Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-09Bitstream added on 2014-06-13T19:32:17Z : No. of bitstreams: 1 000748805.pdf: 1127265 bytes, checksum: 787fe9a2f6671b14f42cf03ea4bac0d0 (MD5) / O psilídeo asiático dos citros Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) e, atualmente, considerado a principal praga da citricultura mundial, podendo causar perdas de até 100% na produção. O inseto causa danos diretos, através da sucção de seiva de brotações, contudo sua maior importância está relacionada aos danos indiretos, devido à transmissão da bactéria Candidatus Liberibacter, associada ao greening ou Huanglongbing (HLB). 0 objetivo deste estudo foi avaliar a flutuação populacional e distribuição espacial de adultos de D. citri em áreas citrícolas do sul e centro do Estado de São Paulo sob controle químico convencional. As avaliações foram realizadas no período de 01 de julho de 2010 a 31 de dezembro de 2012 em duas áreas comerciais de plantio de citros, com 9.004 e 5.495 hectares, localizadas nos municípios de laras e Boa Esperança do Sul, respectivamente. Para a quantificação dos adultos de D. citri, foram instaladas armadilhas adesivas nas bordaduras dos lotes, sendo realizadas avaliações semanais. Os picos populacionais ocorreram na primavera e verão, período com maior número de brotações. As aplicações de inseticidas não alteraram o padrão de distribuição de D. citri. Os valores dos índices de agregação indicaram que o inseto se comporta de maneira altamente agregada na cultura / The Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), is currently considered the major world pest of citriculture and can cause yield losses of up to 100%. The insect causes direct damage by consuming sap from shoots, although its greater importance is related to indirect damage due to the transmission of the bacterium Candidatus Liberibacter which are associated to causes the greening or Huanglongbing (HLB). The aim of the study was to evaluate the population fluctuation and spatial distribution of D. citri adults in citrus farming areas of the south and center regions of São Paulo state under conventional chemical control. The evaluations were performed in the period from july 01, 2010 to December 31, 2012 in two areas of citrus commercial planting, with 9,004 and 5,495 hectares, located in the municipalities of laras and Boa Esperança do Sul, respectively. To quantify D. citri adults, yellow sticky traps were assembled on the borders of the lots, and were weekly evaluated by pest inspectors. The population peaks occurred in spring and summer, periods with higher number of new shoots. The insecticides applications did not alter the distribution pattern of D. citri. The values of aggregation index indicated that the insect has a highly aggregate behavior in citriculture

Orientador: Daniel Junior de Andrade / Banca: Marineide Rosa Vieira / Banca: Renato Beozzo Bassanezi / Resumo: O ácaro Brevipalpus yothersi Baker é vetor da leprose dos citros, principal doença viral da citricultura mundial. Informações sobre a biologia de B. yothersi são essenciais para compreender a dinâmica populacional do ácaro no campo e inferir se mudanças no manejo do pomar em função da região pode alterar a biologia do ácaro. O objetivo do trabalho foi determinar a biologia e elaborar a tabela de vida de fertilidade de B. yothersi coletados em diferentes regiões citrícolas do estado de São Paulo. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Acarologia, pertencente à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP. Os ácaros foram coletados em pomares cítricos das regiões de Barretos, Jales e Santa Cruz do Rio Pardo, posteriormente, em laboratório, foram multiplicados em frutos de laranja. Os parâmetros biológicos avaliados foram duração das fases de desenvolvimento, oviposição, período de incubação, viabilidade dos ovos, longevidade, taxa líquida de reprodução (Ro), tempo médio de geração (T), taxa intrínseca de crescimento populacional (rm) e taxa finita de crescimento populacional (λ). Estes parâmetros foram avaliados em dois experimentos, o primeiro consistiu na biologia de B. yothersi em frutos isentos de resíduos de produtos fitossanitários à 23±1ºC e o segundo sob frutos com resíduo de espirodiclofeno à 25±1ºC. As observações foram realizadas diariamente, pela manhã e ao fim da tarde. A duração do desenvolvimento, longevidade, período d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The mite Brevipalpus yothersi Baker is the vector of the citrus leprosis, major viral disease of citrus worldwide. Information about B. yothersi's biology are essential to understanding the population dynamics of the mite in the field and infer whether changes in orchard management by region can change the mite biology. The objective was to determine the biology and prepare the fertility life table of B. yothersi collected in different citrus regions of São Paulo state. The experiments were performed in Acarology Laboratory, belonging to the Faculty of Agricultural and Veterinary Sciences - FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP. The mites were collected in citrus orchards in the regions of Barretos, Jales and Santa Cruz do Rio Pardo, later in the laboratory were multiplied in orange fruits. The biological parameters assessed were duration of the stages of development, oviposition, incubation period, egg viability, longevity, net reproductive rate (Ro), mean generation time (T), intrinsic rate of increase (rm) and finite rate increase (λ). These parameters were evaluated in two experiments, the first consisted the biology of B. yothersi in fruits free of residues of pesticides at 23 ± 1°C and the second consisting of the biology of B. yothersi under fruit with spirodiclofen residue at 25 ± 1°C . The observations were performed daily, in the morning and in the afternoon. The duration of the development, longevity, pre-oviposition period, oviposition rate and number of B. yothersi eggs s... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

[ES] El objetivo de esta Tesis Doctoral es generar conocimiento y tecnología que permitan desarrollar soluciones mecanizadas y automatizadas mediante la aplicación de sensores para monitorizar, optimizar tareas y aumentar la productividad en los cultivos de cítricos y, por ende, la competitividad del sector citrícola. Con este fin, se ha trabajado en la aplicación de tecnologías en algunas de las operaciones más importantes y costosas en la citricultura. En el ámbito de la recolección, con el objetivo de facilitar y optimizar el proceso de recolección de cítricos para consumo en fresco, se implementaron mejoras en un prototipo de plataforma autopropulsada de asistencia para garantizar la seguridad de los trabajadores y minimizar los riesgos laborales, asegurar la calidad de la fruta recolectada y clasificarla adecuadamente en función de su calidad por un sistema de visión artificial. Tras la implementación de estos avances, se evaluó su funcionalidad en condiciones reales de campo y se determinó el rendimiento de la operación de recolección asistida. Los resultados mostraron que el rendimiento operativo teórico en el proceso de recolección con la asistencia del prototipo fue un 17% menor que en la recolección manual tradicional. Asimismo, con la finalidad de generar de manera automática mapas de rendimiento en cítricos accesibles al agricultor, se creó una nueva herramienta a modo de cuadro de mando, denominada CitrusYield. Esta herramienta es capaz de obtener mapas que muestran la variabilidad, haciendo uso de la información proporcionada al inspeccionar cada fruta y de los datos obtenidos por los dispositivos de geolocalización, permitiendo conocer el rendimiento de la producción a nivel intraparcelario. Se evalúo el funcionamiento de CitrusYield con datos obtenidos por el prototipo. El cuadro de mando analizó los datos y generó diferentes mapas georreferenciando la información de la fruta con su punto de recolección. A través de estos mapas, CitrusYield demostró su capacidad para reflejar la heterogeneidad de la producción dentro de la parcela. Los indicadores de calidad, rendimiento del sistema de inspección por visión artificial y la productividad revelaron el grado de eficiencia del proceso de recolección con la asistencia del prototipo. En el ámbito de la detección temprana de plagas y enfermedades, se llevó a cabo la investigación del potencial de la imagen en color y de la imagen hiperespectral para la detección automática de daños causados por la plaga Tetranychus urticae en hojas de cítricos. Además, se diferenciaron en función de la antigüedad y de otros problemas que puede tener el árbol causados por deficiencias nutricionales o por otras plagas. En el análisis para identificar el daño causado por esta plaga, se obtuvo una tasa de éxito del 92,5% en las imágenes en color. No obstante, no se pudo discriminar la edad del daño. En las imágenes hiperespectrales, el éxito fue del 100% en la detección del daño y del 92% en la discriminación de la edad. En cuanto a la discriminación de daños de T. urticae respecto a otros daños, en las imágenes en color se obtuvo una tasa de éxito del 100% en la discriminación de Phyllocnistis citrella en el envés de las hojas. Las deficiencias de N no pudieron discriminarse correctamente y las deficiencias de Fe, Mn o Zn se detectaron acertadamente en el 50% de los casos. En las imágenes hiperespectrales, los daños por P. citrella se discriminaron con éxito en el 100% de los casos. Las deficiencias por N se discriminaron correctamente en más del 65% de los casos. No obstante, las deficiencias de Fe, Mn o Zn no pudieron ser discriminadas correctamente. Las conclusiones de esta Tesis Doctoral ponen de manifiesto el gran potencial de implementar estas tecnologías para monitorizar, optimizar tareas y digitalizar los procesos en las labores llevadas a cabo en los campos de cítricos, de manera que se logra aumentar la eficiencia, productividad y, también, la competitividad en el sector. / [CA] L'objectiu d'esta Tesi Doctoral és generar coneixement i tecnologia que permeten desenvolupar solucions mecanitzades i automatitzades mitjançant l'aplicació de sensors per a monitoritzar, optimitzar tasques i augmentar la productivitat en els cultius de cítrics i, per tant, la competitivitat del sector citrícola. Amb este fi, s'ha treballat en l'aplicació de tecnologies en algunes de les operacions més importants i costoses de la citricultura. Amb l'objectiu de facilitar i optimitzar el procés de recol·lecció de cítrics per a consum en fresc es van implementar millores en un prototip de plataforma autopropulsada d'assistència per a garantir la seguretat dels treballadors i minimitzar els riscos laborals, assegurar la qualitat de la fruita recol·lectada i classificar-la adequadament en funció de la qualitat estimada pel sistema de visió artificial. Després de la implementació d'estos avanços, es va avaluar la seua funcionalitat en condicions reals de camp i es va determinar el rendiment de l'operació de recol·lecció assistida. Els resultats van mostrar que el rendiment operatiu teòric en el procés de recol·lecció amb l'assistència del prototip va ser un 17% menor que en la recol·lecció manual tradicional. Així mateix, amb la finalitat de generar de manera automàtica mapes de rendiment en cítrics accessibles a l'agricultor, es va crear una nova eina digital a manera de quadre de comandament, denominada CitrusYield. Esta eina és capaç d'obtindre mapes que mostren la variabilitat, fent ús de la informació proporcionada pel sistema de visió artificial i de les dades obtingudes pels dispositius de geolocalización, permetent conéixer el rendiment de la producció a nivell intraparcel·lari. El quadre de comandament va analitzar les dades i va generar diferents mapes georreferenciant l'informació de la fruita amb el seu punt de recol·lecció. A través d'estos mapes, CitrusYield va demostrar la seua capacitat per a reflectir l'heterogeneïtat de la producció dins de la parcel·la. Els indicadors de qualitat, rendiment del sistema d'inspecció per visió artificial i la productivitat calculats per CitrusYield van revelar el grau d'eficiència del procés de recol·lecció amb l'assistència del prototip. En l'àmbit de la detecció de plagues i malalties de cítrics, es va dur a terme la investigació del potencial de la imatge en color i de la imatge hiperespectral, per a la detecció automàtica de danys causats per la plaga Tetranychus urticae en fulls de cítrics. A més, es van discriminar en funció de l'antiguitat i d'altres problemes que pot tindre l'arbre causats per deficiències nutricionals o per altres plagues. En l'anàlisi per a identificar el dany causat per esta plaga, es va obtindre una taxa d'èxit del 92,5% en les imatges en color. No obstant això, no es va poder discriminar l'edat del dany. En les imatges hiperespectrals, l'èxit va ser del 100% en la detecció del dany i del 92% en la discriminació de l'edat. En quan a la discriminació de danys de T. urticae respecte a altres danys, en les imatges en color es va obtindre una taxa d'èxit del 100% en la discriminació de Phyllocnistis citrella en el revés dels fulls. Les deficiències de N no van poder discriminar-se correctament i les deficiències de Fe, Mn o Zn es van detectar encertadament en el 50% dels casos. En les imatges hiperespectrals, els danys per pogué P. citrella es van discriminar amb èxit en el 100% dels casos, tant en el feix com en el revés dels fulls. Les deficiències per N es van discriminar correctament en més del 65% dels casos també en ambdós costats del full. No obstant això, les deficiències de Fe, Mn o Zn no van poder ser discriminades correctament Les conclusions de esta Tesi Doctoral posen de manifest el gran potencial d'implementar estes tecnologies per a monitoritzar, optimitzar tasques i digitalitzar els processos en les labors dues a terme en els camps de cítrics, de manera que s'aconseguix augmentar l'eficiència, productivitat i la competitivitat en el sector. / [EN] This PhD dissertation aims to generate knowledge and technology to develop mechanised and automated solutions to monitor processes, optimise tasks and increase the productivity of citrus crops and, therefore, the competitiveness of the citriculture sector. For this purpose, this thesis has focused on the development of technologies in some of the most important and costly operations in the citrus sector. To facilitate and optimise the harvesting of citrus fruits for the fresh market, improvements were implemented in a prototype of a self-propelled assistance platform. The research has focused on guaranteeing the operator safety, ensuring the quality of the harvested fruit and classifying it properly based on its quality by an artificial vision system in real-time. The functionality was evaluated in-field conditions and performance was assessed. The results showed that the assisted harvesting process with the platform was more efficient than traditional manual harvesting. A theoretical operation yield was obtained with the prototype, 17% lower than in conventional manual harvesting. Furthermore, in order to automatically generate citrus yield maps accessible for the farmer, a new digital tool was created as a dashboard, called CitrusYield. This tool is capable of obtaining maps showing the variability, using the information provided during the fruit inspection at harvest and the data obtained by the geolocation device, and also allowing to know the performance of the production at the intra-orchard level. The CitrusYield functionality was evaluated with data obtained by the prototype. The dashboard analysed the data and generated different maps georeferencing the information of the fruit with its harvesting point. Through these maps, the ability of CitrusYield to show the heterogeneity of production within the orchard was demonstrated. The production variability was also quantified in the tables and graphs generated by the tool. The indicators of fruit quality obtained by the artificial vision system and the productivity revealed the degree of effectiveness and efficiency of the harvesting process with the prototype. In the context of early citrus pests and diseases detection, the potential of colour and hyperspectral imaging, as a fast and automatic methods to detect the presence and the age of the damage caused by the Tetranychus urticae pest on citrus leaves, were investigated. Another goal was to discriminate this damage from that caused by other pests and from nutritional deficiencies. In the analysis of identifying the damage caused by T. urticae, a success rate of 92,5% was obtained in the colour images. However, the age of the damage could not be discriminated. In hyperspectral images, the success rate was 100% in damage detection and 92% in age discrimination. Regarding the discrimination of T. urticae damages from others, in the colour images, a success of 100% was obtained in the discrimination of Phyllocnistis citrella on the underside of the leaves. N deficiencies could not be correctly discriminated and Fe, Mn or Zn deficiencies were correctly detected in 50% of cases. In the hyperspectral images, P. citrella damage was successfully discriminated in 100% of cases, both on the upper and under sides of the leaves. N deficiencies were correctly discriminated in more than 65% of cases on both sides of the leaf. However, Fe, Mn or Zn deficiencies could not be correctly discriminated. The conclusions of this Thesis show the potential of implementing these technologies to monitor, optimize tasks and digitize agricultural processes in the operations usually done in citrus crops. Therefore, the efficiency, productivity and competitiveness of the sector can increase when these technologies are used. / Esta Tesis Doctoral ha recibido una subvención para la formación de personal investigador en agroalimentación en los centros de investigación agraria y alimentaria INIA-CC.AA. (FPI-INIA CPD2016-0007, #42), otorgada por el Instituto Nacional de Investigaciones y Tecnología Agraria y Alimentaria, con el apoyo parcial de los Fondos FEDER 2014-2020. En esta Tesis Doctoral se han realizado investigaciones en el marco de varios proyectos de investigación: Aplicación de nuevas tecnologías para una estrategia integral de la recolección mecanizada de cítricos (CITRUSREC) (RTA2014-00025-C05-00).Subproyecto 1 centrado en el desarrollo y evaluación de una plataforma de asistencia a la recolección (RTA2014-00025-C05-01) Subproyecto 5 sobre la generación de herramientas de ayuda para la toma de decisiones (RTA2014-00025-C05-05) Desarrollos de ingeniería para el aseguramiento de una agricultura rentable, sostenible y competitiva del campo a la mesa (GVA-IVIA proyecto 51918) Grupo Operativo "Avances tecnológicos para la modernización y la sostenibilidad en la producción de cítricos (GO CITRUSTECH)". / González González, MG. (2022). Estudio y desarrollo de soluciones mecanizadas automatizadas mediante la aplicación de sensores y nuevas tecnologías para la producción de cítricos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/186174

La mancha parda es una enfermedad causada por el hongo Alternaria alternata (Fr.), que afecta a mandarinas, en especial a una gran variedad de sus híbridos; sin embargo, cuando se tiene una concentración alta de inóculo cercano a otras variedades no susceptibles, puede causar daños apreciables en estos. La enfermedad afecta a órganos jóvenes causando necrosamiento, defoliación, lesiones necróticas y erupciones suberosas en frutos que reduce su valor en el mercado. El control de este patógeno se ha realizado hasta nuestros días con el empleo de fungicidas químicos que presentan desventajas económicas y ecológicas por lo agresivo y costoso que resultan al medio ambiente. En el presente trabajo, se evaluaron 7 cepas fúngicas de los géneros Trichoderma (5), Pochonia (1) y Clonostachys (1), para seleccionar un agente de control biológico (ACB) promisorio para el control de A. alternata en dependencia de los resultados in vitro. Se hizo la selección de la cepa, Trichoderma R6, que presentó un mayor control del fitopatógeno mediante las pruebas in vitro: cultivos duales, observación microscópica, y evaluación de filtrados conteniendo sustancias biológicas inhibitorias. La cepa seleccionada fue evaluada frente a A. alternata en plantas de cítricos de mandarina variedad Fortune en campo, a partir de la época de brotamiento, el estadio fenológico más susceptible de la planta, se aplicaron tres tratamientos: filtrado obteniendo un control de 58,33% del fitopatógeno, y comparándolo con los otros dos, conidios en arroz y fungicidas químicos, con resultados de 50,0% y 48,52%, respectivamente. Palabras clave: Control biológico, cítricos, Alternaria alternata, Trichoderma R6, estadio fenológico. / --- The Alternaria Brown Spot (ABS) is a plant disease caused by the fungus Alternaria alternata (Fr.) that attacks tangerines and the varieties of their hybrids, although it may cause considerable lesions on unsusceptible varieties if they are adjacent to heavily infested plants as high inoculum concentrations. Alternaria Brown Spot (ABS) attacks young fruit, leaves and twigs causing brown-to-black necrotic lesions surrounded by a yellow halo, defoliation and large sunken pockmarks, thus reducing the value of the fruit for the fresh market. Nowadays, fungicides are the primary way of controlling Alternaria Brown Spot. However, this practice has economic and ecological disadvantages because of its higher costs and the aggressiveness against the environment. The objectives of this study were to evaluate 7 fungal species and choose the best one as a biological control agent (BCA) to the control of Alternaria alternata based on in vitro results. Consequently, we have selected Trichoderma R6 that showed better results through evaluations in vitro: dual cultures, microscopic observations, and evaluation of inhibitory substances filtrates. Trichoderma R6 was evaluated in a field of tangerines citrus Fortune variety cultivars since the bud break (vegetative) stage, most susceptible phenological stage against this disease. The filtrate obtained from the selected fungal species got the control 58,33% of phytopathogen in comparison with the 50,0% and 48,52% obtained with conidia on rice and chemical fungicides application respectively. Key words: Biological control, citrus cultivars, Alternaria alternata, Trichoderma R6, phenological stage.

Investiga la actividad antifúngica in vitro del aceite esencial de Citrus paradisi “toronja” sobre cepas de Candida albicans aisladas de pacientes con diagnóstico de estomatitis subprotésica. Utiliza el método de difusión en agar con pozos. Obtiene la cepa de Candida albicans de muestras de hisopado de mucosa de pacientes con estomatitis subprotésica e la identifica por medio de las características morfológicas de sus colonias y la prueba de tubo germinativo. El inóculo fue estandarizado al 0,5 de la escala de Mc Farland y sembrado en 12 placas con agar dextrosa sabouraud. Se hicieron pozos con un sacabocado de 6 mm de diámetro, se depositaron 50 μL de las diferentes concentraciones del aceite esencial y se procedió a la incubación en aerobiosis a 37°C por 48 horas. Realiza el análisis estadístico con el programa SPSS Versión 23. Las concentraciones al 25; 12,5; 6,25; 3,13 y 1,56 % presentan un halo de inhibición promedio de 12,6; 10,3; 7,8; 6,8 y 6,3 mm respectivamente, mientras que al 0,78 y 0,39 % no presentan actividad antifúngica. La CMI promedio para Candida albicans es de 6,25 %. Realiza la prueba de Kruskal Wallis y determina que existe diferencia estadísticamente significativa p (0,00) < 0,05 de promedios entre las concentraciones. Concluye que el aceite esencial de Citrus paradisi “toronja” presenta actividad antifúngica sobre cepas de Candida albicans.

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Alessandro de Mello Varani / Banca: José Belasque Júnior / Banca: Marcos Tulio de Oliveira / Banca: Maria Teresa Marques Novo Mansur / Banca: Maria Célia Bertolini / Resumo: O Cancro Cítrico é uma importante doença que afeta diversas espécies de citros. Tal doença resulta da infecção pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), transmitida pela água, contato ou propagação de folhas infectadas. Estudos comparativos têm mostrado que uma das características mais intrigantes do gênero Xanthomonas é a extraordinária plasticidade do genoma e sua arquitetura altamente mosaica. Isso se deve principalmente a rearranjos genômicos envolvendo diversas ilhas genômicas (GI), sequências de Inserção (IS), e alguns eventos de inserção de profagos. A anotação de IS de alta qualidade em conjunto com a genômica comparativa revelaram um transposon completo da família TN3 no genoma de Xanthomonas citri (ISXax2), contendo diversos genes passageiros efetores do SSTT, incluindo a altamente conservada transglicosilase lítica de mureína (mlt), uma proteína auxiliar do SSTT. Inserção aleatória de transposons foi utilizada para gerar o mutante cromossomal XacΔmltB e mutação sítio-dirigida foi utilizada para gerar o mutante plasmidial XacΔmlt. Usando ISXax2 de Xac como exemplo demonstramos que a cópia plasmidial de mltB (mlt) era funcional e requerida para gerar sintomas in vivo. Ensaios de transposição demonstraram taxas para ISXax2 com uma frequência de cerca de 1.65 x 10-5. Neste estudo nós usamos uma mistura de abordagens experimentais e de bioinformática para elucidar o papel e comportamento desse potencial elemento transponível no plasmídeo de Xac. Demonstramos que a estrutura completa foi capaz de sofrer transposição e que Cassetes de Inserção Móveis (MICs) contendo efetores TAL também poderiam ser mobilizados. Estes resultados mostram forte evidência que em Xac e espécies relacionadas, genes de virulência e patogenicidade podem se espalhar através de um mecanismo de transposição do tipo TN3, usando para tanto plasmídeos conjugativos como vetores intercelulares. Propomos ... / Abstract: Citrus canker (CC) is an important disease affecting many citrus species. It can result from infection by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) and can be transmitted by water, contact or propagation of infected leaves. Comparative studies have shown that one of the most intriguing features within the Xanthomonas genus is the extraordinary genome plasticity and highly mosaic architecture. This is largely the consequence of genomic rearrangements involving several genomic islands (GI), insertion sequences (IS), and few prophages insertion events. High quality IS annotation coupled with comparative genomics revealed a complete transposon of the Tn3 family in the Xanthomonas citri genome (ISXax2), with several T3SEs passenger genes, including a highly conserved lytic murein transglycosylase (mlt), a helper protein of the T3SS. Random transposon insertion was used to generate XacΔmltB and site directed mutagenesis was used to generate the XacΔmlt mutant. Using ISXax2 from Xac as an example we demonstrated that the plasmid copy of mltB (mlt) was indeed functional and required to generate symptoms in vivo. Transposition assays showed transposition rates for ISXax2 with a frequency of about 1.65 x 10-5. In this study we have used a mixture of bioinformatic and experimental approaches to address the role and behavior of such potentially transposable element. We showed that the entire structure was capable of transposition and that MICs (Mobile Insertion Cassettes) containing TAL effectors could also be mobilized. These results provide strong evidence that, in the case of Xac and closely related species, pathogenicity and virulence genes can be spread by a Tn3-like transposition mechanism, using conjugative plasmids as intercellular vectors. We propose that this process is a key agent to modulate the bacterial virulence and the host-specificity in this group of plant pathogens / Doutor

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Rui Pereira Leite Júnior / Banca: Alessandro de Mello Varani / Banca: José Belasque Júnior / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), é uma das principais doenças que acometem a citricultura mundial e ataca uma ampla gama de espécies comerciais de citros, causando perdas significativas nos países produtores. A espécie de laranja doce Hamlin (Citrus sinensis) é suscetível ao cancro cítrico, enquanto a espécie de tangerina Satsuma (Citrus unshiu) é resistente. Para compreender os mecanismos moleculares relacionados aos sistemas de defesa ativados pela planta é importante identificar as alterações transcricionais de cada espécie vegetal sob estresse fitopatogênico, a fim de desvendar os elementos moleculares que são específicos de cada espécie. O objetivo do presente trabalho foi realizar uma análise comparativa temporal do transcriptoma de duas espécies cítricas contrastantes em resposta à Xac, pela técnica do RNA-Seq (Illumina). Um total de 5.673 e 6.231 transcritos diferencialmente expressos foi induzido nos tempos 24, 48 e 72 horas após a inoculação de Xac em Satsuma e Hamlin, respectivamente, enquanto 3.982 e 7.944 transcritos foram reprimidos. Deste total, 52 transcritos foram induzidos em comum, nas duas espécies, em todos os tempos de inoculação. Estes genes estão relacionados com a defesa basal da planta contra o ataque de Xac, pois apresentam genes que participam na percepção e reconhecimento do patógeno, genes que codificam fatores de transcrição e genes que participam na defesa da planta, como glucanases e proteinases. Entre os genes induzidos exclusivamente na espécie resistente Satsuma destacou-se uma proteinase aspártica. Esta proteína apresentou a maior expressão gênica no tempo 24 horas e pode estar envolvida na resistência desta espécie, visto que na espécie suscetível Hamlin, a expressão desta proteína foi menos expressiva e tardia, no tempo 48 horas. Outra resposta oposta entre as espécie foi na expressão de genes relacionados à ... / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is a one of the most important disease affecting citrus production worldwide and attacks a wide range of commercial species of citrus trees, causing significant losses in producing countries. Hamlin sweet orange (Citrus sinensis) is canker-sensitive, while Satsuma mandarin (Citrus unshiu) is canker-resistant. To understand the molecular mechanisms underlying the differences in responses to Xac, transcriptional profiles of these two genotypes following Xac attack were compared by RNA-Seq (Illumina). The purpose of this study was to examine simultaneous changes in gene expression profile during the early stages (24, 48 and 72 hpi) of citrus canker infection in Satsuma and Hamlin. A total of 5673 and 6231 up-regulated transcripts were identified at 24, 48 and 72 hpi in Satsuma and Hamlin, respectively, while 3982 and 7944 were down-regulated. Of these, 52 transcripts were up-regulated in common between both genotypes. These genes in common are related to basic defense against Xac, because there are genes involved in patogen perception and recognition, transcription factors and genes related to plant defense, such as glucanases and proteinases. Among up-regulated genes expressed only in Satsuma, aspartic proteinase was highlighted. This protein presented the highest gene expression 24 hpi and it can be involved in Satsuma resistance, since the expression of this protein was less pronounced and delayed in Hamlin. Another opposite response between these two genotypes was the expression of genes related to cell wall. Such genes were pectato lyase, extensin, cellulose sinthase, and xiloglucano endotransglycosilase. The genes were up-regulated in Satsuma, while in Hamlin, they were down-regulated. For genes related to plant defense, both genotypes up- regulated pathogenesis-related proteins, especially 72 hpi. However, the expression of these genes did not prevent the symptoms in ... / Mestre

Orientador: Eduardo Sanches Stuchi / Coorientador: Helvécio Della Coletta Filho / Banca: Janete Apparecida Desidério / Banca: José Belasque Júnior / Resumo: Huanglongbing (HLB) doença dos citros emergiu como a principal ameaça à produção de citros no mundo, associado com a bactéria ("Candidatus Liberibacter asiaticus" - Las) limitada ao floema e ao vetor (Diaphorina citri). No Brasil, o HLB foi relatado pela primeira vez em 2004 e rapidamente se espalhou para todas as regiões geográficas do Estado de São Paulo (SPS), Paraná (PR) e Minas Gerais (MG). No entanto, informações sobre a diversidade genética desta bactéria são pouco conhecidas. Aqui nós testamos a hipótese H0: ambas as regiões geográficas diferentes e espécies de citros não moldam a diversidade genética de populações de Las do Brasil. Para comprovar a hipótese, DNA de 199 amostras de plantas cítricas com sintomas de HLB foram amplificados com 9 conjuntos de iniciadores microssatélites, sendo os iniciadores diretos marcados com corantes fluorescentes. Níveis moderadamente baixos de diversidade genética (HNei = 0,11 - 0,26) foram observados em todas as populações desta bactéria. Com uso da estatística F de Wright (FST), nenhuma diferença estatística foi observada entre populações de Las de todas as sete subdivisões das regiões geográficas do SPS e de MG (FST <0,095). Mas, valores significativos de diferenciação entre populações (FST = 0,118 - 0,191) foram obtidos para populações de Las do PR comparado com as do SPS e MG. Também, valores ainda mais altos e significativos (FST = 0,275 - 0,445) foram observados comparando populações de Las em laranjeiras doce do SPS, MG e PR com as populações de diferentes espécies de citros cultivados na região Sudeste do SPS. Por meio de métodos de agrupamento realizados por estatística Bayesiana e de coordenada principal pode-se agrupar todos os isolados estudados em três populações geneticamente distintas: 1. Um grupo contempla todas as estirpes das regiões do SPS mais MG, 2. Um segundo contendo somente as estirpes de Las do PR, 3. E... / Abstract: Citrus huanglongbing (HLB) disease emerged as a primary threat for citrus production worldwide, associated with the phloem and vectored (Diaphorina citri) limited - bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" (Las). In Brazil, HLB was first reported in 2004 and quickly spread for all geographic regions of the States of Sao Paulo (SP), Parana (PR) and Minas Gerais (MG). However, information about genetic diversity of this bacterium is poorly known. Here we tested the hypothesis H0: different geographic regions and citrus species have no influence on genetic diversity of Las populations in Brazil. To test this hypothesis, total DNA from 199 samples from citrus plants with symptoms of HLB was amplified by 9 sets of forwardfluorescent microsatellites primers. Moderately low levels of genetic diversity (HNei = 0,11 to 0,26) were observed through all populations. By Wright's F-statistics (FST), no statistic difference was observed among Las populations from all the seven previously subdivided geographic regions of SP and MG (FST <0,095). But significant FST values (0,118 to 0,191) were obtained for Las population from PR compared to SP and MG. On the other hand, highest and significant values for FST index (0,275 to 0,445) were observed comparing Las populations from sweet orange trees from SP, MG, and PR and the populations from different citrus species grown at the Southeast region of SP. By Bayesian statistics and principal coordinate analysis all isolates studied were clustered in three genetically different populations: 1. a group that includes all strains from SP regions and MG, 2. A second composed only by Las strains from PR, and 3. a third where strains from different citrus species were grouped. In conclusion, after 10 years of the HLB first report in Brazil, that genetically homogeneous populations of Las infecting sweet orange are present at different geographic regions sampled, with the exception of the populations ... / Mestre

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: José Belasque Júnior / Banca: Roberto Hirochi Herai / Banca: Fabrício José Jaciani / Banca: Flávia Maria de Souza Carvalho / Banca: Marcos Túlio de Oliveira / Resumo: A bactéria Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipo C (XauC) é o agente causal da cancrose C, que afeta apenas lima ácida 'Galego' (Citrus aurantifolia (Christm) Swingle). A principal característica fenotípica desta doença é a hiperplasia e hipertrofia do tecido afetado, que leva à formação de lesões erupescentes características, sendo que o responsável pela proliferação celular desordenada é um efetor tipo TAL da família AvrBs3/PthA, que é injetado na planta pelo sistema de secreção tipo III (SST3) da bactéria e é translocado até o núcleo, onde interage com regiões UPA-box (up-regulated by AvrBs3) e funciona como um ativador transcricional. As variedades de laranja doce são resistentes à cancrose C e, quando inoculadas com XauC apresentam forte reação de hipersensibilidade (HR), causando morte celular programada local (apoptose) e abscisão das folhas afetadas. O(s) mecanismo(s) que confer(em) à lima ácida 'Galego' susceptibilidade à XauC não é(são) conhecido(s). Este estudo teve como objetivo identificar, através de sequenciamento de nova geração (NGS), transcritos de plantas diferencialmente expressos envolvidos na interação patógeno-hospedeiro nos patossistemas XauC-laranja 'Hamlin' (espécie resistente) e XauC-lima ácida 'Galego' (espécie susceptível). Para isso, folhas de laranja 'Hamlin' e lima ácida 'Galego' foram inoculadas com suspensão de XauC a uma concentração de 106 ufc/mL, sendo que o controle foram folhas inoculadas com água estéril. Essas folhas foram coletadas nos tempos de 5 e 7 dias após inoculação (dai) e o RNA total foi extraído e utilizado para a análise dos transcrissomas por RNA-seq. Os transcritos obtidos do sequenciamento foram normalizados e as redundâncias foram removidas. Foi montado um banco único de dados genômicos e de transcritos de citros... / Abstract: The bacterium Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii type C (XAC) is the causative agent of cancrose C, which affects only acid lime 'Galego' (Citrus aurantifolia (Christm) Swingle). The main phenotypic characteristic of this disease is the hyperplasia and hypertrophy of the affected tissue, leading to the formation of erupescentes characteristic lesions, and responsible for the abnormal cell growth is a transcription activator-like (TAL) effector family (also called the avrBs3/pthA family), which is injected into the plant by the type type III secretion system (T3SS) and is translocated to the nucleus, where it interacts with UPA-box regions (up-regulated by AvrBs3) and acts as a transcriptional activator. The sweet orange varieties are resistant, and when inoculated with XauC show strong hypersensitive response (HR), causing local programmed cell death (apoptosis) and abscission of affected leaves. The mechanisms that give the acid lime 'Galego' susceptibility to XauC is not known. This study aimed to identify, through next-generation sequencing (NGS), plant differentially expressed transcripts involved in host-pathogen interaction in pathosystems XauC-orange 'Hamlin' (species resistant) and XauC-acid lime 'Galego' (species susceptible). Leaves from 'Hamlin' and acid lime 'Galego' were inoculated with XauC suspension at a concentration of 106 cfu/mL (experimental) or sterile water (control) and collected at 5 and 7 days after inoculation (dai). Total RNA was extracted and used for transcriptome analysis by RNA-seq. The transcripts obtained from sequencing were normalized and redundancies removed. A single bank of genomic data and citrus transcripts was assembled, which was called CitSeqDB and is the junction of 6 public banks: AFFYM, NCBI Unigene, USDA, CITRUSGDB and PHYTOZOME. Transcripts that proved to be differentially expressed relative to controls were confronted with the bank and functional annotation was performed using ... / Doutor

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Tiago Santana Balbuena / Banca: Fabrício José Jaciani / Banca: Flávia Maria de Souza Carvalho / Banca: Henrique Ferreira / Resumo: A bactéria Gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, doença ainda sem método curativo que gera grande impacto econômico na produção de laranja. Estudos moleculares envolvendo patossistemas, como o Xac-citros, vêm ganhando espaço no auxílio do entendimento sobre os processos fitopatogênicos. Diante disto, o objetivo do presente trabalho foi investigar a expressão dos genes exsF e exsG de Xac e o efeito dos seus nocautes na patogenicidade de Xac em limoeiro cravo (Citrus limonia Osbeck), bem como obter as proteínas por eles codificadas e utilizá-las em ensaios iniciais de cristalização. Na análise da expressão destes genes, foi utilizada a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR), onde foi avaliada a expressão dos mesmos em Xac inoculada em folhas de limoeiro cravo coletadas em três tempos após a inoculação (48, 72 e 120 h) comparada com a expressão em Xac inoculada em meio de cultura. Já para a produção do mutante duplo de Xac apresentando os genes exsF e exsG nocauteados, foi utilizada a técnica de mutação sítio-dirigida por PCR utilizando o vetor suicida pOK1 e a estratégia de troca alélica. Para a produção das proteínas ExsF e ExsG recombinantes foi utilizada a expressão heteróloga em E. coli através do uso do vetor de expressão pET SUMO e os ensaios iniciais de cristalização foram realizados utilizando-se kits comerciais e não comerciais. A análise da expressão dos genes exsF e exsG revelou que estes foram induzidos, cerca de 10 vezes mais, após 72 horas de infecção da Xac em folhas de limoeiro cravo, em comparação com a Xac multiplicada em meio de cultura. Os ensaios de patogenicidade utilizando o mutante duplo de Xac Δ3135/3136 revelaram que este foi avirulento em folhas de limoeiro cravo, em contraste com a linhagem 306 selvagem, que elicitou os sintomas de cancro cítrico. Além disso, a mutação reduziu a capacidade de multiplicação... / Abstract: The Gram-negative bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, disease that causes a significant economic impact on the orange production. Molecular studies involving pathosystems like Xac-citrus have been used to as an approach to understand the pathogenic processes. Therewith, the objective of this study was to investigate the expression of exsF and exsG Xac genes and the effect of its silencing in Xac pathogenicity in Rangpur lime (Citrus limonia Osbeck) leaves and also get the proteins coded by them and use it in initial tests of crystallization. The real-time PCR (qRT-PCR) technique was used in the analysis of gene expression.The in planta expression of exsF and exsG genes were evaluated in Xac isolated from Rangpur lime leaves collected at 48, 72 and 120 h after inoculation compared to Xac growing in NA culture. For the production of Xac double mutant having the ExsF and exsG genes silenced, the site-directed mutagenesis technique by PCR using the suicide vector pOK1 was used. For the production of ExsF and ExsG recombinant proteins, the E. coli heterologous expression in the pET SUMO expression vector was used. Finally, the initial crystallization trials were performed using commercial and non-commercial kits. The gene expression analysis showed that the exsF and exsG genes were induced about 10-fold more after 72 hours of Xac infection in Rangpur lime leaves, compared with the Xac grown in the culture medium. The functional assays performed with the Xac Δ3135/3136 double mutant showed that it was avirulent on Rangpur lime leaves, in contrast to the wild type strain Xac 306. Moreover, the mutation reduced the multiplication of the bacteria in planta. The mutation also affected the biofilm production, that was reduced in the mutated strain. Through the heterologous expression assays and protein purification it was possible to obtain only the ExsG protein, soluble and pure enough to be ... / Doutor