O estudo de mutações genéticas como causa das cardiomiopatias teve início com a descoberta de mutações em proteínas sarcoméricas que levavam à Cardiomiopatia Hipertrófica, desde então, alterações em diversos genes, de proteínas contráteis ou não, foram descobertas e listadas como a responsável pelo desenvolvimento de diferentes cardiomiopatias. Estudar o efeito destas mutações nos cardiomiócitos destes pacientes permanecia um desafio devido ao difícil acesso às células cardíacas. Em 2007, a técnica de reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes foi descoberta. Pelo fato das células-tronco pluripotentes serem capazes de ser diferenciadas em cardiomiócitos, surgiu-se a possibilidade de se estudar essas células de indivíduos portadores das mutações genéticas. Esta tese teve como objetivo a criação de um modelo celular para estudar a Cardiomiopatia Hipertrófica causada por mutações genéticas. Inicialmente foi estabelecido um protocolo de reprogramação celular para se estabelecer linhagens celulares das células-tronco induzidas de um paciente com mutação no gene MYH7. Tendo as células caracterizadas, elas foram diferenciadas em cardiomiócitos através de um protocolo adaptado de protocolos de diferenciação direta em cardiomiócitos. Os cardiomiócitos gerados apresentaram características moleculares e funcionais semelhantes à cardiomiócitos primários humanos e foi visualizado, através de microscopia eletrônica de transmissão, que os cardiomiócitos do paciente com alteração genética possuíam grande proporção de sarcômeros desorganizados em comparação a cardiomiócitos de indivíduos saudáveis. Em conclusão, o modelo celular desenvolvido sugere ser possível o estudo do efeito de mutações genéticas em Cardiomiopatia Hipertrófica. / The study of genetic mutations as the cause of cardiomyopathies initiates with the discovery of mutations in sarcomeric proteins genes that lead to Hypertrophic Cardiomyopathy. Since then, mutations in several genes, coding to sarcomeric proteins or not, were discovered and listed as the reason to the cardiomyopathies. To study the effect of these mutations was a challenge due the difficulty to accesses cardiac cells. In 2007, the technique of reprogramming somatic cells into pluripotent stem cells was discovered. The fact that the pluripotent stem cells are capable of differentiating into cardiomyocytes opened the opportunity to study these cells from individuals with genetic mutations. This thesis aimed to create a cellular model to study Hypertrophic Cardiomyopathy caused by genetic mutations. Initially we established a cell reprogramming protocol to establish induced stem cells lines from a patient with mutation in MYH7 gene. Having characterized the cells, they were differentiated into cardiomyocytes using an adapted protocol from direct differentiation protocols. Cardiomyocytes generated showed molecular and functional characteristics similar to human primary cardiomyocytes and were visualized by means of transmission electron microscopy. The patient\'s cardiomyocytes had a large proportion of disorganized sarcomeres compared to cardiomyocytes from healthy individuals. In conclusion, the cell model developed suggests that it is possible to study the effect of genetic mutation in Hypertrophic Cardiomyopathy using induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.

Os vírus são eficazes na transferência de genes em células devido aos seus mecanismos especializados. No entanto, vírus como veículos de entrega de genes podem acarretar em problemas, particularmente quando proposto para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) visando utilização terapêutica. No presente estudo, procurou-se desenvolver um sistema alternativo para entregar diretamente proteínas nucleares (Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc) fusionadas com o domínio de transdução de proteína TAT, para promover a reprogramação de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) ou células mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (hASC) em células iPS. Primeiramente o PTD TAT ou TAT- foi fundido a proteína verde fluorescente (GFP) como modelo para prova de princípio e padronização detalhada. Inesperadamente, TAT-GFP produzido e secretado pelas células NIH-3T3 produtora não foi capaz de ser detectado no meio de cultura por verificação quantitativa fluorimétrica, nem foi capaz de ser detectada em células-alvo, por citometria de fluxo, depois de co-cultura em transwells. Essa observação pode ser explicada por: (1) ineficiência desse tipo de célula em secretar proteínas e (2) falta de resistência à clivagem por endoproteases furinas. Para contornar esses fatores limitantes usou-se citometria de fluxo para avaliar as melhores condições para a transfecção por seis diferentes tipos de células (CHO, NIH-3T3, HT1080, HEK-293A, HEK-293t e COS-7) com TAT (modificada para ser resistente à furinas) fundido a GFP. Células 293t-TAT-GFP exibiram a maior eficiência de transfecção e também de secreção. O mesmo pôde ser observado para as seis linhagens celulares expressando fatores de transcrição nucleares TAT, determinados por ELISA. Em seguida, diferentes estratégias de entrega foram testadas. A primeira foi baseada na co-cultura de uma mistura de células produtoras com MEF ou hASC. No entanto, não foi possível observar a reprogramação devido à morte celular. A segunda foi baseada na concentração de meio condicionado de cultura de células por centrifugação usando colunas Amicon, trocando o meio a cada 24h, em quatro ciclos. No entanto, apesar da presença de algumas colônias após 20-30 dias, nenhuma colônia verdadeira iPS foi obtida. Na sequência, as células foram tratadas com cada proteína de forma independente, e as demais foram substituídas pelo retrovírus correspondente, trocando meio a cada 72h, em quatro ciclos. Essa estratégia, apesar de permitir verificar a função de cada proteína, também não resultou em reprogramação. Este achado pode ser explicado pela diferenciação celular induzida por BCS, que também é concentrado no processo. Assim, passou-se a adaptação de \"células produtoras\" em condições de cultura livre de soro, para enriquecer a produção dos fatores nucleares individuais, necessários para a reprogramação. A otimização sistematizada deste processo está sendo realizada em parceria com o IPT e deve resultar em quantidades de proteína de fusão suficientes para o teste final da hipótese proposta. Em conjunto, são apresentados os dados da geração de linhagens celulares expressando estavelmente os vários fatores de transcrição e estratégias para melhorar a eficiência necessária para a produção iPS. Esta nova estratégia garante uma produção eficiente de TAT fundida a fatores nucleares de reprogramação e sua eficácia para promover a reprogramação de células somáticas de maneira livre de vírus merece ser investigado futuramente / Viruses are effective at transferring genes into cells by its specialized mechanisms. However, viruses as gene delivery vehicles entail problems, particularly when proposed to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPS) for therapeutic uses. In the present study, we aimed to develop an alternative system for directly delivering nuclear proteins (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc) fused with TAT protein transduction domain to promote reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEF) or human adipose tissue derived mesenchymal cells (hASC) into iPS cells. First TAT- or TAT- PTD was fused to green fluorescent protein (GFP) as a proof of principle model and for detailed standardization. Unexpectedly, TAT-GFP produced and secreted by NIH-3T3 producer cells was not detected in the culture medium by quantitative fluorimetric verification, nor detected on target cells, by flow cytometry, after being co-cultured using transwells. This observation maybe explained by: (1) inefficiency of this cell type to be transfected and to secrete proteins and (2) lack of resistance to furin endoproteases cleavage on Golgi of TAT sequence. To circumvent these limiting factors we used flow cytometer to assess the best conditions for transfection in six different cell types (CHO, NIH-3T3, HT1080, HEK-293A, HEK-293t and COS-7) with TAT- (a modified PTD to be resistant to furin endoproteases) fused to GFP. 293t-TAT-GFP cells displayed the highest transfection efficiency and secretion levels. The same could be observed for the six cell lineages expressing TAT- nuclear transcription factors, determined by ELISA.Next, different delivery strategies were tested for TAT- nuclear transcription factor system. Co-culturing a mix of producer cells with MEF or hASC resulted in not reprogramming and this was associated with cell death. The second was based on the use of microconcentrated conditioned cell culture medium, changed every 24h, in four cycles. However, despite the presence of some emerging colonies after 20-30 days, no true iPS colonies were obtained. Then, cells were treated with each protein independently, and the others were replaced by the corresponding retrovirus, changing cell medium every 72h, in four cycles. We verified the reprogramming potential of each protein, but no true colonies were obtained.One possibility for this finding is that BCS is also concentrated by centrifugation and may induce cell differentiation. To circumvent these problems, we have started the adaptation of producer cells in a serum-free culture condition to enrich the production of the individual factors required for reprogramming. This optimization process is taking place in collaboration with the IPT and shall result in large amounts of the fusion protein to finally test the proposed hypothesis. Altogether, we presented the generation of several cell lines stably expressing the transcription factors and strategies to improve the efficiency required for iPS production. This novel strategy guarantees efficient production of TAT-fused reprogramming nuclear factors and its efficacy to promote somatic cells reprogramming in a virus-free manner deserves to be further investigated

A reprogramação nuclear de uma célula somática a um estado embrionário tem diversas aplicações, como pesquisas básicas na biologia do desenvolvimento, terapia celular, melhoramento genético em animais de produção e conservação de espécies. As principais técnicas utilizadas para a reprogramação nuclear são a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) e a geração de células tronco pluripotente induzidas (iPS). Muitos trabalhos têm mostrado uma baixa eficiência no processo de reprogramação nuclear nas duas técnicas, além disso, modificações epigenéticas tem sido apontada como a principal barreira para uma reprogramação nuclear eficiente. Por esse motivo, medidas como a utilização de células menos diferenciadas e/ou alteração do perfil epigenético das células somáticas podem aumentar a eficiência destas técnicas. Por isso, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência de marcas epigenéticas em células bovinas utilizadas na reprogramação nuclear mediada por TNCS ou superexpressão de genes relacionados a pluripotêcia (iPS). Para isso, utilizamos 3 abordagens. Primeiro, analisamos marcações epigenéticas relacionadas ao desenvolvimento embrionário e pluripotência (H3K9me2, H3K9me3, H3K9ac, 5mC e 5hmC) em diferentes tipos celulares, analisamos a expressão gênica de genes responsáveis por essas marcações em células de diferentes tecidos (ex. células tronco mesenquimais (MSC) e fibroblastos) e as utilizamos como doadoras de núcleo na TNCS. Na segunda e a terceira abordagem, utilizamos células com menores níveis de H3K9me2 para a geração de iPS e na TNCS, respectivamente. Além disso, por se mostrar eficiente na TNCS, analisamos o efeito da sincronização do ciclo celular por privação de soro fetal bovino (SFB) na geração de células iPS. Com o intuito de diminuir os níveis de H3K9me2, as células foram tratadas com UNC0638, um inibidor especifico das metiltransferases de histona G9a/GLP. Nossos resultados do primeiro experimento mostraram que as MSC podem ser utilizadas como doadoras de núcleo na TNCS, no entanto, mesmo com algumas diferenças na expressão gênica em relação aos fibroblastos, a produção de blastocistos não foi diferente entre as duas células. No segundo experimento, as células privadas de SFB geraram mais colônias que as células controle, enquanto que as células tratadas não apresentaram diferença. Por último, as células tratadas com o UNC0638 apresentaram um menor nível de metilação no DNA em zigotos em relação às células controle. Os resultados encontrados neste trabalho podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos epigenéticos envolvidos na reprogramação nuclear de bovinos / Nuclear reprogramming of somatic cells to embryonic state has several aplications, such as basic research on developmental biology, cell therapy, genetic improvement in livestock animals and preservation of endangered species. The principal techniques utilized to achieve nuclear reprogramming are Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) and induced pluripotency. Several works has reported low efficiency rates of nuclear reprogramming when these techniques are used to reprogram somatic cells. Moreover, epigenetic modifications acquired during development act as epigenetic barrier to the complete reprogramming process. For this reason, strategies such as use of less differentiated cells and/or modification of epigenetic profile of somatic cells might increase the efficiency these techniques. The objective of this work was investigate the influence of epigenetic marks in bovine cells utilized on nuclear reprogramming experiments mediated by SCNT or induced pluripotency. To investigate it, we used three approaches. First, we analyzed the epigenetic marks related to the embryonic development and pluripotency (e.g H3K9me2, H3K9me3, H3K9ac, 5mC and 5hmC), gene expression of genes involved in these epigenetic marks in different tissues (i.e. mesenchymal stem cells (MSC) and fibroblasts) and their use as nuclear donor cells on SCNT procedure. Regarding the second and the third approach, we utilized cells with reduced levels of H3K9me2 to generate iPS cells and cloned embryos, respectively. Furthermore, since serum starvation has been demonstrated increase SCNT developmental rates, we assessed the effect of cell cycle synchronization mediated by serum starvation on nuclear reprogramming using iPS cells. Aiming decrease the levels of H3K9me2, cells were treated with UNC0638, a chemical probe that works as a specific inhibitor of the histone methyltransferases G9a and its counterpartner GLP. Our results showed that MSC are suitable to be used as nuclear donors on SCNT procedures, however, in spite of differences on gene expression comparing with fibroblasts, the embryonic developmental rates were not improved. On the second experiment, cells privated of fetal calf serum produced more iPS cells colonies than control cells, whereas cells treated with UNC did not show differences when compared with untreated cells. Lastly, UNC treated donor cells treated produced cloned zygotes with lower levels of DNA methylation compared to zygotes derivated from untreated cells. The results presented here will contribute to the better understanding of the epigenetic mechanisms involved on bovine nuclear reprogramming

Os tecidos da polpa dentária e vibrissa são dois microambientes celulares que compartilham a mesma origem embrionária. Ambos possuem o seu nicho especifico pós-natal que abrigam células tronco adultas (CTA). O objetivo do trabalho foi investigar a expressão diferencial dos marcadores de células pluripotentes, mesenquimais e neuroepiteliais nas populações de células tronco isoladas das vibrissas (CTV) e polpa de dente (CTPD) de camundongos C57BL-6. Resultados obtidos no presente trabalho, utilizando o método de imunofluorescência, revelaram que as CTA de ambos tecidos expressam um amplo painel de marcadores de pluripotência (Oct4, Nanog e Sox2), mesenquimais (CD73, CD90 e CD105), hematopoiético (CD34), crista neural (CKit), neuronal (Nestina) e epitelial (Integrina α6, LGR5 e LGR6) e indica possível potencial destas células em diversas linhagens celulares. Desta forma, células isoladas destes tecidos podem ser interessantes para serem aplicadas em diversos tratamentos na medicina regenerativa. Portanto, o estudo comparativo da expressão de um amplo painel de marcadores de células tronco em CTV e CTPD pode vir a aumentar o leque de possibilidades de sua utilização na terapia celular. Com isso, as células isoladas de polpa dentária foram submetidas à análise de expressão de marcadores já citados e a outros conhecidamente positivos e específicos para os folículos piloso como Citoqueratina 15 (CK15), LRig1 e Blimp1. Foram realizados ensaios de imunofluorescência, imunohistoquímica, citometria de fluxo e RT-PCR. Os dados obtidos nos permitiram concluir, que as CTA isoladas das ambas as fontes são bastante semelhantes em relação ao seu imunofenótipo, porém as características da sua diferenciação precisam ainda ser analisadas. / The tissues of the dental pulp and vibrissae are two cellular microenvironments that share the same embryonic origin. Both have their postnatal specific niche that keep adult stem cells (ASC). The objective of this study was to investigate the differential expression of pluripotent markers, mesenchymal and neuroepithelial in populations of stem cells isolated from whiskers (WSC) and dental pulp (DPSC) C57BL-6 mice. Results obtained in this study, using immunofluorescence, revealed that the ASC both tissues express a broad panel of pluripotency markers (Oct4, Nanog and Sox2), mesenchymal cells (CD73, CD90 and CD105), hematopoietic (CD34), crest neural (cKIT), neuronal (Nestin) and epithelial (Integrin α6, LGR5 and LGR6) and indicates possible potential of these cells in several cell lines. Thus, isolated cells of these tissues may be interesting for application in various treatments in regenerative medicine. Therefore, the comparative study of the expression of a broad panel of stem cell markers in WSC and DPSC could increase the range of possibilities for their use in cell therapy. Thus, the isolated cells were subjected to the dental pulp marker expression analysis cited above and others known to be positive and specific to hair follicles as Cytokeratin 15 (CK15), and LRig1 Blimp1. Immunofluorescence assays were performed, immunohistochemistry, flow cytometry and RT-PCR. The data allowed us to conclude that the ASC isolated from both sources are quite similar with respect to their immunophenotype, but the characteristics of differentiation remain to be analyzed.

As doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade a nível mundial. Desde o conhecimento da importância da mitocôndria no metabolismo do cardiomiócito, alterações no funcionamento desta organela têm sido associadas a um dos principais causadores do infarto do miocárdio e consequente morte celular. O cofator de transcrição PGC-1alfa tem sido alvo de diversos estudos relacionados com o metabolismo celular devido à sua forte participação na biogênese mitocondrial. Considerando a limitação de material biológico para o estudo de doenças cardíacas, muito se tem investido no estudo de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Esta tese teve como principal objetivo a avaliação dos efeitos da variação da expressão de PGC-1alfa em iPSCs e na sua diferenciação em cardiomiócitos. Após estabelecimento de um protocolo de reprogramação celular, em que ocorre geração de iPSCs a partir de fibroblastos humanos, induzimos a inibição da expressão de PGC-1alfa em 50% e 70% pelo uso de vetores lentivirais, e analisamos o estado de pluripotência através da avaliação de expressão genica e proteica dos principais marcadores - SSEA4, TRA-1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA-1-81. Não observamos diferenças significativas no conteúdo destes marcadores entre os clones de iPSC controle e inibidos. Estabelecemos um protocolo de diferenciação de iPSCs em cardiomiócitos com elevada taxa de reprodutibilidade, através da adaptação de protocolos descritos na literatura, e submetemos estas iPSCs à diferenciação. As células geradas pela diferenciação do clone controle apresentaram características típicas de cardiomiócito: contratilidade e alta expressão molecular de troponina T e troponina I. Em contraste, as células com 70% de inibição de PGC-1alfa se mostraram incapazes de contrair e com baixa expressão de troponina. Através de uma análise dos níveis de expressão genica e proteica de diversos marcadores expressos durante o processo de diferenciação (T, NKX2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), observamos que o clone com maior inibição de PGC-1alfa apresentou sempre níveis de expressão diminuídos em relação aos clones controle. Em conclusão, podemos afirmar que o PGC-1alfa não interfere com as características de auto-renovação e pluripotência das iPSCs mas possui um papel essencial na diferenciação de células-tronco pluriotentes induzidas em cardiomiócitos. Os resultados obtidos contribuem para informações preliminares acerca do desenvolvimento de iPSCs com inibição da expressão de PGC-1alfa durante a diferenciação cardíaca, mas estudos relativos ao potencial papel deste cofator durante o desenvolvimento cardíaco in vivo ainda precisam ser aprofundados, utilizando outros modelos de estudo / Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Since the knowledge of the importance of mitochondria in the cardiomyocyte metabolism, changes in the functioning of this organelle has been associated with one of the main causes of myocardial infarction and subsequent cell death. The transcriptional cofactor PGC-1alpha has been subjected to several studies related to cell metabolism due to its strong involvement in mitochondrial biogenesis. Considering the limitations of biological material in the study of heart disease, there has been a lot of investment in the study of induced pluripotent stem cells (iPSCs). The main objective of this thesis was to evaluate the effects of the variation in expression of PGC-1alpha in iPSCs and it\'s differentiation in cardiomyocytes. After the estabilshment of a cellular reprogramming protocol, where iPSCs is generated from human fibroblasts, the expression of PGC-1alpha was induced by 50% and 70% with the use of lentiviral vectors and the state of pluripotency was determined by analyzing the gene and protein expression of the main markers - SSEA4, TRA- 1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA- 1- 81. There were no significant differences observed in the content of these markers between the iPSC clones control and inhibited. A protocol for the differentiation of iPSCs into cardyomyocites was established with a high reproducibility rate, by adapting existing protocols in the general literature, submiting these iPSCs into diferentiation. The cells generated from the differentiation of the control clone showed typical characteristis of cardiomyocytes: contractility and high molecular expression of troponin T and troponin I. In contrast, the cells with 70% inhibition PGC-1alpha were unable to contract and had low troponin expression. Through an analysis of gene expression and protein levels of several markers expressed during the differentiation process (T, Nkx2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), the clone with greater inhibition of PGC-1alpha always showed decreased expression levels compared to control clones. In conclusion, we can say that the PGC-1alpha does not interfere with the characteristics of self-renewal and pluripotency of iPSCs but has an essential role in the differentiation of pluripotent stem cells induced into cardiomyocytes. These results were obtained thanks an original approche based on iPSC technology enabling genetic modifications of the cells and controled differentiation into cardiomyocytes, but the potential role of PGC-1alpha on in vivo cardiac development or cardiomyocytes maturation remaisn to be evaluated using other models

As doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade a nível mundial. Desde o conhecimento da importância da mitocôndria no metabolismo do cardiomiócito, alterações no funcionamento desta organela têm sido associadas a um dos principais causadores do infarto do miocárdio e consequente morte celular. O cofator de transcrição PGC-1alfa tem sido alvo de diversos estudos relacionados com o metabolismo celular devido à sua forte participação na biogênese mitocondrial. Considerando a limitação de material biológico para o estudo de doenças cardíacas, muito se tem investido no estudo de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Esta tese teve como principal objetivo a avaliação dos efeitos da variação da expressão de PGC-1alfa em iPSCs e na sua diferenciação em cardiomiócitos. Após estabelecimento de um protocolo de reprogramação celular, em que ocorre geração de iPSCs a partir de fibroblastos humanos, induzimos a inibição da expressão de PGC-1alfa em 50% e 70% pelo uso de vetores lentivirais, e analisamos o estado de pluripotência através da avaliação de expressão genica e proteica dos principais marcadores - SSEA4, TRA-1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA-1-81. Não observamos diferenças significativas no conteúdo destes marcadores entre os clones de iPSC controle e inibidos. Estabelecemos um protocolo de diferenciação de iPSCs em cardiomiócitos com elevada taxa de reprodutibilidade, através da adaptação de protocolos descritos na literatura, e submetemos estas iPSCs à diferenciação. As células geradas pela diferenciação do clone controle apresentaram características típicas de cardiomiócito: contratilidade e alta expressão molecular de troponina T e troponina I. Em contraste, as células com 70% de inibição de PGC-1alfa se mostraram incapazes de contrair e com baixa expressão de troponina. Através de uma análise dos níveis de expressão genica e proteica de diversos marcadores expressos durante o processo de diferenciação (T, NKX2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), observamos que o clone com maior inibição de PGC-1alfa apresentou sempre níveis de expressão diminuídos em relação aos clones controle. Em conclusão, podemos afirmar que o PGC-1alfa não interfere com as características de auto-renovação e pluripotência das iPSCs mas possui um papel essencial na diferenciação de células-tronco pluriotentes induzidas em cardiomiócitos. Os resultados obtidos contribuem para informações preliminares acerca do desenvolvimento de iPSCs com inibição da expressão de PGC-1alfa durante a diferenciação cardíaca, mas estudos relativos ao potencial papel deste cofator durante o desenvolvimento cardíaco in vivo ainda precisam ser aprofundados, utilizando outros modelos de estudo / Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Since the knowledge of the importance of mitochondria in the cardiomyocyte metabolism, changes in the functioning of this organelle has been associated with one of the main causes of myocardial infarction and subsequent cell death. The transcriptional cofactor PGC-1alpha has been subjected to several studies related to cell metabolism due to its strong involvement in mitochondrial biogenesis. Considering the limitations of biological material in the study of heart disease, there has been a lot of investment in the study of induced pluripotent stem cells (iPSCs). The main objective of this thesis was to evaluate the effects of the variation in expression of PGC-1alpha in iPSCs and it\'s differentiation in cardiomyocytes. After the estabilshment of a cellular reprogramming protocol, where iPSCs is generated from human fibroblasts, the expression of PGC-1alpha was induced by 50% and 70% with the use of lentiviral vectors and the state of pluripotency was determined by analyzing the gene and protein expression of the main markers - SSEA4, TRA- 1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA- 1- 81. There were no significant differences observed in the content of these markers between the iPSC clones control and inhibited. A protocol for the differentiation of iPSCs into cardyomyocites was established with a high reproducibility rate, by adapting existing protocols in the general literature, submiting these iPSCs into diferentiation. The cells generated from the differentiation of the control clone showed typical characteristis of cardiomyocytes: contractility and high molecular expression of troponin T and troponin I. In contrast, the cells with 70% inhibition PGC-1alpha were unable to contract and had low troponin expression. Through an analysis of gene expression and protein levels of several markers expressed during the differentiation process (T, Nkx2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), the clone with greater inhibition of PGC-1alpha always showed decreased expression levels compared to control clones. In conclusion, we can say that the PGC-1alpha does not interfere with the characteristics of self-renewal and pluripotency of iPSCs but has an essential role in the differentiation of pluripotent stem cells induced into cardiomyocytes. These results were obtained thanks an original approche based on iPSC technology enabling genetic modifications of the cells and controled differentiation into cardiomyocytes, but the potential role of PGC-1alpha on in vivo cardiac development or cardiomyocytes maturation remaisn to be evaluated using other models

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-06-21T17:12:33Z No. of bitstreams: 1 cinthiadias_dissert.pdf: 1995817 bytes, checksum: 27317444195c0604e0ed14f9ac182ee5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-21T17:12:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cinthiadias_dissert.pdf: 1995817 bytes, checksum: 27317444195c0604e0ed14f9ac182ee5 (MD5) Previous issue date: 2015-08-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP / Introduction: Stem cell therapy is a promising strategy to repair or delay the progression of chronic renal failure (CRF). Induced pluripotent stem cells (iPS) can be a therapeutic alternative due to their differentiation potential. Objectives: 1- To modify genetically stem cells from mice´s fibroblasts with lentiviral vectors containing transcription factors, transforming differentiated cells into iPS; 2- To evaluate the effect of iPS in the experimental IRC progression of IRC induced by 5/6 nephrectomy (CRF-5/6). Materials and Methods: The animals were divided according to the type of cell therapy received from extracted mesenchymal stem cells from bone marrow (MSC) or iPS and compared with CRF group 5/6 without treatment. Assessment of renal function was carried out during baseline and after 60 days. Additionally expression of genes, VEGF, IL-6, TGF-β and IL-10 were quantified in the kidney tissue, and also the analysis of implanted cell migration through the SRY gene. Immunohistochemical study evaluated the expression of CD68, α-SMA, TGF-β, PCNA and VEGF markers. Results: A significant decrease was observed in creatinine variation (p<0.05) and plasma urea (p<0.01) in animals treated with MSC and a 33%-decrease in plasma creatinine levels of animals treated with iPS cells, although non- significant when compared to the control group. The 24-hour proteinuria was significantly reduced only in the iPS group (p<0.0001). Significant improvement was observed in creatinine clearance in both treatments (p<0.04). Disease progression measured by the clearance decline rate was significantly lower only in the MSC group (p<0.05) and the urinary osmolality was similar in both treated groups. There was an increase in the expression of TGF- β gene in iPS group when compared to the control group (p<0.05) and VEGF expression in the groups treated with iPS and MSC (p<0.05). IL-6 and IL-10 showed similar expression levels in both treated groups (p=NS). Immunohistochemical analysis showed fewer macrophages and decreased cell proliferative activity (PCNA) in the iPS group p<0.05. Histological analysis showed a significant decrease in glomerulosclerosis in both treatment groups (p<0.01), tubular atrophy was similar in all groups . Leukocyte infiltration was reduced in both treatments when compared to CRF group. The SRY gene was detected in 5 out of 8 (62.5%) mice that were treated with iPS. After 60 days the tumor formations were observed in animals in which SRY gene was detected. Conclusions: MSC therapy is effective in delaying the progression of CKD. Treatment with iPS also improves some parameters of renal function but this assessment can be difficult since the onset of tumor formations; thus some care is necessary with this type of cells. / Introdução: A terapia com células-tronco (CT) é uma estratégia promissora para reparar ou retardar a progressão da insuficiência renal crônica (IRC). As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) podem ser uma alternativa terapêutica, em virtude de seu potencial de diferenciação. Objetivos: 1) Modificar geneticamente células de fibroblastos de ratos com vetores lentivirais contendo fatores de transcrição, transformando essas células diferenciadas em iPS; 2) Avaliar o efeito das iPS e CTM na progressão da IRC experimental induzida pela nefrectomia 5/6 (CRF5/6). Materiais e Métodos: Os animais foram divididos conforme o tipo de terapia celular recebida (célula-tronco mesenquimal extraída da medula óssea (CTM) ou com iPS) e comparados com o grupo CRF5/6. A avaliação da função renal foi realizada no período basal e após 60 dias. Adicionalmente foi quantificada a expressão dos genes, VEGF, IL-6, TGF-β e IL-10 no tecido renal e estudada a migração das células implantadas contendo o gene SRY. O estudo imunohistoquímico avaliou a expressão de marcadores CD68, α-SMA, TGF-β, PCNA e VEGF. Resultados: Redução significativa foi observada na variação da creatinina (p<0,05) e ureia plasmática (p<0,01) dos animais tratados com CTM e uma diminuição de 33% dos níveis de creatinina plasmática nos animais tratados com células iPS, porém sem significância estatística quando comparada ao grupo controle. A proteinúria de 24 horas foi reduzida somente no grupo iPS (p=0,0001) e houve melhora significativa no clearance de creatinina com ambos tratamentos (p=0,04). A progressão da doença, medida pela taxa de declínio do clearance de creatinina, foi significativamente lentificada somente no grupo CTM (p=0,04) e a osmolalidade urinária foi similar em ambos os grupos tratados. Houve aumento na expressão do gene TGF-β no grupo iPS quando comparado ao grupo controle (p=0,01) e da expressão de VEGF nos grupos tratados com iPS e CTM (p=0,01). IL-6 e IL-10 mostraram níveis de expressão semelhantes em ambos os grupos tratados (p=NS). A análise imunohistoquímica demonstrou menor número de macrófagos e diminuição da atividade proliferativa celular (PCNA) no grupo iPS p<0,05. A analise histológica mostrou diminuição significativa da glomeruloesclerose em ambos grupos tratados (p<0,01), a atrofia tubular foi semelhante nos três grupos. A infiltração leucocitária foi reduzida em ambos os tratamentos, quando comparados ao grupo CRF. O gene SRY foi detectado em 5 de 8 (62,5%) ratos que receberam tratamento com iPS. Após 60 dias foram observadas as formações tumorais nos respectivos animais em que o gene SRY foi detectado. Conclusões: A terapia com CTM é eficiente para retardar a progressão da IRC. Tratamento com iPS também melhora alguns parâmetros da função renal, mas o aparecimento de formações tumorais dificulta essa avaliação e requer cuidados com esse tipo de célula.

A cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito (CAVD) tem origem genética e é caracterizada pela substituição de células miocárdicas por tecido fibroadiposo. A doença tem uma prevalência aproximada de 1:3500, sendo mais frequentemente diagnosticada em indivíduos jovens, atletas e do sexo masculino. Atualmente, várias alterações genéticas associadas a CAVD foram descritas em 12 genes diferentes. No entanto, existem poucos estudos na literatura que descrevem o espectro mutacional da doença usando um painel abrangente de genes potencialmente causais, em populações diferentes das coortes descendentes de europeus. O sequenciamento de nova geração (NGS) como ferramenta para o diagnóstico molecular da doença, permite um avanço na correlação entre alterações genotípicas e fenotípicas e tem aportado potenciais benefícios que crescem juntamente com os desafios na sua interpretação. Além disso, o uso de hiPSCs como modelo in vitro de determinadas doenças cardíacas, permite avaliar especificamente a relação do genótipo com as diferentes consequências fenotípicas celulares da CAVD. Entretanto, os mecanismos moleculares da doença ainda são pouco esclarecidos e não há na literatura estudos que englobem ao mesmo tempo o perfil mutacional (com um painel extenso de genes) e estudo funcional das alterações encontradas com o uso de hiPSC-CMs. Esta tese teve como objetivo descrever a prevalência de variantes causais em genes associados à CAVD na população brasileira, e caracterizar, do ponto de vista funcional, os cardiomiócitos derivados de hiPSC (hiPSC-CMs) de pacientes com mutações identificadas, a fim de associar o perfil mutacional e a expressão fenotípica celular. Quarenta e sete indivíduos, não aparentados, sendo 38 (80,85%) pacientes do sexo masculino, idade média 40,2 ± 15,56 anos, com diagnóstico clínico de CAVD, foram submetidos ao sequenciamento de um painel genético relacionado à cardiomiopatias hereditárias, compreendendo os 12 genes previamente descritos como causadores de CAVD, utilizando sequenciamento de nova geração (NGS). As variantes foram interpretadas e classificadas de acordo com os critérios da ACMG. Variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas foram encontradas em dezoito probandos (38,3%), com maior número de ocorrências no gene PKP2 (38,8%). Entre os 18 casos positivos, treze variantes diferentes foram encontradas, quatro delas novas variantes em genes desmossomais, sem descrição prévia na literatura. Variantes de significado incerto (VSI) foram encontradas em 16 pacientes. A presença de uma variante causal ocorreu em todos os probandos assintomáticos e foi significativamente associada a probandos com histórico familiar de morte súbita cardíaca abaixo de 35 anos. Para a modelagem celular da CAVD, foram geradas hiPSCs de dois pacientes a partir de células progenitoras de urina (UPCs) e fibroblastos, por transfecção episomal. O primeiro paciente possuía alteração missense no gene PKP2 e o segundo, uma inserção no gene DSC2. As hiPSCs foram caracterizadas quanto ao seu potencial de pluripotência e posteriormente diferenciadas em cardiomiócitos (hiPSC-CMs). Nossos resultados demonstraram diferenças fenotípicas significativas entre os CAVD-CMs comparados com os controle-CMs, como: reduções significativas de expressão das proteínas desmossomais e desmossomos estruturalmente alterados; presença de marcadores do acúmulo de gotículas lipídicas e regulação aumentada do fator de transcrição proadipogênico PPAR-gama; aumento de duração do potencial de campo (FPD) e do potencial de ação em 90% de repolarização (APD90); velocidade de condução mais lenta e uma força de contração menor. Em conclusão, este é o primeiro trabalho a caracterizar o perfil genético da CAVD, abrangendo todos os genes descritos até o momento relacionados à doença, na população brasileira. Os dados obtidos neste trabalho sugerem que, pacientes com história familiar de MSC ( < 35 anos) têm maior probabilidade de portar uma variante causal. Além disso, nossos achados sugerem que pacientes com alteração causal no gene PKP2 têm uma maior gravidade da apresentação fenotípica de arritmia. Nosso modelo celular, que contemplou células paciente-específicas com diferentes alterações das estudadas até o presente momento,sugere ser possível o estudo do efeito das alterações genéticas na CAVD e pode ser um acréscimo às ferramentas disponíveis para estudar o mecanismo desta doença complexa / Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) has a genetic origin and is mainly characterized by the replacement of myocardial cells with fibroadipose tissue. The disease has a prevalence of approximately 1: 3.500, being more frequently diagnosed in young individuals, athletes and males. Currently, several mutations associated with ARVC have been described in 12 different genes. However, there are few studies in the literature that describe the mutational spectrum of the disease using a comprehensive panel of potentially causal genes in populations other than European-descent cohorts. Next Generation Sequencing (NGS) as a tool for molecular diagnosis of the disease allows an advance in the correlation between genotypic and clinical phenotypic aspects and has potential benefits that grow along with the challenges in its interpretation. In addition, the use of hiPSCs as an in vitro model of certain heart diseases, allows to specifically evaluate the relationship of the genotype with the different cellular phenotypic consequences of ARVC. However, the molecular mechanisms of the disease are still poorly understood and there are no studies in the literature that include both the mutational profile (with an extensive panel of genes) and functional study of different causal variants, with the use of hiPSC-CMs. The aim of this thesis was to describe the prevalence of causal variants in ARVC-associated genes in the Brazilian population, and to characterize, from a functional point of view, cardiomyocytes derived from hiPSC (hiPSC-CMs) from patients with identified mutations, in order to associate the mutational profile and cellular phenotypic expression. Forty-seven unrelated probands, 38 (80.85%) male, mean age 40.2 ± 15.56 years, with clinical diagnosis of ARVC, were submitted to a cardiomyopathy-related gene panel sequencing, comprising 12 genes, using next-generation sequencing (NGS). Variants were interpreted and classified according to the ACMG criteria. Pathogenic or Likely Pathogenic variants were found in eighteen probands (38.3%), with the largest number of occurrences in the PKP2 gene (38.8%). Among the 18 positive cases, thirteen different variants were found, four of them novel mutations in desmosomal genes, without previous description in the literature. Variants of uncertain significance (VUS) were found in 16 patients. The presence of a causal variant was present in all asymptomatic probands and was significantly associated with probands who have a family history of sudden cardiac death under 35 years. For the cellular modeling, from urinary progenitor cells (UPCs) and fibroblasts, hiPSCs from two patients were generated by episomal transfection. The first patient had a missense variant in the PKP2 gene, while the second had an insertion in the DSC2 gene. The hiPSCs were characterized for its pluripotency potential and subsequently differentiated into cardiomyocytes (hiPSC-CMs). Our results demonstrated significant phenotypic differences between the ARVC-CMs compared to the control-CMs, such as: significant reductions in the expression of desmosomal proteins and structurally altered desmosomes; presence of lipid droplet accumulation markers and increased regulation of the proadipogenic transcription factor PPAR-gamma; prolonged field potential duration (FPD) and action potential in 90% repolarization (APD90); slower conduction velocity and a lower active contraction force. In conclusion, this is the first work to characterize the genetic profile of ARVC, covering all genes described to date related to the disease, in the Brazilian population. The data obtained in this study suggests that patients with a family history of sudden cardiac death ( < 35 years) are more likely to carry a causal variant. In addition, our findings suggest that patients with causal variant in the PKP2 gene have a greater severity of the phenotypic presentation of arrhythmia. Our cellular model, which contemplated patient-specific cells with different causal variants of the previous studies, suggests that it is possible to study the effect of the genetic changes in ARVC, and may be an addition to the tools available to study the mechanism of this complex disease

Introdução: As células-tronco apresentam capacidade de proliferação, autorrenovação, potencial de diferenciação e já foram descritas na hipófise estando envolvidas na renovação celular e regulação homeostática, porém pouco se sabe sobre o seu perfil de expressão nos quadros de hipopituitarismo. Dentre os marcadores de células-tronco descritos previamente na hipófise, destacam-se os genes Sox2, Nanog, Nestina, Cd44 e Oct4. Outro marcador, o gene Nr2e1 (Tlx), encontrado em células-tronco neuronais, apresenta-se elevado durante a embriogênese e na vida adulta no cérebro de camundongos, mas, até o momento, não foi caracterizado na hipófise. Objetivo: Analisar a imunolocalização do SOX2 e o padrão de expressão de marcadores de células-tronco/progenitoras, fatores de transcrição precoce, marcadores de apoptose e proliferação celular na hipófise de três linhagens de camundongos com hipopituitarismo de causa genética por alteração em fatores precoces de diferenciação glandular, as linhagens Ames (Prop1) e Snell (Pou1f1), e por fator tardio de conjugação dos hormônios glicoproteicos, a linhagem alfaGSU, nocaute do gene Cga. Material e Métodos: Foram coletadas hipófises nos tempos P0 (ao nascimento), P7 (final da primeira onda de crescimento glandular), 4 semanas (4S-período da puberdade) e 8 semanas (8S-vida adulta). Nas três linhagens de animais, realizou-se imuno-histoquímica com SOX2 e RT-qPCR com os marcadores de células-tronco/progenitoras Sox2, Nanog, Nestina, Cd44, Oct4 e Nr2e1, fatores de transcrição precoces (Hesx1, Hes1 e Otx2), fator de proliferação celular (Ki67), fatores de diferenciação celular (S100beta e Sox9) e marcadores de apoptose (Caspases 3 e 7). A quantificação relativa dos genes-alvo nos animais mutantes teve como calibrador os seus respectivos selvagens. Resultados: A imunolocalização do SOX2 foi observada na zona que circunda a fenda de Rathke (camada marginal) e em nichos difusos pela glândula nas três linhagens estudadas. Na linhagem alfaGSU, evidenciou-se uma redução de Nanog, Nr2e1, Oct4, e Hesx1 em 4S e de Nestina em 8S. Na linhagem Snell, observou-se aumento na expressão de Sox2, Nanog, Cd44, Nr2e1, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta e Sox9 em 4S e aumento de Sox2, Cd44, Hesx1, Otx2 e Sox9 em 8S, associado à redução de Ki67 em ambos os períodos. Na linhagem Ames, evidenciou-se aumento de Sox2, Nanog, Cd44, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta e Sox9 em 4S e 8S. O gene Nr2e1 esteve hiperexpresso em todos os tempos. Houve redução do Ki67 em 4S. As caspases 3 e 7 não se apresentaram alteradas em nenhuma linhagem e/ou tempo. Discussão e conclusão: O padrão de imunolocalização de SOX2 encontrado nas três linhagens estudadas foi semelhante ao descrito em animais sem hipopituitarismo. A evidência da presença do Nr2e1 o coloca como um novo marcador de células-tronco/progenitoras na hipófise. A expressão elevada dos marcadores de células-tronco/progenitoras nas linhagens Ames e Snell sugere que a ausência dos fatores de transcrição precoces não permitiria que a célula tronco/progenitora iniciasse o processo de diferenciação celular, enquanto o oposto ocorreria na linhagem alfaGSU. Adicionalmente, estes achados justificam a hipoplasia hipofisária observada em animais com defeitos em fatores de transcrição expressos no início da diferenciação hipofisária, nos quais o acúmulo de células-tronco pode ser um indicador da indiferenciação hipofisária / Introduction: The role of stem cells, with their capacity for proliferation, self-renewal, and differentiation, has already been described in the cell turnover and homeostatic regulation of the pituitary gland. However, little is known about the expression profiles of these markers in hypopituitarism. Among the stem cell markers previously described in the pituitary include the genes for Sox2, Nanog, nestin, CD44 and Oct4. Another gene marker, Nr2e1 (Tlx), found in neural stem cells, is highly expressed during embryogenesis and adulthood, but so far has not been characterized in the pituitary. Objective: To analyze the immunohistochemical profile of SOX2, as well as the pattern of expression of various markers of stem/progenitor cells, early transcription factors, apoptosis factors and cell proliferation in three pituitary strains of mice with a genetic cause of hypopituitarism. Strains studied with hypopituitarism due to changes in factors of precocious glandular differentiation, include the Ames (Prop1) and Snell (Pou1f1) lineages; hypopituitarism due to the delayed conjugation of glycoprotein hormones include the alfaGSU strain, which is caused by the knockout of the Cga gene. Material and Methods: We collected pituitaries at four time points including P0 (birth), P7 (considered the end of the first wave of growth glandular), 4 weeks (4S - puberty period) and 8 weeks (8S - adulthood). All three strains were subjected to immunohistochemical analysis of SOX2 and RT-qPCR of markers of stem/progenitor cells Sox2, Nanog, Nestin, Cd44, Oct4 and Nr2e1, early transcription factors (Hesx1, Otx2 and Hes1), cell proliferation (Ki67), cell differentiation factors (S100beta and Sox9) and apoptosis (caspases 3 and 7) markers. Relative quantification of target genes in mutant animals was normalized to their respective wild type littermate. Results: The immunolocalization of SOX2 was observed in the area surrounding the Rathke cleft (marginal layer), as well as in diffuse niches throughout the gland in all three strains studied. The alfaGSU strain showed a reduction of Nanog, Nr2e1, Oct4 and Hesx1 at 4S, and Nestin at 8S. The Snell mice exhibited an increase of expression in Sox2, Nanog, Cd44, Nr2e1, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta and Sox9 in at 4S and increased Sox2, Cd44, Hesx1, Otx2 and Sox9 at 8S, associated with the reduction of Ki67 in both periods. The Ames strain showed an increase of Sox2, Nanog, Cd44, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta and Sox9 at 4S and 8S; the gene Nr2e1 was over expressed at all times; and there was reduction in Ki67 at 4S. Caspases 3 and 7 had not changed in any strain, at any time. Discussion and Conclusion: The pattern of immunolocalization of SOX2 found in the three strains studied was similar to that described in animals without hypopituitarism. The presence of Nr2e1 in our study suggests it as a new marker of stem/progenitor cells in the pituitary. The high expression of markers of stem/progenitor cells in the Ames and Snell strains suggests that the absence of early transcription factors Prop1 and Pou1f1 do not allow the stem/ progenitors cells to start the process of cell differentiation, while the opposite occurs in the alfaGSU lineage. Additionally, these findings explain the pituitary hypoplasia observed in animals with defects in early transcription factors, as indicated by the accumulation of stem cells in the Snell and Ames lineages, preventing the initiation of pituitary differentiation

Introdução: As células-tronco apresentam capacidade de proliferação, autorrenovação, potencial de diferenciação e já foram descritas na hipófise estando envolvidas na renovação celular e regulação homeostática, porém pouco se sabe sobre o seu perfil de expressão nos quadros de hipopituitarismo. Dentre os marcadores de células-tronco descritos previamente na hipófise, destacam-se os genes Sox2, Nanog, Nestina, Cd44 e Oct4. Outro marcador, o gene Nr2e1 (Tlx), encontrado em células-tronco neuronais, apresenta-se elevado durante a embriogênese e na vida adulta no cérebro de camundongos, mas, até o momento, não foi caracterizado na hipófise. Objetivo: Analisar a imunolocalização do SOX2 e o padrão de expressão de marcadores de células-tronco/progenitoras, fatores de transcrição precoce, marcadores de apoptose e proliferação celular na hipófise de três linhagens de camundongos com hipopituitarismo de causa genética por alteração em fatores precoces de diferenciação glandular, as linhagens Ames (Prop1) e Snell (Pou1f1), e por fator tardio de conjugação dos hormônios glicoproteicos, a linhagem alfaGSU, nocaute do gene Cga. Material e Métodos: Foram coletadas hipófises nos tempos P0 (ao nascimento), P7 (final da primeira onda de crescimento glandular), 4 semanas (4S-período da puberdade) e 8 semanas (8S-vida adulta). Nas três linhagens de animais, realizou-se imuno-histoquímica com SOX2 e RT-qPCR com os marcadores de células-tronco/progenitoras Sox2, Nanog, Nestina, Cd44, Oct4 e Nr2e1, fatores de transcrição precoces (Hesx1, Hes1 e Otx2), fator de proliferação celular (Ki67), fatores de diferenciação celular (S100beta e Sox9) e marcadores de apoptose (Caspases 3 e 7). A quantificação relativa dos genes-alvo nos animais mutantes teve como calibrador os seus respectivos selvagens. Resultados: A imunolocalização do SOX2 foi observada na zona que circunda a fenda de Rathke (camada marginal) e em nichos difusos pela glândula nas três linhagens estudadas. Na linhagem alfaGSU, evidenciou-se uma redução de Nanog, Nr2e1, Oct4, e Hesx1 em 4S e de Nestina em 8S. Na linhagem Snell, observou-se aumento na expressão de Sox2, Nanog, Cd44, Nr2e1, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta e Sox9 em 4S e aumento de Sox2, Cd44, Hesx1, Otx2 e Sox9 em 8S, associado à redução de Ki67 em ambos os períodos. Na linhagem Ames, evidenciou-se aumento de Sox2, Nanog, Cd44, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta e Sox9 em 4S e 8S. O gene Nr2e1 esteve hiperexpresso em todos os tempos. Houve redução do Ki67 em 4S. As caspases 3 e 7 não se apresentaram alteradas em nenhuma linhagem e/ou tempo. Discussão e conclusão: O padrão de imunolocalização de SOX2 encontrado nas três linhagens estudadas foi semelhante ao descrito em animais sem hipopituitarismo. A evidência da presença do Nr2e1 o coloca como um novo marcador de células-tronco/progenitoras na hipófise. A expressão elevada dos marcadores de células-tronco/progenitoras nas linhagens Ames e Snell sugere que a ausência dos fatores de transcrição precoces não permitiria que a célula tronco/progenitora iniciasse o processo de diferenciação celular, enquanto o oposto ocorreria na linhagem alfaGSU. Adicionalmente, estes achados justificam a hipoplasia hipofisária observada em animais com defeitos em fatores de transcrição expressos no início da diferenciação hipofisária, nos quais o acúmulo de células-tronco pode ser um indicador da indiferenciação hipofisária / Introduction: The role of stem cells, with their capacity for proliferation, self-renewal, and differentiation, has already been described in the cell turnover and homeostatic regulation of the pituitary gland. However, little is known about the expression profiles of these markers in hypopituitarism. Among the stem cell markers previously described in the pituitary include the genes for Sox2, Nanog, nestin, CD44 and Oct4. Another gene marker, Nr2e1 (Tlx), found in neural stem cells, is highly expressed during embryogenesis and adulthood, but so far has not been characterized in the pituitary. Objective: To analyze the immunohistochemical profile of SOX2, as well as the pattern of expression of various markers of stem/progenitor cells, early transcription factors, apoptosis factors and cell proliferation in three pituitary strains of mice with a genetic cause of hypopituitarism. Strains studied with hypopituitarism due to changes in factors of precocious glandular differentiation, include the Ames (Prop1) and Snell (Pou1f1) lineages; hypopituitarism due to the delayed conjugation of glycoprotein hormones include the alfaGSU strain, which is caused by the knockout of the Cga gene. Material and Methods: We collected pituitaries at four time points including P0 (birth), P7 (considered the end of the first wave of growth glandular), 4 weeks (4S - puberty period) and 8 weeks (8S - adulthood). All three strains were subjected to immunohistochemical analysis of SOX2 and RT-qPCR of markers of stem/progenitor cells Sox2, Nanog, Nestin, Cd44, Oct4 and Nr2e1, early transcription factors (Hesx1, Otx2 and Hes1), cell proliferation (Ki67), cell differentiation factors (S100beta and Sox9) and apoptosis (caspases 3 and 7) markers. Relative quantification of target genes in mutant animals was normalized to their respective wild type littermate. Results: The immunolocalization of SOX2 was observed in the area surrounding the Rathke cleft (marginal layer), as well as in diffuse niches throughout the gland in all three strains studied. The alfaGSU strain showed a reduction of Nanog, Nr2e1, Oct4 and Hesx1 at 4S, and Nestin at 8S. The Snell mice exhibited an increase of expression in Sox2, Nanog, Cd44, Nr2e1, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta and Sox9 in at 4S and increased Sox2, Cd44, Hesx1, Otx2 and Sox9 at 8S, associated with the reduction of Ki67 in both periods. The Ames strain showed an increase of Sox2, Nanog, Cd44, Hesx1, Hes1, Otx2, S100beta and Sox9 at 4S and 8S; the gene Nr2e1 was over expressed at all times; and there was reduction in Ki67 at 4S. Caspases 3 and 7 had not changed in any strain, at any time. Discussion and Conclusion: The pattern of immunolocalization of SOX2 found in the three strains studied was similar to that described in animals without hypopituitarism. The presence of Nr2e1 in our study suggests it as a new marker of stem/progenitor cells in the pituitary. The high expression of markers of stem/progenitor cells in the Ames and Snell strains suggests that the absence of early transcription factors Prop1 and Pou1f1 do not allow the stem/ progenitors cells to start the process of cell differentiation, while the opposite occurs in the alfaGSU lineage. Additionally, these findings explain the pituitary hypoplasia observed in animals with defects in early transcription factors, as indicated by the accumulation of stem cells in the Snell and Ames lineages, preventing the initiation of pituitary differentiation