Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: Vias de crescimento, expressao genetica, sintese de macromoleculas, formacao de purinas e pirimidinas e producao de energia estao relacionadas ao metabolismo da glicose e da glutamina. Por isso, o monitoramento dos niveis destes nutrientes e comum na cultura de celulas. Uma vez que o periodo in vitro e obrigatorio na fase pre-clinica da Medicina Regenerativa, as condicoes de cultivo devem ser bem estabelecidas, sendo importante o estudo dos requerimentos nutricionais celulares. Objetivo: Investigar o efeito da glicose e da glutamina sobre a proliferacao e a viabilidade de celulas-tronco dentais humanas. Metodos: O tecido de terceiros molares foi fragmentado em explantes e cultivado ate a obtencao do numero de celulas para as etapas experimentais. As celulas foram submetidas a diferentes concentracoes de glicose e glutamina na presenca ou ausencia de soro, e em seguida, avaliadas em relacao ao numero, viabilidade pelo teste de MTT e estruturas do citoesqueleto, nucleo e mitocondrias com microscopia confocal. Resultados: Baixas concentracoes de glicose favoreceram a viabilidade e a morfologias adequada. A presenca de glutamina mostrou-se benefica apenas quando associada a glicose. A preservacao do potencial biologico em cultura e possivel na ausencia de soro, desde que os requerimentos nutricionais estejam adequados. Conclusao: O comportamento microscopico e a viabilidade celular demonstraram padroes superiores em um meio de cultura livre de soro animal e isento de glutamina. Para determinar os requerimentos de glutamina, mais investigacoes sao necessarias. As doses adequadas e a composicao de nutrientes-chave irao favorecer a selecao de uma populacao celular adequada / Introduction: Monitoring the glucose and glutamine levels is a common practice in the context of cell culture. Growth pathways, genetic expression, macromolecules synthesis, purine and pirimidine formation, and energy production are connected to glucose and glutamine metabolism. Before transplantation in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, cells need to proliferate in vitro and the culture conditions must be well-established. In order to preserve cell biological activity and viability following transplantation, cell nutrient requirements need to be studied. Objective: To evaluate microscopic behavior, morphology and viability of human mesenchymal cells under glucose and glutamine deprivation. Materials and Methods: Human tooth tissues were minced in isolated pieces and cultured until the desired cellular proliferation for experimental phases. The cells were cultured under variations of Glucose and Glutamine in both serum presence and absence, and then those cells were evaluated according to number and viability by MTT assay. The confocal microscopy analyzed cytoskeleton, nucleus, and mitochondria integrity. Results: A low concentration of glucose favored cellular viability and microscopic behavior; the presence of glutamine in culture medium was favorable only when associated with glucose. The preservation of cell biological potential in culture is possible in serum absence provided that the nutritional requirements are adequate. Conclusion: Cell microscopic behavior and viability has demonstrated better patterns on serum-free low glucose culture medium with glutamine deprivation. Further glutamine analysis are necessary to understand its requirements to the HDSC. The employment of the correct dose and composition of key nutrients will favor an appropriate cell population selection for future transplantation. / FAPESP: 2013/06877-1 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Atualmente cerca de 13% da populacao mundial e afetada por algum grau de doenca renal cronica, com um percentual de 45% de mortes atribuidas a desordens de carater fibrotico. Neste contexto, novas formas terapeuticas de tratamento se tornam imprescindiveis, como por exemplo, uso de terapia celular com celulas-tronco mesenquimais. Essas celulas podem ser obtidas do tecido-adiposo (CTAd) tornando-se possiveis terapias devido a sua facil obtencao e propriedades pro-regenerativas, principalmente as exercidas por acoes paracrinas. Portanto, neste presente trabalho analisamos o papel da CTAd na reducao da progressao da fibrose renal em dois modelos experimentais: 1) de isquemia e reperfusao renal unilateral severa (IR) e 2) de nefrite tubulo-intersticial (NTI). Inicialmente, as CTAd foram isoladas de camundongos C57BL/6j, e foram caracterizadas fenotipicamente e funcionalmente. Apos sua caracterizacao, as CTAds foram administradas por via intraperitoneal (2.105 celulas/animal) em diferentes tempos apos insulto inicial, e os animais foram avaliados 24 horas, 6 e 10 semanas apos a IR e 10 dias apos a inducao da NTI. No modelo de IR, no tempo de 24 horas, os animais tratados com CTAd apresentaram reduzida disfuncao renal e tubular e um aumento do processo regenerativo. Adicionalmente, a expressao renal de transcritos pro-inflamatorios (IL-6 e TNF) foi diminuida, enquanto que o nivel de moleculas antiinflamatorias e citoprotetoras (IL-4, IL-10 e HO-1) foram aumentadas. Apesar da melhora funcional, as CTAd nao foram observadas nos rins dos animais transplantados. Como esperado, apos 6 semanas de IR, os rins dos animais nao tratados retrairam, enquanto os rins dos animais tratados com CTAd permaneceram integros com menor deposicao de fibras de colageno do tipo 1 (Col-1) e menos expressao do marcador de fibrose FSP-1. A protecao renal observada em animais tratados com CTAd foi acompanhada por uma reducao nos niveis sericos de citocinas inflamatorias como TNF-α, KC, RANTES e IL-1a. No modelo de NTI o mesmo padrao foi observado, ou seja, os rins dos animais tratados apresentaram menor disfuncao renal com reduzida expressao de moleculas pro-inflamatorias (TNF-a e IL-6) e diminuicao da area fibrotica observada principalmente pela coloracao de Picrosirius e imunohistoquimica para marcadores pro-fibroticos como FSP-1 e Col-1. Surpreendentemente, quando avaliamos o tratamento das CTAd com 6 semanas de IR, periodo em que os animais ja apresentavam fibrose, foi constatado uma melhora nos parametros funcionais e menos fibrose e reducao da expressao de RNAm de Col-1 e vimentina, alem de menor expressao de FSP-1. Conclusivamente, nossos resultados demonstram que a terapia com CTAd pode afetar a progressao da fibrose renal, pela modulacao da resposta inflamatoria inicial. Acreditamos que essa protecao possa estar relacionada a modulacao dos mecanismos que governam a transicao epitelial/endotelio-mesenquimal. Esperamos que esse trabalho possa contribuir para a identificacao de potenciais vias de lesao ou de regeneracao, facilitando a sua traducao mais simples e rapida para a pratica clinica / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-24T13:56:40Z No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-allan-zimmermann.pdf: 1273033 bytes, checksum: 4c1e3537e5d30d25a69e372778e72de0 (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-24T13:59:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-allan-zimmermann.pdf: 1273033 bytes, checksum: 4c1e3537e5d30d25a69e372778e72de0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-24T13:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-allan-zimmermann.pdf: 1273033 bytes, checksum: 4c1e3537e5d30d25a69e372778e72de0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Introdução: Os biomateriais utilizados habitualmente em regeneração óssea não possuem potencial osteogênico e osteoindutivo, apesar de possuírem potencial osteocondutivo. Objetivo: Avaliar a associação entre células-tronco mesenquimais do tecido adiposo autólogo (CTM-TAA) e hidroxiapatita na regeneração óssea guiada da calvária de coelhos. Métodos: CTMTAA de seis animais foram associadas à hidroxiapatita e implantadas nas perdas ósseas pós-craniectomias de 12mm criadas bilateralmente na calvária de seis coelhos (grupo experimento - GE). No grupo controle (GC) o material de enxertia foi utilizado sem células. Em cada animal, uma das áreas de perda óssea foi coberta por uma membrana colágena. Após oito semanas os animais foram submetidos a óbito indolor induzido e a região das falhas ósseas avaliadas por histomorfometria. Resultados: O GE apresentou maior quantidade (p < 0,05) do tecido mineralizado vital e não vital (17,0% ± 5,3% e 25,9% ± 4,6%, respectivamente) comparado ao GC (9,8% ± 5,0% e 13,3% ± 2,3%, respectivamente). No GE nenhuma diferença foi observada entre os lados em que foram ou não utilizada as membranas colágenas (p > 0,05). Entretanto, uma diferença estatisticamente significante foi observada para GC (p < 0,05) relativamente à quantidade de tecido mineralizado vital no lado em que a membrana foi utilizadas. Conclusão: A associação entre CTM-TAA de coelhos e hidroxiapatita de origem bovina foi capaz de promover uma maior regeneração óssea da calvária de coelhos. O uso de membrana colágena de origem porcina não foi capaz de promover maior regeneração óssea do que o uso células-tronco associadas ao enxerto xenógeno. / Introduction: The biomaterials commonly used in bone regeneration lack osteoinductive and osteogenic potential despite these biomaterials possess osteoconductive potential. Objective: To evaluate the association of adult mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (MSC-dAT) with xenogenic bone graft in bone regeneration in rabbit calvaria. Methods: MSCdAT from 12 animals were combined with hydroxyapatite and implanted in 12 mm bilateral bone defects created in the calvaria of six rabbits (experimental group - EG), whereas only hydroxyapatite was implanted in the defects created in another group of six animals (control group - CG). One of the grafted sides in each animal of both groups was covered by a collagen membrane. After eight weeks, the animals were sacrificed and the region of the bone defects was removed and evaluated by histomorphometry and immunohistochemistry. Results: Histomorphometrically, the EG showed higher amounts (p < 0.05) of vital and non-vital mineralized tissue (28.24% ± 6.17% and 27.79% ± 2.72%, respectively), compared to the CG (13.06% ± 5.24% and 13.52% ± 3.00%, respectively). In EG, no difference was observed (p > 0.05) in the amount of mineralized tissue between the side that was covered by the membrane versus the side without membrane coverage. On the other hand, a statistically significant difference (p < 0.05) was observed in the control group with regard to the amount of mineralized tissue between the sides with and without membrane coverage. Conclusions: These observations suggest that the association of MSC-dAT with a xenogenic bone graft was capable of promoting better bone regeneration compared to use of a xenograft alone. Use of a membrane did not produce an increase in the regenerative potential for the EG, in contrast to the CG.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introducao: Pela efetividade da TARV, a infeccao pelo HIV/aids adquiriu um carater de maior cronicidade e menor letalidade. Se por um lado as mortes por doencas relacionadas a imunodepressao estao diminuindo, a proporcao de obitos por causas nao relacionadas a aids, incluindo por doenca cardiovascular esta aumentando, parte como consequencia de eventos adversos relacionados ao tratamento. Objetivos: Quantificar o numero de celulas progenitoras endoteliais (CEP) e microparticulas (MP) em pacientes infectados pelo HIV, sem previo tratamento antirretroviral e comparar com um grupo controle. Alem do perfil bioquimico, examinar a aterosclerose subclinica por meio do espessamento medio intimal carotideo e funcao endotelial pela dilatacao mediada pelo fluxo. Metodos: Estudo tipo coorte transversal, pareado por idade e sexo, com analise cega dos objetivos dos biomarcadores. Quantificacao de CEP e MP por citometria de fluxo, aterosclerose subclinica e funcao endotelial por eco - Doppler com transdutor linear de alta resolucao. Foram incluidos 68 individuos (35 HIV+ e 33 controles), com mediana de idade de 33 anos, sendo 80% do sexo masculino e da raca branca. Resultados: O perfil lipidico diferiu entre os grupos para o colesterol total 156 mg/dL e 173 mg/dL (p = 0,02) e HDL-c 37 mg/dL e 47 mg/dL (p = 0,001), para os pacientes dos grupos caso e controle, respectivamente. A contagem das CEP foi menor nos pacientes infectados pelo HIV quando comparado aos controles para CD34+/KDR+ [0.02% vs. 0.09%, p=0.045]; mas nao para CD34+/CD133+ ou KDR+/CD133+. O numero medio de MP plaquetarias foi semelhante entre os grupos sendo 24 992 por ƒÊL de plasma no grupo infectado pelo HIV e 26 642 ƒÊL de plasma no controle (p = 0.83). A contagem das MP endoteliais/ƒÊL de plasma diferiu entre os grupos, sendo maior no grupo infectado pelo HIV em relacao ao controle (1963 versus 436, p = 0.003). A medida do espessamento medio intimal foi similar entre os grupos, mas foi observada menor dilatacao mediada pelo fluxo [media (DP)] para o grupo caso [9% (5%) versus 16% (10%), p= 0,03]. Conclusoes: Pacientes HIV+, previamente a TARV apresentaram menor quantidade de CEP e maior de MP endoteliais, ao lado de disfuncao endotelial. / Introduction: After the introduction of antiretroviral therapy, aids has acquired an aspect of chronic disease and less deaths has occurred. The deaths related to aids are diminished but the proportion of deaths unrelated to aids,including cardiovascular disease are increasing, in part due to the side effects from the antiretroviral therapy. Objectives: To quantify the number of endothelial progenitor cells (EPC) and microparticles (MP) in HIV-infected naïve patients and compared with a control group. Besides the biochemical profile we evaluated subclinical atherosclerosis through carotid intimal medial thickening and endothelial function by flow mediated dilation. Methods: A case-control study, matched for age and gender, cross-sectional with blind analysis of the goals of biomarkers. Quantification of EPC and MP was done with flow cytometry, subclinical atherosclerosis and endothelial function by echo-Doppler with high resolution linear transducer. We included 68 subjects (35 HIV + and 33 controls) with a median age of 33 years, 80% were male and Caucasian. Results: The lipid profile differ between the groups for total cholesterol 156 mg / dL and 173 mg / dL (p = 0.02) and HDL-C 37 mg / dL and 47 mg / dL (p = 0.001) for case and control groups, respectively. The count of the CEP was lower in HIV-infected patients compared with control CD34 + / KDR + [0.02% vs. 0.09%, p = 0.045], but not to CD34 + / CD133 + and KDR + / CD133 +. The average number of platelet MP was similar between the groups 24 992 per mL of plasma in HIV-infected group and 26 642 mL plasma in control (p = 0.83). The counting of endothelial MP / mL of plasma differed between groups, being higher in HIV-infected group compared to control (1963 vs. 436, p = 0.003). The measurement of intimal medial thickening was similar between groups, but was found lower flow-mediated dilation [mean (SD)] in the HIV patients [9% (5%) versus 16% (10%), p = 0.03]. Conclusions: HIV + patients, before HAART had lower amounts of EPC and increased endothelial MP, along with endothelial dysfunction. / FAPESP: 2008/55223-6 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 331910.pdf: 9255216 bytes, checksum: c096660b6a5ea99355187178c0a800b1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Esta tese apresenta uma série de investigações e resultados na interface entre ciência dos materiais, ciência da computação e biologia, em que, primeiramente, interações nanopartícula-célula foram estudadas utilizando simulações de dinâmica molecular, buscando compreender aspectos fisico-químicos da interface existente entre nanomateriais e células. A partir destes estudos, logo ficou evidente que novos métodos para estudar estas interações, assim como interações biomaterial-célula, seriam necessários. Neste sentido, uma abordagem baseada em biologia de sistemas (CellNet) foi utilizada para elucidar mudanças globais em programas de expressão de genes em células interagindo com nanopartículas ou cultivadas em culturas de células organóides. Estes métodos foram primeiramente desenvolvidos e validados para área de células-tronco, especificamente para experimentos de engenharia de identidade celular, tais como reprogramação de células somáticas para um estado de pluripotência induzida, diferenciação dirigida de células-tronco pluripotentes para tipos de células específicos (cardiomiócitos) e conversão direta entre células somáticas (fibroblastos para cardiomiócitos). Aplicação de CellNet para interações nanopartícula-célula indicou que mudanças transcricionais significativas podem ocorrer, tal como quantificado pelo estabelecimento de redes reguladoras de genes (GRN) em células do sistema imune incubadas com nanopartículas de ouro, funcionalizadas com oligonucleotídeos. Além disso, respostas inflamatórias podem estar associadas a estas interações, uma vez que genes regulando vias de sinalização mediadas por interferon são super expressos. Análise de queratinócitos humanos em plataformas de cultura celular organóides mostrou o estabelecimento completo da GRN da pele e que existem diferenças significativas no transcriptoma de células cultivadas em plataformas bidimensionais e tridimensionais. Nanopartículas ativáveis por processos de remodelagem da matriz extracelular foram desenvolvidas e caracterizadas, onde se verificou que a ativação por proteases específicas tais como MMP9/2 e uPA é possível, juntamente com a aparente inibição da atividade da enzima catepsina B, sugerindo uma abordagem terapêutica plausível para tumores apresentando padrões de super expressão de MMP9/2 e catepsina B. Os resultados deste trabalho contribuem para o entendimento de interações nanomaterial/biomaterial-célula e o projeto de nanopartículas terapêuticas, assim como melhor entendimento sobre os três principais paradigmas de engenharia celular atualmente amplamente utilizados.<br> / Abstract: This thesis presents investigations and results at the interface between materials science, computer science and biology where nanoparticle-cell interactions were studied using molecular dynamics simulations, aiming at understanding physical-chemical aspects of the interface existing between nanomaterials and cells. From these studies was evident that new methods to study such interactions as well as biomaterial-cell interactions would be required. Thus, an approach based on systems biology (CellNet) was used to elucidate global changes in gene expression programs in cells interacting with nanoparticles or cultured in organoid cell cultures. Firstly, these methods were developed and validated for stem cells, especifically to the engineering of cell identity such as reprogramming of somatic cells to pluripotency, directed differentiation of stem cells to specific lineages (such cardiomyocytes) and direct conversion between somatic cells (fibroblastos to cardiomyocytes). CellNet application to nanoparticle-cell interactions showed that significant transcriptional changes may occur as quantified by the establishment of Gene Regulatory Networks (GRNs) in immune system cells incubated with gold nanoparticles functionalized with oligonucleotides. In addition, inflammatory responses might be associated as suggested by the upregulation of genes regulating interferon-mediated signaling pathways. Analysis of human keratinocytes in organoid cell culture indicated the full establishment of the skin GRN and that there are major differences between cells cultured in bidimensional and tridimensional platforms at the transcriptome level. Nanoparticles activated by extracellular matrix remodelling processes were developed and characterized, where it was demonstrated that activation by specific proteases such as MMP9 and MMP2 is possible as well as an unclear effect on the inhibitionof Cathepsin B by nanoparticles, suggesting a therapeutic strategy for cancers showing upregulation of MMP9, MMP2 and cathepsin B. The results presented contribute to a better understanding of nanoparticle/biomaterialcell interactions, the design of therapeutic nanomaterials as well as a better understanding regarding the three major cell engineering paradigms widely used.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-06T16:58:42Z No. of bitstreams: 1 Afrânio Ferreira Evangelista Avaliação...2014.pdf: 2792913 bytes, checksum: 154973247ed482dbfeac342e4b641d7c (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-06T17:00:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Afrânio Ferreira Evangelista Avaliação...2014.pdf: 2792913 bytes, checksum: 154973247ed482dbfeac342e4b641d7c (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-06T17:01:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Afrânio Ferreira Evangelista Avaliação...2014.pdf: 2792913 bytes, checksum: 154973247ed482dbfeac342e4b641d7c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T17:01:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Afrânio Ferreira Evangelista Avaliação...2014.pdf: 2792913 bytes, checksum: 154973247ed482dbfeac342e4b641d7c (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / O diabetes é uma doença de alta prevalência que, frequentemente, induz o comprometimento do sistema nervoso periférico. Na neuropatia diabética periférica, os sintomas mais encontrados são os sensitivos, no qual a dor neuropática, condição crônica caracterizada por alodinia e hiperalgesia, é a mais debilitante. Esta, prejudica a qualidade de vida do paciente, sendo muitas vezes não responsiva aos métodos farmacológicos convencionais de tratamento. Diante desse panorama, o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que possuam ação efetiva neste tipo de dor é de grande relevância. O uso da terapia celular no tratamento de lesões do sistema nervoso tem demonstrado resultados promissores e o potencial terapêutico de células-tronco na neuropatia experimental tem sido proposto. Neste estudo, avaliou-se o efeito de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (CMsMO) na neuropatia diabética periférica estabelecida em modelo experimental de diabetes induzido por estreptozotocina (ETZ). Quatro semanas após a indução do modelo por ETZ (80 mg/kg; ip; 3 dias consecutivos), os animais receberam uma administração endovenosa de CMsMO (1 x 106) ou veículo. O tratamento com gabapentina (30 mg/kg; v.o. a cada 12 horas durante seis dias consecutivos) foi usado como padrão ouro. Os limiares nociceptivos térmico e mecânico foram avaliados durante todo o período experimental (90 dias), pelos métodos de hargreaves e von Frey. A avaliação da função motora foi realizada pelo teste de rota-rod. Em diferentes tempos e para todos os grupos experimentais, foram realizadas coletas de segmentos da medula espinal (L4-L5) para dosagem de citocinas por ELISA e segmentos do nervo isquiático foram também coletados para avaliação de alterações morfológicas por microscopia óptica e eletrônica de transmissão. Os dados comportamentais demonstraram que o tratamento com CMsMO reduziu a mecanoalodinia e a hipoalgesia térmica, levando os limiares nociceptivos de animais neuropáticos a níveis similares aos de animais não neuropáticos. Do mesmo modo, a administração de CMsMO normalizou a função motora dos animais neuropáticos. Dados de microscopia mostraram que animais neuropáticos apresentaram atrofia axonal, redução do número de fibras mielínicas e aparente redução do numero de fibras amielínicas no nervo isquiático. Animais neuropáticos tratados com CMsMO tiveram menor ocorrência de atrofia axonal e não apresentaram redução do numero de fibras mielínicas ou amielínicas, em relação aos neuropáticos tratados com salina. Além disso, animais neuropáticos tratados com CMsMO apresentaram menores níveis espinais de IL-1β e TNF-α, e maiores de IL-10 e TGF-β, em relação aos animais neuropáticos não tratados. Esse conjunto de resultados indica que CMsMO produzem efeito antinociceptivo duradouro na neuropatia diabética, seguido de modificações no padrão fisiopatológico da doença, o que aponta a terapia celular como uma interessante alternativa para o controle da neuropatia diabética periférica dolorosa. / Diabetes is a highly prevalent disease which frequently compromises the peripheral nervous system. In peripheral diabetic neuropathy, the most frequent symptoms are sensitive, in which the neuropathic pain, chronic condition characterized by allodynia and hyperalgesia, is the most debilitating. Neuropathic pain affects the quality of patients’ lives, and is often not responsive to pharmacological conventional treatment methods. Against this background, the development of new therapeutic approaches that have an effective action in this type of pain is of great importance. The use of cell therapy in the treatment of lesions in the nervous system has shown promising results and the therapeutic potential of stem cells in experimental neuropathy has been proposed. In this study, we evaluated the effect of mesenchymal stem cells derived from bone marrow (CMsMO) in peripheral diabetic neuropathy established in experimental model of streptozotocin (STZ) induced diabetes in mice. Four weeks after the induction of the model by administration of STZ (80 mg/kg, ip; 3 days) the animals received an CMsMO by intravenous administration (1x106) or vehicle. The treatment with gabapentin (30 mg/kg, orally every 12 hours for six days) was used as the gold standard. The thermal and mechanical nociceptive thresholds were assessed throughout the entire experimental period (90 days), using Hargreaves and von Frey methods, respectively. Motor function evaluation of was conducted using the rotarod test. At different times, were analyzes conducted in spinal cord segments (L4-L5) to determine cytokines profile by ELISA. Sciatic nerve segments were also collected for evaluation of morphological changes by optical and electron transmission microscopy. According to the behavioral data, the CMsMO treatment reduced the mecanoalodinia and the thermal hypoalgesia, leading nociceptive thresholds of neuropathic animals to levels similar to those of non-neuropathic animals. Similarly, CMsMO administration normalized motor function of neuropathic animals. Microscopy data demonstrated that neuropathic animals had axonal atrophy and an apparent decrease of the number of myelinated fibers as well a reduction in the number of unmyelinated fibers in the sciatic nerve, but neuropathic animals treated with CMsMO had a lower incidence of axonal atrophy, showed no decrease in the number of myelinated fibers and no apparent decrease in the amount of unmyelinated fibers in relation to neuropathics treated with saline. Furthermore, neuropathic animals treated with CMsMO presented lower levels of spinal IL-1β and higher levels of TNF-α, and IL-10 and TGF-β compared to neuropathic animals that received saline. These data indicate that CMsMO produces a lasting analgesic effect in diabetic neuropathy, followed by changes in the pathophysiological disease pattern, which indicates cell therapy as an interesting alternative for the control of painful peripheral diabetic neuropathy.

Made available in DSpace on 2016-03-15T14:14:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 195.pdf: 1054766 bytes, checksum: 75fcd88c5f5acb965876b14c3b9091b0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Este trabalho investiga a questão da distribuição dos transplantes de medula óssea abordada a partir do princípio da justiça, entendido como equidade no acesso a esse benefício terapêutico no contexto brasileiro. O trabalho se inicia contextualizando os problemas éticos levantados pelo desenvolvimento das pesquisas com células tronco e as perspectivas terapêuticas promissoras associadas a tais pesquisas. A questão da justiça enquanto oportunidade de acesso a todos aos benefícios terapêuticos resultantes dessas pesquisas é considerada, nesse contexto, uma questão moral crucial. O transplante de medula óssea é um caso concreto de aplicação terapêutica bem-sucedida resultante das pesquisas com células-tronco. Esta é uma terapia eficaz para o tratamento de dezenas de doenças do sangue, bem estabelecida em âmbito global, inclusive no Brasil. No entanto, garantir o acesso de todos a ela não é tarefa fácil de realizar em contextos como o latinoamericano, incluindo o brasileiro, nos quais os recursos escassos conflitam com as imensas demandas na área da Saúde. O objetivo geral da investigação foi examinara prática do transplante de medula óssea no contexto brasileiro, a fim de saber se esta preenche os requerimentos do princípio da justiça como equidade, garantindo oportunidade de acesso a esse benefício a todos os que dele necessitarem, segundo a medida deste princípio. Metodologicamente trata-se de uma discussão teórica e crítica secundada por elementos qualitativos de um estudo de caso sobre os transplantes de medula óssea no Brasil. Discutimos inicialmente o conceito de justiça como equidade, investigando os fundamentos teóricos da ética dos direitos humanos e os fundamentos da concepção de justiça de Amartya Sen. Completamos esse referencial teórico com o exame da contribuição proposta pela bioética da proteção. / Com isso, pretendemos ter alcançado um adequado conceito de justiça como equidade. Passamos então à análise do contexto brasileiro, visando a saber das condições de possibilidade que tal contexto oferece para a prática da justiça no campo sanitário. Nesse sentido, analisamos o direito formal à saúde inscrito no Sistema Único de Saúde, em contraste com as imensas desigualdades que predominam no país e as iniquidades em saúde. Exploramos as diversas incongruências do sistema público de saúde, o papel do Estado e a importância da participação social. Examinamos, por fim, o sistema de transplantes de medula óssea no Brasil e as diversas espécies de dificuldades que o desafiam na tentativa de agir com justiça. A conclusão é que, embora o sistema seja sensível aos problemas bioéticos que cercam essa atividade e considere os requerimentos da justiça na distribuição dos transplantes, a equidade no acesso a esse benefício terapêutico ainda é uma exigência difícil de ser realizada em razão das características do contexto brasileiro. / The present study uses the justice theory principles to investigate how bone marrowtransplant is allocated in the Brazilian health context and how equitable is theBrazilian population access to this therapy. The first part of the study is dedicated toidentify the ethical issues brought up by the development of stem-cell researches andits outcomes. Justice theory brings a compelling moral issue to this scenario. Bonemarrow transplant is a successful application of stem cell researches and has beenstablished as an efficient therapy for several blood diseases. However, it has beendifficult to guarantee universal access to this therapy in Latin America, where limitedresources are constantly challenged by huge health care needs. The objective of thisstudy is to evaluate if equity parameters are taken into consideration in thedistribution of bone marrow transplant procedures in Brazil, according to justicetheory principles. Amartya Sen s ideas of human rights ethics and justice are thebasis for our discussion of justice as equity. Theoretical approach is complementedby the conceptual framework of the protection bioethics so as to achieve a broaderconcept of justice as equity that could be applied to the Brazilian health context. Howuniversal access to health care in Brazil is actually operationalized in view of themassive inequalities of the country. Health care system characteristics andcontradictions, the rule of the state and the importance of social control are alsoanalysed in the study. The difficulties faced in access of bone marrow transplants arealso examined in view of the bioethic challenges to regulate state actions and rightswith justice principles. Conclusions show that the health care system considersjustice and bioethics arguments in the managing of bone marrow transplants,however equity in access of such therapy is hardly achieved. (AU)^ien

Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:28:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Thamile_versaofinal.pdf: 1994677 bytes, checksum: ae5ee13d8f71c37552b741b9a2c81a37 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:46:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Thamile_versaofinal.pdf: 1994677 bytes, checksum: ae5ee13d8f71c37552b741b9a2c81a37 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T16:46:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Thamile_versaofinal.pdf: 1994677 bytes, checksum: ae5ee13d8f71c37552b741b9a2c81a37 (MD5) / As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células indiferenciadas capazes de se autorrenovarem e diferenciarem em diversos tipos celulares; estas células têm sido amplamente avaliadas quanto ao uso em terapias para doenças cardiovasculares, visando recuperar o tecido cardíaco danificado. É sabido que o comportamento biológico das CTMs depende do microambiente onde se encontram, que é composto principalmente por células, matriz extracelular (MEC) e fatores solúveis. Desta forma, isolamos células residentes cardíacas através da cultura de explantes de aurícula e ventrículo cardíaco humano e realizamos a caracterização do fenótipo destas células, bem como de proteínas de MEC e do meio condicionado (fatores solúveis) secretados por elas. Constatamos que ambas as populações celulares são compostas por CTMs, fibroblastos cardíacos e possivelmente pericitos/miofibroblastos. Realizamos o cultivo destas células e isolamos a MEC por meio da descelularização das monocamadas celulares com uma solução de Triton X-100 0,5%. Por outro lado, obtivemos o meio condicionado (MC) de ambas as populações celulares e observamos que estes são compostos por diversas proteínas, muitas das quais sendo relacionadas aos processos de regulação da diferenciação celular, desenvolvimento e reparo tecidual. Devido ao fato destas populações celulares serem populações heterogêneas compostas de células encontradas no coração, procuramos avaliar o papel das proteínas de MEC e do MC secretados por elas em cultivos de CTMs. Primeiramente, observamos através de ensaios de viabilidade celular e morte por apoptose e necrose, que as MEC e os MCs não foram tóxicos para os cultivos de CTMs. Observamos que a MEC derivada de células de aurícula induziu redução da taxa de proliferação das CTMs em 24 horas. Em contrapartida, após 7 dias, o número de CTMs cultivadas na presença de ambos os MCs aumentou significativamente em relação ao controle, sugerindo um papel destas proteínas secretadas como indutoras da proliferação celular. Em relação a adesão, observamos que as MECs não influenciaram o número de CTMs aderidas em comparação com o controle de colágeno tipo I. Da mesma forma, não observamos diferença na taxa de migração e na marcação para GATA-4 e Troponina-I entre os grupos controle e os cultivados na presença das MECs e/ou MCs. Embora não tenhamos observado diferença nestes parâmetros, ao menos nas condições avaliadas neste estudo, conseguimos demonstrar através deste trabalho que as populações celulares derivadas de aurícula e ventrículo são secretoras ativas de diversas proteínas relacionadas a processos de desenvolvimento celular e possivelmente ao reparo do tecido cardíaco. Portanto, estas células podem representar uma importante fonte de fatores tróficos a ser avaliada como indutora de estímulos em células progenitoras com objetivos terapêuticos em lesões cardiovasculares.

As perdas ósseas representam um desafio à cirurgia reparadora, onde a utilização de diferentes fontes de enxertos ósseos com limitações físicas, químicas e biológicas é frequente. Atualmente, a bioengenharia alia os conhecimentos de diferentes áreas para o estudo de novas formas de produção de tecidos, inclusive para uso em cirurgias reparadoras. O objetivo deste estudo foi associar a nanotecnologia e as células-tronco, para estudar a neoformação óssea na região de defeitos ósseos criados em calota craniana de ratos. Dois estudos foram conduzidos. No primeiro, confeccionaram-se matrizes de nanofibras (scaffolds) a partir do ácido poli (lático-co-glicólico) (PLGA) pela técnica de electrospinning, as quais apresentaram propriedades morfológicas adequadas para seu emprego no estudo. Após, cinco amostras de Stem Cell from Deciduos Tooth (SCDT) de humanos, em processo de rizólise, foram obtidas e cultivadas até atingirem entre 5ª e 7ª passagem, momento no qual foram empregadas no estudo. As SCDT foram semeadas em placas de cultura (grupo controle) e nos scaffolds (grupo teste) para os ensaios de adesão, viabilidade e proliferação celular. Observou-se que a capacidade das SCDT em realizar adesão no grupo teste foi semelhante à sua capacidade de adesão no grupo controle, sem diferença estatística entre os grupos. Verificou-se que as células mantiveram-se viáveis durante todos os dias do experimento (21 dias) nos grupos teste e controle, não apresentando diferença estatística entre os grupos. Em ambos os grupos ocorreu o aumento gradativo da viabilidade celular a partir do inicio do experimento até o 14º dia de cultura, seguido pela sua diminuição quando analisada no 21º dia. O segundo trabalho objetivou avaliar a capacidade da associação scaffolds/SCDT em promover neoformação óssea em ratos. Para isso utilizou-se 15 ratos Wistar, nos quais foram confeccionados defeitos críticos de 8,0 mm de diâmetro nas calotas cranianas. Os animais foram divididos em três grupos experimentais com 5 animais cada: grupo 1 – implante no defeito ósseo de scaffolds; grupo 2 – implante no defeito ósseo de scaffolds semeados com SCDT; grupo 3 – implante no defeito ósseo de scaffolds semeados com SCDT que foram mantidas durante 13 dias em meio de diferenciação osteogênica prévio a sua implantação. Decorrido 60 dias pós operatório, foi realizada a análise 10 histométrica, a qual avaliou a quantidade de tecido ósseo formado no interior do defeito produzido Observou-se que a associação scaffold/SCDT mantida em meio osteogênico previamente à implantação apresentou uma maior neoformação óssea em relação aos demais grupos, sendo esta diferença estatisticamente significante. Em vista dos resultados obtidos, conclui-se que, obedecidos os parâmetros utilizados, os scaffolds de PLGA apresentam resultados favoráveis em relação à interação com as SCDT. Ainda, a utilização de meio de diferenciação osteogênico associado ao scafolld/SCDT, prévio a implantação, mostrou que essa associação possui a capacidade de promover neoformação óssea, sendo a sua utilização adequada para o uso na bioengenharia. / Bone loss is a challenge to reconstructive surgery, where the use of different sources of bone grafts with physical, chemical and biological limitations is common. Currently, bioengineering combines knowledge from different fields to study new forms of tissue production, including for use in reconstructive surgery. The aim of this study was to associate nanotechnology and stem cells in relation to the study of bone formation in the area of bone defects created in rat calvaria. Two studies were conducted. Firstly, nanofiber matrices (scaffolds) were made from acid poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) by the electrospinning technique, which showed morphological properties suitable for use in the study. Following this, five samples from Deciduous Tooth Stem Cells (SCDT) from human, in the process of rhizolysis, were obtained and grown until they reached between the 5th and 7th passage, at which point they were used in the study. The SCDT were seeded onto culture plates (control group) and scaffolds (test group) for adhesion assays, cell viability and proliferation. It was observed that the ability of SCDT to adhere in the test group was similar to their ability to adhere in the control group. There was no statistical difference between the groups. It was found that the cells remained viable for every day of the experiment (21 days) in the test and control groups. There was no statistical difference between the groups. In both groups there was a gradual increase in cell viability from the start of the experiment until the 14th day of culture, followed by their decrease when analyzed on day 21. The second study evaluated the ability of the association scaffolds / SCDT to promote new bone formation in rats. For this, 15 Wistar rats were used, in which were induced critical defects of 8.0 mm diameter in the skulls. The animals were divided into three groups of five: group 1 - bone defect of the implant scaffolds, group 2 - implant in the bone defect of scaffolds seeded with SCDT, group 3 - implant in the bone defect of scaffolds that were seeded with SCDT and kept for 13 days in osteogenic differentiation medium prior to implantation. After 60 days postoperatively, histometric analysis was performed, which assessed the amount of bone formed within the imposed defect. It was observed that the scaffold association/SCDT maintained in osteogenic medium prior to implantation showed greater bone formation than the other groups. This 12 difference was statistically significant. In the light of these results, it can be concluded that, in compliance with the parameters used, the PLGA scaffolds have favorable results in relation to the interaction with the SCDT. Furthermore the use of osteogenic differentiation associated with scafolld / SCDT, prior to implantation showed that this association has the ability to promote bone formation and its use is therefore appropriate for use in bioengineering.

As células-tronco mesenquimais (CTMs) tornaram-se um grande interesse para a ciência por serem capazes de estimular a regeneração tecidual, apresentarem habilidade de se expandir e diferenciar em cultura e, consequentemente, apresentarem diversas possibilidades terapêuticas, bem como para a engenharia de tecidos. Muitos dos tecidos dentários também apresentam nichos de CTMs. O fácil acesso à polpa dos dentes decíduos, em virtude da esfoliação dental, a torna uma fonte muito atraente para a terapêutica e a engenharia de tecidos. Todos os avanços advindos das terapias baseadas em células-tronco tornam a preservação das fontes celulares, por longos períodos de tempo, um assunto de suma importância. Para que isso possa ocorrer, métodos de armazenamento devem ser adotados, tanto para as culturas celulares já estabelecidas, quanto para os tecidos inteiros. Uma das formas mais comuns de manutenção de culturas e de tecidos é a criopreservação em nitrogênio líquido. Contudo, existem poucas evidências no sentido de estabelecer um protocolo eficaz para o congelamento do dente decíduo intacto. Dessa forma, esse trabalho objetivou isolar, cultivar e caracterizar, para parâmetros apresentados para CTMs, as células pulpares após a criopreservação de dentes decíduos intactos por 7 dias. Para isso, vinte e seis dentes decíduos foram alocados em 2 grupos experimentais, sendo: grupo 1, células pulpares de dentes decíduos criopreservados intactos (grupo Crio) e grupo 2, células pulpares de dentes decíduos isoladas imediatamente após a exodontia (grupo fresco - controle). As células pulpares de ambos os grupos foram isoladas, cultivadas, analisadas por citometria de fluxo (CD14, CD29, CD34, CD45, CD73, CD90 e HLA-DR), submetidas aos protocolos de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica, e aos ensaios de proliferação celular (WST-8). A morfologia celular de ambos os grupos foi avaliada por microscopia confocal. Os resultados demonstraram uma taxa de cultivo de 30% para o grupo Crio e 61% para o grupo Fresco. Não houve diferença estatística entre os grupos para os marcadores de superfície analisados. As células de ambos os grupos foram capazes de se diferenciar em células das 3 linhagens testadas. Para o ensaio de proliferação, não houve diferença estatística entre os grupos ao longo dos tempos testados (p>0,05), embora a média de dias entre o isolamento e a quinta passagem foi menor para o grupo controle (p=0,035). As células do grupo Crio mostraram morfologia alterada. Assim, conclui-se ser possível obter células-tronco da polpa de dentes decíduos congelados pelo protocolo sugerido, sem alterações imunofenotípicas. No entanto, esse protocolo demonstrou baixas taxas de sucesso de isolamento, menor capacidade de diferenciação e de proliferação, além de alteração da morfologia celular. / Mesenchymal stem cells (MSC) became of great value for science for being capable of stimulating tissue regeneration and showing ability to proliferate and differentiate when cultured properly. Dental tissues also present MSC niches as well. Mesenchymal stem cells from the pulp of deciduous teeth are considered an easy access source during a specific period of time in the patients life, when teeth are undergoing exfoliation; therefore, very attractive for cell based therapeutics and tissue engineering. All advances seen in cell based therapies for the last years depend on cell or tissue preservation for long periods of time. Thus, storage methods must be adopted for cultures of cells and whole tissues. The most common technique to preserve cell cultures and tissues is cryopreservation with liquid nitrogen. However, fragile evidence concerns the cryopreservation of intact deciduous teeth. This research aimed to isolate, cultivate and characterize the dental pulp cells of intact cryopreserved deciduous teeth and compare to the dental pulp cells of non-cryopreserved deciduous teeth. Thirteen pairs of deciduous teeth were donated from patients in orthodontic treatment and were randomly allocated in two different groups. The first group was made of cryopreserved intact deciduous teeth (Cryo group), and in second group pulp cells were isolated from fresh teeth (Fresh group). The cells of both groups were isolated, cultivated and characterized for mesenchymal stem cell parameters, and then compared for isolation and proliferation rates, surface markers expression (CD14, CD29, CD34, CD45, CD73, CD90 and HLA-DR), differentiation ability and morphology. The culture rate was 30% for the cryopreserved group and 61% for the fresh. There were no statistical differences between the groups for the surface markers tested. Cells in both groups were capable of differentiating in the 3 mesenchymal lineages. For the proliferation assay, there was no statistical difference between groups throughout the time tested although the mean time between isolation and the fifth passage was lower for the control group (p=0,035). Cells from Cryo group showed altered morphology. The present study showed that Dental Pulp Stem Cells can be obtained from cryopreserved intact deciduous teeth without changes in the immunophenotypical profile, however low success rates for isolation, differentiation ability and morphological alterations were observed.