (T3) tratadas com 50 nM de TSA por 4 h na ativação e 16 h no cultivo embrionário. Todos os tratamentos foram comparados com o grupo sem tratamento (controle). O tratamento com procaína provocou alterações na morfologia e teve baixa produção de blastocistos (4,4%). O tratamento com TSA por 24 h teve baixa produção de blastocistos (4,5%) e foi significativamente diferente da TSA 20 h e do controle. O tratamento por 20 h (17,19%) viabilizou o uso da TSA, mas não foi superior ao controle (21,73%). Os resultados demonstram que, em bovinos as CFA e CCU podem ser isoladas, cultivadas in vitro e criopreservadas em 10% de DMSO, apresentando estabilidade cromossomal e baixa fragmentação nuclear, sendo que as CCU são mais resistentes que as CFA. O uso de 1,5 mM de procaína e de 50 nM de TSA por 24 h não foram viáveis na produção de embriões por TN. Porém, o uso de 50 nM TSA por 20 h não comprometeu a produção de blastocistos produzidos por TN. No entanto, concentrações e tempo de exposição ao TSA diferentes devem ser testados para aumentar a produção embrionária e o nascimento de bezerros saudáveis. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Despite all the potential of animal cloning by nuclear transfer (NT), some parameters still limit the efficiency of this technique. Considering these limitations, the objective of this work was to study the cellular types that did not participated in the gastrulation process, in conditions of long-term culture and cryopreservation with different solutions. We also studied the potential of these cell types to produce embryos by NT when recontructed zygotes were treated with substances to optimize nuclear reprogramming. Amniotic fluid cells (AFCs) and umbilical cord cells (UCCs) were used in a comparative study with ear fibroblast cells (EFCs) that were cultured in vitro until 20 passages and cryopreserved in 10% Dimethyl sulfoxide (DMSO), 5% Dimethyl formamide and 7% Glycerol solutions. The cellular viability, ultrastructure, DNA fragmentation and chromosome stability were evaluated to determine the most resistant cellular type. In all animals, it was possible to evaluate the AFCs and UCCs until 20 passages with different periods of cellular growth to reach the confluence phase. Solutions containing 10% DMSO ensured viability of 90.33±5.58%, 90.56 ±4.40% and 81.90±3.31%, respectively for EFCs, AFCs and UCCs, being significantly more efficient and with less variation than other cryoprotectant solutions. There was no changes in karyotype and nuclear fragmentation was low at the cellular passages studied. In the ultrastructural evaluation, AFCs were more sensitive to cryopreservation than UCCs and EFCs and presented low viability rate at P20 (17.2±8.87%). From these results, the UCCs were used in the NT and submitted to three treatments: (T1) UCCs were treated with 1.5 mM procaine in two growth cycles; (2) reconstructed oocytes treated with 50 nM of trichostatin A (TSA) for 4 h in the activation phase and for 20 h in embryo development; (3) reconstructed oocytes treated with 50 nM TSA for 4 h in the activation phase and for 16 h during initial embryo culture. All treatments were compared with the untreated group (control). Treatment with procaine caused changes in cellular morphology and resulted in low blastocysts rate (4.4%). Treatment with TSA for 24 hours had low blastocyst production (4.5%) and was significantly different from the control and TSA 20 h treatment. The treatment for 20 hours made feasible the use of TSA (17.19% of blastocysts), but was not superior to the control group (21.73%). The results demonstrate that in bovine, AFCs and UCCs can be isolated, cultured in vitro and cryopreserved in 10% DMSO, not causing damage to DNA and chromosomes. The UCCs were more resistant than AFCs in all aspects. The use of 1.5 mM procaine and 50 nM TSA for 24 hours was not viable for NT embryos production. However, the use of 50 nM TSA for 20 hours did not compromise the blastocysts production, but different concentrations and times of exposure to TSA should be tested to enhance bovine NT embryo production and birth of healthy calves.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-11-08T16:45:34Z No. of bitstreams: 1 2013_IngridOliveiraSilva.pdf: 4680892 bytes, checksum: f09e5202a34b51b6905050f6fd9cfc2f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-11T14:43:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_IngridOliveiraSilva.pdf: 4680892 bytes, checksum: f09e5202a34b51b6905050f6fd9cfc2f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-11T14:43:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_IngridOliveiraSilva.pdf: 4680892 bytes, checksum: f09e5202a34b51b6905050f6fd9cfc2f (MD5) / O objetivo foi avaliar o efeito de sistemas de cultura definidos na maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos utilizando um procedimento em duas etapas: inibição e a subsequente retomada do bloqueio meiótico. Na primeira etapa os CCOs foram cultivados em meio controle, MIV-B ou MIV-C por 24h. Na segunda etapa, o cultivo continuou até 32, 40 ou 48 horas para os CCOs cultivados em MIV-B ou MIV-C para avaliação tempo-dependente do estágio da meiose dos oócitos. O meio controle utilizado foi TCM-199 suplementado com SFB e FSH. Já MIV-C foi constituído por meio Alpha –MEM suplementado com PVA, insulina, IGF-I, androstenediona, aminoácidos não essenciais, trasnferrina e selênio, e a constituição de MIV-B foi semelhante à de MIV-C, porém sem a adição dos hormônios e fator de crescimento. A maturação citoplasmática foi avaliada por microscopia eletrônica de transmissão (MET) nos tempos de 0, 24 e 48h de cultivo e também pela expressão dos genes HSP70.1, PRDX1, GDF9 e IFF1R. Os resultados mostraram que tanto MIV-C quanto MIV-B inibiram a meiose em cerca de 70% dos CCOs cultivados por 24h. Nas 24h de cultivo subsequentes, apenas 30% dos CCOs cultivados em MIV-C alcançaram o estágio maduro (MII). Já MIV-B apresentou cerca de 50% dos CCOs em MII após 32h de cultivo. Ao microscópio eletrônico o grupo controle apresentou características de maturação tais como a presença de espaço perivitelínico (PvS) desenvolvido, microvilosidades (Mv) eretas, grânulos corticais (GC) alinhados à membrana plasmática e mitocôndrias despersas pelo citoplasma. O grupo 0h apresentou características de imaturidade como pequeno PvS, Mv deitadas, GC em grumos e mitocôndrias no córtex do oócito. Os sistemas de cultura definidos proporcionaram, no entanto a presença de características intermediárias entre o grupo 0h e o grupo controle, como as Mv eretas em 83,3% dos CCOs, presença de mitocôndrias ligeiramente dispersas pelo citoplasma e GC se alinhando à membrana plasmática em 50% dos CCOs cultivados em MIV-C, apesar do bloqueio da meiose. Após 24h de cultivo em MIV-B foram observadas algumas características de maturação semelhantes ao controle maduro, como o alinhamento dos GC e a dispersão das mitocôndrias (p<0,05). As Mv ficaram num estágio intermediário e o PvS seguiu o padrão imaturo (p<0,05). Com 48h de cultivo nenhum outro avanço foi observado para os CCOs cultivados em MIV-B. O cultivo por 48h com MIV-C, no entanto promoveu a dispersão das mitocôndrias e o alinhamento dos GC como no controle maduro (p<0,05). Para a quantificação da expressão gênica por real-time-PCR, os oócitos cultivados nos meios descritos acima foram separados após 24 ou 48h de cultivo em oócitos com (CP) e sem corpúsculo polar (SCP), ou maduros e imaturos respectivamente. Oócitos frescos (0h) foram usados como controle imaturo. O resultado da quantificação da expressão dos genes em geral mostrou que tanto o cultivo com MIV-C, quanto o cultivo com MIV-B apresentou os oócitos imaturos com maior abundância relativa que os oócitos maduros, sendo que a quantificação dos oócitos maduros foi igual ao controle maduro (TCM-199) e a quantificação dos oócitos imaturos foi semelhante ao controle imaturo (0h). As exceções a essa regra foram: O grupo C48SCP (oócitos sem CP cultivados por 48h em MIV-C) para o gene PRDX1, apresentou-se semelhante ao controle maduro (p<0,05); o grupo B24CP (oócitos com CP cultivados por 24h em MIV-B) apresentou maior abundância relativa que o controle maduro para os genes PRDX1 e HSP70.1. Com relação ao gene GDF9, o cultivo dos CCOs por 24h tanto em MIV-B, quanto em MIV-C promoveu maior abundância relativa nos grupos maduros cultivados por 24h (B24CP e C24CP), quando comparados ao controle maduro (p<0,05). A abundância relativa do gene IGFIR não apresentou diferença significativa após o cultivo em MIV-C. No entanto, na comparação da quantificação desse gene após o cultivo em MIV-B por 24h foi observado que o controle maduro apresentou menor abundância relativa do que os demais grupos (p<0,05). No presente estudo, concluiu-se que o cultivo de CCOs em MIV-B ou MIV-C, por se tratar de dois meios estritamente definidos e que, portanto permitem a obtenção de respostas consistentes, constituem bons modelos para o estudo dos eventos que ocorrem durante a maturação oocitária sem necessidade do uso de inibidores da meiose. A manutenção dos CCOs em estágio imaturo in vitro sem qualquer efeito prejudicial pode ser usada para fornecer tempo adicional para estudar o processo de sincronização entre a maturação citoplasmática e nuclear durante a MIV. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The objective was to evaluate the effect of defined culture systems on nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes using a two-step procedure: inhibition and the subsequent resumption of meiotic arrest. In the first step the CCOs were cultured in control medium, MIV-B or MIV-C for 24h. In the second step, the culture continued until 32, 40 or 48 hours for the CCOs cultivated in MIV-B or MIV-C for the time-dependent evaluation of oocytes meiosis stage. The control medium used was TCM-199 supplemented with FCS and FSH. The MIV-C constitution was MEM-Alpha Medium supplemented with PVA, insulin, IGF-I, androstenedione, non-essential amino acids, transferrin and selenium, and the MIV-B constitution was similar to MIV-C, but without the addition of hormones and growth factor. The cytoplasmic maturation was evaluated by transmission electron microscopy (TEM) at 0, 24 and 48 h of cultivation, and by gene expression (HSP70.1, PRDX1, GDF9 and IFF1R). The results showed that MIV-C and MIV-B inhibited the meiosis in about 70% of the CCOs cultivated by 24h. In the subsequent 24h of culture, only 30% of MIV-C CCOs reached the mature stage (MII). MIV-B already has filed about 50% of the CCOs in MII after 32 h of culture. The control group presented ultaestructural characteristics of maturation such as the presence of conspicuous perivitelline space (PvS), erect microvilli (Mv), aligned cortical granules (CG) and spread mitochondria through the cytoplasm. The 0h group has shown characteristics of immaturity as small PvS, bent Mv, clusters of CG and cortical mitochondria. Defined culture systems provided, however the presence of intermediate characteristics between the 0h group and the control group, as the erect Mv in 83.3% of CCOs, the presence of mitochondria cortical/evenly distributed by cytoplasm and aligned/cluster GC in 50% of CCOs cultivated in MIV-C, despite the meiosis arrest. After MIV-B culture for 24h were observed some maturation characteristics similar to control group, as the alignment of the CG and the spread mitochondria (p < 0.05). The Mv were in an intermediate stage and the PvS followed the immature pattern (p < 0.05). With 48h of culture no other advance was observed for the CCOs cultivated in MIV-B. The culture for 48 h with MIV-C, however promoted the dispersion of mitochondria and the alignment of the GC as in mature control (p < 0.05). For the quantification of gene expression by real-time-PCR, the oocytes cultured in the media described above were separated after 24 or 48h of culture in oocytes with (PB) and without polar body (WPB), or mature and immature respectively. Fresh oocytes were used as immature control. The result of the quantification of gene expression in general showed that MIV-C and MIV-B culture presented the immature oocytes with greatest relative abundance that the mature oocytes, and the quantification of mature oocytes was equal to the mature control (TCM-199) and the quantification of immature oocytes was similar to the immature control. The exceptions to this rule were: the C48WPB Group (oocytes without PB cultured for 48 hours MIV-C) for PRDX1 gene appeared similar to mature control (p < 0.05); the B24PB Group (oocytes with PB cultivated in MIV-B for 24h) showed higher relative abundance for PRDX1 and HSP 70.1.genes than the mature control. With respect to GDF9, 24h of culture in MIV-B or MIV-C promoted greater relative abundance in mature groups (B24PB and C24PB), than the mature control (p < 0.05). The relative abundance of IGFIR gene showed no significant difference after cultivation in MIV-C. However, the quantification of this gene after 24h of culture in MIV-B showed lower relative abundance in mature control group than the other groups (p < 0.05). In the present study, it was concluded that MIV-B and MIV-C, can be used in lieu of meiosis inhibitors and furthermore, can provide extra time to study nuclear and cytoplasmic maturation synchrony of IVM.

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: João Paulo Elsen Saut / Banca: Ricarda Maria dos Santos / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Banca: Maria Emília Franco Oliveira / Banca: Érica Azevedo Costa / Resumo: De modo geral, o objetivo deste estudo foi determinar se as células endometriais bovinas responderam a análogos virais de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) mediante a produção de citocinas pró-inflamatórias após ativadas pelos receptores "Toll-Like" (TLRs) no endossoma celular e no citoplasma celular pelo genes indutores de ácido retinóico tipo I (RIG-I). No primeiro experimento, amostras uterinas de vacas de corte mestiças pós-púberes foram dissectadas para obtenção de células endometriais epiteliais e estromais. Um controle negativo e quatro PAMPs: LPS, ssRNA, Poly I:C (LMW), Poly (I:C) HMW foram utilizados. Dois grupos de tratamentos (transfectados e não transfectados) foram analisados durante 24 horas. Em outro experimento, células endometriais foram tratadas apenas com o PAMP Poly (I:C) LMW e um grupo Controle Negativo. Neste, os grupos foram incubados às 0, 2, 6, 12, 24, 36, 48 e 72 horas. Sobrenadantes foram colhidos para desenvolver o teste de ELISA para IL-6 e IL-8. Células epiteliais produziram IL-6 em resposta ao Poly I:C (HMW) quando comparadas com o Controle (Grupo DOTAP positivo; P< 0.05), enquanto que o LPS induziu produção de IL-6 e IL-8 em células estromais (P< 0.05). O uso de um reagente de transfecção entre as células e tratamentos demonstrou efeito (P> 0.05). Ainda, células estromais tratadas por Poly I:C (LMW) demonstraram uma maior produção de IL-6 às 48 e 72 horas (P< 0.05), e para o IL-8 às 6, 12, 24, 36, 48 e72 horas quando comparadas com o grupo Controle (P< 0.05). No segundo experimento, outras amostras uterinas de vacas de corte pós-púberes foram utilizadas. A obtenção de células endometriais estromais e epiteliais foram isoladas pelo mesmo protocolo do primeiro experimento. O PAMP Poly (I:C) LMW e um controle negativo foram utilizados. Proteínas para o RIG-I e p65 foram colhidas após 12, 24, 48 e 72 horas de tratamento / Abstract: In general, the objective of this study was to determine if bovine endometrial cells replied to virus analogs of pathogen associated molecular pattern (PAMPs) by production of proinflammatory cytokines after Toll-Like Receptor (TLR) activation in the cell endosome and after retinoic acid inducible gene - I (RIG-I) stimulation in the cell cytoplasm. In the first experiment, uterine samples from post pubertal cross-breed beef cows were dissected using a protocol to obtain epithelial and stromal cells. A negative control and four different PAMPs: LPS, ssRNA, Poly I:C (LMW), Poly (I:C) HMW were used. Two treatments (transfected and non-transfected) groups were investigated during 24 hours. In the other experiment, endometrial cells were treated with only Poly (I:C) LMW and a negative Control group. All incubated at 0, 2, 6, 12, 24, 36, 48 and 72 hours. Supernatants were collected to develop Elisa for IL-6 and IL-8. Epithelial cells produced IL-6 in response do Poly I:C (HMW) compared to Control (P< 0.05), otherwise, LPS induced IL-6 and IL-8 in stromal (P< 0.05). The transfection Reagent differ between cells and treatments (P> 0.05). Still, in stromal cells treated by Poly I:C (LMW) the production of IL-6 was higher at 48 and 72 hours (P< 0.05), and for IL-8 at 6, 12, 24, 36, 48 and 72 hours when compared to the Control (P< 0.05). In the second experiment, uterine samples from others post pubertal mixed-breed beef cows were used. To obtain stromal and epithelial cells, uterine samples were dissected with the same protocol as the first experiment. The PAMP Poly (I:C) LMW and a negative control were used. Proteins for RIG-I and p65 were collected after 12, 24, 48 and 72 hours. In response to Poly (I:C) LMW induction, stromal cells activated RIG-I at 48 hours (P< 0.05) were compared to the Control group. On the other hand, epithelial cells were not sufficient stimulated Poly (I:C) LMW to activate ... / Doutor

Orientador: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Carlos Antônio de Carvalho Fernandes / Banca: Eunice Oba / Banca: Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpção / Banca: Maria Denise Lopes / Resumo: Neste estudo vitrificou-se em OPS ovócitos (Experimentos 1, 2 e 3) e embriões bovinos (Experimentos 4, 5 e 6) em três soluções de vitrificação distintas: Experimentos 1 e 4) 20%EG + 20%DMSO + 0,5M sacarose; Experimentos 2 e 5) 20%DF + 20%EG + 0,5M sacarose; Experimentos 3 e 6) 20%DF + 20%DMSO + 0,5M sacarose. Os embriões foram vitrificados na presença ou não de citocalasina B. Os ovócitos foram vitrificados ou somente expostos aos crioprotetores imaturos (G0h e G0hexp), ou após 6 horas (G6h e G6hexp), 12 horas (G12h e G12hexp) ou 22 horas de MIV (G22h e G22hexp). Após a exposição ou aquecimento, parte dos ovócitos completou as 22 horas de MIV e foi destinada à PIV, para avaliação da capacidade de se desenvolverem até blastocisto. No restante avaliou-se o estágio de maturação nuclear e a distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias. Observou-se que a exposição dos ovócitos imaturos (0 ou 6 horas de MIV) aos crioprotetores nos experimentos 1, 2 e 3 resultou em perda substancial de viabilidade, avaliada pelas taxas de clivagem (GC=79,4%; 1G0hexp=37,1%; 1G6hexp=51,1%; 2G0hexp=33%; 2G6hexp=52,5%; 3G0hexp=36,2%; 3G6hexp=49,8%), o que foi menos notável nos ovócitos expostos após 12 ou 22 horas de MIV (1G12hexp=59,1%; 1G22hexp=71,1%; 2G12hexp=61,5%; 2G22hexp=62,5%; 3G12hexp=58,8%; 3G22hexp=68,6%). A realização da MIV antes da vitrificação foi benéfica. Apesar de nenhuma das soluções de crioprotetores ter sido capaz de promover proteção adequada aos ovócitos submetidos à vitrificação em qualquer momento da MIV, no Experimento 1 foi observada clivagem (1G12h=7,3%; 1G22h=4,2%) indicando que a mistura de crioprotetores EG+DMSO foi a mais eficiente nas condições utilizadas. Entretanto, não houve produção de blastocistos em nenhum experimento. Nos Experimentos 4, 5 e 6 notou-se que em todos os grupos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this study bovine oocytes (Experiments 1, 2 and 3) and embryos (Experiments 4, 5 and 6) were vitrified in OPS using 3 different cryoprotectant solutions: Experiments 1 and 4) 20%EG + 20%DMSO + 0,5M sucrose; Experiments 2 and 5) 20%DF + 20%EG + 0.5M sucrose; Experiments 3 and 6) 20%DF + 20%DMSO + 0.5M sucrose. Embryos were vitrified in the presence or not of cytocalasin B. Oocytes were vitrified or just exposed to the cryoprotectant solutions after 0h (G0h and G0hexp), 6h of IVM (G6h and G6hexp), 12h of IVM (G12h and G12hexp) and 22h of of in vitro maturation (IVM) (G22h and G22hexp). Oocytes from groups 0 and 6h were considered immature and from 12 and 22h groups were considered mature. After exposure to cryoprotectants or warming, part of the oocytes that completed 22h of IVM were submitted to IVF to evaluate their developmental ability. Another part of the oocytes were used to evaluate nuclear maturation in the distribution of mitochondria and cortical granules. The results showed that the exposure of immature oocytes (0 and 6 hours of MIV) to cryoprotectants reduce their viability, since cleavage rates of all groups were significantly lower compared to control group (GC=79.4%; 1G0hexp=37.1%; 1G6hexp51.1%; 2G0hexp=33%; 2G6hexp=52.5%; 3G0hexp=36.2%; 3G6hexp=49.8%). This effect was less evident in the groups of mature oocytes submitted to IVM for 12 or 22 hours (1G12hexp=59.1%; 1G22hexp=71.1%; 2G12hexp=61.5%; 2G22hexp=62.5%; 3G12hexp=58.8%; 3G22hexp=68.6%). The previous IVM is beneficial to vitrification. Although none of the cryoprotectant solutions utilized were totally efficient in protecting the oocytes form cryodamage, in Experiment 1 cleavage was observed (1G12h=7.3%; 1G22h=4.2%) indicating that the combination of EG+DMSO was more effective than the other two. However in none of the groups blastocyst was formed. When embryos... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-01Bitstream added on 2014-08-13T18:01:04Z : No. of bitstreams: 1 000740552_20150801.pdf: 754242 bytes, checksum: bc5e88cf87d7787c34d18c1a6e215275 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:20:57Z: 000740552_20150801.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:17Z : No. of bitstreams: 1 000740552.pdf: 1359921 bytes, checksum: 8d035cb78ff5afaa9c1f0d1ef3b02d72 (MD5) / O fator de crescimento dos fibroblastos 8 (FGF8) é expresso pelo oócito bovino, ativa os receptores expressos por células do cumulus e oócitos, e está envolvido na regulação da glicólise e meiose no CCO de murinos. O primeiro objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do FGF8 sobre a expansão das células do cumulus, a progressão da meiose e metabolismo energético em CCOs bovinos submetidos à MIV. Uma vez que foram observadas influências sobre a progressão da meiose e no metabolismo energético, os efeitos de FGF8 sobre a abundância de genes que codificam o RNAm que controlam estes processos foram avaliados. O FGF8 não afetou a expansão do cumulus, mas diminuiu a porcentagem de oócitos que alcançaram a metáfase II, consequentemente houve o aumento da porcentagem de oócitos na metáfase I. Tal efeito foi associado com um efeito inibitório do FGF8 sobre os níveis de RNAm que codifica a Ciclina B1 no oócito. Em contraste com os achados anteriores em murinos, o FGF8 leva à diminuição dos níveis de RNAm de NPR2 nas células do cumulus. O FGF8 tende a diminuir a absorção de glicose e produção de lactato, que foi acompanhada por uma redução significativa nos níveis de RNAm para PFKP em células de cumulus. O FGF8 também tende a diminuir a expressão de RNAm para o LDHA, mas não alterou os níveis de RNAm para GLUT1, GLUT4 e PDHA1 nas células do cumulus, enquanto que aumentou a expressão de RNAm para o PDHA1 no oócito. Este estudo apresenta evidências de que o FGF8 pode retardar a progressão da meiose durante a MIV em bovinos por meio de mecanismos que envolvam redução da expressão de Ciclina B1. Além disso, novamente em contraste com estudos em ratos, os dados sugerem um efeito inibidor modesto de FGF8 sobre o metabolismo glicolítico das células do cumulus durante a maturação in vitro de bovinos / Fibroblast growth factor 8 (FGF8) is expressed by the bovine oocyte, activate receptors expressed by cumulus cells and oocytes, and is involved in the regulation of glycolysis and meiosis in the murine COC. The first aim of this study was to assess the effects of FGF8 on cumulus expansion, meiosis progression and energy metabolism in bovine COCs submitted to IVM. Then, once influences on meiosis progression and energy metabolism were observed, effects of FGF8 on abundance of mRNA encoding genes that control these processes were assessed. FGF8 did not affect cumulus expansion but decreased the percentage of oocytes reaching metaphase II, while increasing the percentage of oocytes in metaphase I. This was associated with an inhibitory effect of FGF8 on levels of mRNA encoding Cyclin B1 in the oocyte. In contrast with previous findings in mice, FGF8 decreased mRNA levels of NPR2 in cumulus cells. FGF8 tended to decrease glucose uptake and lactate production, which was accompanied by a significant reduction in PFKP mRNA abundance in cumulus cells. FGF8 also tended to decrease LDHA mRNA expression, but did not change GLUT1, GLUT4 and PDHA1 mRNA levels in cumulus cells, while it increased PDHA1 mRNA abundance in the oocyte. This study presents novel evidence that FGF8 can slow meiosis progression during IVM in cattle through mechanisms involving reduction of Cyclin B1 expression

Orientador: Eunice Oba / Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Otavio Mitio Ohashi / Banca: Marcelo Marcondes Seneda / Banca: Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpção / Resumo: Pesquisadores do mundo inteiro têm investigado a função de fatores e eventos biológicos envolvidos na foliculogênese e no processo de maturação ovocitária in vitro em várias espécies, com o intuito de aprimorar tecnologias de produção e manipulação de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar: a morfometria ovariana; os aspectos morfométricos e ultra-estruturais dos folículos ovarianos; os fatores que influenciam a recuperação, qualidade ovocitária e taxas de maturação nuclear in vitro; as concentrações de progesterona e insulina plasmáticas e os níveis de hormônios esteróides (estradiol e progesterona) e IGF-I no líquido folicular, em búfalas e vacas. Amostras de sangue e os ovários de 86 búfalas (33 gestantes e 53 não gestantes) e de 95 vacas (36 gestantes e 59 não gestantes) foram colhidos em abatedouros. Os ovários foram transportados ao laboratório em solução salina acrescida de penicilina e estreptomicina a 36ºC. As dimensões ovarianas foram mensuradas com o auxílio de paquímetro e balança digitais. Para a maturação ovocitária in vitro, os complexos cumulus oophorus (CCOs) foram recuperados por aspiração folicular, selecionados e cultivados em meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino, piruvato de sódio, FSH, LH, estradiol, cisteamina e gentamicina, por 22 a 24 horas, a uma temperatura de 38,5ºC, em atmosfera úmida com 5% de CO2 em ar. Para as técnicas de histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão foram processados 10 e 5 ovários de cada espécie, respectivamente. As concentrações de progesterona, insulina, estradiol e IGF-I nas amostras de sangue e fluido folicular foram determinadas por procedimento de radioimunoensaio, utilizando-se kits comerciais. Na análise histológica, verificou-se ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Researchers around the world have investigated the function of biological factors and events during folliculogenisis and in the process of in vitro maturation of oocytes in several species in order to improve technologies of embryo production and manipulation. The aim of the present study was to evaluate: ovarian morphometry; morphological and ultrastructural aspects of ovarian follicles; factors affecting the recovery and competence of oocytes and in vitro nuclear maturation; plasma progesterone and insulin concentrations; progesterone, estradiol and IGF-I in follicular fluid, in bubaline and bovine species. Blood samples and ovaries of 86 buffaloes (33 pregnant and 53 non pregnant) and 95 cows (36 pregnant and 59 non pregnant) were collected at slaughterhouses. The ovaries were transported to the laboratory in saline solution enriched with penicillin and streptomycin at 36ºC. The ovarian dimensions were measured using digital paquimeter and balance. For in vitro maturation process, cumulus-oocyte complexes (COCs) were recovered by follicular aspiration, selected and matured in TCM 199 supplemented with 10% fetal calf serum, sodium pyruvate, LH, FSH, estradiol, gentamicin and cysteamin. In vitro maturation was carried out at 38.5ºC under a controlled gas atmosphere of 5% CO2 in humidified air for 22-24 hours. For classical histology and transmission electron microscopy, 10 and 5 ovaries of each species respectively were processed. Progesterone, insulin, estradiol and IGF-I concentrations of blood and follicular fluid were determined by use of radioimmunoassay and commercial kits. In histological evaluation, the diameters of follicles and oocytes increased according to follicular development. Ultrastructural characterization of bubaline and bovine ovarian follicles showed a differentiated cell apparatus for substrate metabolization, ...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-09-22T20:53:14Z No. of bitstreams: 1 2008_TatianeCarmoDuarteMundim.pdf: 429588 bytes, checksum: a569d620900910d9afcf1c181c02b277 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-06-23T22:54:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_TatianeCarmoDuarteMundim.pdf: 429588 bytes, checksum: a569d620900910d9afcf1c181c02b277 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-23T22:54:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_TatianeCarmoDuarteMundim.pdf: 429588 bytes, checksum: a569d620900910d9afcf1c181c02b277 (MD5) Previous issue date: 2008-11 / Embriões produzidos por hiperestimulação hormonal são usados como controle in vivo na maioria das publicações relacionadas à expressão gênica. Entretanto, ainda não se sabe se esses embriões são os controles mais apropriados a serem utilizados em estudos de perfil da expressão gênica. Deste modo, o objetivo do presente estudo foi comparar a expressão dos genes candidatos relacionados ao desenvolvimento embrionário bovino: GRB-10, IGF-II, IGF-IIR, MnSOD, GPX-4, CATALASE, BAX, e INTERFERON-τ, entre embriões produzidos in vivo através de superovulação (SOV), através de Produção in vitro (PIV) e in vivo produzidos por ovulação natural, sem nenhuma estimulação hormonal (OVN). A comparação foi realizada através da técnica de RT-PCR usando β-ACTIN e GAPDH como os controles constitutivos. Quando a expressão individual dos genes foi analisada, GRB-10 foi menos expresso em embriões OVN do que em SOV (P = 0,04) e PIV (P = 0,01), no entanto, nenhuma diferença foi encontrada entre os outros genes. Genes relacionados à resposta ao estresse foram agrupados e comparados entre os diferentes tipos de embriões. A soma da expressão dos genes MnSOD, GPX-4, CATALASE tende (P = 0,10) a ser maior em embriões PIV do que em OVN. A expressão de todos os genes estudados foi também somadas para cada tratamento, e a expressão gênica geral foi menor em embriões OVN quando comparados com embriões de SOV(P = 0,06) ou de PIV(P = 0,04). Nenhuma diferença foi observada entre os embriões SOV e PIV(P = 0,70). Finalmente, os genes foram agrupados de acordo com suas funções, relacionadas ao desenvolvimento embrionário (GRB-10, IGF-II e IGF-IIR), a resposta ao estresse (MnSOD, xiv GPX-4 e CATALASE) e a qualidade embrionária (BAX, INTERFERON-τ). A análise de correlação foi realizada e mostrou um comportamento distinto nos embriões de OVN quando comparados com os de SOV (r = -0,9429) e com os de PIV (r = - 0,8833) para os genes GRB-10, IGF-II e IGF-IIR. No entanto, o comportamento desses genes foi similar para os embriões de SOV e de PIV (r = 0.9890). Concluímos que a estimulação hormonal ovariana afeta os embriões através da alteração de sua expressão gênica. Portanto, se os embriões de SOV tiverem que ser usados como contrôle em estudos de expressão gênica, os dados deverão ser analisados com cautela. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Embryos produced by hormonal hyperstimulation are used as “in vivo” control in the majority of publications related to gene expression. However, if those are the most appropriated control for gene expression profile studies it is not known. Thus, the objective of this study was to compare the expression of GRB-10, IGF-II, IGF-IIR, MnSOD, GPX-4, CATALASE, BAX, and Interferon-τ genes among embryos produced in vivo by hormonal hyperstimulation (SOV), by in vitro fertilization (IVF) or in vivo without any hormonal stimulus (NOV). Comparison was performed using a semi-quantitative RT-PCR using β-Actin and GAPDH as constitutive controls. When the individual gene expression was analyzed, GRB-10 was less expressed in NOV than SOV (P = 0.04) and IVF (P = 0.01) embryos, whereas no differences were found for the other genes. Then, genes related to stress response were grouped and compared among the types of embryos. The sum of expression of MnSOD, GPX-4, CATALASE genes tended (P = 0.10) to be greater in IVF than NOV embryos. The expression of all studied genes were also added together for each treatment, the “overall” gene expression was lower in the NOV embryos when compared with SOV (P = 0.06) or IVF (P = 0.04). No difference was observed between the SOV and IVF embryos (P = 0.70). Finally, genes were grouped according to their function as being related to embryo development (GRB-10, IGF-II, IGF-IIR), stress response (MnSOD, GPX4, CATALASE) and embryo quality (BAX, INTERFERONτ). A correlation analysis was performed and showed a distinct behavior for NOV embryos when compared with SOV (r = -0.9429) or IVF (r = -0.8833) for GRB-10, IGF-II and IGF-IIR genes. However, the behavior of xvi xvii those genes was similar for SOV and IVF embryos (r = 0.9890). We conclude that ovarian hormonal stimulation affects embryos by altering their gene expression. Therefore, if SOV embryos have to be used as experimental control for gene expression studies, data should be analyzed with caution.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-03Bitstream added on 2014-06-13T20:32:58Z : No. of bitstreams: 1 lima_rs_me_botib.pdf: 532125 bytes, checksum: 43ee357752dc07c85fbf032817d7466d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O estresse térmico materno compromete a fertilidade de vacas leiteiras. Os oócitos nas fases de vesícula germinativa (VG) e maturação são susceptíveis aos efeitos deletérios causados pelo estresse térmico, entretanto os mecanismos celulares desencadeados pela temperatura elevada são pouco conhecidos. Os danos celulares induzidos pelo estresse térmico podem ser manipulados por amplo espectro de fatores biológicos, incluindo o fator de crescimento semelhante à insulina- I (IGF-I). Dessa forma, os objetivos gerais desta proposta foram caracterizar as alterações celulares e de desenvolvimento induzidas pela temperatura elevada em oócitos na fase de VG e avaliar o papel termoprotetor do IGF-I neste contexto. Para tanto, os experimentos 1 e 2 visaram estabelecer o modelo de bloqueio meiótico in vitro. No primeiro experimento foram avaliadas concentrações crescentes (50; 75; 100; 150 e 200 μM) do bloqueador meiótico roscovitina. A porcentagem de oócitos em VG (taxa de bloqueio meiótico) foi baixa em todas as doses de roscovitina testadas. No segundo experimento foram avaliadas diferentes concentrações de butirolactona (0; 12,5; 25; 50 e 100 μM) em meio de inibição meiótica contendo 0 ou 3 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) na porcentagem de oócitos em VG e na porcentagem de oócitos em metáfase II (taxa de reversão do bloqueio meiótico após a maturação in vitro). A eficiência do bloqueio meiótico foi alta para todas as doses de butirolactona avaliadas, exceto 12,5 μM de butirolactona com BSA. De maneira similar, a porcentagem de oócitos em MII foi alta para todos os tratamentos, exceto para dose de 100 μM de butirolactona sem BSA, indicando possível efeito tóxico desta concentração. Com base nestes resultados o modelo de inibição meiótica utilizado para todos os demais experimentos fez uso... / Maternal heat stress compromises fertility of lactating dairy cows. Germinal vesicle stage (GV) and mature oocytes are susceptible to deleterious effects of maternal heat stress. However, the cellular mechanisms triggered by elevated temperature are not well known. The cellular damage induced by heat stress can be manipulated by a wide range of biological factors, such as insulin-like growth factor-I (IGF-I). Therefore, overall objectives of this proposal were to characterize cellular and developmental changes induced by elevated temperature on GV oocytes and evaluate the role of IGF-I in this context. Experiments 1 and 2 aimed to establish an in vitro meiotic arrest model. The first study evaluated the effect of increasing concentrations (50, 75, 100, 150 and 200 μM) of the meiotic inhibitor roscovitine. The percentage of GV oocytes (rate of meiotic arrest) was low at all roscovitine doses tested. In the second experiment different butyrolactoneconcentrations (0, 12.5, 25, 50 and 100 uM) were evaluated in meiotic inhibition medium containing 0 or 3 mg/mL bovine serum albumin (BSA) in percentage of GV oocytes and percentage of metaphase II oocytes (rate of meiotic arrest reversibly after in vitro maturation). Meiotic arrest efficiency was high for all butyrolactone doses tested, except 12.5 μM butyrolactone with BSA. Similarly, the percentage of MII oocytes was high for all doses, except for 100 μM butyrolactone without BSA, indicating a possible toxic effect of this concentration. Based on these results the meiotic arrest model used for all subsequent experiments used 12.5 μM butyrolactone in the absence of BSA. The third experiment evaluated the effect of various IGF-I concentrations (0, 12.5, 25, 50 and 100 ng/ml) on heat-induced DNA fragmentation on GV oocyte. In the absence of IGF-I, heat shock of 41°C for 14 hours increased... (Complete abstract click electronic access below)

Resumo: No presente estudo, foi avaliada a ação da Somatrotopina Bovina (bST) sobre a superovulação nas fêmeas bovinas, bem como seus efeitos sobre a produção e o desenvolvimento embrionário. Para o estudo foram utilizadas (n=8) novilhas Blonde d'Aquitaine, que foram superovuladas duas vezes como grupo controle, ou seja, sem bST e duas vezes como grupo tratamento com bST, totalizando 32 colheitas, sendo 16 para cada delineamento experimental. A análise dos resultados teve como objetivo avaliar a produção de embriões totais, viáveis, degenerados e infertilizados, além das diferenças entre os estádios de desenvolvimento embrionário e a manifestação de estro pelas doadoras superovuladas. Foram evidenciadas diferenças significativas (p<0,05) para a produção de embriões totais e viáveis, mas não se encontrou diferença significativa entre os embriões degenerados ou infertilizados. Para os estágios de desenvolvimento embrionário, observou-se diferença significativa na proporção de mórula, blastocisto inicial e blastocisto. A manifestação de cio pelas doadoras foi 100% nos dois tratamentos, Palavras-chave: somatotropina, superovulação, transferência de embriões, vacas