Orientadores: Lucila Costallat Ricci, Maria Jose Soares Mendes-Giannini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T18:45:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Uemura_MarciaAkemi_M.pdf: 9642195 bytes, checksum: e7486d439dee261adb01b7891294c0d5 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: O Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), fungo dimórfico, é o agente etiológico de micose sistêmica, a paracoccidioidomicose (PCM). Esta doença, invasiva no homem, é endêmica na América Latina, principalmente no Brasil, Venezuela e Colombia. Os mecanismos de patogenicidade deste fungo ainda não estão bem esclarecidos, porém, existem indícios de que a constituição da parede celular e a produção de antígenos solúveis, como a glicoproteína de 43 kDa (gp43), sejam fatores de virulência responsáveis pelo seu estabelecimento no hospedeiro. Neste sentido, foram realizados estudos in vitro para avaliar possíveis mecanismos e fatores de virulência envolvendo adesão e invasão celular. No presente trabalho, foi analisado o processo de infecção de cinco diferentes cepas do P. brasiliensis em células HeLa (adenocarcinoma cervical humano) e revelados por diferentes técnicas de coloração (May-Grünwald/Giemsa, PAS e Imunofluorescência Indireta). Através de observações em microscopia óptica destas preparações, verificouse que todas as cepas aderiram e invadiram as células em cultura. Em provas imunoenzimáticas, observou-se diferenças quanto a concentração de células fúngicas aderidas às células HeLa. Desta forma, a cepa Pb18 apresentou maior índice de adesão, seguida pelas cepas Pb113 e Pb265. Estes dados apresentam concordância aos diferentes graus de patogenicidade, já descritos na literatura, para estas cepas em experimentos in vivo. Ainda por esta metodologia, foi analisada a inibição da adesão do fungo através de tratamento prévio com diferentes soros imunes (anti-gp43 e "pool" de soros de pacientes com PCM). Dentre estes soros, o tratamento com o "pool" de soros de pacientes apresentou maior índice de inibição da adesão do P. brasiliensis em células HeLa. Ainda pela técnica de contagem de unidades formadoras de colonias (ufc) foi constatada a viabilidade das células fúngicas intracelulares. Estudos complementares foram realizados através de observações em Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), onde foram observadas avaliação do processo de infecção. Nesta abordagem, foi verificada uma provável sequência de infecção do P. brasiliensis às células HeLa. Devido a presença de formas intracelulares não usuais deste agente, apresentando-se como protoplastos, a utilização da técnica de "immunegold" foi conclusiva na comprovação do processo de adesão e invasão celular deste importante patógeno do nosso meio / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Maria Silvia Viccari Gatti, Antonio Fernando Pestana de Castro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T12:11:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_AngelaBonifacioBarbosade_M.pdf: 5173818 bytes, checksum: 01ef420d430ad90980e8c98866b3fd56 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Porphyromonas gingivalis é um dos agentes etiológicos envolvidos na periodontite. Os objetivos do trabalho foram isolar P. gingivaBs da bolsa periodontal de pacientes com periodontite, identificá-la por métodos tradicionais e através de PCR, realizando com essas amostras testes de adesão e invado, inibição desses fen6menos em células epiteHais KB com soros humano e fetal bovino, além de açúcares (D-manose, D-manosamina, N-acetil-galactosamina, D-galactosamina, N-acetil-galatosamina e a-D-fucose). O microrganismo foi isolado de pacientes com doença periodontal e sua identificaçlo foi realizada com os testes de produçlo de pigmento escuro em ágar sangue, coloração de Gram, crescimento sob atmosfera anaeróbia, aglutinação de eritrócitos de carneiro e reação em cadeia da polimerase (PCR). Quatro amostras de Porphyromonas gingivalis isoladas dos pacientes foram testadas no PCR, sendo que uma delas não apresentou 8 seqüência gênica para a fimbria característica. Após a identificação, a amostra padrão ATCC 33277 e duas amostras positivas.também em PCR, foram testadas em células KB para a verificação de sua capacidade de adesão e invasão, utilizando-se para a visualiZaçAo dos testes a coloração de Kinyon e também a reação de imunoperoxidase, com anti-soro produzido em coelhos albinos, a partir da inoculação da amostra padrão inativada. Todas as amostras testadas foram capazes de aderir e Invadir células e essa capacidade foi inibida com o pré-tratamento das células com soro humano e soro fetal bovino. A aglutinação também foi inibida quando as hemácias foram tratadas da mesma forma. o mesmo não ocorrendo quando as bactérias foram tratadas com os soros e quando os açúcares foram testados, tanto nas células como nas bactérias. O sobrenadante da cultura de P. gingivalis foi testado sobre as monocamadas celulares e verificou-se a destruição celular / Abstract: Porphyromonas gingivalis, a gram negative anaerobic bacterium, is one of the etiological agents responsible for periodontitis and produces a variety of virulence factors. The aim of this study was not on1y to isolate and identify P. gingivalisfrom periodontal pocket ar periodontitis patients using traditional and PCR methodologies, but aJso to observe their process of adhesion and invasion on epithelial cells (ephidermoid, carcinoma, oral, HeLa markers - KB). We studied also the capability of human and calf sera anel several kinds of sugars to impair cellular adhesion and invasion. The pathogen was isolated from patients with periodontal disease and its identification was performed by dark pigment production on blood agar. Gram staining, growth under anaerobic atmosphere, sheep blood agglutination tests and polymerase chain reaction (PCR). Four colonies of The isolates were tested by PCR for the fimbriae of this pathogen. One of them did not present the genomic sequenc8 for the fimbriae of the bacteria / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:32:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peixoto_ElisaBoucadaMauroInacio_M.pdf: 4690936 bytes, checksum: 83dc2cec84d0956920cafa3104250eed (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

Orientador: João Alberto Negrão / Banca: Luis Felipe Prada e Silva / Banca: Lenira El Faro Zadra / Banca: Kênia Cardoso Bícego / Banca; Márcia Helena Machado da Rocha Fernandes / Resumo: O aumento da produção leiteira no início de lactação depende do número e capacidade de síntese das células epiteliais mamárias. Porém, alguns estudos indicam que a partir do pico da lactação, o processo de apoptose das células mamárias aumentam gradualmente até o final da lactação, reduzindo progressivamente o número de células epiteliais bem como sua capacidade de síntese de leite. Alguns estudos sugerem que as alterações metabólicas causadas pelo estresse durante a lactação, podem via ação do cortisol, intensificar o processo de apoptose na glândula mamária.Inicialmente presumimos que o cortisol reduz a liberação de IGF-1 (que tem sido visto como hormônio anti-apoptótico, prolongando assim a lactação) e acelera o processo apoptose das células epiteliais. Neste contexto, o estudo da liberação do cortisol e sua relação com o IGF-1 são ferramentas importantes para avaliar o efeito do estresse na apoptose das células mamárias durante a lactação. Ao estudar via respostas zootécnicas e fisiológicas a associação entre o cortisol e IGF-1 será possível entender as relações entre a apoptose e proliferação celular durante a lactação. Utilizando como modelo experimental cabras Saanen em lactação, esse projeto propõe estudar se o aumento de cortisol reduz a liberação de IGF-1 acelerando a apoptose das células epiteliais bem como, se o IGF-1 realmente possui efeito anti-apoptótico nas células epiteliais.Os estudos foram realizadosin vivo(Experimento I) e in vitro (Experimento II). Para t... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The increase in milk production in early lactation depends on the number and capacity of synthesis of mammary epithelial cells. However, some studies indicate that from the peak of lactation the process of apoptosis of mammalian cells gradually increases until the end of the same progressively reducing the number of epithelial cells as well as their milk synthesis capability. Some studies suggest that the metabolic alterations caused by stress during lactation can via cortisol action to intensify the process of apoptosis in mammary gland. At first, we assume that cortisol reduces the release of IGF-1 (which has beenseen as antiapoptotic hormone, thus prolonging lactation) and accelerates the apoptosis of epithelial cells. In this context, the study of the release of cortisol and its relationship with the IGF-1 are important tools to evaluate the effect of stress on apoptosis of mammalian cells during lactation. By studying via zootechnical and physiological responses to the association between cortisol and IGF-1, it will be possible to understand the relationship between apoptosis and cell proliferation during lactation. Using an experimental Saanen goats lactating model, this project proposes to study the increase of cortisol reduces the release of IGF-1 accelerating the apoptosis of epithelial cells as well as IGF-1 actually has anti-apoptotic effect on epithelial cells, studies will be conducted in vivo (Experiment I) and in vitro (Experiment II). Therefore, the experimental goats will bechalleng via exogenous administration of ACTH (standard physiological stress) / Doutor

Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição patológica que acomete os homens na senescência e está presente em 50% da população masculina, com cerca de 85 anos de idade. Os hormônios androgênicos atuam na próstata provendo sua diferenciação, crescimento e funcionalidade, sendo este efeito mediado pela ligação do hormônio com o receptor de androgênios (AR) e pela a ativação de genesalvo. O equilíbrio entre apoptose e proliferação celular é mantido por uma série de genes modulados pelos androgênios que estão implicados no controle do ciclo celular. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares mediados por androgênio que possam estar envolvidos no descontrole proliferativo do epitélio prostático que ocorre durante a senescência. As células epiteliais prostáticas humanas não- transformadas derivadas de HPB (HNTEP) foram cultivadas e incubadas com diferentes concentrações de diidrotestosterona (DHT) e com o antiandrogênio hidroxiflutamida (OH-FLU). Uma baixa concentração de DHT (10-13M) provocou um aumento significativo na proliferação destas células em relação ao controle e às doses mais altas de androgênio (10-10 e 10-8 M ). Este efeito foi abolido pela adição de OHFLU. A expressão do gene do AR foi avaliada por RT-PCR em tempo real com diferentes tempos e condições de tratamento, sendo que os níveis de RNAm do AR permaneceram inalterados bem como sua proteína. Buscando compreender fatores que possam interferir na ativação transcricional do AR, avaliou-se a expressão dos coreguladores FHL-2 e shp-1. No grupo tratado com DHT.10-13 M houve um aumento significativo na expressão do co-ativador FHL-2 em relação aos outros grupos tratados (C5%, OH-FLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU e DHT.10-13 +OH-FLU) enquanto que a expressão do co-repressor shp-1 foi diminuída com esta dose, mas aumentada com a dose de DHT.10-8. Genes envolvidos na proliferação celular e que podem ser modulados pela ação androgênica, também foram avaliados em células HNTEP por RT-PCR em tempo real. O gene anti-apoptótico bcl-2 teve sua expressão aumentada sob o tratamento com DHT.10-13 M em relação ao tratamento com DHT.10-8 . Entretanto, o gene supressor de tumor p53 apresentou um aumento na sua expressão mediante o tratamento com a alta dose de androgênio (DHT.10-8M) em relação ao grupo controle, OH-FLU, DHT.10-13M e DHT.10-8 + OH-FLU. A análise da expressão do gene p21, alvo direto do gene p53, apresentou resultados semelhantes, com uma maior expressão com DHT.10-8M. Para averiguar alterações pós-transcrionais avaliou-se também os níveis protéicos do AR que não apresentaram alteração siginificativa e do p21, que apresentou uma maior marcação da proteína quando tratado com DHT10-8 M. Os dados obtidos neste trabalho indicam que pode ocorrer uma modulação da expressão destes genes mediante o tratamento com diidrotestosterona. Baixas doses de androgênio desencadeiam uma via estimulatória da proliferação enquanto que altas doses promovem a ativação de uma via inibitória nas células HNTEP. / Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a pathologic condition that affects older men and is present in 50% of the male population at 85 years of age. The androgenic hormones act on the prostate gland promoting its differentiation, growth and function, this effect being mediated by the hormone's binding to the androgen receptor (AR) and the activation of target genes. The balance between apoptosis and cell proliferation is maintained by a series of genes modulated by the androgens that are implicated in the cell cycle control. This research aimed to investigate the androgen-mediated molecular mechanisms that may be involved in the proliferative imbalance of the prostatic epithelium in older men. Human non-transformed epithelial prostate (HNTEP) cells derived from BPH were incubated in different concentrations of dihydrotestosterone (DHT) and of antiandrogen hydroxylutamide (OH-FLU). A low concentration of DHT (10- 13M) led to a significant increase in the proliferation of these cells as compared to the control condition and to higher concentrations (10-10 and 10-8 M). This effect was abolished by the addition of OH-FLU. AR gene expression was evaluated by real-time RT-PCR in different times and conditions of treatment, and no differences in the AR mRNA and its protein were found. In an attempt to understand the factors that can change the AR transcriptional activation, the expression of co-regulators FHL-2 and shp 1 were also evaluated. There was a significantly increased expression of co-activator FHL-2 in the group treated with DHT.10-13 M as compared to all other groups (C5%, OHFLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU and DHT.10-13 +OH-FLU). On the other hand shp-1 expression was low at this concentration but high when cells were treated with DHT.10-8 M. Genes participating in cell proliferation and that can be modulated by androgens were also evaluated in HNTEP cells by real-time RT-PCR. The anti-apoptotic bcl-2 gene had its expression increased by the treatment with DHT.10-13 M as compared to the treatment with DHT.10-8 M. However, the expression of tumor-suppressing p53 gene showed an increase in its expression by the treatment with a high level of androgen (DHT.10-8 M) as compared to control, OH-FLU, DHT.10-13M and DHT.10-8 + OH-FLU. The analysis of gene p21 expression, direct target of p53 gene, presented similar results (higher expression with DHT.10-8M). Post-transcriptional alterations were studied by evaluating the proteins levels of AR and p21; there were no significant differences, but the latter showed greater protein labeling when treated with DHT.10-8 M. The data obtained here indicate that the expression of these genes may be modulated by dihydrotestosterone (DHT). Low concentrations of androgens trigger a stimulatory pathway of proliferation, while high concentrations promote the activation of an inhibitory pathway in HNTEP cells.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:40:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) luciana_moreira_ioc_mest_2007.pdf: 9179691 bytes, checksum: 2c7d90ce2854f60c131128c9ab783c1e (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Corpúsculos lipídicos são inclusões preenchidas principalmente por triglicerídeos e ésteres de colesterol, sendo também depósitos intracelulares de ácido araquidônico (AA). A participação de corpúsculos lipídicos na geração eicosanóides por células hematopoiéticas é suportada pela localização de proteínas envolvidas na cascata metabólica do AA e co-localização do produto final desta via, a prostaglandina E2 (PGE2). A PGE2 é o principal metabólito do AA produzido por células epiteliais, sendo um potente mediador capaz de modular a motilidade, sobrevivência celular, proliferação celular e angiogênese, que são processos importantes na restauração da homeostase do tecido epitelial após injúria. O nosso objetivo central é investigar a modulação de corpúsculos lipídicos em células epiteliais. Analisando a indução de corpúsculos lipídicos por mediadores inflamatórios, as vias de sinalização intracelular envolvidas, e a modulação de corpúsculos lipídicos durante a proliferação e migração celular. Utilizamos como modelo experimental uma linhagem celular derivada de epitélio intestinal normal de rato (IEC-6) A avaliação de corpúsculos lipídicos é realizada através da marcação com tetróxido de ósmio e contagem por microscopia de campo claro. Análise da expressão de proteínas é realizada por SDS-PAGE e a produção de PGE2 por ELISA. Células confluentes não apresentam corpúsculos lipídicos, enquanto células não-confluentes possuem em média de 15 a 20 corpúsculos/célula. A deprivação de soro fetal bovino leva a uma redução no número de corpúsculos lipídicos. Estímulos inflamatórios em células confluente, como IL-1?, PAF e PMA não provocam alterações no número de corpúsculos lipídicos. Enquanto a adição de AA induz a formação de corpúsculos lipídicos de maneira dose-dependente. A adição de PGE2, ou o tratamento com inibidores de COXs NS398 e Salicilato de Valeril não alteram o número de corpúsculos lipídicos. Inibidores seletivos de MEK 1 e 2 e de JNK 1,2 e 3 não interferem na indução de corpúsculos lipídicos por AA, enquanto o inibidor de p38 reduz em 80% a formação dessas estruturas. Nossos resultados indicam uma forte relação entre a biogênese de corpúsculos lipídicos e proliferação celular, e que essas organelas são induzidas de forma estímulo-específica em células epiteliais / Lipid Bodies (LBs) are cytoplasmic inclusions manly formed by triglycerides and cholesterol esters, being also intracellular deposits of arachidonic acid (AA), which can be metabolized for generation of eicosanoids. PGE2 is the major AA metabolite produced by epithelial cells. It is a potent mediator of cell motility, survival, proliferation and angiogenesis, all central processes to restoration of epithelial tissue homeostasis after injury. Our aim was to investigate LBs biogenesis and their role in AA metabolic pathway in epithelial cells. Specifically we evaluated: i) induction of LBs by inflammatory mediators; ii) intracellular signaling pathways involved in such induction; iii) and modulation of LBs during cell proliferation and migration. We used IEC-6 as experimental model, a cell line derived from rat normal intestinal epithelium. LBs were evaluated under light microscopy after staining by osmium tetroxide. Protein expression level was assessed by western blotting, and PGE2 generation determined by EIA in cell culture supernatants. IEC-6 cells cultured subconfluently in DMEM supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS) presented 15-20 LBs/cell. FBS withdraw or reaching confluency eliminated LBs. FBS-induced LB biogenesis in sub-confluent cells was blocked by ERK1/2 and p38 inhibitors. Stimulation of confluent IEC-6 by IL-1b, PAF and PMA was unable to induce LBs. In contrast, addition of AA dosedependently- induced LB formation, independent of its metabolism to PGE2, and proliferation foci in confluent cells. LBs formation induced by AA was dependent on signaling through p38, PKC and PI3K, but not on ERK 1/2 or JNK. LB biogenesis by epithelial cells facilitates AA release after activation without changes in cytosolic phospholipase A2-a (cPLA2-a) expression. Altogether, our results suggest a strong relationship between LB biogenesis and cell proliferation, and indicate that such organelles are induced in a stimulus-specific manner and facilitate AA mobilization in epithelial cells.

Made available in DSpace on 2016-03-04T13:59:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luciana_barros_ioc_dout_2014.pdf: 3326577 bytes, checksum: 370ee3d6142f8100a7adc37a80899e9a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O timo é um órgão linfoide primário, sítio do desenvolvimento de células T, provendo fatores críticos e coordenados que induzem e suportam o comprometimento de linhagem, diferenciação e sobrevivência dessas células. A presença das células não-linfóides, principalmente as células epiteliais do timo (TEC) no parênquima tímico promove a migração e diferenciação coordenada dos linfócitos T. Os linfócitos T são o principal alvo do Virus linfotrópico T humano (HTLV-1), agente etiológico da leucemia/linfoma associado ao HTLV-1 (ATL) e de doença que compromete o sistema nervoso/muscular (HAM/TSP). É desconhecida a causa que leva a uma ou outra doença. A resposta imune antiviral mediada por células T é ineficiente nessas patologias. Mesmo que o vírus tenha tropismo pelos linfócitos T, ele é capaz de infectar outros tipos celulares por contato direto entre células ou por partículas virais livres. Linfócitos ativados recirculam pelos órgãos linfoides, incluindo o timo, onde as células epiteliais tímicas (TEC) interagem intimamente com as células recirculantes, promovendo uma possível via de transmição do HTLV-1. No nosso trabalho, observamos que as TECs possuem os receptores para a entrada do vírus (GLUT-1 e Neuropilina-1). Experimentos in vitro mostraram que as TECs podem ser infectadas pelo HTLV-1 por linhagens de linfócitos derivados de pacientes portadores de ATL e de HAM/TSP Essas infecções ocorreram tanto por contato direto entre as células, quanto por sobrenadante contendo partículas virais livres derivadas do sobrenadante dos linfócitos. O vírus pode ser observado após 24 horas e 10 dias de cultivo, quando a maioria das células estava infectada. Através de microscopia eletrônica de transmissão, foram observadas partículas virais brotando de estruturas semelhantes a corpos multivesculares nas TECs. A expressão gênica de citocinas e quimiocinas foram encontradas aumentadas nas TECs logo após contato com o sobrenadante contendo HTLV-1 derivado dos linfócitos. Somado a isso, a expressão gênica de inteferon tipo 1 e genes induzidos por interferon estavam diminuídos. A resposta migratória de linfócitos T CD4+ induzida por TEC HTLV-1+ estava aumentada em relação as TEC não-infectadas. As TEC infectadas são capazes de transmitir a infecção para linfócitos T por contato, alterando a expressão de receptores de quimiocinas e de adesão nos linfócitos T CD4+. Juntos, esses resultados sugerem que as TEC HTLV-1+ infectadas por linfócitos infectados ou por vírus livres, transmitem a infecção para outras TECs e para linfócitos T CD4+, disseminando a infecção / The thymus is a primary lymphoid organ, site of developing T cells, providing a coordinated set of critical factors to induce and support lineage commitment, di fferentiation and survival of these cells. The presence of non - lymphoid cells through the thymic parenchyma serves to provide coordinated migration and differentiation of T lymphocytes. T lymphocytes are the main target of Human T Lymphotropic Virus type 1 (HTLV - 1). This virus is the etiologic agent of HTLV - 1 associated lymphoma and leukemia (ATL) or a disease of muscular/nervous systems (HAM/TSP), but it is unknown what triggers to one or other disease. T - cell mediated immune response against viral protein s is not effective in both diseases. Although the virus has T lymphocyte tropism, it can infect other cells by cell contact and cell - free virus. Activated T lymphocytes circulates around lymphoid organs, including the thymus, where the thymic epithelial ce lls (TEC) strongly interact with recirculating cells, so infected lymphocytes could transmit the virus to TEC. Interestingly, in our work we observed that TEC expresses molecules related to the HTLV - 1 transmission (GLUT - 1, Neuropilin 1). In vitro experimen ts showed that TEC could be infected by cell lineages derived from ATL and HAM/TSP patients. These infections happened from cell contact and by cell - free virus derived from cell supernatants. The virus can be seen after 24h and after 10 days, when most cel ls in the culture were infected. By transmission electron microscopy, virus particles were observed budding from multivesicular bodies like structures in TEC. Cytokines and chemokines were incr eased at mRNA level soon after contact with HTLV - 1 containing supernatant derived from lymphocytes. In addition, type 1 interferon and interferon stimulated genes were decreased in HTLV - 1 infected TEC. Migration response from T CD4 + lymphocytes driven by H TLV - 1 + TEC were increased in relation to non - infected TEC. HTLV - 1 + TEC could transmit the infection to T CD4 + lymphocytes by cell contact, altering some chemokines and adhesion receptors in T CD4 + cells. Altogether, these results suggest that after TEC inf ection by HTLV - 1 via infected lymphocytes and cell - free virus, it is able to contaminate another TEC and transmit the virus to non - infected T lymphocytes, disseminating the infection.

Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição patológica que acomete os homens na senescência e está presente em 50% da população masculina, com cerca de 85 anos de idade. Os hormônios androgênicos atuam na próstata provendo sua diferenciação, crescimento e funcionalidade, sendo este efeito mediado pela ligação do hormônio com o receptor de androgênios (AR) e pela a ativação de genesalvo. O equilíbrio entre apoptose e proliferação celular é mantido por uma série de genes modulados pelos androgênios que estão implicados no controle do ciclo celular. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares mediados por androgênio que possam estar envolvidos no descontrole proliferativo do epitélio prostático que ocorre durante a senescência. As células epiteliais prostáticas humanas não- transformadas derivadas de HPB (HNTEP) foram cultivadas e incubadas com diferentes concentrações de diidrotestosterona (DHT) e com o antiandrogênio hidroxiflutamida (OH-FLU). Uma baixa concentração de DHT (10-13M) provocou um aumento significativo na proliferação destas células em relação ao controle e às doses mais altas de androgênio (10-10 e 10-8 M ). Este efeito foi abolido pela adição de OHFLU. A expressão do gene do AR foi avaliada por RT-PCR em tempo real com diferentes tempos e condições de tratamento, sendo que os níveis de RNAm do AR permaneceram inalterados bem como sua proteína. Buscando compreender fatores que possam interferir na ativação transcricional do AR, avaliou-se a expressão dos coreguladores FHL-2 e shp-1. No grupo tratado com DHT.10-13 M houve um aumento significativo na expressão do co-ativador FHL-2 em relação aos outros grupos tratados (C5%, OH-FLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU e DHT.10-13 +OH-FLU) enquanto que a expressão do co-repressor shp-1 foi diminuída com esta dose, mas aumentada com a dose de DHT.10-8. Genes envolvidos na proliferação celular e que podem ser modulados pela ação androgênica, também foram avaliados em células HNTEP por RT-PCR em tempo real. O gene anti-apoptótico bcl-2 teve sua expressão aumentada sob o tratamento com DHT.10-13 M em relação ao tratamento com DHT.10-8 . Entretanto, o gene supressor de tumor p53 apresentou um aumento na sua expressão mediante o tratamento com a alta dose de androgênio (DHT.10-8M) em relação ao grupo controle, OH-FLU, DHT.10-13M e DHT.10-8 + OH-FLU. A análise da expressão do gene p21, alvo direto do gene p53, apresentou resultados semelhantes, com uma maior expressão com DHT.10-8M. Para averiguar alterações pós-transcrionais avaliou-se também os níveis protéicos do AR que não apresentaram alteração siginificativa e do p21, que apresentou uma maior marcação da proteína quando tratado com DHT10-8 M. Os dados obtidos neste trabalho indicam que pode ocorrer uma modulação da expressão destes genes mediante o tratamento com diidrotestosterona. Baixas doses de androgênio desencadeiam uma via estimulatória da proliferação enquanto que altas doses promovem a ativação de uma via inibitória nas células HNTEP. / Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a pathologic condition that affects older men and is present in 50% of the male population at 85 years of age. The androgenic hormones act on the prostate gland promoting its differentiation, growth and function, this effect being mediated by the hormone's binding to the androgen receptor (AR) and the activation of target genes. The balance between apoptosis and cell proliferation is maintained by a series of genes modulated by the androgens that are implicated in the cell cycle control. This research aimed to investigate the androgen-mediated molecular mechanisms that may be involved in the proliferative imbalance of the prostatic epithelium in older men. Human non-transformed epithelial prostate (HNTEP) cells derived from BPH were incubated in different concentrations of dihydrotestosterone (DHT) and of antiandrogen hydroxylutamide (OH-FLU). A low concentration of DHT (10- 13M) led to a significant increase in the proliferation of these cells as compared to the control condition and to higher concentrations (10-10 and 10-8 M). This effect was abolished by the addition of OH-FLU. AR gene expression was evaluated by real-time RT-PCR in different times and conditions of treatment, and no differences in the AR mRNA and its protein were found. In an attempt to understand the factors that can change the AR transcriptional activation, the expression of co-regulators FHL-2 and shp 1 were also evaluated. There was a significantly increased expression of co-activator FHL-2 in the group treated with DHT.10-13 M as compared to all other groups (C5%, OHFLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU and DHT.10-13 +OH-FLU). On the other hand shp-1 expression was low at this concentration but high when cells were treated with DHT.10-8 M. Genes participating in cell proliferation and that can be modulated by androgens were also evaluated in HNTEP cells by real-time RT-PCR. The anti-apoptotic bcl-2 gene had its expression increased by the treatment with DHT.10-13 M as compared to the treatment with DHT.10-8 M. However, the expression of tumor-suppressing p53 gene showed an increase in its expression by the treatment with a high level of androgen (DHT.10-8 M) as compared to control, OH-FLU, DHT.10-13M and DHT.10-8 + OH-FLU. The analysis of gene p21 expression, direct target of p53 gene, presented similar results (higher expression with DHT.10-8M). Post-transcriptional alterations were studied by evaluating the proteins levels of AR and p21; there were no significant differences, but the latter showed greater protein labeling when treated with DHT.10-8 M. The data obtained here indicate that the expression of these genes may be modulated by dihydrotestosterone (DHT). Low concentrations of androgens trigger a stimulatory pathway of proliferation, while high concentrations promote the activation of an inhibitory pathway in HNTEP cells.

Orientador: Vera Lúcia Mores Rall / Coorientador: João Pessoa Araújo Júnior / Banca: Ary Fernandes Júnior / Banca: Antonio Carlos Paes / Resumo: Staphylococcus aureus é um dos principais patógenos envolvidos na mastite humana e bovina. Entre seus diversos fatores de virulência está a capacidade de aderir e invadir células do epitélio mamário, estabelecendo a doença, produzir enterotoxinas que podem causar intoxicações de origem alimentar, caso haja consumo do leite contaminado. O objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar o potencial de adesão e de invasão de S. aureus, isolados de leite de vacas com mastite subclínica e de leite humano de um Banco de Leite, em cultura de células epiteliais mamárias bovinas (BMECs), HEp-2 e HeLa, pesquisar os genes envolvidos na formação de algumas enterotoxinas por PCR, verificar a produção das enterotoxinas clássicas in vitro e pesquisar a presença do gene mecA, que confere resistência à vários antibióticos beta lactâmicos. Foram utilizados 20 isolados de S. aureus, de leite de vacas com mastite subclínica e 20 de leite humano de um Banco de Leite, de um hospital público, na cidade de Botucatu, SP. Os isolados de leite humano apresentaram melhor adesão em células HeLa (p=0,043), enquanto os isolados de leite bovino aderiram melhor em células HEp-2 e BMEC (p=0,01). Nos testes de invasão, os isolados de leite humano e bovino invadiram os três tipos celulares indistintamente em porcentagens de invasão de 1 a 62,5% para S. aureus de origem humana e de 0,7 a 100%, para isolados de origem bovina. O gene que codifica a enterotoxina G (seg) foi o mais frequente em ambos os tipos de leite, com prevalência de 90% (n=18) e 80% (n=16), em humanos e bovinos, respectivamente. No leite humano, sea foi o segundo mais prevalente, com 75% (n=15), dos quais 11 (73,3%) produziram SEA in vitro, seguido de sec, que foi observado em 9 (45%) isolados, dos quais 4 (44,5%) produziram a enterotoxina in vitro. Os genes sea e sec foram observados, simultaneamente, em 6 desses isolados e 2 deles produziram ambas as enterotoxinas. Em relação... / Abstract: Staphylococcus aureus is one of the main pathogens involved in human and bovine mastitis. Among his many virulence factors is the ability to adhere and invade mammary epithelial cells, establishing the disease, produce enterotoxin that can cause foodborne poisoning, if any contaminated milk consumption. The objective of this study was to evaluate and compare the potential of adherence and invasion of S. aureus, isolated from dairy cows with subclinical mastitis and breast milk from a milk bank in culture bovine mammary epithelial cells (BMEC), HEp -2 and HeLa, searching genes involved in the formation of certain enterotoxins by PCR, verify the production of enterotoxins classical in vitro and investigate the presence of the mecA gene, which confers resistance to various beta lactam antibiotics. Were used 20 S. aureus isolates from milk cows with subclinical mastitis and 20 human milk from a milk bank of a public hospital in the city of Botucatu, SP. The isolated human milk showed better adhesion to HeLa cells (p = 0.043), while isolates from bovine milk adhered better to HEp-2 cells and BMEC (p = 0.01). In invasion testing, isolates from human milk and bovine invaded the three cell types indistinctly in percentage from 1 to 62.5% invasion for S. aureus of human origin and 0.7 to 100% for isolates from bovine origin. It was concluded that the adhesion test for human isolates can be used and HeLa cells isolated from bovine origin, can be used Hep-2 and BMEC cells. For testing invasion any cell type may be utilized for S. aureus from both origins. The gene encoding the enterotoxin C (sec) was the most common in both types of milk, with a prevalence of 90% (n = 18) and 80% (n = 16) in human and bovine, respectively. In human milk, sea was the most prevalent second, with 75% (n = 15), of which 11 (73.3%) produced SEA in vitro, followed sec, which was observed in 9 (45%) isolates of which 4 (44.5%) enterotoxin produced in vitro. The sea and ... / Mestre

Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é micose sistêmica causada pelos fungos dimórficos Paracoccidioides brasiliensis (espécies cripticas S1, PS2, PS3) e Paracoccidioides lutzii (Pb01-like espécies), endêmica na América Latina, principalmente no Brasil. A capacidade de causar micose com grande variedade de manifestações clínicas, desde formas localizadas até doença disseminada evoluindo para letalidade, depende da virulência do fungo e de sua habilidade em interagir com as estruturas superficiais do hospedeiro e invadi-las, e a resposta imunológica deste último. P. brasiliensis tem a capacidade de aderir e invadir células epiteliais de linhagens humanas e animais e o processo de invasão do fungo afeta a estrutura do citoesqueleto, interferindo em aspectos morfológicos da actina, tubulina e citoqueratina, indicando a participação funcional dos microfilamentos e microtúbulos neste mecanismo. Em estudos prévios foi identificada adesina de P. brasiliensis de 30 kDa, ligante de laminina, caracterizada como uma proteína pertencente à família 14-3-3. O objetivo deste trabalho foi produzir a proteína recombinante, verificar o papel desta na interação do fungo com células epiteliais pulmonares de linhagem contínua. Para tanto, com o anticorpo anti-14-3-3 foi verificada a sua localização, tanto nas formas leveduriformes do fungo como no processo de interação. A clonagem foi realizada em vetor de clonagem pCR2.1-TOPO - pET32a, para permitir a expressão da proteína Pb14-3-3r com cauda de histidina no espaço periplasmático de E. coli. A fração periplasmática foi purificada por cromatografia de afinidade seguida de eletroeluição. Foi possível verificar alteração do padrão de distribuição de actina quando as células foram tratadas com a proteína recombinante e nativa. A proteína 14-3-3 apresenta distribuição ubíqua na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis (cryptic species S1, PS2, PS3) and Paracoccidioides lutzii (Pb01-like species), endemic in Latin America, mainly Brazil. The ability to cause mycosis with a variety of clinical manifestations, from localized forms to disseminated disease progressing to lethality, possibly depends on the relationship between the virulence of these, the ability to interact with the surface structures of the host and invade them, and this immune response. P. brasiliensis has the ability to adhere and o invade human and animal epithelial cells lineage and the process of invasion of the fungus affects the structure of the cytoskeleton, morphological interfering with actin, tubulin and cytokeratin morphology, indicating the functional participation of microfilaments and microtubules in this mechanism. Previous study identified a 14-3-3 protein (30 kDa) that acts as a P. brasiliensis adhesin (laminin ligand) and this protein contributes to the virulence of this important fungal pathogen. The objective of this study was to produce recombinant protein, to verify the role of the interaction of the fungus with lung epithelial cells of continuous lineage. To do so, with the anti-14-3-3 was verified its location, both in the forms of the fungus and yeast in the process of interaction. The cloning was done in cloning vector pCR2.1-TOPO - pET32a to allow expression of protein Pb14-3-3r-tailed histidine periplasmic space of E. coli. The periplasmic fraction was purified by affinity chromatography followed by electroelution. It was possible to see change in the pattern of distribution of actin when cells were treated with recombinant and native protein. The 14-3-3 protein has ubiquitous distribution in yeast cells of P. brasiliensis (strain 18/S1) have a certain... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Clayton Luiz Borges / Banca: Oscar Zaragoza Hernandez / Doutor