Made available in DSpace on 2016-03-08T14:03:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_gandini_ioc_dout_2014.pdf: 15196987 bytes, checksum: 785cdc40cbdacbdb42278c64af49aee2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus dengue é um flavivírus causador de síndrome febril hemorrágica, sendo alguns casos graves evidenciados pelo acúmulo de plasma nas cavidades. Sugerese que a intensa replicação viral na fase aguda resultaria na intensa produção de mediadores inflamatórios, levando ao extravasamento plasmático. A imunidade inata é uma importante barreira na limitação da dispersão viral. As células dendríticas plasmacitoides (PDCs) e as células NK são fundamentais durante a fase inicial das infecções por suas características antivirais e citotóxicas contra células infectadas. O fenótipo \201CKiller\201D das PDCs (IKPDCs) resultaria da ativação viral e é caracterizado pela expressão membranar do ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral (TRAIL) e pela produção de interferons do tipo I. As células NK podem ser diretamente ativadas reconhecendo as células alvo ou, indiretamente ativadas pelas citocinas (como os interferons) tornando-se citotóxica, expressando TRAIL membranar. Apesar do papel antiviral, pouco se sabe sobre os mecanismos de ação dessas populações celulares durante a febre do dengue (FD). Nosso objetivo foi estudar o envolvimento das PDCs e células NK ativadas na imunopatologia da FD. Analisando as células de pacientes ex vivo, observamos maior frequência de IKPDCs nos casos brandos de FD, assim como de células NK TRAIL+. Outros marcadores de ativação como o marcador de degranulação CD107a e o receptor de reconhecimento padrão TLR3 foram expressos em maiores níveis nos pacientes comparando aos controles saudáveis As citocinas relacionadas a ativação celular - IFN\03B1, TRAIL solúvel e IL12 - foram correlacionadas com os quadros brandos. Em modelos in vitro, o DENV induziu a transformação das PDCs em IKPDCs, em via dependente dos endossomos e da dose viral. Além disso, as IKPDCs reduziram a detecção de antígenos virais em modelos de cocultura com monócitos humanos infectados, em mecanismo dependente da via dos interferons do tipo I e independente de TRAIL. As células NK foram capazes de expressar TRAIL durante estimulação in vitro tanto estimuladas pelo DENV2 quanto pelo IFN\03B1, sugerindo mecanismos de ativação indireta da população. Assim, observamos que o DENV pode ativar ambas as populações. A relação entre a maior ativação das PDCs e células NK promoveria maior limitação da dispersão viral, contribuindo para diminuir a intensidade da resposta inflamatória. Sugerimos então que a ativação do eixo antiviral PDCs-Células NK contribuiria para proteção dos quadros graves durante a dengue / Dengue virus is a flavivirus that can cause a hemorrhagic febrile syndrome, in which some severe cases are characterized by plasma accumulation in cavities. It is suggested that a high viral burden in the acute phase would lead to an enhanced production of inflammatory mediators, leading to plasma leakage. Innate immunity is an important barrier limiting viral spread. Plasmacytoid dendritic cells (PDCs) and NK cells are main actors in the beginning of infection because of their antiviral and cytotoxic features against infected cells. PDC killer phenotype (IKPDCs) is induced by viral activation and main profile is membrane expression of TNF-related apoptosis-inducer ligand (TRAIL) and type I interferon production. NK cells can be activated directly, by target recognition, or indirectly, by cytokines (like interferons) and become cytotoxic, expressing membrane TRAIL. Despite its antiviral role, the function of those cell populations during dengue fever (DF) is not largely known. Our aim was to study activated PDCs and NK cells involvement in DF immunopathology. DF patients’ cells analysis ex vivo presented higher frequency of IKPDCs and also higher frequency of TRAIL+NK cells in mild DF cases. NK activation markers such as CD107a degranulation marker and pattern recognition receptor TLR3 were upregulated in patients’ cells compared to healthy donors. Cytokines – IFNα, soluble TRAIL, IL12 – related to cell activation were upregulated in mild DF cases. In vitro models show DENV induced transformation of PDCs into IKPDCs, in endosome and viral-dependent pathways. Besides, IKPDCs could reduce viral antigen detection on co-culture models with human infected monocytes, in a type I interferon-dependent, TRAIL-independent mechanism. DENV-stimulated and IFNα-stimulated NK cells were able to express TRAIL in vitro, suggesting an indirect activation of cells. Therefore, we observed DENV-induced activation of both populations studied. A higher activation of PDCs and NK cells would promote limited viral spread, resulting in dimished inflammatory response. Then, we suggest that activation of antiviral axis PDCs-NK cells would promote protection against severity during dengue

Made available in DSpace on 2016-05-16T13:00:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thays_joaquim_ioc_mest_2016.pdf: 1892469 bytes, checksum: 0f2ff8d520cb9116ff431c417c125af4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A toxoplasmose é uma infecção causada pelo protozoário Toxoplasma gondii, parasita intracelular obrigatório de ampla distribuição mundial. A lesão característica da toxoplasmose ocular (TO) é a retinocoroidite, principal causa de uveíte posterior, podendo deixar sequelas graves, inclusive a perda da visão. Embora existam muitos estudos referentes à imunologia da toxoplasmose sistêmica, pouco se conhece a respeito da resposta imune na TO humana. As células natural killers (NK) são células efetoras do sistema imune inato, cuja função principal é a atividade citotóxica. Elas interagem com as células-alvos por meio de receptores, que emitem sinais de inibição ou ativação. Dentre os receptores de células NK, os receptores semelhantes à imunoglobulina (KIR), merecem destaque devido ao seu elevado polimorfismo. O interesse pelo estudo desses genes está na eficiência de serem utilizados como marcadores genéticos em estudos de associação com doenças. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo analisar o polimorfismo dos genes KIR, no curso da infecção toxoplásmica ocular, verificando se o mesmo estaria associado com a ocorrência de recidivas oculares após episódio ativo. Participaram desse estudo 101 pacientes com diagnóstico de toxoplasmose ocular, oriundos do ambulatório de Oftalmologia do Instituto Nacional de Infectologia (INI/Fiocruz) RJ. Observamos que os genes KIR3DL1, KIR2DL1, KIR2DS4, KIR2DP1 foram os mais prevalentes (acima de 95%) em nossa população e que essas altas frequências são similares às encontradas em outras regiões brasileiras. Caracterizamos 25 genótipos KIR e observamos uma maior frequência dos genótipos 1 (31,7%), 4 (11,9%), 2 (10,9%) e 3 (7,9%), todos com distribuição cosmopolita A análise entre as distâncias genéticas revelou um grupamento dos pacientes em estudo com populações do Rio de Janeiro, Porto Velho e de países do continente Americano. Observamos que o gene inibidor KIR2DL2 e o gene ativador KIR2DS2 estavam mais frequentes nos indivíduos sem recidiva (P=0,03 e P= 0,02, respectivamente), sugerindo que ambos possam estar atuando como marcadores de proteção à recidiva de TO. O grupo recidiva apresentou maior variabilidade genotípica (20/25), sendo os genótipos 1 (36,3%) e 2 (13,8%), os mais frequentes. No grupo sem recidiva, os genótipos mais frequentes foram o 1 (23,7%) e o 4 (21%). Ao avaliarmos a variação da proporção entre genes KIR inibidores e ativadores, observamos que a maioria dos indivíduos com média ponderada negativa pertencia ao grupo dos indivíduos com recidiva (62,7%; P= 0,003), sugerindo que a menor proporção de genes KIR ativadores possa estar associada à susceptibilidade. Não há na literatura dados que relacionem o polimorfismo de genes KIR com esta doença. A caracterização destes genes torna este estudo pioneiro na pesquisa de associação entre o polimorfismo dos genes KIR e a recidiva de TO / Toxoplasmosis is an infection caused by the protozoan Toxoplasma gondii, obligate intracellular parasite of worldwide distribution. The characteristic injury of ocular toxoplasmosis (OT) is the retinochoroiditis, which is the main cause of posterior uveitis and can leave serious consequences, including blindness. Although there are many studies about the immunology of systemic toxoplasmosis, the immune response in human TO still unclear. The natural killer cells (NK) are effectors cells of the innate immune system, whose main function is the cytotoxic activity. They interact with target cells through receptors that emit inhibition or activation signals. Among the NK cell receptors, immunoglobulin-like receptors (KIR) deserve attention due to their high polymorphism. Interest in the study of these genes is in the efficiency of use as genetic markers in association studies to diseases. In this context, this study aimed to analyze the polymorphism of KIR genes in the course of ocular toxoplasmosis infection by checking whether it was associated with the occurrence of eye relapse after active episode. Participated in this study 101 patients with ocular toxoplasmosis, arising from the Ophthalmologic Clinic of the National Institute of Infectious Diseases (INI/Fiocruz) RJ. We observed that the genes KIR3DL1, KIR2DL1, KIR2DS4, KIR2DP1 were the most prevalent (over 95%) in our population and that these high frequencies are similar to those found in other Brazilian regions. We identified 25 KIR genotypes and found a higher frequency of genotypes 1 (31.7%), 4 (11.9%) and 2 (10.9%), all with worldwide distribution The analysis of genetic distances revealed a cluster of patients in a study with populations of Rio de Janeiro, Porto Velho and the American continent. We note that the KIR2DL2 inhibitor gene and the gene activator KIR2DS2 were more frequent in patients without recurrence (P = 0.03 and P = 0.02, respectively), suggesting that both may be acting as a protective marker for recurrence TO. The recurrence group had higher genotypic variability (20/25), and genotype 1 (84%) and 2 (32%), were the most frequent. In the group without recurrence, the most common genotypes were 1 (36%) and 4 (32%). When evaluating the change of ratio of KIR genes inhibitors and activators, observed that most individuals with negative weighted average belonged to the group of individuals with recurrence (62.7%; P = 0.003), suggesting that the lowest proportion of KIR genes activators may be associated with susceptibility. There is no data in the literature that relate polymorphism of KIR genes with this disease. The characterization of these genes makes this pioneering study on the association between the polymorphism survey of KIR genes and the recurrence OT

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento / Made available in DSpace on 2013-03-04T20:42:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 313825.pdf: 2234847 bytes, checksum: 0b50f1734f61ae413cbbdcea1df4feda (MD5) / A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por inflamação crônica que causa erosões e deformidades nas articulações e manifestações inflamatórias sistêmicas como acometimentos pulmonar e cardíaco. As células natural killer (NK) são células efetoras que participam tanto da resposta imune inata quanto adaptativa através de produção de citocinas e ação citolítica. As NK são encontradas com frequência nas articulações afetadas pela AR. Dentre os receptores das células NK, destaca-se o receptor das células killer semelhante à imunoglobulina (KIR) que possui ação ativadora e/ou inibidora das NK. O objetivo deste trabalho foi investigar a presença/ausência dos genes KIR na população de Santa Catarina e a associação da presença dos genes KIR ativadores com pacientes de AR e com dados clínicos. Neste estudo foram avaliados 147 pacientes com AR (casos) e 164 indivíduos sem histórico de doença autoimune (controle) para a presença/ausência de 16 genes KIR, através da técnica de PCR por primer de sequência específica (PCR-SSP). No entanto, apenas os genes KIR ativadores (KIR2DS1, KIR2SD2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1) foram investigados para o estudo de associação caso-controle. As frequências gênicas foram estimadas e o odds ratio (OR) foi calculado para avaliar associação dos genes KIR ativadores com AR (p<0,05 foi considerado significativo). As amostras de pacientes e controles tiveram predominância de mulheres (87%) com média de 53(±12) anos e com ascendência europeia (86%). As frequências de presença/ausência dos 16 genes KIR em pacientes com AR assemelharam-se aos estudos com AR e outras doenças autoimunes no Brasil, bem como as frequências destes genes no grupo controle aproximaram-se aos demais estudos brasileiros para populações eurodescendentes. Não foi encontrada associação do polimorfismo de ausência e presença dos genes ativadores com AR. No entanto, a presença do gene KIR2DS2 foi mais frequente em pacientes com AR que apresentaram manifestação articular (MA) em relação ao grupo controle (OR=2,312; p=0,010). Além do mais, não houve associação do tagabismo com a AR, apenas com fator reumatoide (FR) em pacientes com AR (OR=2,947; p=0,02). Os genes KIR não foram associados ao desenvolvimento de AR neste estudo. Entretanto, o gene KIR2DS2 foi mais frequente em pacientes com a presença de MA, enquanto que o hábito tabagista foi relacionado com FR.

Orientação: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T01:18:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_PriscilaMeirelles_M.pdf: 16438409 bytes, checksum: 1276810b9fc2617332f439ef171bc3ce (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: As células natural killer uterinas (NKu) estão presentes no útero de roedores durante a gestação, período em que surgem e se diferenciam, desaparecendo por completo ao final deste. Os fatores envolvidos nos mecanismos de diferenciação e ativação destas células, bem como as funções por estas desempenhadas são pouco conhecidas. A dificuldade na compreensão plena das funções das NK do ambiente uterino é atribuída à complexidade e dinamismo do ambiente uterino durante a gestação. Os estudos realizados in vitro são igualmente inconclusivos devido à falta do estabelecimento de uma condição padrão nos ensaios realizados. O presente trabalho teve o intuito de padronizar uma condição de obtenção e manutenção de células NKu viáveis para ensaios in vitro, a partir do cultivo primário da glândula metrial. Foram utilizados fragmentos (explantes) da glândula metrial obtidos de camundongos prenhes no 8° dia de gestação (ddg). Estes explantes foram cultivados por 24 e 48 horas, em meios de cultivo MEM e RPMI, com ou sem a adição de MCE (meio condicionado esplênico). Os explantes em O hora (controle) e após 24 ou 48 horas de cultivo, assim como as células derivadas destes explantes (aderidas e em suspensão) no cultivo, foram processados para as análises histoquímicas de PAS e lectina DBA (Dolichos biflorus aglutinin) e para análises ultra-estruturais em MET. Os resultados demonstraram que tanto as formas aderidas quanto em suspensão apresentaram positividade à reação histoquímica de PAS e lectina DBA, sendo identificadas como sendo células NKu. O explante residual mostrou sinais de degeneração acentuada após 24 horas, independentemente das condições de cultivo empregadas. Pela MET, o maior índice de células NKu com boa preservação ultra-estrutural foi observada nas células NKu aderidas obtidas após 24 horas de cultivo em meio RPMI padrão, sem suplementação do meio condicionado esplênico (MCE). Estas condições de cultivo foram estabeleci das como padrão para a obtenção de células NKu morfologicamente bem preservadas, sendo utilizadas nos ensaios ín vítro, para avaliar a viabilidade destas células. Sob o efeito da lectina DBA, as células NKu demonstraram variações nos padrões morfológicos e de marcação pela lectina DBA, dependentes da concentração e tempo de ação, constatadas pelas microscopias de tluorescência e eletrônica de varredura (M EV). Pelos resultados obtidos, estabeleceram-se as condições de cultivo para obtenção de células NKu preservadas a partir do cultivo de explantes da glândula metrial, sendo estas células passíveis de serem utilizadas em ensaios in vítro. Pelo padrão de resposta das células NKu em conseqüência da ação da lectina DBA utilizada para avaliar a viabilidade destas células ín vítro, sugere-se que o substrato presente na superfície das células NKu poderia ser um potencial receptor de membrana envolvido no mecanismo de resposta celular / Abstract: During the pregnancy, uterine natural killer (uNK) cells appear in the rodent uterus, differentiate and disappear at the end of this period. H oweve r, which factors are involved in the differentiation[activation mechanisms of uNK cells, as well as in their functions, remain to be solved. The advancing on knowledge about these cells has been due to the complexity and dynamism of the uterine environment during pregnancy. Even the in vitro studies are inconclusive since no standard condition has been established. The present work proposed to establish a standard condition of culture to obtain and maintain uNK cells and further evaluate their viability for in vitro assays. Metrial gland fragments (explants) were obtained from the uterus of mice on 8th days of pregnancy and used as explants of culture The explants were cultured during 24 and 48 hours, in MEM and RPMI media, added or not with spleen-conditioned medi um (SCM). The O hour explants and after 24 or 48 hours of incubation, as well as explants derived cells (adherents and notadherents), were processed for PAS and DBA (Dolichos biflorus agglutinin) histochemistry analyses and for ultrastructural analyses in TEM. The results showed positive reaction to PAS and DBA histochemistries both for adherent and not-adherent cell forms in the culture. The residual explant showed degenerative signals after 24 hours, in despite of the culture conditions. The highest index of well-preserved uNK cells evaluated at ultrastructural levei was found to adherent uNK form, after 24 hours in standard RPMI, without the supplementation with SCM. This procedure was established as standard culture conditions to obtain morphologically well preserved uNK cell that was used to in vitro assays for evaluation of cellular viability. Under the effect of DBA lectin, uNK cells showed changes in morphology and labelling patterns, upon dependence of concentration and time lapsed effect, as noticed by fluorescence and scanning electron microscopes (SEM). Altogether, our findings allowed to establish the conditions to obtain wel / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador : Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T21:08:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roman_SilvaneSouza_M.pdf: 7734833 bytes, checksum: 8cc79cbd14542714863a4b95b7e4fdf5 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: As células Natural Killer participam da resposta imune inata por meio da sua ação citolítica sobre células alvos que expressam antígenos de superfície não reconhecidos como próprios ou anormais. A capacidade citolítica é atribuída à liberação do seu conteúdo granular, que contém, além de perforina, granzimas e outras enzimas hidrolíticas. Durante a gestação são encontradas elevadas incidências de células NK no útero (NKu), que apresentam comportamento peculiar e distinto das células NK do sangue circulante (NKc). Se por um lado tem sido comprovado que, a célula NK atua na manutenção da homeostasia e equilíbrio do ambiente uterino durante a gestação, por outro lado, não há dados que demonstrem a atividade citolítica ou citotóxica das NKu na gestação normal, ou, se esta pode ocorrer em situação de anormalidade. O presente trabalho teve o intuito de estabelecer um modelo experimental que induz uma anormalidade na gestação para avaliar o comportamento das células NKu nestas condições. Para tanto foram realizadas lesões dos sítios de desenvolvimento embrionário ou fetal por meio de perfuração dos sítios com agulha hipodérmica em animais nos 6°, 8°, 10°, 12°, 15° e 17° dias de gestação. Amostras de sítios lesados e não lesados foram coletadas nos intervalos de 6 e 24 horas pós-lesão para análises macroscópicas e microscópicas. Nas análises microscópicas, os materiais foram processados pelas técnicas histológicas rotineiras de parafina e submetidos às reações histoquímicas de PAS e lectina DSA (Dolichos bifloros), assim como pelo TUNEL. Pelas análises macroscópicas, foram verificadas ocorrências de hemorragias de diferentes intensidades classificadas como sendo de tipos: lateral (H L), mesometrial (HM), generalizada (HG) e atrófica (HA), de incidências tanto nos sítios submetidos à lesão primária quanto nos adjacentes não manipulados. Nas análises microscópicas dos cortes submetidos às reações histoquímicas, foram encontradas células NKu com alterações morfológicas nos sítios com HM, HG e HA, porém, não naqueles encontrados nos sítios HL e normais. As alterações das NKu foram classificadas em categorias de I a VI, baseando-se no padrão de reatividade pela lectina DSA encontrada na superfície celular e/ou no conteúdo granular. Dentre as alterações das NKu, chamou maior atenção aquela com ausência de marcação no conteúdo granular. As incidências de células NKu com estas alterações variaram tanto ao longo da gestação, quanto nas áreas em que se encontravam nos sítios hemorrágicos. Ressalta-se a coincidência dos períodos em que foram encontradas maiores incidências de hemorragias nas regiões (HM, HG e HA), com os períodos de maior incidência de células NKu apresentando alterações. Não foi encontrado aumento significativo na incidência de células NKu com núcleo apoptótico, porém as células trofoblásticas mostraram marcações positivas em maior proporção no período de 24 horas pós-lesão. Os resultados obtidos, demonstram que a lesão embrionária ou fetal provoca desequilíbrio acentuado no ambiente uterino, acarretando em hemorragias de diferentes intensidades, onde foram encontradas células NKu de morfologias alteradas. As alterações encontradas nas células NKu sugerem a ocorrência da liberação do seu conteúdo lítico. O fenômeno da degranulação ocorre em células NKu diferenciadas sem acarretar na auto-degeneração, podendo o seu conteúdo granular ser restaurado. O provável efeito da liberação do conteúdo lítico pelas células NKu pode estar relacionado com o aumento de células trofoblásticas com núcleo apoptótico no período de 24 horas pós-lesão, conforme determinado pelo teste de TUNEL. O fato de terem sido encontradas as mesmas alterações também nos sítios não submetidos à lesão, faz pressupor um efeito sistêmico decorrente da lesão. Além disso, a coincidência do período em que se verificam as hemorragias mais acentuadas nos sítios de maior incidência das NKu com alterações, configura uma relação direta entre os dois fenômenos decorrente da gestação anômala / Abstract: The Natural Killer cell shares in the innate immunity by targeting its cytolytic activity against cells expressing non-self or abnormal MHC class I antigens. The cytolytic capability is related to perforin, granzymes and hydrolytic enzymes contents of the granules that once released induces apoptosis of target cells. However, the NK cell found in the pregnant uterus (uNK) shows peculiar and distinct behavior if compared with those collected from circulating blood (NKc). One of intriguing question in the immunology of reproduction is the presence of such a killer cell which does not trigger the Iytic activity neither in vitro nor in the pregnant uterus. The present work aimed to establish an experimental model of abnormal pregnancy in the mouse to evaluate the uNK cell behavior. In order to, it was performed mechanical lesion of embryo or fetus from 6° to 17° days of pregnancy (dp). Samples of damaged and undamaged uterine sites were collected at 6 and 24h after and evaluated by naked eye. The desired uterine samples were processed for conventional paraffin embedding, sectioning and staining with PAS or D8A (Dolichos biflorus) lectin cytochemistry, as so as, for TUNEL method. 80th damaged and undamaged uterine sites showed hemorrhages that were classified as lateral (LH), mesometrial (MH), general (GH) and atrophic (AH) according to intensity and localization. The uNK cells found in uterine sites with the MH, GH and AH showed changes of morphology and D8A lectin reaction pattems which were classified in the range from I to VI. Among the changes, those uNK showing lost of D8A reactivity in the granules contents (class I) attract special attention. The distribution of such an altered uNK cells varied both along the gestation period and localization in the uterine sites with hemorrhage. The higher incidence of uNK presenting alterations coincides with those periods of higher incidences of hemorrhages in the mesometrial region. No significant increase of apoptotic uNK amount was detected in the damaged samples but the increased amount of trophoblast cells with labeled nuclei with TUNEL method was seen 24hs after lesion. Therefore, the embryo or fetus lesion induces the environment unbalance of respective and adjoining uterine sites eliciting the hemorrhage of different intensities, where were found morphologically abnormal uNK cells. The morphological changes found in the uNK cells suggest the occurrence of granules contents releasing by fully differentiated cells without self-degeneration and the granules contents being probably restored in. The increasing of trophoblast apoptosis found at 24h after lesion could be the effect of cytolytic activity of uNK cell. Since the same profiles of alterations were found in the undamaged uterine sites, the effect of lesion seems to affect systemically the uterus. Furthermore, the coincidences between the periods of higher hemorrhage and higher incidences of mature uNK cell, suggest a direct relation between them in the abnormal pregnancy / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular

Embora a obesidade esteja associada à disfunção imune, com incidência aumentada de infecções e alguns tipos de cânceres, há poucos estudos que avaliaram parâmetros imunológicos em pacientes obesos graves. Além disso, há um número limitado de trabalhos analisando o efeito da perda de peso sobre parâmetros imunológicos na obesidade grave. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da perda de peso de pacientes com obesidade grau III submetidos à cirurgia de derivação gastrojejunal em Y de Roux (DGJYR) em parâmetros imunológicos. A produção de citocinas associadas com a resposta imune adquirida (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN-) e inata (TNF- e IL-6) por células mononucleares de sangue periférico (PBMC), o perfil das populações de linfócitos e a atividade citotóxica de células natural killer (NK), além de citocinas associadas a sua função e desenvolvimento (IL-12 e IL-18), foram avaliados em vinte e oito pacientes não diabéticos, sedentários, com obesidade grau III (20 mulheres e 8 homens, com média de idade de 39,9 ± 10,9 anos e IMC de 49,5 ± 7,1kg/m2) no pré-operatório e 6 meses após a cirurgia. As PBMC foram estimuladas com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA) e as citocinas produzidas foram quantificadas por ELISA. O perfil das populações de linfócitos foi avaliado por citometria de fluxo. A citotoxicidade mediada por células NK foi determinada pelo ensaio de liberação de LDH por células alvo K562. A perda de peso foi de 35,3 ± 4,5 kg, com uma significativa redução no IMC seis meses após a cirurgia (-12,9 ± 0,9 kg/m2, p< 0,001). Nenhuma das populações de linfócitos analisadas apresentou modificação no 6º mês após a cirurgia. Observou-se aumento significativo da proliferação de linfócitos seis meses após a cirurgia (p= 0,0026). Houve aumento pósoperatório nas concentrações de IFN-, IL-12 e IL-18 produzidas por PBMC após estímulo com PHA, enquanto a IL-2 apresentou uma tendência ao aumento (p= 0,07). As demais citocinas não apresentaram variação significativa. A atividade citotóxica das células NK aumentou seis meses após a cirurgia [17,1 ± 14,7% no pré vs 51,8 ± 11,3% 6 meses pósoperatório, na proporção 40:1 (célula NK:célula alvo); p< 0,001], mostrando recuperação quando se compara aos valores obtidos em indivíduos controle, pareados por idade e sexo, de peso normal [proporção 40:1 (célula NK:célula alvo) de 45,4 ± 7,8%]. Houve aumento de atividade citotóxica em todos os pontos da curva no pós-operatório em cerca de 79% da amostra (22 pacientes). Os resultados obtidos demonstram que a perda de peso induzida por DGJYR aumenta a produção de algumas citocinas relacionadas com a função das células NK e melhora a sua atividade citotóxica. As alterações na função de células NK e do nível de citocinas envolvidas com a atividade destas células podem explicar a propensão ao desenvolvimento de infecções e cânceres associados com a obesidade. Os dados obtidos neste estudo sugerem que a cirurgia bariátrica pode ter impacto positivo sobre estes fatores. / Although obesity is related to immune dysfunction, with a higher incidence of infections and some types of cancer, few studies have evaluated immunological parameters in severely obese patients. Moreover, a limited set of studies have analyzed the effect of weight loss in immunological parameters in severely obese patients. Thus, the objective of this thesis was to evaluate the influence of weight loss induced by Roux en-Y gastric bypass in patients with grade III obesity in immunological parameters. The production of cytokines associated with acquired (IL-2, IL-4, IL-10 and IFN-) and innate (TNF- e IL-6) immune responses from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), the profile of lymphocytes populations and the cytotoxic activity of natural killer cells (NK), besides cytokines related with NK cell cytotoxic function and development (IL-12 e IL-18), were analyzed in 28 non-diabetic and sedentary patients with grade III obesity (20 women and 8 men, 39,9 ± 10,9 years and BMI 49,5 ± 7,1 kg/m2) before and 6 months after RYGB. PBMCs were stimulated with the mitogen phytohemagglutinin (PHA) and cytokines were measure by ELISA. The profile of lymphocytes populations was evaluated by flow cytometry. NK cell cytotoxicity was determined by the lactate dehydrogenase release assay from K562 lysed target cells. The weight loss 6 months after surgery was 35.3±4.5 kg and there was a significant post-surgical decrease in BMI at this point (-12.9±0.9 kg/m2, p<0.001). No significant differences were found in the lymphocytes populations after surgery. It was observed a significant increase in the lymphocytes proliferation six months after surgery (p= 0.0026). There was also a post-surgical increase in the production of IFN-, IL-12 e IL-18 from PBMC stimulated with PHA, while there was a trend towards the increase of the IL-2 production (p=0.07). The other cytokines analyzed were not altered. Cytotoxic activity of NK cells was significantly enhanced 6 months after RYGB [17.1±14.7% before RYGB vs 51.8±11.3% at 6 months after, at effector to target cell (NK cell:K562 cell) ratio 40:1; p<0.001], and it was in the same range when compared to data obtained from controls with normal BMI matched for age and gender (45,4 ± 7,8% at NK cell:K562 cell ratio 40:1). There was a significant post-surgical improvement in all points of the cytotoxic activity curve in almost 79% of the sample (22 patients). In conclusion, the data obtained show that the weight loss induced by RYGB increases the production of cytokines related with NK cell cytotoxic function and improves its activity. The impairment in NK cells cytotoxic activity and cytokines observed in patients with severe obesity may explain their propensity to develop infections and cancer. Our data suggests that the weight loss induced by bariatric surgery can positively impact these factors.

Base teórica: A sepse é uma síndrome heterogênea, definida como disfunção orgânica que ameaça à vida, causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção. É um problema de saúde mundial, graças à sua alta prevalência, morbimortalidade associada, além de custos para seu tratamento. As células Natural Killer (NK) fazem parte do sistema imune inato reconhecendo moléculas de HLA de classe I em células alvo, através de seus receptores de membrana killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR). A intensidade da resposta à infecção pode variar entre indivíduos, logo pode-se considerar que esta seja determinada por bases genéticas, e estas influenciem na ocorrência de sepse e variabilidade nos desfechos. Objetivos: Avaliar a associação entre os genes KIR e os ligantes HLA em pacientes críticos, comparando pacientes com sepse e controles não sépticos internados na mesma UTI. Métodos: Foi examinado o polimorfismo de 16 genes KIR e seus ligantes HLA em 271 pacientes críticos, caucasóides, sendo 211 pacientes com sepse e 60 controles, pela técnica de PCR-SSO e PCR-SSP, respectivamente. Resultados: Os genes ativadores KIR2DS1 e KIR3DS1 foram mais frequentes nos controles que nos pacientes com sepse (41,23% versus 55,00%, e 36,49% versus 51,67%; p = 0.041 e 0,025, respectivamente). Estes resultados fornecem informação inicial sobre o papel de polimorfismos de KIR na sepse, sugerindo que este possa ser um potencial marcador diagnóstico ou prognóstico da doença. / Background: Sepsis is a heterogeneous syndrome, defined a life-threatening organic dysfunction caused by a dysregulated host response to infection. Sepsis is a global health problem, due to its high prevalence, associated morbidity and mortality, and costs for its treatment. Cells Natural Killer (NK) cells are part of the innate immune system that recognize HLA class I molecules on target cells via membrane receptors called killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR). The intensity of the response to an infection may vary among individuals and might be influenced genetic features affecting sepsis occurrence and variability in outcomes. Objectives: To evaluate the association between KIR genes and HLA ligands in critically ill patients, comparing patients with sepsis and without sepsis admitted to the same ICU. Methods: We examined the polymorphism of 16 KIR genes and their HLA ligands in 271 critically ill patients, Caucasians, and 211 patients with sepsis and 60 controls by PCR-SSO and PCR-SSP, respectively. Results: Activating KIR2DS1 and KIR3DS1 genes were more common in controls than in patients with sepsis (41.23% versus 55.00% and 36.49% versus 51.67%, p = 0.041 and 0.025, respectively). These results provide initial information on the role of polymorphism of KIR in sepsis, suggesting that this may be a potential diagnostic or prognostic marker of the disease.

OBJETIVOS: Avaliar o perfil e o número absoluto e percentual de células NK verdadeiras (CD56+CD16+CD3-) e de células NK e NKT (CD56+) no sangue periférico de uma coorte de pacientes com artrite reumatóide (AR) antes e durante o tratamento com rituximabe (RTX). MÉTODOS: Foram analisados dez pacientes do grupo controle (doadores de sangue) e dez pacientes com AR que receberam duas infusões de RTX 1g separadas por intervalo de 14 dias. As análises imunofenotípicas para avaliação do perfil e quantificação de células NK foram realizadas pré e após a infusão ou até a recaída clínica. Pacientes respondedores e não respondedores foram classificados de acordo com os critérios do Colégio Americano de Reumatologia (ACR) em 6 meses. RESULTADOS: A quantidade de células NK verdadeiras não demonstrou variação significativa pré e após o tratamento com RTX. Contudo, houve aumento percentual de células CD56+ entre o primeiro e o segundo mês após a infusão com RTX. Além disso, os pacientes respondedores apresentaram uma tendência de aumento do número absoluto de células NK verdadeiras após dois meses de tratamento. Já em relação ao grupo controle, observou-se um aumento significativo do número de células NK basais nos pacientes com AR (p<0,05). CONCLUSÕES: Foi identificada uma tendência de aumento nos valores absolutos de células NK verdadeiras entre os pacientes respondedores no segundo mês após a infusão com RTX. Não foi identificada uma variação significativa no perfil e quantidade de células NK nos pacientes com AR pré e após o tratamento com RTX. Contudo, foi observado que os pacientes com AR possuem uma quantidade maior de células NK do que os controles, sugerindo um possível envolvimento destas células na AR. / OBJECTIVES: To assess the profile as well as the absolute number and percentage of true NK cells (CD56+CD16+CD3-), and NK and NKT cells (CD56+) in the peripheral blood of a cohort of patients with rheumatoid arthritis (RA) before and during rituximab (RTX) therapy. METHODS: Ten control patients (blood donors) and ten patients with RA were assessed. The latter group received two intravenous infusions of 1g RTX, separated by a 14 day interval. Immunophenotypic analyses of NK cells were conducted before and after infusion, or until clinical relapse. After six months, respondents and nonrespondents were reassessed according to American Rheumatology Criteria (ARC). RESULTS: The number of true NK cells did not significantly change after treatment with RTX. However, an increase in the percentage of CD56+ cells was observed between the first and second month after RTX infusion. Respondents also displayed a tendency toward an increased number of true NK cells after two months of treatment. At baseline, the number of NK cells was also found to be significantly higher in patients with RA than in control individuals (p<0.05). CONCLUSIONS: Respondents displayed a tendency toward an increase in the absolute number of true NK cells in the second month after RTX infusion. No significant changes in the profile and frequency of NK cells were found between preand post-RTX treatment assessments of patients with RA. However, it was found that patients with RA have a higher number of NK cells than control partcipants, suggesting a possible role of these cells in RA.

Meduloblastoma (MB) e Tumor Teratóide Rabdóide Atipico (TTRA) são tumores malignos do sistema nervoso central (SNC) que ocorrem na infância. Embora tenha havido um aumento na sobrevida, recorrência e metástases são frequentes e as opções terapêuticas poucas e tóxicas para crianças. Uma alternativa à terapia tradicional é a imunoterapia, que pode contornar os efeitos tóxicos associados à radioterapia e quimioterapia. De uma forma geral a imunoterapia depende da presença de antígenos associados a tumor (TAA) e/ou processamento de antígenos expressos pelo HLA classe I. No entanto, TAA para MB ou ATRT não estão bem definidos e tecidos neuronais tem a expressão de HLA classe I muito baixa. As células Natural Killer (NK) não dependem de TAA para citólise e são particularmente ativas na ausência de moléculas do HLA classe I tendo, portanto, potencial para o tratamento dessas doenças. Atualmente as barreiras para a aplicação clínica de células NK são quantitativas e qualitativas. Com o intuito de quebrar a barreira quantitativa foi criada uma plataforma tecnológica para a expansão das NK ex vivo. Essa plataforma consiste no co-cultivo de células mononucleares de sangue periférico com células apresentadoras de antígeno artificiais (aAPC), que expressam Interleucina 21 ligada à membrana. Com essa tecnologia foi possível expandir células NK na ordem de 40.000 vezes. Também foi demonstrada a persistência das células NK expandidas in vitro por 3 semanas após infusão em cérebro murino e que essas células expressam altos níveis de citocinas antitumorais e estimulantes do sistema imune: Interferon gama e Fator de Necrose Tumoral alfa. Finalmente, foi demonstrada a atividade citolítica das células NK tanto in vitro, contra um painel de células de MB e ATRT, quanto in vivo em um modelo murino de MB. Os resultados obtidos fornecem a primeira evidência pré-clínica que provê suporte ao uso de células NK expandidas usando essa plataforma tecnológica no combate a cânceres de cérebro pediátricos. Com base nesses dados, nosso grupo no MD Anderson Cancer Center iniciou um ensaio clínico fase I para testar a segurança e eficácia de administração locorregional de células NK expandidas usando aAPC para o tratamento de tumores pediátricos da fossa posterior do cérebro. / Medulloblastoma (MBs) and Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor (ATRT) are malignant pediatric brain tumors. Although survival has improved, recurrence and metastasis are frequent with few therapeutic options for these children. Immunotherapy is an alternative to traditional therapies that may circumvent the potential toxicities associated with traditional chemotherapy and radiation approaches. Many immune based therapies rely on the presence of tumor associated antigens (TAAs) and/or antigen processing and class I human leukocyte antigen (HLA I) expression. However, TAAs for MB are not well defined and neuronal tissues have very low HLA I expression. Natural killer (NK) cells do not rely on TAA for cytolysis and therefore have potential for the treatment of these diseases. The current barriers to clinical application of NK therapy are quantitative and qualitative. To overcome quantitative barriers, we have worked with a platform technology for the ex vivo expansion of NK cells through co-culture of peripheral blood mononuclear cells with artificial antigen presenting cells expressing membrane-bound IL-21 (mbIL21) to promote a 40,000-fold expansion of NK cells. We also demonstrate prolonged life-span of ex vivo expanded NK cells and persistence for up to 3 weeks post-infusion in the murine brain. These cells express high levels of immune stimulatory and anti-tumor cytokines - interferon gamma and TNF-alpha following activation. Finally we demonstrate NK cytolytic activity in vitro against a panel of primary and established ATRT and MB cells and in vivo following locoregional delivery in a mouse orthotopic model of MB. Our data provide the first pre-clinical evidence supporting the use of mbIL21 expanded NK cells against pediatric brain tumors. Based on this data we have initiated a novel Phase I clinical trial at MD Anderson Cancer Center to assess the safety and efficacy of locoregional delivery of mbIL21 expanded NK cells for the treatment of posterior fossa pediatric brain tumors.

Nosso estudo teve como um dos objetivos analisarmos a frequência do polimorfismo dos genes KIR na população caucasóide do Rio Grande do Sul e comparamos com resultados de outros Estados do Brasil e também de outros países. Em um segundo momento, avaliar a associação entre os genes KIR em pacientes com diabete Mellitus tipo 1 (DM1) e controles saudáveis. As células natural killer (NK) fazem parte do sistema imune inato e reconhecem as moléculas HLA (antígeno leucocitário humano) de classe I em células-alvo através de seus receptores de membrana. Os receptores principais das células NK são conhecidos como receptores killer do tipo imunoglobulina (KIR) e estão localizados no cromossomo 19q13.4. Estão divididos em grupos funcionais inibidores e ativadores. No primeiro artigo, o objetivo era de analisar os genes KIR e HLA -A, -B e -Cw em 200 indivíduos saudáveis do Rio Grande do Sul pela técnica PCR-SSP. A população do Sul do Brasil demonstrou similaridades com Estados mais próximos geograficamente, e diferenças principalmente com o norte e nordeste. O gene KIR2DS5 foi o menos frequente na população estudada, e a interação KIR ⁄HLA foi mais comum na associação 2DS1-⁄2DL1+⁄C2+. No segundo artigo, analisamos 15 genes KIR e os alelos do sistema HLA classe I em 248 pacientes caucasóides brasileiros com DM1 e em 250 controles saudáveis, usando a técnica de PCR com primers específicos (PCR-SSP). O genótipo 2DL1/C2+ foi mais comum em controles (p=0.001), assim como o haplótipo KIR2DL2/DR3/DR4+ e KIR2DL2/DR3+ (p<0.001; p<0.001).