O vitiligo é uma doença dermatológica de causa desconhecida. O aparecimento se dá através de manchas branco-nacaradas na pele, ocorridas pela morte ou redução na funcionalidade das células epidérmicas, os melanócitos, que produzem a melanina, pigmento cutâneo. As células Natural Killer (NK) fazem parte do sistema imune inato e através de seus receptores KIR (Killer immunoglobulin-like-receptors) reconhecem moléculas de HLA (Human leukocyte antigen) classe I presentes nas células. Quando não há o reconhecimento do HLA classe I, como em células tumorais ou infectadas por vírus, a célula NK induz a morte da célula alvo. Uma das teorias para essa doença é a imunológica, a qual admite que o vitiligo seja doença autoimune pela formação de anticorpos antimelanócitos, podendo ser associado a outras doenças autoimunes. O objetivo deste estudo foi investigar polimorfismos dos genes KIR e HLA e sua associação com pacientes com vitiligo comparando com um grupo controle. Foram genotipados 112 pacientes com diagnóstico de vitiligo e 250 indivíduos saudáveis para 16 genes KIR e seus ligantes HLA por PCR-SSO e PCR-SSP respectivamente. Nossos resultados mostraram um fator de risco para a doença na interação do gene ativador KIR2DS1 com o seu ligante C2 (P=0,015; OR: 2,06). Também houve uma associação significativa do gene ativador KIR2DS1 com o ligante heterozigoto C1/C2 (P=0,025; OR: 2,26). A interação KIR2DS1/C2 está presente em 52,8% dos pacientes com vitiligo e em 35,2% do grupo controle, já a interação KIR2DS1/C1/C2 está presente em 54,7% dos pacientes com vitiligo e 34,9% do grupo controle. Nossos resultados sugerem um possível fator de risco do gene ativador KIR2DS1 com o seu ligante C2, sendo essa combinação uma possível susceptibilidade à doença. / Vitiligo is a skin disease of unknown cause. The main symptom of vitiligo is white patches on the skin. Which are caused by destruction of pigment-forming cells (melanocytes). Natural killer (NK) cells are part of the innate immune system and they recognize class I HLA molecules (human leukocyte antigen) through their KIR receptors (killer-cell immunoglobulin-like-receptors). When class I HLA molecules are not recognized, e.g.: tumour cells or virus-infected cells, NK cells induce the death of target cells. One of the possible aetiologies for this disease is the immune cause. According to this theory, vitiligo is an autoimmune disease caused by the production of anti-melanocyte antibodies and it may be associated with other autoimmune diseases. The objective of the present study was to investigate KIR and HLA gene polymorphisms and their association with vitiligo comparing with a control group. We genotyped 112 patients diagnosed with vitiligo and 250 healthy individuals for 16 KIR genes and their HLA ligands using PCR-SSO and PCR-SSP respectively. Our findings showed a risk factor for vitiligo in the interaction between the activating KIR2DS1 gene and its C2 ligand (P=0.015; OR: 2.06). There was also a significant association of the activating KIR2DS1 gene with the heterozygous C1/C2 ligand (P=0.025; OR: 2.26). The KIR2DS1/C2 interaction was found in 52.8% of vitiligo patients and in 35.2% of the control group; whereas the KIR2DS1/C1/C2 interaction was found in 54.7% of vitiligo patients and 34.9% of the control group. These findings suggest a possible risk factor related to the interaction between the activating KIR2DS1 gene and its C2 ligand, since this combination may be a disease susceptibility factor.

Nosso estudo teve como um dos objetivos analisarmos a frequência do polimorfismo dos genes KIR na população caucasóide do Rio Grande do Sul e comparamos com resultados de outros Estados do Brasil e também de outros países. Em um segundo momento, avaliar a associação entre os genes KIR em pacientes com diabete Mellitus tipo 1 (DM1) e controles saudáveis. As células natural killer (NK) fazem parte do sistema imune inato e reconhecem as moléculas HLA (antígeno leucocitário humano) de classe I em células-alvo através de seus receptores de membrana. Os receptores principais das células NK são conhecidos como receptores killer do tipo imunoglobulina (KIR) e estão localizados no cromossomo 19q13.4. Estão divididos em grupos funcionais inibidores e ativadores. No primeiro artigo, o objetivo era de analisar os genes KIR e HLA -A, -B e -Cw em 200 indivíduos saudáveis do Rio Grande do Sul pela técnica PCR-SSP. A população do Sul do Brasil demonstrou similaridades com Estados mais próximos geograficamente, e diferenças principalmente com o norte e nordeste. O gene KIR2DS5 foi o menos frequente na população estudada, e a interação KIR ⁄HLA foi mais comum na associação 2DS1-⁄2DL1+⁄C2+. No segundo artigo, analisamos 15 genes KIR e os alelos do sistema HLA classe I em 248 pacientes caucasóides brasileiros com DM1 e em 250 controles saudáveis, usando a técnica de PCR com primers específicos (PCR-SSP). O genótipo 2DL1/C2+ foi mais comum em controles (p=0.001), assim como o haplótipo KIR2DL2/DR3/DR4+ e KIR2DL2/DR3+ (p<0.001; p<0.001).

Embora a obesidade esteja associada à disfunção imune, com incidência aumentada de infecções e alguns tipos de cânceres, há poucos estudos que avaliaram parâmetros imunológicos em pacientes obesos graves. Além disso, há um número limitado de trabalhos analisando o efeito da perda de peso sobre parâmetros imunológicos na obesidade grave. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da perda de peso de pacientes com obesidade grau III submetidos à cirurgia de derivação gastrojejunal em Y de Roux (DGJYR) em parâmetros imunológicos. A produção de citocinas associadas com a resposta imune adquirida (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN-) e inata (TNF- e IL-6) por células mononucleares de sangue periférico (PBMC), o perfil das populações de linfócitos e a atividade citotóxica de células natural killer (NK), além de citocinas associadas a sua função e desenvolvimento (IL-12 e IL-18), foram avaliados em vinte e oito pacientes não diabéticos, sedentários, com obesidade grau III (20 mulheres e 8 homens, com média de idade de 39,9 ± 10,9 anos e IMC de 49,5 ± 7,1kg/m2) no pré-operatório e 6 meses após a cirurgia. As PBMC foram estimuladas com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA) e as citocinas produzidas foram quantificadas por ELISA. O perfil das populações de linfócitos foi avaliado por citometria de fluxo. A citotoxicidade mediada por células NK foi determinada pelo ensaio de liberação de LDH por células alvo K562. A perda de peso foi de 35,3 ± 4,5 kg, com uma significativa redução no IMC seis meses após a cirurgia (-12,9 ± 0,9 kg/m2, p< 0,001). Nenhuma das populações de linfócitos analisadas apresentou modificação no 6º mês após a cirurgia. Observou-se aumento significativo da proliferação de linfócitos seis meses após a cirurgia (p= 0,0026). Houve aumento pósoperatório nas concentrações de IFN-, IL-12 e IL-18 produzidas por PBMC após estímulo com PHA, enquanto a IL-2 apresentou uma tendência ao aumento (p= 0,07). As demais citocinas não apresentaram variação significativa. A atividade citotóxica das células NK aumentou seis meses após a cirurgia [17,1 ± 14,7% no pré vs 51,8 ± 11,3% 6 meses pósoperatório, na proporção 40:1 (célula NK:célula alvo); p< 0,001], mostrando recuperação quando se compara aos valores obtidos em indivíduos controle, pareados por idade e sexo, de peso normal [proporção 40:1 (célula NK:célula alvo) de 45,4 ± 7,8%]. Houve aumento de atividade citotóxica em todos os pontos da curva no pós-operatório em cerca de 79% da amostra (22 pacientes). Os resultados obtidos demonstram que a perda de peso induzida por DGJYR aumenta a produção de algumas citocinas relacionadas com a função das células NK e melhora a sua atividade citotóxica. As alterações na função de células NK e do nível de citocinas envolvidas com a atividade destas células podem explicar a propensão ao desenvolvimento de infecções e cânceres associados com a obesidade. Os dados obtidos neste estudo sugerem que a cirurgia bariátrica pode ter impacto positivo sobre estes fatores. / Although obesity is related to immune dysfunction, with a higher incidence of infections and some types of cancer, few studies have evaluated immunological parameters in severely obese patients. Moreover, a limited set of studies have analyzed the effect of weight loss in immunological parameters in severely obese patients. Thus, the objective of this thesis was to evaluate the influence of weight loss induced by Roux en-Y gastric bypass in patients with grade III obesity in immunological parameters. The production of cytokines associated with acquired (IL-2, IL-4, IL-10 and IFN-) and innate (TNF- e IL-6) immune responses from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), the profile of lymphocytes populations and the cytotoxic activity of natural killer cells (NK), besides cytokines related with NK cell cytotoxic function and development (IL-12 e IL-18), were analyzed in 28 non-diabetic and sedentary patients with grade III obesity (20 women and 8 men, 39,9 ± 10,9 years and BMI 49,5 ± 7,1 kg/m2) before and 6 months after RYGB. PBMCs were stimulated with the mitogen phytohemagglutinin (PHA) and cytokines were measure by ELISA. The profile of lymphocytes populations was evaluated by flow cytometry. NK cell cytotoxicity was determined by the lactate dehydrogenase release assay from K562 lysed target cells. The weight loss 6 months after surgery was 35.3±4.5 kg and there was a significant post-surgical decrease in BMI at this point (-12.9±0.9 kg/m2, p<0.001). No significant differences were found in the lymphocytes populations after surgery. It was observed a significant increase in the lymphocytes proliferation six months after surgery (p= 0.0026). There was also a post-surgical increase in the production of IFN-, IL-12 e IL-18 from PBMC stimulated with PHA, while there was a trend towards the increase of the IL-2 production (p=0.07). The other cytokines analyzed were not altered. Cytotoxic activity of NK cells was significantly enhanced 6 months after RYGB [17.1±14.7% before RYGB vs 51.8±11.3% at 6 months after, at effector to target cell (NK cell:K562 cell) ratio 40:1; p<0.001], and it was in the same range when compared to data obtained from controls with normal BMI matched for age and gender (45,4 ± 7,8% at NK cell:K562 cell ratio 40:1). There was a significant post-surgical improvement in all points of the cytotoxic activity curve in almost 79% of the sample (22 patients). In conclusion, the data obtained show that the weight loss induced by RYGB increases the production of cytokines related with NK cell cytotoxic function and improves its activity. The impairment in NK cells cytotoxic activity and cytokines observed in patients with severe obesity may explain their propensity to develop infections and cancer. Our data suggests that the weight loss induced by bariatric surgery can positively impact these factors.

Nosso estudo teve como um dos objetivos analisarmos a frequência do polimorfismo dos genes KIR na população caucasóide do Rio Grande do Sul e comparamos com resultados de outros Estados do Brasil e também de outros países. Em um segundo momento, avaliar a associação entre os genes KIR em pacientes com diabete Mellitus tipo 1 (DM1) e controles saudáveis. As células natural killer (NK) fazem parte do sistema imune inato e reconhecem as moléculas HLA (antígeno leucocitário humano) de classe I em células-alvo através de seus receptores de membrana. Os receptores principais das células NK são conhecidos como receptores killer do tipo imunoglobulina (KIR) e estão localizados no cromossomo 19q13.4. Estão divididos em grupos funcionais inibidores e ativadores. No primeiro artigo, o objetivo era de analisar os genes KIR e HLA -A, -B e -Cw em 200 indivíduos saudáveis do Rio Grande do Sul pela técnica PCR-SSP. A população do Sul do Brasil demonstrou similaridades com Estados mais próximos geograficamente, e diferenças principalmente com o norte e nordeste. O gene KIR2DS5 foi o menos frequente na população estudada, e a interação KIR ⁄HLA foi mais comum na associação 2DS1-⁄2DL1+⁄C2+. No segundo artigo, analisamos 15 genes KIR e os alelos do sistema HLA classe I em 248 pacientes caucasóides brasileiros com DM1 e em 250 controles saudáveis, usando a técnica de PCR com primers específicos (PCR-SSP). O genótipo 2DL1/C2+ foi mais comum em controles (p=0.001), assim como o haplótipo KIR2DL2/DR3/DR4+ e KIR2DL2/DR3+ (p<0.001; p<0.001).

Infusões de células T e células NK (Natural Killer) de sangue periférico estão sendo realizadas para tratamento de malignidades. Os linfócitos propagados ex vivo, em normóxia (20% O2), são intravenosamente infundidos e precisam sobreviver a hipóxia associada a circulação venosa, da medula óssea (5% O2) e do microambiente tumoral (1% O2). O objetivo principal deste estudo foi determinar a capacidade proliferativa das células humanas T e NK em normóxia (20% O2) versus hipóxia (1% O2), por 28 dias, utilizando uma célula apresentadora de antígeno artificial (aAPC) para propagação em grau clínico. As células T expostas a hipóxia cresceram 100 vezes menos que as células T cultivadas em normóxia, enquanto que houve uma diminuição de 1000 vezes na taxa proliferativa das células NK hipóxicas, que exibiram um aumento na apoptose bem como um prejuízo na citotoxicidade. Hipóxia também induziu uma diminuição na expressão dos receptores KIR, NCR e NKG2D das células NK. Nesta mesma condição, a produção de IL-2 e IFNγ nas células T estavam diminuídas, sendo que nas células NK esse efeito foi mais acentuado. Hipóxia aumentou a expressão de genes relacionados com apoptose, angiogênese e metabolismo glicolítico, os quais estavam moderadamente aumentados nas células T, mas profundamente super-regulados nas células NK. Os níveis de ATP nas células T foram muito similares em ambas as condições de oxigênio, mas intensamente diminuídos nas células NK cultivadas em hipóxia. Também se observou, que a expressão do miR-210 induzido por hipóxia, estava super regulada nas células NK hipóxicas correlacionando com a perda da expressão da molécula NCAM/CD56. Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram um maior impacto da hipóxia sobre as atividades proliferativas e citotóxicas das células NK estimuladas por aAPCs. Estudos adicionais são necessários para o entendimento do impacto deste comportamento das células NK em condições hipóxicas sobre a imunoterapia celular adotiva. / Infusions of T cells and natural killer (NK) cells from peripheral blood (PB) are being undertaken for the treatment of malignancies. Lymphocytes are propagated ex vivo in normoxia (20% O2) and intravenously infused and must survive hypoxia associated with venous blood and bone marrow (5% O2), and the tumor environment (1% O2). The objective this study was to determine the ability of T and NK cells to proliferate under normoxia (20% O2) versus hypoxia (1% O2) over 28 days using an artificial antigen presenting cells (aAPC) to propagate clinical-grade lymphocytes. T cells continuously exposed to 4 weeks of hypoxia grew at a rate of 100-fold less than T cells cultured in normoxia while the proliferative rate of NK cells lagged by 1,000-fold, behind normoxic conditions. Hypoxic cultured NK cells exhibit an increase in apoptosis as well as a correspondent impairment in cytotoxicity. In low oxygen tension the expression of KIR, NCR, and NKG2D receptors were decreased in NK cells. In hypoxia, the production of IL-2 and IFNγ were decreased in T cell and more so in NK cell. Chronic hypoxia increased the expression of related apoptosis, glycolytic metabolism and angiogenesis genes which were moderately increased in T cells but profoundly upregulated in NK cells. ATP levels in T cell were very similar in both oxygen conditions, but profoundly diminished in NK cells under hypoxia. We also noted that hypoxia inducible miR-210 levels are up regulated in hypoxic NK cells correlating with loss of CD56 expression. Taken together, this data show that a greater impact of hypoxia on proliferative and cytotoxic activity of NK cells activated by artificial antigen-presenting cells. More studies are needed to understand the impact of this behavior on the cell adoptive immunotherapy.

Meduloblastoma (MB) e Tumor Teratóide Rabdóide Atipico (TTRA) são tumores malignos do sistema nervoso central (SNC) que ocorrem na infância. Embora tenha havido um aumento na sobrevida, recorrência e metástases são frequentes e as opções terapêuticas poucas e tóxicas para crianças. Uma alternativa à terapia tradicional é a imunoterapia, que pode contornar os efeitos tóxicos associados à radioterapia e quimioterapia. De uma forma geral a imunoterapia depende da presença de antígenos associados a tumor (TAA) e/ou processamento de antígenos expressos pelo HLA classe I. No entanto, TAA para MB ou ATRT não estão bem definidos e tecidos neuronais tem a expressão de HLA classe I muito baixa. As células Natural Killer (NK) não dependem de TAA para citólise e são particularmente ativas na ausência de moléculas do HLA classe I tendo, portanto, potencial para o tratamento dessas doenças. Atualmente as barreiras para a aplicação clínica de células NK são quantitativas e qualitativas. Com o intuito de quebrar a barreira quantitativa foi criada uma plataforma tecnológica para a expansão das NK ex vivo. Essa plataforma consiste no co-cultivo de células mononucleares de sangue periférico com células apresentadoras de antígeno artificiais (aAPC), que expressam Interleucina 21 ligada à membrana. Com essa tecnologia foi possível expandir células NK na ordem de 40.000 vezes. Também foi demonstrada a persistência das células NK expandidas in vitro por 3 semanas após infusão em cérebro murino e que essas células expressam altos níveis de citocinas antitumorais e estimulantes do sistema imune: Interferon gama e Fator de Necrose Tumoral alfa. Finalmente, foi demonstrada a atividade citolítica das células NK tanto in vitro, contra um painel de células de MB e ATRT, quanto in vivo em um modelo murino de MB. Os resultados obtidos fornecem a primeira evidência pré-clínica que provê suporte ao uso de células NK expandidas usando essa plataforma tecnológica no combate a cânceres de cérebro pediátricos. Com base nesses dados, nosso grupo no MD Anderson Cancer Center iniciou um ensaio clínico fase I para testar a segurança e eficácia de administração locorregional de células NK expandidas usando aAPC para o tratamento de tumores pediátricos da fossa posterior do cérebro. / Medulloblastoma (MBs) and Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor (ATRT) are malignant pediatric brain tumors. Although survival has improved, recurrence and metastasis are frequent with few therapeutic options for these children. Immunotherapy is an alternative to traditional therapies that may circumvent the potential toxicities associated with traditional chemotherapy and radiation approaches. Many immune based therapies rely on the presence of tumor associated antigens (TAAs) and/or antigen processing and class I human leukocyte antigen (HLA I) expression. However, TAAs for MB are not well defined and neuronal tissues have very low HLA I expression. Natural killer (NK) cells do not rely on TAA for cytolysis and therefore have potential for the treatment of these diseases. The current barriers to clinical application of NK therapy are quantitative and qualitative. To overcome quantitative barriers, we have worked with a platform technology for the ex vivo expansion of NK cells through co-culture of peripheral blood mononuclear cells with artificial antigen presenting cells expressing membrane-bound IL-21 (mbIL21) to promote a 40,000-fold expansion of NK cells. We also demonstrate prolonged life-span of ex vivo expanded NK cells and persistence for up to 3 weeks post-infusion in the murine brain. These cells express high levels of immune stimulatory and anti-tumor cytokines - interferon gamma and TNF-alpha following activation. Finally we demonstrate NK cytolytic activity in vitro against a panel of primary and established ATRT and MB cells and in vivo following locoregional delivery in a mouse orthotopic model of MB. Our data provide the first pre-clinical evidence supporting the use of mbIL21 expanded NK cells against pediatric brain tumors. Based on this data we have initiated a novel Phase I clinical trial at MD Anderson Cancer Center to assess the safety and efficacy of locoregional delivery of mbIL21 expanded NK cells for the treatment of posterior fossa pediatric brain tumors.

O vitiligo é uma doença dermatológica de causa desconhecida. O aparecimento se dá através de manchas branco-nacaradas na pele, ocorridas pela morte ou redução na funcionalidade das células epidérmicas, os melanócitos, que produzem a melanina, pigmento cutâneo. As células Natural Killer (NK) fazem parte do sistema imune inato e através de seus receptores KIR (Killer immunoglobulin-like-receptors) reconhecem moléculas de HLA (Human leukocyte antigen) classe I presentes nas células. Quando não há o reconhecimento do HLA classe I, como em células tumorais ou infectadas por vírus, a célula NK induz a morte da célula alvo. Uma das teorias para essa doença é a imunológica, a qual admite que o vitiligo seja doença autoimune pela formação de anticorpos antimelanócitos, podendo ser associado a outras doenças autoimunes. O objetivo deste estudo foi investigar polimorfismos dos genes KIR e HLA e sua associação com pacientes com vitiligo comparando com um grupo controle. Foram genotipados 112 pacientes com diagnóstico de vitiligo e 250 indivíduos saudáveis para 16 genes KIR e seus ligantes HLA por PCR-SSO e PCR-SSP respectivamente. Nossos resultados mostraram um fator de risco para a doença na interação do gene ativador KIR2DS1 com o seu ligante C2 (P=0,015; OR: 2,06). Também houve uma associação significativa do gene ativador KIR2DS1 com o ligante heterozigoto C1/C2 (P=0,025; OR: 2,26). A interação KIR2DS1/C2 está presente em 52,8% dos pacientes com vitiligo e em 35,2% do grupo controle, já a interação KIR2DS1/C1/C2 está presente em 54,7% dos pacientes com vitiligo e 34,9% do grupo controle. Nossos resultados sugerem um possível fator de risco do gene ativador KIR2DS1 com o seu ligante C2, sendo essa combinação uma possível susceptibilidade à doença. / Vitiligo is a skin disease of unknown cause. The main symptom of vitiligo is white patches on the skin. Which are caused by destruction of pigment-forming cells (melanocytes). Natural killer (NK) cells are part of the innate immune system and they recognize class I HLA molecules (human leukocyte antigen) through their KIR receptors (killer-cell immunoglobulin-like-receptors). When class I HLA molecules are not recognized, e.g.: tumour cells or virus-infected cells, NK cells induce the death of target cells. One of the possible aetiologies for this disease is the immune cause. According to this theory, vitiligo is an autoimmune disease caused by the production of anti-melanocyte antibodies and it may be associated with other autoimmune diseases. The objective of the present study was to investigate KIR and HLA gene polymorphisms and their association with vitiligo comparing with a control group. We genotyped 112 patients diagnosed with vitiligo and 250 healthy individuals for 16 KIR genes and their HLA ligands using PCR-SSO and PCR-SSP respectively. Our findings showed a risk factor for vitiligo in the interaction between the activating KIR2DS1 gene and its C2 ligand (P=0.015; OR: 2.06). There was also a significant association of the activating KIR2DS1 gene with the heterozygous C1/C2 ligand (P=0.025; OR: 2.26). The KIR2DS1/C2 interaction was found in 52.8% of vitiligo patients and in 35.2% of the control group; whereas the KIR2DS1/C1/C2 interaction was found in 54.7% of vitiligo patients and 34.9% of the control group. These findings suggest a possible risk factor related to the interaction between the activating KIR2DS1 gene and its C2 ligand, since this combination may be a disease susceptibility factor.

Orientadores: Carlos Alberto Petta, Fernando Guimarães / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T09:37:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_PauloCesarMartins_M.pdf: 1689043 bytes, checksum: d194c0a2789183c6c8600428851acdbc (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo:A possibilidade de se gerar preparações de células efetoras enriquecidas com células natural killer (NK) de pacientes com câncer tem sido foco de estudos que buscam fontes de células efetoras autólogas para o tratamento de tumores humanos. Objetivos: O objetivo neste estudo foi avaliar a possibilidade de se expandir células NK a partir do sangue de pacientes com neoplasia de ovário, assim como o potencial citotóxico destas células. Sujeitos e métodos: Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 13 pacientes voluntárias com neoplasia de ovário, Grupo Benigno (n=7) e Grupo Maligno (n=6), foram cultivados em meio CellGro suplementado com anti-CD3 (20ng/ml, adicionado aos primeiros 10 dias), IL-2 ( 1000 UI / ml) e SFB (10%) por 21 dias. A ação citotóxica das preparações de células efetoras foi avaliada por citometria de fluxo utilizando como células alvo linhagens tumorais K562 e OVCAR3.Resultados: No Grupo Benigno, as células cultivadas por 21 dias apresentaram variação percentual positiva dos subtipos de linfócitos NK (17,1 ± 5,2%) e NK-T (10,4 ± 3,1%) associados à variação percentual negativa das células T (-6,2 ± 6,2 %). No Grupo Maligno, as células cultivadas por 21 dias apresentaram variação percentual positiva para todos os subtipos (NK 12,5 ± 6,0%, NK-T 4,2 ± 0,7% e T 15,3 ± 5,6%). As preparações de células enriquecidas com células NK, de ambos os grupos, foram citotóxicas contra as linhagens de células tumorais. A citotoxicidade foi significativamente (p <0,05) maior quando utilizadas células efetoras cultivadas por 21 dias, em comparação com células efetoras obtidas no dia 14 da cultura. Também foi observado maior ação citotóxica (p<0,05) nas frações, separadas magneticamente, contendo células CD56+ em comparação com as frações CD56-. Conclusões: Preparações de células efetoras ricas em células NK podem ser expandidas in vitro a partir de CMSP de pacientes com neoplasia de ovário. Estas células são providas de função citolítica, indicando o sistema de cultivo empregado como uma fonte viável de células efetoras autólogas / Abstract: The possibility of generating natural killer (NK) enriched cell preparations from cancer patients has been focused on studies seeking for autologous effector cell source for treatment of human malignancies. The objective of the present work was to evaluate the possibility of expanding NK cells from peripheral blood of patients with ovarian neoplasia, and to evaluate their cytotoxic function. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 13 volunteer patients with ovarian neoplasia, 7 benign and 6 malignant tumors, were cultured in CellGro medium supplemented with anti-CD3 (20ng/ml, for the 9-10 initial days), IL-2 (1000 UI/ml) and FBS (10%) for 21 days. The cytotoxic capacity of NK cells was evaluated using a flow cytometry-based cytotoxicity assay. The K562 and the OVCAR3 cell lines were used as target cells. Day-21 cultured cells of the benign neoplasia patients resulted in positive percentual variation of NK (+17.1±5.2%) and NK-T (+10.4±3.1%) lymphocyte subtypes associated with negative percentual variation of T cells (-6.2±6.2%). Differently, day-21 cultured cells of the malignant neoplasia patients presented positive percentual variation for all of the lymphocyte subtypes (NK +12.5±6.0%, NK-T +4.2±0.7% and T +15.3±5.6%). NK enriched effector cell preparations from both, benign and malignant ovarian neoplasia patients, were cytotoxic against the K562 and OVCAR3 cell lines. Cytotoxicity was significantly (p<0.05) higher using effector cells from day-21 cultures, compared with effector cells from day-14. Cytotoxicity was significantly (p<0.05) higher using magnetically separated effector cell fractions containing CD56+ cells compared with effector cell fractions deprived of these cells. The present study demonstrated that NK enriched effector cell preparations can be expanded in vitro from PBMC of ovarian neoplasia patients. These cells are provided with cytolytic function, indicating the culture system employed as a feasible source for autologous effector cells that should be evaluated for the NK-based adoptive therapy of cancer / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Tocoginecologia

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T17:18:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianco_JuaresEdnaldoRomero_M.pdf: 23225852 bytes, checksum: 523781fa325c40e61fa0fe33c59406a1 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Durante o período peri-implantacional na gestação de humanos e roedores, ocorre no estroma da mucosa uterina um conjunto de fenômenos que envolvem modificações dos componentes celulares e da matriz extracelular. Este conjunto de modificações é conhecido como decidualização ou reação decidual. Concomitante a este processo ocorre a migração de leucócitos provenientes de órgão hematopoéticos para este estroma. Dentre estes leucócitos predominam as subpopulações de linfócitos denominados de células ¿uterine Natural Killer¿ (uNK), que atuam na gestação reconhecendo o embrião alogeneico, modulando a reação decidual e o crescimento placentário. Porém, a sua participação nos casos de aborto e o possível desencadeamento do potencial lítico e citotóxico relacionado com a resposta imune inata, não foi ainda totalmente elucidado. O presente trabalho buscou desenvolver estratégias para o estudo in situ das células uNK, sem a influência de fatores oriundos do embrião, empregando o modelo da pseudogestação em camundongos. Foram utilizados fêmeas pseudogestantes obtidos através do acasalamento com machos vasectomizados e inoculação intraluminal do óleo vegetal (arachis) ou mineral (nujol) no útero de 4° dia de pseudogestação (dpg). Estes animais pseudogestantes foram subdivididos em grupos submetidos ou não a ovarectomia e com suplementação hormonal de estrógeno e/ou progesterona ou hormônio gonadotrófico coriônico (hCG). Foram coletados o útero e ovário e processados para análise em microscopia de luz e eletrônica de transmissão no 9°, 12° e 14° dpg. Fêmeas em gestação normal foram utilizados como grupo controle. As análises histológicas, citoquímicas e ultra-estruturais efetuadas demonstraram que a indução da pseudogestação com emprego tanto de óleo vegetal (arachis) quanto de óleo mineral resultam na reação decidual e presença de células uNK lectina DBA (Dolichos biflorus) positivas. A reação decidual resultante e mais exuberante com o óleo de arachis, porém, o período de manutenção do deciduoma é menor, mesmo com a suplementação hormonal de progesterona, se comparado ao grupo de animais induzidos com o óleo mineral e suplementada com HCG. As características morfológicas das células uNK foram melhor preservadas nos animais pseudogestantes induzidos com o óleo mineral, não ovarectomizados e suplementados com o HCG.Nestes, as células uNK foram encontradas aém do 12° dpg em meio ao endométrio que mantinha o deciduoma, enquanto nos demais grupos o deciduoma era destituído antes do 12º dpg. Porém, , à semelhança dos demais grupos experimentais, houve predominância de formas menos diferenciadas de células uNK (subtipos I e II), sendo raras as formas plenamente diferenciadas (subtipo III). Em nenhum dos grupos foi encontrado o subtipo IV, correspondentes à forma de degeneração destas células. Estes resultados demonstram que as características do endométrio e o comportamento das células uNK na pseudogestação, apresentam diferenças influenciadas pelos meios de indução utilizados e regimes hormonais adotados.Além disso, a ausência do concepto parece ser o fator limitante na continuidade da manutenção do utero seudogestante. Por conseguinte, a pseudogestação induzida com óleo mineral e mantida sob a regência ovariana supra-controlado pelo HCG poderia ser adotada como modelo experimental para estudo das células uNK sem a interferência do embrião. Este modelo deverá permitir novas estratégias para investigação dos diversos fatores de origem embrionário/fetal que possam afetar as atividades destas e/ou outras células de forma controlada in situ no ambiente uterino que simule a gestação / Abstract: During the period of pre-implantation in humans and rodents gestations, a set of phenomenon, involving, modifications of cellular components and extracellular matrix occur in the stroma of the uterus. These modifications, are known as decidualization or decidual reaction. During this processes a migration of leukocytes that came from the heamatopoetic organs occur into the uterine stroma. Among these leukocytes, there is a predominance of a subpopulation of leukocytes known as uterine Natural Killers (uNK) that play important roles during gestation by recognizing the allogeneic embryos and modulating the decidual reaction and the placental growth. However, the uNK participations in miss carriage and triggering of lytic and citotoxic potential related to innate immune response during pregnancy have not elucidated yet. The present work aimed to develop a strategy for uNK study without the influence of embryonaryfactors by using the pseudopregnancy model in mice. It was used the pseudopregnant females mice obtained by matting with vasectomized males and intra-luminal injection of arachis or mineral oil in the uterus on 4th day of pseudopregnancy (dpp). These animals were grouped according to treatment submitted of ovarectomy or not and with exogenous supplement of progesterone and/or estradiol or chorionic gonadotrophin hormone (HCG). The uteri and ovary were collected and processes for light and electron microscope on the 9th, 12thand 14thdpp. Normal pregnant females were used as controls. Histological analysis, cytochemistry and ultrastructure demonstrated that the induction of pseudopregnancy by using both arachis oil and mineral oil resulted in decidual reaction and presence of the DBA (Dolichos biflorus) lectin positive uNK cells. The decidual reactions induced by arachis oil were more intensive and exuberant, but the deciduomas were not sustained longer even under progesterone treatment, if compared to those, in the uterus induced with mineral oil, and supplemented with HCG. The morphological characteristics of the uNK cells were better preserved in the pseudopregnant animals induced with mineral oils, not ovarectomized and supplement with HCG. In these animals, the uNK cells were found over the 12th dpp in the endometrium preserving the deciduoma while it failed before 12th dpp in the other groups However, similarly to other experimental groups, there was predominance immature forms of uNK cells (subtypes I and II), being rare the fully differentiated forms (subtype III). No groups did not show the uNK sub type IV, corresponding to the degeneration form of this cell / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Aureo Tatsumi Yamada, Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T04:32:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bizinotto-Assuncao_MarciaCristina_D.pdf: 17669234 bytes, checksum: 7623e53be29f1a69dba9c95b19066e0e (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O fenômeno da gestação em mamíferos de placentação hemocorial, onde o feto alogênico, apresentando metade dos genes de origem paterna, desenvolve um íntimo contato com o tecido materno sem desencadear uma resposta de rejeição pelo sistema imune materno, é ainda uma questão da imunologia da reprodução não esclarecida completamente. O diálogo na interface materno-fetal do útero gestante envolve uma gama de citocinas da categoria Th1fTh2, bem como de várias populações celulares, onde se destacam as células Natural KiUer uterinas (uNK). As uNK são populações linfocitárias transitórias que migram a partir de progenitores localizados em órgãos linfóides secundários como linfonodo e baço para o útero gestante e, neste proliferam e diferenciam ao longo da gestação. A presença destas células no útero gestante tem sido relacionada com o reconhecimento dos antígenos HLA-G e HLA-E expressos pelos trofoblastos, resultando na inibição tanto da resposta imune inata quanto da adaptativa. Esta atuação peculiar das uNK sugere que a modulação destas células no útero gestante esteja relacionada com a expressão de receptores específicos não compartilhada com células NK circulantes (eNK). Em uNK de camundongos, a lectina DBA (Doliehos biflorus agglutin) identifica glicoconjugados contendo N-acetil D-galactosamina presentes na superfície destas células e que não são expressos por outros linfócitos, corroborando com a hipótese de que as uNK expressam receptores específicos não comuns às eNK Neste trabalho, nós propusemos avaliar a possível expressão de moléculas específicas na superfície das células uNK de camundongos e identificar as proteínas candidatas através de técnicas proteômicas. Para tanto foram inicialmente utilizadas células uNK isoladas e purificadas de úteros de camundongos prenhes como in6culos antigênicos em machos da mesma espécie, para avaliar a capacidade de indução de uma resposta imune com produção de anticorpos reativos a esses antígenos. Outra estratégia utilizada foi o isolamento de proteínas de homogenados uterinos, de células uNK e da membrana destas células, na tentativa de isolar e identificar aquelas reativas à lectina DBA. Como resultado das inoculaçães de células uNK, os camundongos receptores produziram anticorpos séricos que reconheciam células uNK através de reações imunocitoquímicas. Este resultado confirma a expressão de moléculas específicas em células uNK, que por sua vez as caracteriza como uma subpopulação de NK específica da gestação. Dos dois animais com maior nível de anticorpos séricos foram coletados os baços para o preparo das células empregadas em experimentos de fusão celular para a obtenção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais. Um dos anticorpos monoclonais obtidos reconheceu moléculas presentes na superfície e no citoplasma das células uNK de várias linhagens de camundongos, assim como moléculas em células presentes no endométrio de ratas prenhes e no endométrio gestacional de humanos, sugerindo que moléculas homólogas são expressas em uNK de outras espécies. No entanto, este anticorpo monoclonal anti-uNK de camundongo (mamuNK1) apresentou reação cruzada com componentes citoplasmáticos de outras células, sugerindo não serem específicos para uNK Em relação ao isolamento dos glicoconjugados lectina DBA reativos observouse que através da cromatografia de gel filtração o isolamento mostrou-se pouco eficiente para o "pool" de proteínas contidas no homogenado uterino, ou mesmo de homogenado de células uNK, em decorrência da existência de múltiplas frações de proteínas capazes de ligar à lectina DBA. Restringindo-se o "pool" de proteínas àquelas obtidas apenas da membrana de células uNK e, através da eletroforese de duas dimensões pode-se delimitar as proteínas de interesse, as quais foram submetidas à análise proteomica. A identificação das proteínas isoladas das membranas de células uNK através de técnicas proteomicas sugeriram as proteínas Conserved oligomeric Golgí complex component 4 (COG4) e Heat shock 70-líke proteín 1 (Hsp 70 L1) como potenciais candidatas relacionadas com as atividades das células natural kíller no útero gestante / Abstract: The phenomenon of pregnancy in mammalians with hemochorial type placenta ions where the allogeneic fetus presenting the half of gene from paternal origins growth in tight contact with maternal tissues, without triggering the rejections responses of maternal immune system is still a non-solved question of immunology of reproduction. The cross-talk at maternal-fetal interface in the pregnant uterus involves a range of Th1rrh2 cytokines, as well as, several cell populations with accentuated participation of uterine Natural Killer (uNK) Iymphocytes. The uNK .are transient leukocyte population that migrate from precursor cells localized at secondary Iymphoid organs such as Iymph nodes and spleen into the pregnant uterus and proliferate and differentiate during the gestation. The presence of these cells in the pregnant uterus has been related to recognition of the HLAG and HLA-E antigen present in the trophoblast, which results in inhibition of both innate and adaptive immune response. This peculiar activity of uNK suggests that the modulation of such cells in the pregnant uterus should be related with the expression of specific receptors not shared with peripheral blood circulating NK (cNK) cell. In the mouse uNK, the DBA (Dolichos biflorus agglutin) lectin identify n-acetyl D-galactosamine containing glycoconjugates present on the surface of these cells not expressed by other Iymphocytes, which corroborate the hypothesis of uNK expressing specific receptors not shared by cNK. The present work aimed to evaluate the presumed expression of specific molecules on mouse uNK cell surface and identify the candidate proteins by proteomic methods. Initially were used uNK cells isolated and purified from pregnant mice uteri as antigen to be inoculated in the male mice and evaluate the capacity of induction of immune response with production of antibodies reactive to these antigens. Other strategy was to realize procedures of protein isolation from uterine homogenates, uNK cells and the membrane of these cells, in the attempt to isolate and identify those reactive to DBA lectin. As results of inoculation of uNK cells were verified responses in the inoculated males by presence of serum antibodies that recognized uNK with immunocytochemistry. These results confinn the expression of specific molecules in uNK cells which characterize these cells as specific NK subset of pregnancy. From two animaIs with highest levei of antibodies in 1he serum were collected the spleen to isolate the Iymphocytes clones for monoclonal antibodies obtantion. One of these antibodies recognized antigen molecules found on the surface and cytoplasm of the uNK cells of several mice strains, as well as, molecules in cells present in the pregnant rats and human beings endometrium, which suggests the expression of homologous molecules in uNK of other species. However, this mouse anti-mouse uterine NK (mamuNK1) was reactive with citoplasmatic components the other cells, suggesting not be specific to uNK. About the isolation of DBA lectin reactive glycoconjugates by purification in gel filtration chromatography revealed low efficiency to the pool of proteins contained in the uterine homogenate, or even in the homogenate of isolated uNK cells due to the multiple DBA lectin positive protein fractions. By restriction of protein pool to those obtained from the uNK cells membrane and by two dimension electrophoresis was delimited the target proteins that were submitted to the proteomic analysis. The identification of isolated proteins of the membranes of uNK cells with proteomics methods suggested the Conserved proteins oligomeric Golgi complex Component (4 COG4) and Heat shock 7D-like protein 1 (Hsp 70 L1) as potential candidates related to the activity of the natural to killer cells in the pregnant uterus / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural