Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1996. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [142-157]).

Curling är unik i avseendet att man kan påverka stenens bana efter att den släppts av spelaren. Beroende på trycket (Kg) och frekvensen (soptag/min) man kan applicera under sopmoment påverkas stenen olika mycket. Syftet med studien är att undersöka om curlingspelare med greppsula är mer uthålliga beträffande trycket och frekvensen vid sopning under flera stenar jämfört med curlingspelare som sopar med glidsula. Studien är en experimentellundersökning med två grupper och urvalet bestod av 17 män, 16–23 år, som spelade curling i någon av de två högsta serierna i Sverige. Undersökningsdeltagarna sopade tre stenar i följd under 15 sekunder med 50 sekunders vila mellan varje sten. Utrustningen som användes var mätinstrumentet (Broom-Mate), pulsklockan (Pm25, Beurer: Tyskland) och (Borg-Rpe-skalan). Resultatet från studien tyder på att det inte finns några signifikanta skillnader mellan att sopa med greppsula eller glidsula gällande förmågan att applicera och bibehålla trycket och frekvensen under tre sopade stenar. / Curling is unique in the way that you can affect the path of the curling rock after it´s been released. Depending on the amount of force (Kg) and frequency (strokes/min) of the sweeping motion it affects the path differently. The purpose of this study is to exam if curling players sweeping with gripper on are better regarding sustaining their force and frequency sweeping multiple stones compared to curling players sweeping with sliders on. The report is an experimental study with two groups. The selection consisted of 17 men, aged 16-23 years, regularly playing in one of the two top leagues in Sweden. The participants swept three stones in a row during 15 seconds with 50 seconds rest in between the stones. Equipment used during the collection of data were the (Broom-mate), heartrate monitor (Pm25, Beurer: Germany) and (Borg-RPE-scale). The results from the report suggest that there´s no significant difference between sweeping with gripper or slider on, regarding the ability to apply and sustain their force and frequency during three rounds of sweeping.

International Telemetering Conference Proceedings / October 25-28, 1999 / Riviera Hotel and Convention Center, Las Vegas, Nevada / A high performance lossy data compression technique is currently being developed for space science applications under the requirement of high-speed push-broom scanning. The technique is also error-resilient in that error propagation is contained within a few scan lines. The algorithm is based on block-transform combined with bit-plane encoding; this combination results in an embedded bit string with exactly the desirable compression rate. The lossy coder is described. The compression scheme performs well on a suite of test images typical of images from spacecraft instruments. Hardware implementations are in development; a functional chip set is expected by the end of 2000.

O fungo fitopatogênico hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, causador da doença Vassoura-de-Bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao), é um dos maiores responsáveis pela contribuição do declínio da produção brasileira de cacau e constitui um problema fitopatológico em todas as regiões cacauicultoras. O gênero Solanum, do qual faz parte o tomate, berinjela, batata entre outros, é bem conhecido na literatura por conterem compostos que exibem atividade biológica tais como antifúngica, antiviral, moluscida, anticancerígena entre outras. O presente trabalho explorou o potencial de extrato bruto de folhas de Solanum lycopersicum como agente inibidor no controle de crescimento e desenvolvimento de três biotipos de M. perniciosa (cacau, solanácea e liana). Através de ensaios biológicos e métodos cromatográficos foi identificado o metabólito secundário -tomatina como responsável pela atividade antifúngica. Este glicoalcalóide, que apresentou potente atividade antifúngica em ensaios in vitro, foi utilizado como agente de controle no desenvolvimento do fungo e manifestação dos sintomas em plantas in vivo, onde foi verificado uma redução significativa no número de plantas com sintomas. / The hemibiotrophic phytopathogenic fungi Moniliophthora perniciosa, agent of witches broom disease of cocoa (Theobroma cacao) is one of the major responsible for the Brazilian cocoa production decay and it is a phytopathological problem in every cocoa yield area. Solanum genera, from each belongs tomatoes, eggplants, potatoes, among others, is well known as producer of biological activity such as antifungal, antiviral, anti mollus, anticancer, etc. This study explored the potential of crude extract leaves from Solanum lycopersicum as an inhibitor agent for the control of growing and development of three M. perniciosa biotypes. By the use of biological assays and chromatography, -tomatine, a secondary metabolite was identified as responsible for antifungal activity. This glycoalcaloid presented great antifungal activity on in vitro assays and it was used on the control and development of witches broom symptoms in vivo, where a significant reduction of symptomatic plants could be observed.

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo

O fungo fitopatogênico hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, causador da doença Vassoura-de-Bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao), é um dos maiores responsáveis pela contribuição do declínio da produção brasileira de cacau e constitui um problema fitopatológico em todas as regiões cacauicultoras. O gênero Solanum, do qual faz parte o tomate, berinjela, batata entre outros, é bem conhecido na literatura por conterem compostos que exibem atividade biológica tais como antifúngica, antiviral, moluscida, anticancerígena entre outras. O presente trabalho explorou o potencial de extrato bruto de folhas de Solanum lycopersicum como agente inibidor no controle de crescimento e desenvolvimento de três biotipos de M. perniciosa (cacau, solanácea e liana). Através de ensaios biológicos e métodos cromatográficos foi identificado o metabólito secundário -tomatina como responsável pela atividade antifúngica. Este glicoalcalóide, que apresentou potente atividade antifúngica em ensaios in vitro, foi utilizado como agente de controle no desenvolvimento do fungo e manifestação dos sintomas em plantas in vivo, onde foi verificado uma redução significativa no número de plantas com sintomas. / The hemibiotrophic phytopathogenic fungi Moniliophthora perniciosa, agent of witches broom disease of cocoa (Theobroma cacao) is one of the major responsible for the Brazilian cocoa production decay and it is a phytopathological problem in every cocoa yield area. Solanum genera, from each belongs tomatoes, eggplants, potatoes, among others, is well known as producer of biological activity such as antifungal, antiviral, anti mollus, anticancer, etc. This study explored the potential of crude extract leaves from Solanum lycopersicum as an inhibitor agent for the control of growing and development of three M. perniciosa biotypes. By the use of biological assays and chromatography, -tomatine, a secondary metabolite was identified as responsible for antifungal activity. This glycoalcaloid presented great antifungal activity on in vitro assays and it was used on the control and development of witches broom symptoms in vivo, where a significant reduction of symptomatic plants could be observed.

A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.), causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa consiste numa importante enfermidade e apenas o uso de variedades resistentes representa uma solução econômica e ambientalmente viável. Os hormônios vegetais são imprescindíveis na rede de sinalização envolvida na resposta contra uma grande variedade de estresses bióticos e abióticos, sendo bem reconhecido o papel crucial do ácido salicílico (AS), etileno (ET) e os jasmonatos (JA) na interação planta-patógeno. O mecanismo de resistência observado em T. cacao contra o fungo hemibiotrófico M. perniciosa parece não envolver resposta de hipersensibilidade mediada pela sinalização por AS, e caracteriza-se pela menor incidência de sintomas e atenuação do crescimento micelial no material resistente. A resposta regulada por JA e/ou ET é determinada pela contenção e redução da colonização de tecidos infectados pelo patógeno, com atenuação dos sintomas manifestados, e está associada com a indução e produção de inibidores de protease, enzimas líticas da parede de fungos e enzimas do metabolismo secundário e cujo os genes demonstraram indução diferencial em amostras inoculadas com M. perniciosa. Recentemente, foi demonstrada a produção de AS pelo fungo M. perniciosa, o que poderia estar associado a um desarranjo hormonal na planta, auxiliando o pátogeno no processo infectivo. A partir destas evidências este trabalho teve como hipótese que JA e/ou ET estaria regulando a interação T. cacao e M. perniciosa. Sabe-se que a transcrição de genes codificantes das enzimas da via de biossíntese de JA é induzida por aplicação exógena de metil-jasmonato (MJ) e por patógenos, assim para verificar a participação de JA na resposta de defesa de cacau, seqüências de genes que codificam para enzimas da via de biossíntese foram identificadas, classificadas e confirmados sua identidade por seqüenciamento. A indução e expressão quantitativa destes, além dos genes Samsi, Accox, Pal, Jaz e Della, foram avaliadas entre o acesso susceptível à M. perniciosa (\'P7\') e o resistente (\'CAB 214\') de T. cacao, em experimentos de aplicação de indutores (AS, ET e MJ) e inoculação com M. perniciosa. As análises de expressão gênica relativa por RT-qPCR foram conduzidas e a resposta dos genes de biossíntese de JA, quando tratado com MJ no \'P7\' pareceu ser mais intensa e mais específica, enquanto que o acesso \'CAB 214\' apresentou resposta com menor intensidade, porém com resposta mais precoce, demonstrando que o mecanismo de regulação positiva pela aplicação exógena de MJ também ocorre em T. cacao. Em relação à inoculação, os resultados de expressão gênica sugerem uma diferença na resposta transcricional dos genes analisados sob inoculação de M. perniciosa entre o \'P7\' e o \'CAB 214\' onde os transcritos de Aos, Kat, Samsi e Jaz apresentaram elevação significativa somente no \'CAB 214\' em comparação ao \'P7\'. Em acessos resistentes, como \'CAB 214\', o efeito de AS produzido pelo fungo poderia não estar surtindo efeitos antagônicos, como indicado pelo aumento transcricional de Aos, gene codificador da principal enzima envolvida na biossíntese de JA, e embora os demais genes da via estejam sendo reprimidos, muito possivelmente a sinalização da resposta de defesa do acesso resistente \'CAB 214\' seja desencadeada por JA, devido ao papel central de AOS na sua biossíntese, e de maneira sinérgica ET estaria participando do mecanismo de resposta, indicado pela alta indução de Samsi no acesso resistente / Witches broom disease of cacao (Theobroma cacao L.), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa is an important disease and the use of resistant varieties is the only economic and environmental long-term solution. Plant hormones are essential in the signaling network involved in the response against a variety of biotic and abiotic stresses. It is well recognized the crucial role of salicylic acid (SA), ethylene (ET) and jasmonate (JA) in plant-pathogen interactions. The mechanism of resistance observed in Theobroma cacao against M. perniciosa does not appear to involve hypersensitivity response mediated by AS signaling, and it is characterized by lower incidence of symptoms and reduction of mycelial growth in resistant material. The response regulated by JA and/or ET is determined by the growth inhibition and a reduction of the colonization of infected tissues by the pathogen, together with an attenuation of symptoms. It is also associated with an induction and production of the protease inhibitors, lytic enzymes and enzymes of secondary metabolism and the genes enconding these enzymes have shown differential expression patterns in samples inoculated with M. perniciosa. It has been recently demonstrated that the production of AS by the fungus M. perniciosa could be associated with a hormonal disorder in the plant, which could therefore help the pathogen in the infective process. Considering this, the hypothesis that JA and/or ET would regulate the interaction of T. cacao with M. perniciosa was formulated in order to be tested by this research work. It is known that the transcription of genes encoding the enzymes of the JA biosynthesis pathway is induced by exogenous application of methyl jasmonate (MJ) and by pathogen, thus, in order to verify the involvement of JA in defense response of cocoa, sequences of genes that encode the enzymes of the JA biosynthesis pathway were isolated, identified, classified and had their identity confirmed by sequencing, and relative quantitative gene expression were evaluated in susceptible \'P7\' and resistant \'CAB 214\' plants of T. cacao. In addition genes Sams, Accox, Pal , Jaz and Della, were evaluated in experiments with application of inducers (AS, ET and MJ) and inoculation with M. perniciosa. Analysis of relative gene expression by RT-qPCR were conducted and \'P7\' seems to have the expression of jasmonate biosynthesis genes in a more intense and more specific manner when treated with MJ, while \'CAB 214\' shows an earlier yet lower response suggesting that the mechanism of positive regulation by the exogenous application of MJ also occurs in T. cacao. For the inoculation, the gene expression results suggest a difference in the transcriptional response from inoculation with M. perniciosa between \'P7\' and \'CAB 214\' in T. cacao. The effect of AS produced by the fungus may not have antagonistic effects in resistant materials such as \'CAB 214\', as indicated by the increase of the transcription of Aos gene that encodes the main enzyme involved in JA biosynthesis, so the defense responses of \'CAB 214\' is possibly triggered by JA signaling, because the central role of AOS in its biosynthesis, and may be part of synergistic ET signaling, indicated by high Samsi expression in resistance material

En av park- och gatuarbetarnas många verktyg, är den traditionella sopkvasten. Sopkvasten används för att städa upp ytor där maskiner inte kommer åt, såsom; under bänkar, i hörn och mindre områden. Vid användning av en traditionell sopkvast innefattar rörelsen rotation och framåtlutning av kroppsställningen, som kan om den utförs under en längre tidsperiod leda till muskuloskeletala besvär och ha negativa effekter på hälsan. Detta projekt syftar till att utveckla ett nytt rengöringsverktyg för att minska framåtlutad, roterad kroppsställning. Denna avhandling har använt en produktutvecklingsmetodik och en biomekanisk analys för att uppfylla en faktabas för att nå målet. Översyn av litteratur, biomekanisk analys och benchmarking användes för att ställa in kravspecifikationer för detta projekt. Projektet tillämpade David G Ullman iterativ produktutvecklingsmetodik, inklusive brainstorming, Quality Function Deployment, Morfologi, Pugh's matris och Failure Mode Effects Analysis. Vidare har en fungerande prototyp byggts som ett sista steg i utvecklingsfasen. Utvärdering av prototypen i jämförelse med den traditionella sopkvasten, utfördes med hjälp av 3D rörelseanalys (Qualisys motion capture-system) och ytelektromyografi (Mega 8-kanalsystem) på en testperson. Projektet resulterade i en fysiskt fungerande prototyp som kan användas till liknande uppgifter som en traditionell sopkvast. Prototypen påtvingar användaren att skjuta rengöringsverktyget framför kroppen med en symmetrisk kroppställning i alla tre planen. Jämförelsen mellan en traditionell sopkvast och prototypen visade en minskning i muskelaktivitet vid användning av prototypen. Dessutom visade rörelseanalysen att arbetsställningen var mindre framåtlutad och roterad i ryggen. Vidare kunde testpersonen hålla neutrala vinklar i axlar och handleder under hela utförandet av uppgiften. Märk väl att de biomekaniska analyserna enbart gjorts på en deltagare vilket inte är tillräckligt för att konstatera att prototypen bidrar till en mer hälsosam arbetsställning. / One of the park and street workers many tools, is the traditional broom. The broom is used to tidy up surfaces where machines can’t reach, such as; underneath benches, in corners and smaller areas. Using a traditional broom requires a twisted and forward leaning body posture that, if performed during an extended time period, can result in musculoskeletal problems and negative impact on the health. This project aimed to develop a new cleaning tool to reduce the forward-leaning, twisted body posture. This thesis used a product development methodology and a biomechanical analysis to fulfil, and evidence base the aim. Review of the literature, biomechanical analysis and benchmarking were used to set requirement specifications for this project. The project applied David G Ullman's iterative product development methodology, including brainstorming, quality function deployment, morphology, Pugh´s matrix and a failure mode effects analysis. Furthermore, a functional prototype was built as a last step of the development phase. Evaluation of the prototype, in comparison to the traditional broom, was performed using 3D movement analysis (Qualisys motion capture system) and surface electromyography (Mega 8 channel system) on one test person. The project resulted in a physically functional prototype that can be used for similar tasks as a traditional broom. The concept design dictates the user to push the cleaning tool in front of the body with postural symmetry in all three planes. The comparison between a traditional broom and the prototype showed a reduction in muscle activity when using the prototype. Furthermore, the movement analysis showed a working posture with less forward leaning and back rotation. Furthermore, the participant could keep neutral angles in the shoulders and wrists throughout the task. Note that, the biomechanical analyzes was only made on one test person which is not enough to conclude that the prototype contributes to a more healthy working posture.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T14:19:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 786589 bytes, checksum: eb63aec8e42b5ea4321e4a66b75765e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T14:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 786589 bytes, checksum: eb63aec8e42b5ea4321e4a66b75765e1 (MD5) Previous issue date: 2003-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho abordou a transformação genética em C. perniciosa, fungo causador da vassoura-de-bruxa no cacaueiro, investigando os fatores que podem influenciar a eficiência de transformação neste organismo, bem como a forma de integração do vetor no genoma do fungo. A transformação dos protoplastos foi realizada pelo método químico do PEG/CaCl 2 e a seleção dos transformantes foi feita com base na resistência à higromicina B. A eficiência de transformação foi analisada em função do promotor utilizado para expressar o gene marcador (se proveniente de basidiomiceto ou de ascomiceto), da forma do vetor (circular ou linear) e da presença de inibidores de nuclease (ácido aurintricarboxílico, putrecina e espermidina) na mistura de transformação. A técnica REMI (restriction enzyme mediated integration) foi realizada utilizando a enzima de restrição BamHI. Também foi construído um vetor contendo o gene que confere resistência à higromicina B (hph) sob o comando do promotor do gene gpd de Agaricus bisporus, para experimentos futuros de mutagênese insercional. A utilização do promotor gpd de Agaricus bisporus resultou em uma eficiência de transformação cinco vezes superior àquela obtida quando o promoter gpd de Aspergillus nidulans foi utilizado. Além disso, os transformantes desenvolveram- se mais rapidamente, com redução do tempo necessário para visualização das colônias nas placas em comparação aos transformantes que continham o gene hph sob o controle do promotor gpd Aspergillus. Os inibidores de nucleases putrecina e ATA (ácido aurintricarboxílico) reduziram a eficiência de transformação nas condições utilizadas, enquanto que a presença de espermidina não exerceu influência quando comparado ao controle. A linearização do vetor não influenciou a eficiência de transformação e todos os transformantes resultantes desse tratamento que foram analisados por hibridização apresentaram um padrão complexo de integração, com duas ou mais cópias do plasmídeo inseridas em posições distintas no genoma. A mais elevada eficiência de transformação foi obtida com REMI, utilizando-se 10U da enzima de restrição BamHI e 10 μg do vetor na forma circular. Nesta condição, foram obtidos cerca de 64 transformantes/μg de plasmídeo, cerca de três vezes mais transformantes que o tratamento onde BamHI não esteve presente. Não foi verificada a influência da enzima de restrição promovendo a obtenção de transformantes com uma única cópia do vetor integrada. Os transformantes mostraram alto nível de resistência à higromicina (>500 μg/mL). Dos transformantes analisados quanto à estabilidade mitótica, 100% conservaram-se resistentes após a passagem por meio não seletivo durante 40 dias. / The present work has investigated the different conditions that may influence the transformation efficiency and the way transforming DNA integrates into the genome of the fungus Crinipellis perniciosa, the causal agent of the witches' broom disease of cacao. Protoplast transformation was done by the PEG/CaCl 2 method. Transformant colonies were selected for resistance to hygromycin B. The transformation efficiency was related to the type of promoter used to express the hph gene (either from an ascomycete or from a basidiomycete fungus), vector shape (linear or circular forms), and the presence of nuclease inhibitors (aurintricarboxylic acid, putrescine or spermidine) in the transformation mix. The REMI (restriction enzyme-mediated integration) technique was employed using BamHI. For future experiments of insertional mutagenesis, a plasmid containing the hph gene controlled by the gpd gene from Agaricus bisporus was constructed. The use of the gpd promoter from Agaricus bisporus resulted in a five-fold increase in transformation efficiency compared to that obtained with the gpd promoter from Aspergillus nidulans. In addition, these transformants showed faster growth than those containing gpd from Aspergillus. Putrescine and ATA (aurintricarboxylic acid) decreased the transformation efficiency, while spermidine did not have any influence in comparison to the control. Vector linearization was not effective and a complex pattern of plasmid integrations resulted from this procedure, with two or more copies integrated throughout the genome. The highest efficiency was obtained with REMI (10U of BamHI added prior to transformation with 10 μg of circular vector). An efficiency of 64 transformants/μg of plasmid was obtained in this treatment. Under the analyzed conditions, BamHI did not induce single copy integrations in Crinipellis perniciosa, although an approximate three-fold increase in the transformation efficiency was obtained. The transformants were highly resistant to hygromycin (> 500 μg/mL). All transformants analyzed were mitotically stable after successive transfers to nonselective media for 40 days.

A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.), causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa consiste numa importante enfermidade e apenas o uso de variedades resistentes representa uma solução econômica e ambientalmente viável. Os hormônios vegetais são imprescindíveis na rede de sinalização envolvida na resposta contra uma grande variedade de estresses bióticos e abióticos, sendo bem reconhecido o papel crucial do ácido salicílico (AS), etileno (ET) e os jasmonatos (JA) na interação planta-patógeno. O mecanismo de resistência observado em T. cacao contra o fungo hemibiotrófico M. perniciosa parece não envolver resposta de hipersensibilidade mediada pela sinalização por AS, e caracteriza-se pela menor incidência de sintomas e atenuação do crescimento micelial no material resistente. A resposta regulada por JA e/ou ET é determinada pela contenção e redução da colonização de tecidos infectados pelo patógeno, com atenuação dos sintomas manifestados, e está associada com a indução e produção de inibidores de protease, enzimas líticas da parede de fungos e enzimas do metabolismo secundário e cujo os genes demonstraram indução diferencial em amostras inoculadas com M. perniciosa. Recentemente, foi demonstrada a produção de AS pelo fungo M. perniciosa, o que poderia estar associado a um desarranjo hormonal na planta, auxiliando o pátogeno no processo infectivo. A partir destas evidências este trabalho teve como hipótese que JA e/ou ET estaria regulando a interação T. cacao e M. perniciosa. Sabe-se que a transcrição de genes codificantes das enzimas da via de biossíntese de JA é induzida por aplicação exógena de metil-jasmonato (MJ) e por patógenos, assim para verificar a participação de JA na resposta de defesa de cacau, seqüências de genes que codificam para enzimas da via de biossíntese foram identificadas, classificadas e confirmados sua identidade por seqüenciamento. A indução e expressão quantitativa destes, além dos genes Samsi, Accox, Pal, Jaz e Della, foram avaliadas entre o acesso susceptível à M. perniciosa (\'P7\') e o resistente (\'CAB 214\') de T. cacao, em experimentos de aplicação de indutores (AS, ET e MJ) e inoculação com M. perniciosa. As análises de expressão gênica relativa por RT-qPCR foram conduzidas e a resposta dos genes de biossíntese de JA, quando tratado com MJ no \'P7\' pareceu ser mais intensa e mais específica, enquanto que o acesso \'CAB 214\' apresentou resposta com menor intensidade, porém com resposta mais precoce, demonstrando que o mecanismo de regulação positiva pela aplicação exógena de MJ também ocorre em T. cacao. Em relação à inoculação, os resultados de expressão gênica sugerem uma diferença na resposta transcricional dos genes analisados sob inoculação de M. perniciosa entre o \'P7\' e o \'CAB 214\' onde os transcritos de Aos, Kat, Samsi e Jaz apresentaram elevação significativa somente no \'CAB 214\' em comparação ao \'P7\'. Em acessos resistentes, como \'CAB 214\', o efeito de AS produzido pelo fungo poderia não estar surtindo efeitos antagônicos, como indicado pelo aumento transcricional de Aos, gene codificador da principal enzima envolvida na biossíntese de JA, e embora os demais genes da via estejam sendo reprimidos, muito possivelmente a sinalização da resposta de defesa do acesso resistente \'CAB 214\' seja desencadeada por JA, devido ao papel central de AOS na sua biossíntese, e de maneira sinérgica ET estaria participando do mecanismo de resposta, indicado pela alta indução de Samsi no acesso resistente / Witches broom disease of cacao (Theobroma cacao L.), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa is an important disease and the use of resistant varieties is the only economic and environmental long-term solution. Plant hormones are essential in the signaling network involved in the response against a variety of biotic and abiotic stresses. It is well recognized the crucial role of salicylic acid (SA), ethylene (ET) and jasmonate (JA) in plant-pathogen interactions. The mechanism of resistance observed in Theobroma cacao against M. perniciosa does not appear to involve hypersensitivity response mediated by AS signaling, and it is characterized by lower incidence of symptoms and reduction of mycelial growth in resistant material. The response regulated by JA and/or ET is determined by the growth inhibition and a reduction of the colonization of infected tissues by the pathogen, together with an attenuation of symptoms. It is also associated with an induction and production of the protease inhibitors, lytic enzymes and enzymes of secondary metabolism and the genes enconding these enzymes have shown differential expression patterns in samples inoculated with M. perniciosa. It has been recently demonstrated that the production of AS by the fungus M. perniciosa could be associated with a hormonal disorder in the plant, which could therefore help the pathogen in the infective process. Considering this, the hypothesis that JA and/or ET would regulate the interaction of T. cacao with M. perniciosa was formulated in order to be tested by this research work. It is known that the transcription of genes encoding the enzymes of the JA biosynthesis pathway is induced by exogenous application of methyl jasmonate (MJ) and by pathogen, thus, in order to verify the involvement of JA in defense response of cocoa, sequences of genes that encode the enzymes of the JA biosynthesis pathway were isolated, identified, classified and had their identity confirmed by sequencing, and relative quantitative gene expression were evaluated in susceptible \'P7\' and resistant \'CAB 214\' plants of T. cacao. In addition genes Sams, Accox, Pal , Jaz and Della, were evaluated in experiments with application of inducers (AS, ET and MJ) and inoculation with M. perniciosa. Analysis of relative gene expression by RT-qPCR were conducted and \'P7\' seems to have the expression of jasmonate biosynthesis genes in a more intense and more specific manner when treated with MJ, while \'CAB 214\' shows an earlier yet lower response suggesting that the mechanism of positive regulation by the exogenous application of MJ also occurs in T. cacao. For the inoculation, the gene expression results suggest a difference in the transcriptional response from inoculation with M. perniciosa between \'P7\' and \'CAB 214\' in T. cacao. The effect of AS produced by the fungus may not have antagonistic effects in resistant materials such as \'CAB 214\', as indicated by the increase of the transcription of Aos gene that encodes the main enzyme involved in JA biosynthesis, so the defense responses of \'CAB 214\' is possibly triggered by JA signaling, because the central role of AOS in its biosynthesis, and may be part of synergistic ET signaling, indicated by high Samsi expression in resistance material