O ambiente epifítico é considerado um dos habitats mais desafiadores para as plantas, pois a disponibilidade hídrica e nutricional pode ser bastante escassa. Além disso, as plantas que colonizam este ambiente estão mais expostas aos fatores ambientais, dentre eles a luminosidade se mostra bastante importante, uma vez que esta atua tanto como fonte de energia na fotossíntese quanto como sinal ambiental em repostas fotomorgênicas. Sabe-se, por exemplo, que a luz exerce forte influência sobre a morfogênese radicular de plantas em geral, porém impacta ainda mais o desenvolvimento de orquídeas epífitas, dada a frequente exposição de suas raízes aéreas à incidência luminosa. Tendo em vista que a auxina ácido indolil-3-acético (AIA), o ácido abscísico (ABA) e o etileno são moduladores cruciais no controle da arquitetura radicular na maioria das plantas, sendo também mediadores chave em várias respostas fotomorfogênicas, este estudo propôs-se a investigar o possível envolvimento destes hormônios durante diferentes respostas morfo-fisiológicas desencadeadas pela exposição à luz do sistema radicular de plantas de C. fimbriatum. A ausência de incidência luminosa sobre às raízes resultou em maiores taxas de crescimento e volume radicular, porém, com menor acúmulo de biomassa em relação às raízes expostas à luz. O incremento na biomassa em raízes expostas à luz esteve correlacionado ao espessamento da parede celular na região cortical, o qual ocorreu em resposta especificamente à luz azul. Em termos gerais, a exposição das raízes à luz induziu o aumento nos níveis de AIA e ABA, enquanto que os teores de ACC foram superiores em raízes protegidas da incidência luminosa. Estes resultados sugerem que a luz pode modular o desenvolvimento radicular de C. fimbriatum através de um fino controle hormonal que depende de ajustes coordenados dos níveis de AIA ABA e ACC. Também foi investigado o potencial envolvimento das auxinas e do ABA durante a remobilização de carboidratos entre pseudobulbos e folhas de plantas que tiveram seus sistemas radiculares expostos à (ou protegidos da) luz. Os resultados revelaram que a manutenção das raízes sob condições de escuro levou ao aumento dos teores de AIA e de todas as fontes de carbono estudadas (especialmente de glicose e frutose) nos pseudobulbos, enquanto que as raízes cobertas apresentaram apenas um leve aumento no conteúdo de AIA. O tratamento concomitante das raízes com a condição de escuro e a aplicação de um inibidor do transporte polar de auxina causou uma diminuição abrupta nos teores de AIA em todos os órgãos analisados e a elevação do conteúdo de ABA no sistema radicular. De maneira interessante, essa última condição experimental induziu um conspícuo acúmulo de carboidratos nos pseudobulbos, principalmente de sacarose. Assim, os dados deste trabalho reforçam a importante participação do AIA e ABA como possíveis mediadores da sinalização desencadeada pela luz incidente no sistema radicular de C. fimbriatum, cujas respostas induzidas regulam não somente a morfogênese de tecidos radiculares, mas também influenciam na regulação da partição de carbono no sistema caulinar por meio de um provável mecanismo de sinalização à longa distância / The epiphytic environment is considered one of the most challenging for plants, due to frequent scarcity of water and nutrients. Furthermore, the plants that colonized this biotope are usually more exposed to the environmental cues. Light is considered one of the most important signals controlling plant development because it can act as both an energy source for photosynthesis and an environmental signal for photomorphogenic responses. Besides, light can influence the root morphology of most plants, with even stronger impacts expected in aerial roots of epiphytic orchids due their frequent exposition to direct light. Since indole-3-acetic acid (IAA), abscisic acid (ABA) and ethylene are crucial hormonal signals modulating the root architecture in most plant species, and key mediators during numerous photomorphogenic responses, this study investigated the potential involvement of these hormones in different morpho-physiological responses regulated by either the darkness treatment or the light exposure of Catasetum fimbriatum root system. The absence of light incidence on the roots resulted in higher root volume and growth rate, but lower dry mass accumulation than the light-exposed ones. The higher accumulation of biomass in the light-exposed roots was closed correlated with a more intense cell wall thickening in the root cortex, which appeared to be specifically induced by the blue light. In general, root exposure to light induced increasing levels of ABA and AIA, while the ACC content was higher in roots protected from light. This suggests that light might modulate C. fimbriatum root development through a fine-tuned hormonal mediation, which depends on coordinated adjustments of IAA, ABA and ACC levels. This study also investigated the potential involvement of auxin and ABA during the (re)mobilization of carbohydrates in pseudobulbs and leaves of plants that had their root systems either exposed to (or protected from) light. The results revealed that covering the roots increased in pseudobulbs the levels of AIA and all carbon sources studied (specially glucose and fructose), while the covered roots showed slightly higher levels of AIA. The concomitant treatment with NPA and root covering caused a sharp decrease of AIA levels in all organs and an ABA increase in the root system. Interestingly, this last condition induced a conspicuous carbohydrate accumulation in pseudobulbs, with sucrose as the predominant form. The data obtained in this study reinforce the remarkable participation of IAA and ABA as possible mediators of the signaling cascades triggered by the light incidence on C. fimbriatum root system, which was capable of inducing photomorphogenic responses not only in root tissues, but was also able to influence the carbon portioning in the shoot system by a potential long-distance signaling mechanism

The objective of this study was to quantify the effect of partial replacement of finely ground corn by steam-flaked corn or pelleted citrus pulp and two concentrate levels, either 60 or 80%, on rumen pH, in vitro digestibilities of tropical forages, performance and rumen fermentation of Nellore young bulls. Three rumen cannulated Nellore steers with average BW of 350 ± 15 kg were assigned in a 3×3 Latin Square design. The rumen pH was measured and rumen fluid used to evaluate in vitro DM and NDF digestibilities (IVDMD and IVNDFD) of tropical forages. Moreover, a total of 108 Nellore young bulls with initial BW of 365.3 ± 3.12 kg, were distributed in collective pens, with 3 animals per pen, in a randomized complete block design with 6 replicates in a 3×2 factorial arrangement of treatments. The performance, carcass traits, blood parameters, feeding behavior, and sorting index were evaluated. Additionally, six rumen-cannulated steers, weighing 345.10 ± 14 kg were arranged in 2 6×6 non-contemporary Latin squares, in a 3×2 factorial arrangement of treatments. The rumen was manually evacuated, an aliquot of the digesta was filtered to separate solid and liquid phases. Rumen fluid samples were taken at multiple times after feeding to determine pH, short chain fatty acids and ammonia nitrogen. The steam-flaked corn decreased in vitro digestibility of the forages evaluated, but increased rate of degradation. It also increased propionic acid, but decreased ammonia compared to the other diets. It decreased NDF total tract digestibility compared to citrus pulp. The steam-flaked corn increased fat deposition, with no impact on animal performance. The citrus pulp decreased lag time and increased rate of degradation. The pelleted citrus pulp caused the bulls to sort the diet against large particles, decreasing the DMI, performance, and rumen propionic acid concentration, but increased the acetic acid, disappearance rate of NDFd, and digestibilities of DM and OM. On the other hand, the 80% concentrate diets decreased passage rate of NDF, but increased the digestibilities of OM, DM, and performance, despite the lower intake. In conclusion, the inclusion of 80% concentrate in sugarcane silage based-diets lowers intake, and increases performance, the partial replacement of ground corn by steam-flaked corn improves carcass fat deposition. And citrus pulp increases rumen pH, fiber digestibility but decreases intake, and performance of finishing young Nellore bulls. / O objetivo deste estudo foi quantificar o efeito da substituição parcial de milho finamente moído por milho floculado a vapor ou polpa cítrica peletizada e dois níveis de concentrado, 60 ou 80% sobre o pH, digestibilidade in vitro de forragens tropicais, desempenho e fermentação ruminal de tourinhos Nelore. Foram utilizados três novilhos Nelore canulados no rúmen PV médio de 350 ± 15 kg em um delineamento de quadrado latino 3×3. O pH do rúmen foi medido e o fluido do rúmen utilizado para avaliar as digestibilidades in vitro da MS e da FDN (DIVMS e DIVFDN) de forragens tropicais. Além disso, um total de 108 novilhos Nelore com PV inicial de 365,3 ± 3,12 kg, foram distribuídos em baias coletivas, com 3 animais por baia, em um delineamento de blocos ao acaso com 6 repetições em um arranjo fatorial 3×2 de tratamentos. As avaliações feitas foram desempenho, características de carcaça, parâmetros de sangue, comportamento alimentar e índice de seleção de partículas. Ademais, seis novilhos canulados no rúmen, pesando 345,10 ± 14 kg, foram organizados em 2 quadrados latinos não contemporâneos 6×6, em um arranjo fatorial 3×2 de tratamentos. O rúmen foi evacuado manualmente, uma alíquota da digesta foi filtrada para separar as fases sólida e líquida. As amostras de fluido de rúmen foram tomadas em várias horas após a alimentação para determinar o pH, ácidos graxos de cadeia curta, e nitrogênio amoniacal. O milho floculado diminuiu a digestibilidade in vitro de forragens avaliadas, mas aumentou a taxa de degradação, ácido propiônico, mas diminuiu a amônia em comparação com as outras dietas., e a digestibilidade do trato total do FDN em relação à polpa cítrica. O milho floculado aumentou a deposição de gordura, sem impacto no desempenho. A polpa cítrica diminuiu o Lag time e aumentou a taxa de degradação, e fez com que os touros selecionassem a dieta contra partículas grandes, diminuindo o CMS, desempenho e ácido propiônico do rúmen. Por outro, lado a polpa aumentou o ácido acético, a taxa de desaparecimento de FDNd e digestibilidades de MS e MO. As dietas com 80% de concentrado diminuíram a taxa de passagem do FDN, mas aumentaram as digestibilidades da MO, MS e desempenho, apesar da menor ingestão. Em conclusão, a inclusão de 80% de concentrado em dietas à base de silagem de cana-de-açúcar reduz a ingestão e aumenta o desempenho. A substituição parcial de milho moído por milho floculado melhora a deposição de gordura de carcaça. A polpa cítrica aumenta o pH do rúmen, e a digestibilidade da fibra, mas diminui o consumo e desempenho de tourinhos Nelore em terminação.

O presente estudo teve como objetivo a caracterização das frações protéicas e de carboidratos em pastagem de capim-elefante (Pennisetum purpureum cv. Cameroon), manejada com altas taxas de lotação no período das águas. O experimento foi realizado nas instalações do Departamento de Zootecnia da Esalq/USP. A forragem foi coletada nas estações do outono/2006, primavera/2006 e verão/2006-07, adotando-se intervalos de desfolhação fixos de 27 dias e variáveis, onde a entrada dos animais ocorreu quando o capim atingiu 1,05 m de altura (95 % IL). Foi determinada a composição bromatológica, frações protéicas e de carboidratos tanto por métodos químicos quanto pelo método de degradação in situ da forragem. A pastagem também foi avaliada quanto à massa de forragem (kg de MS por ha-1), composição morfológica e alturas do dossel na entrada e saída dos animais. Para as determinações no pasto utilizou-se o delineamento inteiramente aleatorizado com medidas repetidas no tempo. Para as frações protéicas A, B e C, foi realizado ensaio de degradabilidade in situ utilizando-se 4 garrotes castrados e canulados no rúmen. As amostras de forragem secas e moídas a 5 mm foram acondicionadas em sacos de nylon e incubadas no rúmen por 0, 3, 6, 12, 24, 48, 60, 72, 96 e 120 horas. O delineamento experimental foi em quadrados latinos 2x2 replicados. A duração do intervalo entre desfolhas não diferiu entre os tratamentos (P>0,05), em nenhuma das estações avaliadas. As alturas do dossel no pré-pastejo foram maiores (P<0,05) nos tratamentos com ID variável. Para altura do dossel em pós-pastejo, houve efeito somente da estação (P<0,05), com menores alturas na primavera (0,43 e 0,51 m), e maiores no verão (0,56 e 0,57 m) para os tratamentos com ID fixo e variável. Não foi verificada diferença (P>0,05) para produção de forragem entre os tratamentos. Apenas os teores de PB da forragem foram afetados pelos tratamentos (P<0,05), com menores valores para ID variável. Os teores de MS, FDN, FDA, lignina e PIDA não diferiram (P>0,05) entre os tratamentos. Somente a fração protéica B2 foi afetada, com maiores valores para ID variável (P<0,05). As frações A e B3 diferiram nas estações do ano (P<0,05), com o outono apresentando menores valores de A e maiores da B3. Não houve diferença para as frações B1 e C (P>0,05). No verão, a fração A+B1 dos carboidratos apresentou os menores valores dentre as estações (13,80 e 16,22 % para ID fixo e variável), e a fração B2, os maiores valores (76,59 e 73,42 %) (P<0,05). Não houve diferenças (P>0,05) para as variáveis de degradabilidade da MS e MO. Na degradabilidade da FDN, diferenças significativas foram observadas apenas para variável de DP e DE com taxa de passagem de 2 %/h no tratamento com ID fixo. A correção da contaminação microbiana resultou em aumento nos valores da fração protéica A e redução na B. Não houve efeito (P>0,05) para as variáveis da PB corrigida pela contaminação, exceto para a fração B, onde os valores foram maiores no outono (73,3 e 73,69%) e menores na primavera com ID variáveis (55,87%). / The present study designed to characerize the protein and carbohydrate fractions of elephant grass pasture (Pennisetum purpureum) cv. Cameroon, intensively grazed at high stocking rate during the rainy season. The experiment was carried in the Animal Sciences Department of the University of São Paulo (USP/ESALQ). Forage samples were collected during autumn and spring/2006 and summer/2006-07. Two defoliation intervals (DI) were adopted, fixed and variable. For the fixed DI treatment experimental animals had access to the paddocks every 27 days, and for the variable DI treatment experimental animals had access to the paddocks when the sward reached 1,05m height, corresponding to 95% light interception. Forage samples were analyzed for chemical composition and protein and carbohydrate fractions by chemical methods and with \"in situ\" degradation technique. Pasture was also analyzed for pre-grazing forage mass (kg DM ha-1) , morphologic composition, pre and post grazing sward heights. A completely randomized design with repeated measures was used for pasture determinations. For protein fractions (A, B, C) determinations, an in situ trial was developed using four rumen canulated steers. 5mm ground forage samples were conditioned in nylon bags and incubated in the rumen for 0, 3, 6, 12, 24, 48, 60, 72, 96 and 120 hours. The experimental design was a replicated 2x2 Latin square. The defoliation interval length did not differ (P>0,05) among treatments, in any season. Pre-grazing sward heights were higher (P<0,05) for the variable DI treatment. A season effect (P<0,05) was observed for post-grazing heights, with lower values observed on spring (0,43 and 0,51m) and higher on summer (0,56 and 0,57m) for both treatments. No differences (P>0,05) were observed among treatments for total forage mass. Only forage CP content was affected by treatments, with lower values (P<0,05) for variable DI. DM, NDF, ADF, lignin and ADIN were not different (P>0,05) among treatments. Protein B2 fraction was affected, showing higher values (P<0,05) for variable DI treatment. Fractions A and B3 were different among seasons, with lower fraction A and higher fraction B3 values during autumn (P<0,05). No differences were observed for fractions B1 and C (P>0,05). During summer carbohydrate fractions A + B1 showed the lowest values among seasons (13,80 and 16,22% for fixed and variable DI), and B2 fraction showed the highest values (76,59 and 73,42 %) (P<0,05). No differences were observed for DM and OM degradabilities variables (P>0,05). For NDF degradability significant differences were observed only PD and ED variables with 2%/h passage rate for fixed DI treatment. Microbial contamination adjustment resulted in higher protein A and lower protein B fraction values. No effects were observed (P>0,05) for microbial contamination adjusted CP variables, except for B fraction that showed higher values during autumn (73,3 and 73,69%) and lower during spring with variable DI (55,87%).

A galectina-4 humana (HGal-4), pertencente à família das galectinas, possui dois domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) com alta afinidade para &beta;-galactosídeos e se encontra amplamente distribuída em células normais e neoplásicas de diferentes organismos. Suas funções snglobam uma grande variedade de eventos celulares, tais como processos inflamatórios, neoplásicos, progressão tumoral e metástase. Entretanto, muitas perguntas sobre suas interações com diferentes carboidratos, a especificidade destas interações e o papel específico das galectinas permanecem ainda sem resposta. No presente trabalho, propomos a investigação das interações galectina-glicano da galectina-4 humana e de seus domínios CRDs independentes (CRD-I e CRD-II) através de um conjunto de métodos biofísicos. Através do método de dicroísmo circular (CD), usando várias regiões espectrais, e fluorescência fomos capazes de entender mudanças ocorrentes na estrutura secundária e terciária das protéinas quando da interação com lactose/sacarose. Estes dados, juntamente com testes de hemaglutinação, mostraram que a glectina-4 e os CRDs respondem de forma distinta à ligação com açúcar. Por diferentes técnicas (fluorescência, ITC e MST) determinamos as constantes de dissociação para os domínios CRDs (Kd ~0,5 mM) e para HGal-4 e, de forma qualitativa, os valores obtidos indicaram possíveis estados oligoméricos dessas proteínas. A investigação da interação proteína-membrana da HGal-4 foi feita, primeiramente, com miméticos de membranas e monitorada pela técnica de RPE em crescente complexidade de composição de tais miméticos, indo desde composições mais simples, passando por lipid rafts na presença de diferentes glicolipídeos (GM1, LPS) e chegando-se à interação com células tumorais (U87MG, T98G e HT-29). Tais experimentos mostraram que galectina-4 reconhece e se liga naqueles modelos onde existem glicanos complexos na superfície. Investigamos também a participação de HGal-4 endógena e exógena no tratamento quimioterápico de células tumorais e verificamos um papel importante de HGal-4 para células HT-29. Finalizando esta tese, apresentamos o trabalho realizado em um ano de estágio na University of Oxford, durante o qual, investigamos a estrutura da região C-terminal de um receptor da família GPCR, qual seja o receptor de neurotensina NTS1. Aqui, mais uma vez, foi empregada a técnica de RPE que aliada à produção/marcação de mutantes do receptor, permitiu determinar que a hélice H8 se estabiliza quando em proteolipossomos. / Human galectin-4 (HGal-4), a member of the galectin family, contains two carbohydrate recognition domains (CRDs) with high affinity for &beta;-galactosides and is widely distributed in normal and neoplastic cells of different organisms. Its functions include a wide variety of cellular events such as inflammation, cancer, cell adhesion, tumor progression and metastasis. However, many questions about their interactions with different carbohydrates, the specificity of these interactions and the specific role of galectins remain unanswered. In this study, we propose the investigation of galectin-glycan interactions of human galectin-4 and its independent CRDs (CRD-I and-II) through a combination of biophysical methods. From circular dichroism (CD), measured in different spectral ranges, and fluorescence experiments we were able to understand changes in secondary and terciary structure of the protein while interacting with lactose/sucrose. These results along with hemagglutination assays showed that galectin-4 and its CRDs respond differently to sugar binding. From fluorescence, ITC and MST measurements we determined the dissociation constants for the CRDs (Kd ~0.5 mM) and for HGal-4. These values qualitatively indicated the formation of potential oligomers of CRDs and of HGal-4. The investigation of the HGal-4 interaction with membranes was firstly performed using mimetic membranes and monitored by EPR spectroscopy. The composition of the mimetic membranes was gradually increased so that to span simple compositions (such as DMPC), passing by lipid rafts in the presence of different glycolipds (GM1, LPS) up to interactions with tumor cells (U87MG, T98G e HT-29). These experiments showed that galectin-4 recognizes and binds to membrane models constituted by complex glycans on their surface. We also investigated the involvement of endogenous and exogenous HGal-4 in chemotherapies of tumor cells and found an important role of HGal-4 in the case of HT-29 cells. At last, we presented the work done in an one-year internship at the University of Oxford, during which we investigated the C-terminal region of the GPCR family receptor, the neurotensin receptor NTS1. Here, we used once again the EPR technique combined with the production/spin-labelling of mutants of the receptors, and determined that helix H8 was stabilized upon receptor reconstitution in proteolipossomes.

Um total de sete experimentos foi realizado com o objetivo de avaliar o impacto da nutrição pós- eclosão sobre o desenvolvimento de frangos de corte. No experimento I foi avaliada a utilização de diferentes níveis de levedura hidrolisada. No experimento II foram avaliadas diferentes estratégias nutricionais, através do fornecimento de água, ração e de diferentes soluções de glucose de milho. O experimento III foi avaliado o fornecimento de diferentes níveis de óleo de peixe. O experimento IV consistiu em avaliar o fornecimento de um complexo vitamínico, já os experimentos V e VI avaliou-se a suplementação de zinco e manganês, respectivamente, suplementados na forma orgânica de glicinatos. No experimento VII foi avaliado o desempenho dos animais recebendo a suplementação com os nutrientes fornecidos nos experimentos anteriores, ou seja, levedura hidrolisada, estratégia nutricional, óleo de peixe, suplemento vitamínico, zinco e manganês. Em cada experimento foram incubados 1200 ovos embrionados para uso de 840 pintos após a eclosão. As aves foram distribuídas em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 2, sendo 5 nutrientes e dois sexos (machos e fêmeas). Os tratamentos experimentais foram fornecidos logo após a eclosão e as aves foram mantidas em caixas de transporte de pintinhos por um período de 5 horas, para posterior distribuição nos boxes. Após o alojamento as aves receberam dietas semelhantes até o final do período experimental (41 d), de acordo com as recomendações propostas por Rostagno et al. (2011). Foram avaliados os dados de desempenho (ganho de peso, consumo de ração e conversão alimentar) e ao final dos experimentos, aos 41 dias, duas aves de cada repetição foram abatidas para a avaliação de características de carcaça (rendimento de carcaça, peito, pernas e gordura abdominal). Nos dias 0, 3, 6, 9 e 12, sete aves de cada tratamento foram abatidas para avaliar a alometria dos órgãos digestivos. Os dados obtidos foram analisados pelo procedimento GLM do sistema SAS (2010) e as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade / A total of seven experiments was conducted to evaluate the impact of post-hatch nutrition on the development of broilers. In the first experiment we evaluated the use of different levels of hydrolyzed yeast. In the second experiment different nutritional strategies were evaluated, by providing water, food and different solutions of corn syrup. Experiment III evaluated the provisions of different levels of fish oil. The IV experiment consisted in evaluating the provision of a vitamin, while the V and the VI experiments evaluated the supplementation of zinc and manganese, respectively, supplemented in the form of organic glycinates. In experiment VII was rated the performance of animals receiving supplementation with nutrients provided in previous experiments, that is, hydrolyzed yeast, nutritional strategy, fish oil, vitamin supplement, zinc and manganese. In each experiment 1200 embryonated eggs were incubated and used 840 chicks after hatching. The birds were distributed in a completely randomized design in a factorial 5 x 2, 5 nutrients and both sexes (males and females). The experimental treatments were provided right after hatching and the birds were kept in transportation boxes for a period of 5 hours, for further distribution in the pits. After housing the birds received similar diets until the end of the experimental period (41 d), according to the proposed recommendations by Rostagno et al. (2011). Performance data (weight gain, feed intake and feed conversion) were evaluated and at the end of the experiments, after 41 days, two birds from each replicate were slaughtered to evaluate carcass traits (carcass yield, breast, legs and abdominal fat). On days 0, 3, 6, 9 and 12, seven birds from each treatment were sacrificed to assess the allometric digestive organs. Data were analyzed by GLM procedure of SAS (2010) system and the means were compared by Tukey test at 5% probability

As galectinas, proteínas que compartilham características como afinidade por ?-galactosídeos e a presença de um domínio de reconhecimento ao carboidrato (CRD), tem como importante papel a decodificação de mensagens moleculares. As galectinas são encontradas em uma grande variedade de células e tecidos animais e estão envolvidas em diversos processos celulares relacionados a resposta imune e inflamatória. O grupo tandem-repeat das galectinas é formado por proteínas que apresentam dois CRDs distintos (CRD1 e CRD2) conectados por um peptídeo de ligação, ao qual pertencem as galectinas-4 e -12 humanas, alvos de nosso estudo. Durante o desenvolvimento do presente projeto foram utilizadas abordagens multidisciplinares através de técnicas biofísicas, cristalográficas, computacionais e imunoquímicas. Foi iniciado o estudo de caracterização estrutural da galectina-4 humana (hGal4) e seus domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2, de forma independente, através da produção heteróloga das proteínas e ensaios de estabilidade térmica e cristalização. As estruturas cristalográficas dos domínios foram determinadas a 1,48 e 2,46 Å de resolução, respectivamente e utilizadas para a construção de um modelo para a hGal4. Com base nos estudos de dinâmica molecular e estabilidade térmica foi possível propor um modelo de interação entre os CRDs através do peptídeo de ligação. Ensaios de dinâmica da hGal4 com LacNAc sugeriram uma diferença de plasticidade dos CRDs no reconhecimento do ligante. Foram também realizadas incessantes tentativas de desenvolver um protocolo de expressão heteróloga para as isoformas e domínios da galectina-12 humana (hGal12). Como resultado, observamos uma alta tendência à formação de corpos de inclusão e agregados resistentes a desnaturação, além da susceptibilidade ao ataque proteolítico. Os modelos estruturais dos domínios da hGal12 não permitiram identificar nenhuma característica que justificasse o comportamento das proteínas. Foram realizados estudos de localização celular em células HL-60 e foi possível identificar a presença da hGal12 na superfície das gotas de lipídio, organelas responsáveis pelo armazenamento de energia e o processo de catabolismo celular. A alta insolubilidade observada para as isoformas e domínios da hGal12, a sua localização em gotas de lipídeos, a divergência evolutiva da hGal12 quando comparada com outras galectinas do mesmo grupo e incluindo o fato de um dos CRDs não apresentar os requerimentos estruturais básicos para ligar ?-galactosídeos, nos leva a especular se essa proteína estaria, na verdade, sendo expressa como parte de um heterocomplexo proteico, que estabilizaria a estrutura da hGal12 e a endereçaria para as gotas de lipídeo. Em nossa hipótese, o domínio hGal12-CRD2 poderia ter evoluído para favorecer a interação com outros parceiros macromoleculares. Devido ao importante papel desempenhado pelas galectinas em inúmeros processos celulares, os resultados aqui obtidos representam uma importante contribuição no entendimento do papel que as galectinas hGal4 e hGal12 exercem nos diferentes eventos celulares, além de fornecem ferramentas experimentais para desenvolvimento de futuros estudos funcionais. / Galectins are proteins that share characteristics such as affinity for ?-galactosides and the presence of a carbohydrate recognition domain (CRD). They belong to a family of proteins that display the important role of decoding molecular messages. Galectins are found in a variety of cell types and are involved in several biological phenomena related to immune response and inflammation. The tandem-repeat group of galectins consists of proteins with two distinct CRDs (CRD1 and CRD2) connected by a peptide linker, in which belong galectins-4 and -12, targets of our study. During the development of the present project a multidisciplinary approach was used including the use of biophysical, crystallographic, computational and immunochemical techniques. The structural characterization of human galectin-4 (hGal4) and its hGal4-CRD1 and hGal4-CRD2 independent domains was initiated by their heterologous protein production, thermal stability and crystallization assays. The crystallographic structure of domains were determined at 1.48 e 2.46 Å resolution, respectively, and used for constructing a model for hGal4. Based on molecular dynamics and thermal stability studies we propose a model of interaction between CRDs mediated by linker peptide. Dynamics simulation of hGal4 with LacNAc suggested a difference in plasticity between CRDs and ligand recognition. In addition, several attempts have been made towards the development of a protocol for expression of isoforms and independent domains from human galectin-12 (hGal12). As result, we observed a high tendency to body inclusion formation and denaturing resistant aggregates, besides high susceptibility to proteolytic attack. Structural models for the hGal12 domains did not allow the identification of any feature to justify proteins behavior. Cell location studies in HL-60 cells were performed and hGal12 was found to be located on the surface of lipid droplets, organelles responsible for energy storage and catabolism. The high insolubility displayed by isoforms and domains from hGal12, together with its location on lipid droplets, the evolutionary divergence of hGal12 compared to tandem-repeat proteins, and the fact that hGal12-CRD2 does not present the structural requirements for ?-galactosides binding, suggest that hGal12 is, in fact, expressed as part of a protein complex that could both stabilize hGal12 structure and guide it to the lipid droplets. In our hypothesis, the hGal12-CRD2 could have evolved in order to favor the interaction with other macromolecular partners. Due to crucial roles displayed by galectins in innumerous biological process, we believe that our results represent an important contribution for the understanding of hGal4 e hGal12 proteins roles within the cell, besides providing experimental tools for the development of further functional studies.

Este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial de 39 isolados bacterianos para produção de polihidroxialcanoatos contendo monômeros de cadeia média (PHA|MCL). Os isolados foram incapazes de utilizar eficientemente amido, lactose ou sacarose. O desempenho na produção de PHA a partir de glicose ou frutose pelos isolados foi inferior à linhagem de referência (Pseudomonas sp. LFM046). Muitos dos isolados apresentaram bom desempenho na conversão de glicerol em PHAMCL. Pela primeira vez, foram detectadas bactérias capazes de produzir PHAMCL a partir de xilose. Com base no sequenciamento do rDNA 16S, estes isolados foram identificados como pertencentes ao gênero Pseudomonas. Cultivos em biorreator, resultaram em uma biomassa de aproximadamente 6 g/L, contendo cerca de 11 a 14% de PHA. A superexpressão dos genes responsáveis pelo catabolismo de xilose (xylAB) em Escherichia coli não levou a melhora no consumo de xilose ou produção de PHAMCL. / This work aimed to evaluate the potential of 39 bacterial isolates to produce polyhydroxyalkanoates containing medium-chain monomers (PHAMCL). The isolates were unable to efficiently utilize starch, lactose or sucrose. The performance of the PHA production from glucose or fructose by the isolates was lower than the reference strain (Pseudomonas sp. LFM046). Many isolates showed good performance in the conversion of glycerol into PHAMCL. For the first time, bacterial isolates capable of producing PHAMCL from xylose were detected. Based on the sequencing of 16S rDNA, these isolates were identified as belonging to the genus Pseudomonas. Bioreactor cultures resulted in a biomass of approximately 6 g/L, containing about 11 to 14% PHA. Overexpression of the genes responsible for the catabolism of xylose (xylAB) in Escherichia coli did not led to improved xylose consumption or production of PHAMCL.

A crescente demanda de combustível leva a procura por um que seja produzido a partir de uma fonte limpa e renovável. A biofermentação da batatadoce (Ipomoea batatas (L.) Lam) para a produção de biocombustíveis gera um resíduo que muitas vezes é descartado no campo mas por ser rico em proteínas e carboidratos outros usos e aplicações podem e devem ser exploradas. O objetivo deste trabalho foi estudar a composição e estrutura química fina dos carboidratos presentes no coproduto proveniente da biofermentação etanólica de batata-doce. O coproduto foi submetido a duas extrações aquosas consecutivas, extração aquosa fria (AQF) e uma extração aquosa quente (AQQ). Os carboidratos extraídos, fracionados (oligossacarídeos e polissacarídeos), purificados e hidrolisados foram submetidos a diferentes técnicas cromatográficas (Cromatografia em camada delgada, cromatografia liquida de alta eficiência e cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas) visando a composição monossacarídica e quantificação destes. A caracterização estrutural dos carboidratos for feita por meio de ressonância magnética nuclear. Foi possível quantificar e identificar por meio de técnicas de alta precisão (CG e CLAE) os monossacarídeos presentes. Glicose é o principal componente da fração oligossacarídica e a galactose da polissacarídica, foi possível ainda identificar a presença de manose, xilose, ramnose e arabinose em menores quantidades. A análise estrutural mostrou que a fração polissacarídica tem como componente uma possível arabinogalactana do tipo I (com cadeia principal composta de (1→4)-β-Galp). Estes polímeros são amplamente estudados em virtude dos seus benéficos quando ingeridos, dentre eles combatem diversos vírus prejudiciais, atividade bifidogênica, benefícios relacionados ao sistema imune e relacionadas ao câncer. Assim, faz-se necessário o estudo continuado deste coproduto além de suas possíveis atividades biológicas. / The growing in the demand and need for fuels lead to the search for a renewable and clean source. The biofermentation of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam) for the production of biofuel generates a waste which is in the most times disposable in field, but the characteristics of this waste (rich in protein and carbohydrate) makes it susceptible for being studied and other uses exploited, making it a coproduct of the production. The goal of this work was the study of the composition and chemical structure of the carbohydrates found in the coproduct of the fermentation of sweet potato. Underwent this coproduct to two consecutive water extractions, cold-water extraction (CWE) and hot-water extraction (HWE). The extracted, fractioned (oligosaccharides and polysaccharides), hydrolyzed and purified carbohydrates underwent to different chromatography techniques (Thin layer chromatography, high precision liquid chromatography and gas chromatography with mass spectrometry) to clarify the composition and quantity of monosaccharides. Nuclear magnetic resonance (NMR) was used to the structural characterization of the carbohydrates. With the use of high precision techniques (GC-MS and HPLC) it was possible to identify and quantify the sugars. Glucose is the main component founded in the oligosaccharide fraction and galactose in the polysaccharides, was possible to identify the presence of mannose, xylose, rhamnose and arabinose in fewer quantities. The structural analyses show that the polysaccharide fraction has a type I arabinogalactana (composed by (1→4)-β-Galp as the backbone). Those polymers are highly studied because of the benefits when ingested, for example the combat to virus, bifidogenic activity, related to be beneficial to the immune system and to cancer. Therefore, the continued study of this coproduct is necessary and the possible health benefits.

trans-Sialidase de Trypanosoma cruzi (TcTS) pertence à família de glicoproteínas de superfície do parasita e constitui um dos poucos exemplos naturais de glicosiltransferases superficiais encontradas em eucariotes. T. cruzi é incapaz de sintetizar ácido siálico e utiliza esta enzima para retirar este monossacarídeo de glicoconjugados do hospedeiro para sialilar moléculas aceptoras, como mucina-GPI (glicosilfosfatidilinositol), presentes na sua membrana plasmática. Esta enzima é específica em catalisar, preferencialmente, a transferência de ácido siálico para moléculas de mucina, originando ligações -2,3 com moléculas de galactose aceptoras na superfície do parasita. Considerando a heterogeneidade das moléculas de mucina de T. cruzi, é necessário que novas moléculas sejam sintetizadas a fim de que estas atuem como substratos glicopeptídicos, os quais podem levar ao melhor entendimento das interações entre enzima e substratos e permitir o planejamento racional de inibidores seletivos. Por isso, o trabalho foi divido em três rotas sintéticas: (i) preparação do doador de galactose, (ii) preparação dos aceptores-doadores e (iii) acoplamento dos dissacarídeos com aminoácidos aceptores para obtenção dos blocos de construção. Apesar dos objetivos propostos inicialmente não terem sido totalmente alcançados, o trabalho desenvolvido durante esse período permitiu a síntese do doador de galactose (3) em três etapas, aceptor de galactose (6) em cinco etapas, dissacarídeo (11) na glicosilação de 6 com 3, aminoácidos aceptores (13 e 14) e também dos blocos de construção (17 e 18) decorrente do acoplamento de 11 com os aminoácidos aceptores. Não obstante, é importante ressaltar que apesar da extensa rota planejada, porém necessária, a síntese dos blocos de construção é inédita. Portanto, pode-se concluir que o trabalho trouxe relevante contribuição no que diz respeito à química de carboidratos e à disponibilização de dados espectrométricos de compostos orgânicos para a literatura. / Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS) belongs to the family of glycoproteins expressed on the surface of the parasite and constitutes one of the few examples of natural surface glycosyltransferases found in eucariotes. T. cruzi can not synthesize sialic acid itself and uses this enzyme to scavenge this monosaccharide from host glycoconjugates to sialylate acceptors molecules, such as GPI (glycosylphosphatidylinositol) mucins, that are present in parasite plasma membrane. This enzyme is specific to catalyze, preferentially, the transference of sialic acid to mucin glycoproteins, generating -2,3-linkages with acceptor galactose molecules in the parasite surface. Considering the heterogeneity of T. cruzi mucin molecules, its necessary to synthesize new compounds that can act as glycopeptide substrates, leading to a better understanding concerning the enzyme and substrates and allow the rational design of some selective inhibitors. Thus, this work was developed in three synthetic routes: (i) the synthesis of galactose donor, (ii) synthesis of donor-acceptors and (iii) coupling between disaccharides and acceptors amino acids in order to obtain building blocks. Despite of some objectives initially proposed had not been accomplished, the developed work during this period allow the synthesis of the galactose donor (3) in three steps, donor-acceptor (6) in five steps, disaccharide (11), acceptors amino acids (13 and 14) and also the building blocks (17 and 18). However, its important highlight that the synthesis of the building blocks by this necessary, but extensive, synthetic route is unpublished. Therefore, it can be concluded that the present work brought rich contribution concerning the carbohydrate chemistry and the availability of spectrometric data of organic compounds to the literature.

Polihidroxialcanoatos (PHA) produzidos por Pseudomonas sp. LFM046 a partir de carboidratos e ácido propiônico contem monômeros com número ímpar e par de carbonos, representando um bom modelo para o estudo do metabolismo de propionato. Genes relacionados ao ciclo do 2-metilcitrato foram encontrados em todas as espécies de Pseudomonas compondo um operon prpRBCAcnMprpFD. Genes da via do metilmalonil-CoA não foram encontrados em Pseudomonas. Genes da <font face=\"Symbol\">a-oxidação de propionato foram encontrados apenas em P. aeruginosa. A análise de um mutante prp obtido por inserção de transposon revelou que estava mutado no gene prpB, relacionado ao ciclo do 2-metilcitrato. A análise de mutantes obtidos por radiação ultravioleta revelou que dois devem estar afetados em via menos relevante para o metabolismo de propionato e outros dois na ativação desse ácido orgânico. Experimentos com propionato marcado (1C13) demonstraram que as vias do oxobutirato, do metimalonil-CoA e do 2-hidroxiglutarato não devem contribuir para o metabolismo de propionato em Pseudomonas sp. LFM046. / Polyhydroxyalkanoates (PHA) produced by Pseudomonas sp. LFM046 from carbohydrates and propionic acid contains monomers with odd and even number of carbons, representing a good model to study the propionate metabolism. Genes related to 2-methycytrate cycle were found in all Pseudomonas species organized in an operon prpRCAAcnMprpFD. Genes related to the methylmalonyl-CoA pathway were not found in Pseudomonas. Genes related to the propionic <font face=\"Symbol\">a-oxidation were found only in P. aeruginosa. Analysis of a prp mutant obtained by transposon insertion revealead that it was mutated in prpB gene, related to the 2-methylcytrate cycle. The analysis of mutants obtained using ultraviolet radiation showed that two should be affected in less relevant propionate metabolism pathways and other two in the activation of this organic acid. Experiments with labeled propionate (113C) demonstrated that the oxobutyrate, methylmalonil-CoA and 2-hydroxyglutarate pathways should not contribute to the propionate metabolism in Pseudomonas sp. LFM046.