Infusões de células T e células NK (Natural Killer) de sangue periférico estão sendo realizadas para tratamento de malignidades. Os linfócitos propagados ex vivo, em normóxia (20% O2), são intravenosamente infundidos e precisam sobreviver a hipóxia associada a circulação venosa, da medula óssea (5% O2) e do microambiente tumoral (1% O2). O objetivo principal deste estudo foi determinar a capacidade proliferativa das células humanas T e NK em normóxia (20% O2) versus hipóxia (1% O2), por 28 dias, utilizando uma célula apresentadora de antígeno artificial (aAPC) para propagação em grau clínico. As células T expostas a hipóxia cresceram 100 vezes menos que as células T cultivadas em normóxia, enquanto que houve uma diminuição de 1000 vezes na taxa proliferativa das células NK hipóxicas, que exibiram um aumento na apoptose bem como um prejuízo na citotoxicidade. Hipóxia também induziu uma diminuição na expressão dos receptores KIR, NCR e NKG2D das células NK. Nesta mesma condição, a produção de IL-2 e IFNγ nas células T estavam diminuídas, sendo que nas células NK esse efeito foi mais acentuado. Hipóxia aumentou a expressão de genes relacionados com apoptose, angiogênese e metabolismo glicolítico, os quais estavam moderadamente aumentados nas células T, mas profundamente super-regulados nas células NK. Os níveis de ATP nas células T foram muito similares em ambas as condições de oxigênio, mas intensamente diminuídos nas células NK cultivadas em hipóxia. Também se observou, que a expressão do miR-210 induzido por hipóxia, estava super regulada nas células NK hipóxicas correlacionando com a perda da expressão da molécula NCAM/CD56. Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram um maior impacto da hipóxia sobre as atividades proliferativas e citotóxicas das células NK estimuladas por aAPCs. Estudos adicionais são necessários para o entendimento do impacto deste comportamento das células NK em condições hipóxicas sobre a imunoterapia celular adotiva. / Infusions of T cells and natural killer (NK) cells from peripheral blood (PB) are being undertaken for the treatment of malignancies. Lymphocytes are propagated ex vivo in normoxia (20% O2) and intravenously infused and must survive hypoxia associated with venous blood and bone marrow (5% O2), and the tumor environment (1% O2). The objective this study was to determine the ability of T and NK cells to proliferate under normoxia (20% O2) versus hypoxia (1% O2) over 28 days using an artificial antigen presenting cells (aAPC) to propagate clinical-grade lymphocytes. T cells continuously exposed to 4 weeks of hypoxia grew at a rate of 100-fold less than T cells cultured in normoxia while the proliferative rate of NK cells lagged by 1,000-fold, behind normoxic conditions. Hypoxic cultured NK cells exhibit an increase in apoptosis as well as a correspondent impairment in cytotoxicity. In low oxygen tension the expression of KIR, NCR, and NKG2D receptors were decreased in NK cells. In hypoxia, the production of IL-2 and IFNγ were decreased in T cell and more so in NK cell. Chronic hypoxia increased the expression of related apoptosis, glycolytic metabolism and angiogenesis genes which were moderately increased in T cells but profoundly upregulated in NK cells. ATP levels in T cell were very similar in both oxygen conditions, but profoundly diminished in NK cells under hypoxia. We also noted that hypoxia inducible miR-210 levels are up regulated in hypoxic NK cells correlating with loss of CD56 expression. Taken together, this data show that a greater impact of hypoxia on proliferative and cytotoxic activity of NK cells activated by artificial antigen-presenting cells. More studies are needed to understand the impact of this behavior on the cell adoptive immunotherapy.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T05:49:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 294074.pdf: 1739239 bytes, checksum: f9dbbd3514607cc628d58c10c60f0629 (MD5)

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:52Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10949.pdf: 1710290 bytes, checksum: 4f0e0bd77ebdd477f06366315fe3b8f9 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As características da resposta imunológica em pacientes infectados pelo Mycobacterium leprae e pelo virus da imunodeficiência humana (HIV) não estão bem elucidadas. O objetivo geral desta tese foi avaliar diferentes parâmetros imunológicos na interação destas doenças. Inicialmente avaliamos a imunidade celular em quatro grupos de pacientes dividos em: indivíduos saudáveis, monoinfectados pelo Mycobacterium leprae, monoinfectados pelo virus da imunodeficiência humana e coinfectados pelo M. leprae e HIV. Observamos que o grupo coinfectado apresentou diminuição da razão de células CD4:CD8, aumento de níveis de ativação em células T CD8+, aumento da razão de células T V1:V2 e diminuição da porcentagem de células dendríticas plasmocitóides, comparadas com o grupo de indivíduos monoinfectados pelo HIV-1. A produção de IL-4 por linfócitos T CD4+ foi correlacionado positivamente com a porcentagem de subpopulações de memória efetora de células T CD4+, sugerindo diferenciação antigênica da população de células T em ambas as infecções de HIV-1 e M. leprae. A coinfecção por M. leprae pode exacerbar a imunopatologia da doença induzida pelo HIV-1. Houve uma tendência na expressão de citocinas Th2 na resposta de células T CD4+ em ambas infecções de M. leprae e HIV-1, mas não obtivemos efeitos aparentes nos pacientes coinfectados. No trabalho subsequente, avaliamos de forma quantitativa e qualitativa as células NKT da imunidade inata nos indivíduos saudáveis e infectados pelo HIV. A frequência de células NKT que secretam IFN- e TNF- estava significantemente diminuída em pacientes HIV-1 quando comparados com os indivíduos saudáveis. A magnitude da resposta de IFN- teve correlação inversa com o número de anos da infecção, sugerindo que a função das células NKT está diminuída progressivamente ao longo do tempo. Não houve alteração na resposta das células NKT dos indivíduos infectados pelo HIV após tratamento com Forbol12-Miristato13-Acetato (PMA) e ionomicina, sugerindo um defeito no sinal do TCR prejudicando a produção de citocina. Foi observado uma diminuição na magnitude da resposta com produção de citocinas Th1 pelas células NKT quando correlacionado com a expressão de CD161, sugerindo um mecanismo inibitório deste receptor na regulação da resposta de células NKT. Por último, nós demonstramos que pacientes coinfectados tem redução da frequência de células NKT no sangue periférico, quando comparados com indivíduos saudáveis e pacientes monoinfectados pelo M. lepare. Por outro lado, as células NKT de pacientes coinfectados secretam mais IFN- quando comparadas com pacientes monoinfectados pelo M. lepare. Estes resultados sugerem que as células NKT têm atividade aumentada em pacientes coinfectados, contudo em frequência diminuída no sangue periférico. / The immune response characteristics in patients infected with Mycobacterium leprae and human immunodeficiency virus (HIV) is not elucidated. The aim of this study was to evaluate different immune parameters in the overlapping of both diseases. In the first paper we observaded The co-infected group exhibited lower CD4:CD8 ratio, higher levels of CD8 T-cell activation, increased V1: V2 T cell ratio and lower percentage of plasmacytoid dendritic cells, compared to HIV-1 infected subjects. Across infected groups, IL-4 production by CD4 T lymphocytes was positively correlated with the percentage of effector memory CD4 T cells, suggesting antigenically-driven differentiation of such T cell population in both HIV-1 and M. leprae infections. Co-infection with M. leprae may exacerbate the immunopathology of HIV-1 induced disease. A T helper 2 (Th2) bias in the CD4 T-cell response was evident in both HIV-1-infection and leprosy, but no additive effect was apparent in co-infected patients. Subsequently, we evaluated quantitatively and qualitatively the NKT cells from innate immune response in HIV-infected subjects and healthy controls. The frequencies of NKT cells secreting IFN- and TNF- were significantly lower in HIV-1-infected subjects and the magnitude of the IFN- production was negatively correlated with the number of years of infection, suggesting that NKT cell function is progressively lost over time. NKT cell responses in HIV-1 infected subjects were essentially normal after treatment with Phorbol12-Myristate13- Acetato (PMA) and ionomycin, suggesting that defective TCR-signaling was the underlying defect in the cytokine production. The lower levels of the NKT Th1 response correlated with higher CD161 expression, suggesting a role for this inhibitory receptor in regulating NKT cell responsiveness. Finally, we have investigated the NKT cells in the context of HIV and M. leprae coinfection. The volunteers were enrolled into four groups: twenty-seven healthy controls, seventeen HIV seropositive patients, seventeen patients with leprosy, and twenty-three co-infected patients with leprosy and HIV-1 infection. Flow cytometric and ELISPOT assays were performed in stored PBMC. We demonstrated that coinfected patients have reduced NKT cells in the peripheral blood when compared to healthy subjects and leprosy monoinfected patients. On the other hand, NKT cells from coinfected patients secrete more IFN- when compared to leprosy monoinfected patients. These results suggest that NKT cells are highly active in coinfected patients, although occurring in lower frequency in the peripheral blood. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-04-15T12:58:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luciene_silva_ioc_mest_2011.pdf: 1201743 bytes, checksum: d78d095464e3436c4b759e85bee366a4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A malária é a doença parasitária que mais causa mortes em todo o mundo, representando um grave problema de saúde pública. Os mecanismos exatos envolvidos na patogênese e na produção de uma resposta imune eficaz ainda não foram bem esclarecidos. O sistema imune inato constitui a primeira linha de defesa do organismo contra infecções e as células NK são uma importante subpopulação de linfócitos atuantes na fase aguda da resposta imunológica na malária. O controle da ação das células NK se dá através de receptores de membrana, dentre os quais estão os receptores KIR que reconhecem moléculas HLA de classe I expressas pela maioria das células do organismo. Esses receptores, altamente polimórficos, desempenham função significante no controle da resposta imune inata e adaptativa de cada indivíduo. Dentro deste contexto, nosso trabalho caracterizou geneticamente a frequência dos receptores KIR e seus ligantes HLA-I de indivíduos (n=377) naturalmente expostos à malária (Porto Velho - RO), verificando uma possível associação entre a presença desses genes e a infecção. Após a extração de DNA, a genotipagem da população estudada foi realizada através da técnica PCRSSO e a leitura pelo equipamento Luminex. Observamos uma maior frequência dos genes KIR2DL1, 3DL1, 2DS4 e 2DL3 (>89% em todos), HLA-C1, -Bw4 e -C2 (>66% em todos) e os pares KIR2DL2_3/C1, KIR3DL1/Bw4 e KIR2DL1/C2 (>66% em todos) na população de Porto Velho, que é semelhante às de outras regiões brasileiras. Não observamos influência do perfil da distribuição gênica dos receptores KIR e de seus ligantes HLA (-A, -B e -C) na susceptibilidade a malária Caracterizamos 48 genótipos KIR, todos com distribuição cosmopolita. Os mais frequentes foram os genótipos 42/BAF-1 (30,8%) e 33/BAF-2 (15,2%). Nos indivíduos do grupo dos nativos de Porto Velho foram encontradas: uma maior variabilidade genotípica (43/48); uma maior frequência do genótipo 33/BAF-2 quando comparado aos migrantes (P<0,01); e um grande número de genótipos exclusivos desse grupo (27/43). Os indivíduos nativos portadores de genótipos exclusivos relataram um menor número de malárias anteriores e um maior tempo desde a última infecção, sugerindo que esses genótipos possam conferir uma maior proteção à malária. Nos indivíduos com malária e portadores de genótipos com maior gradiente de genes inibidores apresentavam maiores níveis plasmáticos de INF-\03B3 (r = 0,3328; P<0,013), sugerindo que a presença desses genótipos não esteja associada à produção desta citocina. Além disso, esses indivíduos apresentavam uma maior parasitemia (r = 0,3262; P = 0,001), sugerindo que a presença desses genes inibidores possa estar associada a um menor controle/eliminação dos parasitos. Observamos que a presença do par KIR2DS2_C1 estava associado a níveis de parasitemia mais elevados (P = 0,01), indicando que a presença desse par possa também estar associada a um menor controle/eliminação dos parasitos. Os dados obtidos nesse trabalho poderão contribuir para futuros estudos sobre o impacto funcional desses genes na regulação da resposta imune, na relação com a incidência e na evolução clínica da doença não só na malária como de outras doenças infecciosas / Malaria remains one of the most important parasitic disease that causes more deaths in the world, representing a serious public health problem. However, the mechanisms involved in the pathogenesis and /or production of an effective immune res ponse remain unclear. The innate immune system is the first line of defense against infection and NK cells are an important subpopulation of lymphocytes in the acute phase of active immune response in malaria. The control of the action of NK cells is via m embrane receptors, among which are the KIR receptors that recognize HLA class I molecules expressed by the majority of cells of the human body. These receptors, highly polymorphic, play a significant role in controlling innate and adaptive immune response of each individual. Within this context, our work characterized the genetic frequency of KIR receptors and their ligands HLA - I in subjects (n = 377) naturally exposed to malaria (Porto Velho - RO) and the association between the presence of these genes and infection. After DNA extraction, genotyping of the population was performed by PCR - SSO and Luminex equipment for reading. We observed a higher frequency of the genes KIR2DL1, 3DL1, 2DS4 and 2DL3 (> 89% in all), HLA - C1, - Bw4 and - C2 (> 66% in all) and pairs KIR2DL2_3/C1, KIR3DL1/Bw4 and KIR2DL1 / C2 (> 66% in all) in the population of Porto Velho, which is similar to other Brazilian regions. No influence in the profile of the gene distribution and its KIR ligands (HLA - A, - B and - C) and susceptibility to malar ia. We identified 48 KIR profile, all with a cosmopolitan distribution. The most frequent profile were 42/BAF - 1 (30.8%) and 33/BAF - 2 (15.2%). Individuals in the group of natives of Porto Velho presented a greater genotypic variability (43/48), a higher fr equency of genotype 33/BAF - 2 compared to migrants (P <0.01), and a large number of profile exclusive to that group (27/43). Individuals native presenting a exclusive profile reported less malarias in the past and longer time since the last infection, sugg esting that these profile may confer protection against malaria. In individuals with malaria and those carrying high gradient of gene inhibitors had higher plasma levels of INF - γ (r = 0.3328, P <0.013), suggesting that the presence of these profile are not associated with the production of this cytokine. In addition, these individuals had a higher parasitemia (r = 0.3262, P = 0.001), suggesting that the presence of inhibitors of these genes may be associated with a lower control / elimination of parasites. We observed that the presence of the pair KIR2DS2_C1 was associated with higher levels of parasitemia (P = 0.01), indicating that the presence of this pair could also be associated with lack of control / elimination of parasites. The data obtained in this work may contribute to future studies on the functional impact of these genes in regulating the immune response in relation to the incidence and clinical course of the disease not only in malaria as well as in other infectious diseases.

Base teórica: A sepse é uma síndrome heterogênea, definida como disfunção orgânica que ameaça à vida, causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção. É um problema de saúde mundial, graças à sua alta prevalência, morbimortalidade associada, além de custos para seu tratamento. As células Natural Killer (NK) fazem parte do sistema imune inato reconhecendo moléculas de HLA de classe I em células alvo, através de seus receptores de membrana killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR). A intensidade da resposta à infecção pode variar entre indivíduos, logo pode-se considerar que esta seja determinada por bases genéticas, e estas influenciem na ocorrência de sepse e variabilidade nos desfechos. Objetivos: Avaliar a associação entre os genes KIR e os ligantes HLA em pacientes críticos, comparando pacientes com sepse e controles não sépticos internados na mesma UTI. Métodos: Foi examinado o polimorfismo de 16 genes KIR e seus ligantes HLA em 271 pacientes críticos, caucasóides, sendo 211 pacientes com sepse e 60 controles, pela técnica de PCR-SSO e PCR-SSP, respectivamente. Resultados: Os genes ativadores KIR2DS1 e KIR3DS1 foram mais frequentes nos controles que nos pacientes com sepse (41,23% versus 55,00%, e 36,49% versus 51,67%; p = 0.041 e 0,025, respectivamente). Estes resultados fornecem informação inicial sobre o papel de polimorfismos de KIR na sepse, sugerindo que este possa ser um potencial marcador diagnóstico ou prognóstico da doença. / Background: Sepsis is a heterogeneous syndrome, defined a life-threatening organic dysfunction caused by a dysregulated host response to infection. Sepsis is a global health problem, due to its high prevalence, associated morbidity and mortality, and costs for its treatment. Cells Natural Killer (NK) cells are part of the innate immune system that recognize HLA class I molecules on target cells via membrane receptors called killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR). The intensity of the response to an infection may vary among individuals and might be influenced genetic features affecting sepsis occurrence and variability in outcomes. Objectives: To evaluate the association between KIR genes and HLA ligands in critically ill patients, comparing patients with sepsis and without sepsis admitted to the same ICU. Methods: We examined the polymorphism of 16 KIR genes and their HLA ligands in 271 critically ill patients, Caucasians, and 211 patients with sepsis and 60 controls by PCR-SSO and PCR-SSP, respectively. Results: Activating KIR2DS1 and KIR3DS1 genes were more common in controls than in patients with sepsis (41.23% versus 55.00% and 36.49% versus 51.67%, p = 0.041 and 0.025, respectively). These results provide initial information on the role of polymorphism of KIR in sepsis, suggesting that this may be a potential diagnostic or prognostic marker of the disease.

Meduloblastoma (MB) e Tumor Teratóide Rabdóide Atipico (TTRA) são tumores malignos do sistema nervoso central (SNC) que ocorrem na infância. Embora tenha havido um aumento na sobrevida, recorrência e metástases são frequentes e as opções terapêuticas poucas e tóxicas para crianças. Uma alternativa à terapia tradicional é a imunoterapia, que pode contornar os efeitos tóxicos associados à radioterapia e quimioterapia. De uma forma geral a imunoterapia depende da presença de antígenos associados a tumor (TAA) e/ou processamento de antígenos expressos pelo HLA classe I. No entanto, TAA para MB ou ATRT não estão bem definidos e tecidos neuronais tem a expressão de HLA classe I muito baixa. As células Natural Killer (NK) não dependem de TAA para citólise e são particularmente ativas na ausência de moléculas do HLA classe I tendo, portanto, potencial para o tratamento dessas doenças. Atualmente as barreiras para a aplicação clínica de células NK são quantitativas e qualitativas. Com o intuito de quebrar a barreira quantitativa foi criada uma plataforma tecnológica para a expansão das NK ex vivo. Essa plataforma consiste no co-cultivo de células mononucleares de sangue periférico com células apresentadoras de antígeno artificiais (aAPC), que expressam Interleucina 21 ligada à membrana. Com essa tecnologia foi possível expandir células NK na ordem de 40.000 vezes. Também foi demonstrada a persistência das células NK expandidas in vitro por 3 semanas após infusão em cérebro murino e que essas células expressam altos níveis de citocinas antitumorais e estimulantes do sistema imune: Interferon gama e Fator de Necrose Tumoral alfa. Finalmente, foi demonstrada a atividade citolítica das células NK tanto in vitro, contra um painel de células de MB e ATRT, quanto in vivo em um modelo murino de MB. Os resultados obtidos fornecem a primeira evidência pré-clínica que provê suporte ao uso de células NK expandidas usando essa plataforma tecnológica no combate a cânceres de cérebro pediátricos. Com base nesses dados, nosso grupo no MD Anderson Cancer Center iniciou um ensaio clínico fase I para testar a segurança e eficácia de administração locorregional de células NK expandidas usando aAPC para o tratamento de tumores pediátricos da fossa posterior do cérebro. / Medulloblastoma (MBs) and Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor (ATRT) are malignant pediatric brain tumors. Although survival has improved, recurrence and metastasis are frequent with few therapeutic options for these children. Immunotherapy is an alternative to traditional therapies that may circumvent the potential toxicities associated with traditional chemotherapy and radiation approaches. Many immune based therapies rely on the presence of tumor associated antigens (TAAs) and/or antigen processing and class I human leukocyte antigen (HLA I) expression. However, TAAs for MB are not well defined and neuronal tissues have very low HLA I expression. Natural killer (NK) cells do not rely on TAA for cytolysis and therefore have potential for the treatment of these diseases. The current barriers to clinical application of NK therapy are quantitative and qualitative. To overcome quantitative barriers, we have worked with a platform technology for the ex vivo expansion of NK cells through co-culture of peripheral blood mononuclear cells with artificial antigen presenting cells expressing membrane-bound IL-21 (mbIL21) to promote a 40,000-fold expansion of NK cells. We also demonstrate prolonged life-span of ex vivo expanded NK cells and persistence for up to 3 weeks post-infusion in the murine brain. These cells express high levels of immune stimulatory and anti-tumor cytokines - interferon gamma and TNF-alpha following activation. Finally we demonstrate NK cytolytic activity in vitro against a panel of primary and established ATRT and MB cells and in vivo following locoregional delivery in a mouse orthotopic model of MB. Our data provide the first pre-clinical evidence supporting the use of mbIL21 expanded NK cells against pediatric brain tumors. Based on this data we have initiated a novel Phase I clinical trial at MD Anderson Cancer Center to assess the safety and efficacy of locoregional delivery of mbIL21 expanded NK cells for the treatment of posterior fossa pediatric brain tumors.

O vitiligo é uma doença dermatológica de causa desconhecida. O aparecimento se dá através de manchas branco-nacaradas na pele, ocorridas pela morte ou redução na funcionalidade das células epidérmicas, os melanócitos, que produzem a melanina, pigmento cutâneo. As células Natural Killer (NK) fazem parte do sistema imune inato e através de seus receptores KIR (Killer immunoglobulin-like-receptors) reconhecem moléculas de HLA (Human leukocyte antigen) classe I presentes nas células. Quando não há o reconhecimento do HLA classe I, como em células tumorais ou infectadas por vírus, a célula NK induz a morte da célula alvo. Uma das teorias para essa doença é a imunológica, a qual admite que o vitiligo seja doença autoimune pela formação de anticorpos antimelanócitos, podendo ser associado a outras doenças autoimunes. O objetivo deste estudo foi investigar polimorfismos dos genes KIR e HLA e sua associação com pacientes com vitiligo comparando com um grupo controle. Foram genotipados 112 pacientes com diagnóstico de vitiligo e 250 indivíduos saudáveis para 16 genes KIR e seus ligantes HLA por PCR-SSO e PCR-SSP respectivamente. Nossos resultados mostraram um fator de risco para a doença na interação do gene ativador KIR2DS1 com o seu ligante C2 (P=0,015; OR: 2,06). Também houve uma associação significativa do gene ativador KIR2DS1 com o ligante heterozigoto C1/C2 (P=0,025; OR: 2,26). A interação KIR2DS1/C2 está presente em 52,8% dos pacientes com vitiligo e em 35,2% do grupo controle, já a interação KIR2DS1/C1/C2 está presente em 54,7% dos pacientes com vitiligo e 34,9% do grupo controle. Nossos resultados sugerem um possível fator de risco do gene ativador KIR2DS1 com o seu ligante C2, sendo essa combinação uma possível susceptibilidade à doença. / Vitiligo is a skin disease of unknown cause. The main symptom of vitiligo is white patches on the skin. Which are caused by destruction of pigment-forming cells (melanocytes). Natural killer (NK) cells are part of the innate immune system and they recognize class I HLA molecules (human leukocyte antigen) through their KIR receptors (killer-cell immunoglobulin-like-receptors). When class I HLA molecules are not recognized, e.g.: tumour cells or virus-infected cells, NK cells induce the death of target cells. One of the possible aetiologies for this disease is the immune cause. According to this theory, vitiligo is an autoimmune disease caused by the production of anti-melanocyte antibodies and it may be associated with other autoimmune diseases. The objective of the present study was to investigate KIR and HLA gene polymorphisms and their association with vitiligo comparing with a control group. We genotyped 112 patients diagnosed with vitiligo and 250 healthy individuals for 16 KIR genes and their HLA ligands using PCR-SSO and PCR-SSP respectively. Our findings showed a risk factor for vitiligo in the interaction between the activating KIR2DS1 gene and its C2 ligand (P=0.015; OR: 2.06). There was also a significant association of the activating KIR2DS1 gene with the heterozygous C1/C2 ligand (P=0.025; OR: 2.26). The KIR2DS1/C2 interaction was found in 52.8% of vitiligo patients and in 35.2% of the control group; whereas the KIR2DS1/C1/C2 interaction was found in 54.7% of vitiligo patients and 34.9% of the control group. These findings suggest a possible risk factor related to the interaction between the activating KIR2DS1 gene and its C2 ligand, since this combination may be a disease susceptibility factor.

Base teórica: A sepse é uma síndrome heterogênea, definida como disfunção orgânica que ameaça à vida, causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção. É um problema de saúde mundial, graças à sua alta prevalência, morbimortalidade associada, além de custos para seu tratamento. As células Natural Killer (NK) fazem parte do sistema imune inato reconhecendo moléculas de HLA de classe I em células alvo, através de seus receptores de membrana killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR). A intensidade da resposta à infecção pode variar entre indivíduos, logo pode-se considerar que esta seja determinada por bases genéticas, e estas influenciem na ocorrência de sepse e variabilidade nos desfechos. Objetivos: Avaliar a associação entre os genes KIR e os ligantes HLA em pacientes críticos, comparando pacientes com sepse e controles não sépticos internados na mesma UTI. Métodos: Foi examinado o polimorfismo de 16 genes KIR e seus ligantes HLA em 271 pacientes críticos, caucasóides, sendo 211 pacientes com sepse e 60 controles, pela técnica de PCR-SSO e PCR-SSP, respectivamente. Resultados: Os genes ativadores KIR2DS1 e KIR3DS1 foram mais frequentes nos controles que nos pacientes com sepse (41,23% versus 55,00%, e 36,49% versus 51,67%; p = 0.041 e 0,025, respectivamente). Estes resultados fornecem informação inicial sobre o papel de polimorfismos de KIR na sepse, sugerindo que este possa ser um potencial marcador diagnóstico ou prognóstico da doença. / Background: Sepsis is a heterogeneous syndrome, defined a life-threatening organic dysfunction caused by a dysregulated host response to infection. Sepsis is a global health problem, due to its high prevalence, associated morbidity and mortality, and costs for its treatment. Cells Natural Killer (NK) cells are part of the innate immune system that recognize HLA class I molecules on target cells via membrane receptors called killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR). The intensity of the response to an infection may vary among individuals and might be influenced genetic features affecting sepsis occurrence and variability in outcomes. Objectives: To evaluate the association between KIR genes and HLA ligands in critically ill patients, comparing patients with sepsis and without sepsis admitted to the same ICU. Methods: We examined the polymorphism of 16 KIR genes and their HLA ligands in 271 critically ill patients, Caucasians, and 211 patients with sepsis and 60 controls by PCR-SSO and PCR-SSP, respectively. Results: Activating KIR2DS1 and KIR3DS1 genes were more common in controls than in patients with sepsis (41.23% versus 55.00% and 36.49% versus 51.67%, p = 0.041 and 0.025, respectively). These results provide initial information on the role of polymorphism of KIR in sepsis, suggesting that this may be a potential diagnostic or prognostic marker of the disease.

Infusões de células T e células NK (Natural Killer) de sangue periférico estão sendo realizadas para tratamento de malignidades. Os linfócitos propagados ex vivo, em normóxia (20% O2), são intravenosamente infundidos e precisam sobreviver a hipóxia associada a circulação venosa, da medula óssea (5% O2) e do microambiente tumoral (1% O2). O objetivo principal deste estudo foi determinar a capacidade proliferativa das células humanas T e NK em normóxia (20% O2) versus hipóxia (1% O2), por 28 dias, utilizando uma célula apresentadora de antígeno artificial (aAPC) para propagação em grau clínico. As células T expostas a hipóxia cresceram 100 vezes menos que as células T cultivadas em normóxia, enquanto que houve uma diminuição de 1000 vezes na taxa proliferativa das células NK hipóxicas, que exibiram um aumento na apoptose bem como um prejuízo na citotoxicidade. Hipóxia também induziu uma diminuição na expressão dos receptores KIR, NCR e NKG2D das células NK. Nesta mesma condição, a produção de IL-2 e IFNγ nas células T estavam diminuídas, sendo que nas células NK esse efeito foi mais acentuado. Hipóxia aumentou a expressão de genes relacionados com apoptose, angiogênese e metabolismo glicolítico, os quais estavam moderadamente aumentados nas células T, mas profundamente super-regulados nas células NK. Os níveis de ATP nas células T foram muito similares em ambas as condições de oxigênio, mas intensamente diminuídos nas células NK cultivadas em hipóxia. Também se observou, que a expressão do miR-210 induzido por hipóxia, estava super regulada nas células NK hipóxicas correlacionando com a perda da expressão da molécula NCAM/CD56. Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram um maior impacto da hipóxia sobre as atividades proliferativas e citotóxicas das células NK estimuladas por aAPCs. Estudos adicionais são necessários para o entendimento do impacto deste comportamento das células NK em condições hipóxicas sobre a imunoterapia celular adotiva. / Infusions of T cells and natural killer (NK) cells from peripheral blood (PB) are being undertaken for the treatment of malignancies. Lymphocytes are propagated ex vivo in normoxia (20% O2) and intravenously infused and must survive hypoxia associated with venous blood and bone marrow (5% O2), and the tumor environment (1% O2). The objective this study was to determine the ability of T and NK cells to proliferate under normoxia (20% O2) versus hypoxia (1% O2) over 28 days using an artificial antigen presenting cells (aAPC) to propagate clinical-grade lymphocytes. T cells continuously exposed to 4 weeks of hypoxia grew at a rate of 100-fold less than T cells cultured in normoxia while the proliferative rate of NK cells lagged by 1,000-fold, behind normoxic conditions. Hypoxic cultured NK cells exhibit an increase in apoptosis as well as a correspondent impairment in cytotoxicity. In low oxygen tension the expression of KIR, NCR, and NKG2D receptors were decreased in NK cells. In hypoxia, the production of IL-2 and IFNγ were decreased in T cell and more so in NK cell. Chronic hypoxia increased the expression of related apoptosis, glycolytic metabolism and angiogenesis genes which were moderately increased in T cells but profoundly upregulated in NK cells. ATP levels in T cell were very similar in both oxygen conditions, but profoundly diminished in NK cells under hypoxia. We also noted that hypoxia inducible miR-210 levels are up regulated in hypoxic NK cells correlating with loss of CD56 expression. Taken together, this data show that a greater impact of hypoxia on proliferative and cytotoxic activity of NK cells activated by artificial antigen-presenting cells. More studies are needed to understand the impact of this behavior on the cell adoptive immunotherapy.

OBJETIVOS: Avaliar o perfil e o número absoluto e percentual de células NK verdadeiras (CD56+CD16+CD3-) e de células NK e NKT (CD56+) no sangue periférico de uma coorte de pacientes com artrite reumatóide (AR) antes e durante o tratamento com rituximabe (RTX). MÉTODOS: Foram analisados dez pacientes do grupo controle (doadores de sangue) e dez pacientes com AR que receberam duas infusões de RTX 1g separadas por intervalo de 14 dias. As análises imunofenotípicas para avaliação do perfil e quantificação de células NK foram realizadas pré e após a infusão ou até a recaída clínica. Pacientes respondedores e não respondedores foram classificados de acordo com os critérios do Colégio Americano de Reumatologia (ACR) em 6 meses. RESULTADOS: A quantidade de células NK verdadeiras não demonstrou variação significativa pré e após o tratamento com RTX. Contudo, houve aumento percentual de células CD56+ entre o primeiro e o segundo mês após a infusão com RTX. Além disso, os pacientes respondedores apresentaram uma tendência de aumento do número absoluto de células NK verdadeiras após dois meses de tratamento. Já em relação ao grupo controle, observou-se um aumento significativo do número de células NK basais nos pacientes com AR (p<0,05). CONCLUSÕES: Foi identificada uma tendência de aumento nos valores absolutos de células NK verdadeiras entre os pacientes respondedores no segundo mês após a infusão com RTX. Não foi identificada uma variação significativa no perfil e quantidade de células NK nos pacientes com AR pré e após o tratamento com RTX. Contudo, foi observado que os pacientes com AR possuem uma quantidade maior de células NK do que os controles, sugerindo um possível envolvimento destas células na AR. / OBJECTIVES: To assess the profile as well as the absolute number and percentage of true NK cells (CD56+CD16+CD3-), and NK and NKT cells (CD56+) in the peripheral blood of a cohort of patients with rheumatoid arthritis (RA) before and during rituximab (RTX) therapy. METHODS: Ten control patients (blood donors) and ten patients with RA were assessed. The latter group received two intravenous infusions of 1g RTX, separated by a 14 day interval. Immunophenotypic analyses of NK cells were conducted before and after infusion, or until clinical relapse. After six months, respondents and nonrespondents were reassessed according to American Rheumatology Criteria (ARC). RESULTS: The number of true NK cells did not significantly change after treatment with RTX. However, an increase in the percentage of CD56+ cells was observed between the first and second month after RTX infusion. Respondents also displayed a tendency toward an increased number of true NK cells after two months of treatment. At baseline, the number of NK cells was also found to be significantly higher in patients with RA than in control individuals (p<0.05). CONCLUSIONS: Respondents displayed a tendency toward an increase in the absolute number of true NK cells in the second month after RTX infusion. No significant changes in the profile and frequency of NK cells were found between preand post-RTX treatment assessments of patients with RA. However, it was found that patients with RA have a higher number of NK cells than control partcipants, suggesting a possible role of these cells in RA.