Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-10-10T10:45:14Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-10-16T13:33:10Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-10-16T13:33:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2018-06-29 / A Artrite Reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crônica, caracterizada por inflamação das articulações e associada à incapacidade motora e laboral dos pacientes. Tendo em vista que as estratégias atuais para o tratamento da AR podem apresentar sérios efeitos colaterais e nem sempre resultam em melhora clínica, a terapia com laser de baixa potência (LLLT) surgiu como alternativa para o tratamento da artrite, devido às suas propriedades anti-inflamatórias e de regeneração tecidual. Entretanto, os mecanismos anti-inflamatórios da LLLT nos tecidos biológicos ainda não são completamente conhecidos. Assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar os mecanismos imunológicos e a participação das metaloproteinases de matriz (MMP) e seu inibidor (TIMP2), na resolução do processo inflamatório articular após o tratamento com LLLT. Para isso, um processo inflamatório foi induzido nas articulações talocrural e subtalar dos membros posteriores de camundongos C57BL/6, através da administração de zymosan na região periarticular. Os animais foram divididos em 4 grupos (n = 8): (ZY) artrite induzida por zymosan e não tratado, (ZY + 3Jcm-2) artrite induzida por zymosan + LLLT em 3Jcm-2, (ZY + 30Jcm-2) artrite induzida por zymosan + LLLT em 30Jcm-2 e (ZY + DEXA) artrite induzida por zymosan e tratado com dexametasona. As condições da LLLT foram: 830nm, 10mW e densidades energéticas de 3Jcm-2 e 30Jcm-2, no modo contínuo de emissão. A irradiação foi realizada durante 4 dias consecutivos, iniciando 5 horas após a indução da inflamação. Os animais foram eutanasiados 24h após a última aplicação da LLLT e as seguintes análises foram realizadas no tornozelo: morfológica, níveis relativos de mRNA de quimiocinas, citocinas, MMPs e TIMP2 por RT-qPCR, quantificação de citocinas por ELISA e quantificação da expressão tecidual de MMP13 e TIMP2 por imunohistoquímica. No linfonodo poplíteo foi realizada análise de citometria de fluxo para identificação e quantificação das populações de leucócitos. As análises morfológicas revelaram a presença de infiltrado celular no tecido conjuntivo adjacente à região periarticular, após a administração de zymosan. Foi observada diminuição dos níveis teciduais de citocinas após LLLT e alteração nos níveis de mRNA de citocinas e quimiocinas com importância na fisiopatologia da AR, diferentemente, dependendo da densidade de energia utilizada. O grupo ZY + 3Jcm-2 demonstrou aumento na maioria das populações de leucócitos analisadas, bem como na expressão de proteínas co-estimulatórias em macrófagos e células dendríticas do linfonodo proximal à inflamação. Adicionalmente, foi observado maior população de células Treg nos grupos LLLT, e no grupo ZY + 30Jcm-2, mais células Treg CD8+ expressando níveis elevados de CD25. Embora LLLT tenha diminuído os níveis de mRNA da maioria das MMPs analisadas e aumentado de TIMP2, foi observado aumento da expressão tecidual de MMP13 e TIMP2 na região inflamatória do grupo ZY + 3Jcm-2. Tendo em vista a totalidade dos resultados, o LLLT em ambas as densidades de energia, apresentou efeitos anti-inflamatórios positivos para o tratamento da AR, uma vez que diminuiu os níveis da maioria das citocinas, quimiocinas e MMPs nos tecidos inflamados, além de modificar o quantitativo e o fenótipo dos leucócitos linfonodais, especialmente de células Treg. / Rheumatoid Arthritis (AR) is a chronic inflammatory disease, characterized by joint inflammation and associated with motor and labor incapacity. Since treatment strategies could present a serious side effects and not always achieved clinic improvement, the Low Level Laser Therapy (LLLT) have being considered as an alternative to arthritis treatment, due to its anti-inflammatory and healing abilities. However, LLLT anti-inflammatory mechanisms in biological tissues is not completely understood. Then, this study aimed to evaluate immunological mechanisms and contribution of matrix metaloproteinases (MMPs) and its inhibitor (TIMP) on inflammation resolution process induced by LLLT. Arthritis was induced in C57BL/6 mice by zymosan injection into periarticular region. Experimental animals were divided in 4 groups (n=8): (ZY) arthritis induced by zymosan and untreated; (ZY + 3Jcm-2) arthritis induced by zymosan and treated with LLLT at 3Jcm-2; (ZY + 30Jcm-2) arthritis induced by zymosan and treated with LLLT at 30Jcm-2; (ZY + DEXA) arthritis induced by zymosan and treated with dexamethasone. LLLT parameters were: 830nm, 10mW energy densities at 3 Jcm-2 e 30 Jcm-2, in continuous wave emission mode. Irradiation sections and dexamethasone treatment were carried out 4 days consecutively, starting 5 hours after arthritis induction. Animals were euthanized 24h after the last treatment section and the following analysis were procedure at ankle: morphological, cytokine mRNA relative levels, chemokines, MMPs and TIMP2 by RT-qPCR, quantification of cytokines tissue expression by ELISA and MMP13 and TIMP2 by imunohistochemistry. In popliteal lymph node, leukocytes populations were identificated and quantificated by flow cytometry. Morphological analysis showed inflammatory infiltration at adjacent connective tissue of joints, after zymosan injection. After LLLT, it was observed cytokines tissue expression decrease and mRNA levels alteration of important cytokines and chemokines in pathophisiology of AR, depending of energy density used. The ZY + 3Jcm-2 group showed an increase leukocytes populations, as well as, higher expression of costimulatory proteins in macrophages and dendritic cells of popliteal lymph node. Additionally, it was observed higher Treg population in LLLT groups than ZY group. More, ZY + 30Jcm-2 showed higher Treg CD8+ population presenting CD25high. LLLT decreased mRNA levels of almost MMPs analyzed and increased of TIMP2, except for ZY + 3Jcm-2 group in which was observed MMP13 and TIMP2 tissue expression increase. Taken togheter, all results showed that LLLT, at both energy densities used, presente positive anti-inflammatory effects for RA treatment, since it decreases the levels of cytokines, chemokines and MMPs at inflammed tissues. LLLT could also alter number and phenotype leukocytes in lymph node, especially Treg cells.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_thais_farias_collares.pdf: 1094762 bytes, checksum: 647dd933472bf9127c0164ee875617ea (MD5) Previous issue date: 2013-10-17 / The history of sports competition has been related to the use of methods for physical training associated with physiological methods to increase athlete performance. Ethical issues involving the high performance sport and doping are confused with the history of competitive sports. The World Anti - Doping Agency (WADA) prohibits the use of substances or methods to artificially increase sports performance. Currently, 258 substances are listed by WADA and athletes around the world are subjected to tests proving the non-use of doping. EPO is a glycoprotein hormone that has as its main physiological effect induction of erythropoiesis and thereby improving the capacity to transport oxygen in the blood. For these reason EPO has been included in WADA list. The analytical differentiation of endogenous erythropoietin from its recombinant counterpart, using isoelectric focusing and double blotting is a milestone in the detection of doping with recombinant erythropoietin. However, several analogs of the original recombinant EPO are not easily detectable by standard IEF method, requiring the development of alternatives for the detection of doping. In order to improve the current methods of EPO detection, monoclonal and polyclonal antibodies against EPO were obtained and used in various techniques for detection of EPO in biological samples. However, the specificity of these antibodies has been quite controversial and discussed. Therefore, it is necessary to obtain antibodies capable of reacting specifically with the EPO. In this study, rHuEPO was inoculated in New Zealand rabbits to generate a polyclonal antibody (pAb anti-rHuEPO). The pAb was characterized for its potential in detecting rHuEPO using different approaches. The pAb anti- rHuEPO identified the expression of recombinant protein in eukaryotic cells and was able to detect rHuEPO in a suspension at 0.1 μg/mL, showing its potential as a tool for detection of doping by rHuEPO. / A história da competição esportiva sempre esteve relacionada à utilização de metodologias de treinamento físico associadas a métodos de incremento fisiológico do atleta, visando sua máxima performance. Questões éticas envolvendo o esporte de alto rendimento e o doping se confundem com a própria história do esporte competitivo. A Agência Mundial Anti-Doping (WADA) proíbe o uso de substâncias ou métodos capazes de aumentar artificialmente o desempenho esportivo. Atualmente, 258 substâncias estão na lista da WADA e atletas do mundo inteiro são submetidos a testes comprobatórios da não utilização do doping. Entre essas substâncias ilícitas para uso por atletas destaca-se a eritropoetina (EPO). A EPO é um hormônio glicoproteico que possui como principal efeito fisiológico a indução da eritropoiese e consequente melhoria da capacidade de transporte de oxigênio no sangue. A diferenciação analítica da eritropoetina endógena produzida a partir de sua contraparte recombinante usando focalização isoelétrica e duplo blotting é um marco na detecção do doping com eritropoetina recombinante. Anticorpos monoclonais e policlonais específicos anti-EPO foram obtidos e utilizados em várias técnicas para a detecção da EPO em amostras biológicas a fim de melhorar os métodos atuais de detecção. Contudo, a especificidade destes anticorpos tem sido bastante controversa e discutida. Portanto, a obtenção de anticorpos específicos capazes de reagir especificamente com a EPO faz-se necessária. Neste estudo, a rHuEPO foi utilizada para imunizar coelhos New Zealand para gerar um anticorpo policlonal (pAb anti-rHuEPO). O pAb foi caracterizado quanto ao seu potencial na detecção da rHuEPO usando diferentes metodologias. O pAb anti-rHuEPO identificou a expressão da proteína recombinante em células eucarióticas e foi capaz de detectar rHuEPO em suspensão até 0,1 μg/mL, comprovando seu potencial como ferramenta para detecção do doping por rHuEPO.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_katia_leston_bacelo.pdf: 1389207 bytes, checksum: b5ad0bea30c73a3ecb9d5b196b2a8b64 (MD5) Previous issue date: 2013-12-10 / A major challenge for the development of vaccines based on purified or recombinant protein subunits, and synthetic peptides resides in the fact that these are poorly immunogenic and mobilize insufficient immunoprotective response. Adjuvants are often used in association with these subunits in order to amplify and direct the immune response induced. Nowadays, there is a wide range of compounds that demonstrate adjuvant activity, however, few are approved for human use, and these often fail to induce appropriate immune response against a particular pathogen. Thus, there is a need to develop new adjuvants that are safe, effective and represent an alternative to currently available. In the present study, we used as a model antigen the non- identical portion of the Leptospira LigA protein (Leptospiral immunoglobulin-like protein A), an outer membrane protein of great interest as a mediator pathogenic mechanisms, used in serological diagnosis and as experimental vaccines. This antigen was formulated with various adjuvants, and the formulations tested for their immunoprotective potential in hamsters, challenged with a virulent strain of L. interrogans serovar Copenhageni. For this, the LigAni protein was produced in recombinant form (rLigAni) using Escherichia coli as the expression system and associated to xanthan polysaccharide, in its variants xanthan pruni strains 106 (X1) and 101 (X2), commercial xanthan and also to oligodinucleotídeo CpG (CpG ODN), carbon nanotubes (CNTs) and aluminum hydroxide (Alhydrogel). Formulations containing rLigAni associated with xanthan polysaccharide and CNTs induced significant IgG antibody titers, comparable to that induced when the protein was associated with Alhydrogel. Protection against lethal challenge was observed in 100%, 100%, 67% and 50% of the hamsters immunized with rLigAni-X1, rLigAni- CpG-X1, rLigAni-Alhydrogel and rLigAni-X2, respectively (Fisher test P < 0.05). The preparations containing rLigAni associated with CNTs, although induced an antibody response, failed to confer immunoprotection. Additionally, xanthan and CNTs adjuvants were not toxic to Chinese hamster ovary (CHO) cells, in vitro. The results of this study indicate xanthan as a new adjuvant for subunit vaccines against leptospirosis, presenting the ability to potentiate the immune response against the antigen, besides biocompatibility and the possibility of reduction of number of doses required for protection. / O maior desafio para o desenvolvimento de vacinas baseadas em subunidades proteicas, recombinantes ou purificadas e peptídeos sintéticos, reside no fato destas serem pouco imunogênicas e mobilizarem uma resposta imunoprotetora insuficiente. Adjuvantes são utilizados associados a estas subunidades com o intuito de amplificar e direcionar a resposta imune induzida. Na atualidade, existe uma grande gama de compostos que demostram ação adjuvante, contudo, poucos são aprovados para uso humano, e estes muitas vezes falham em induzir resposta imune adequada contra determinado agente patogênico. Assim, existe a necessidade do desenvolvimento de novos adjuvantes que sejam seguros, efetivos e representem uma alternativa aos atualmente disponíveis. No presente estudo, utilizamos como antígeno modelo a porção não-idêntica da proteína LigA (Leptospiral immunoglobulin-like protein A) de Leptospira spp., uma proteína de membrana externa de grande interesse como mediadora de mecanismos de patogenicidade, utilizada em sorodiagnóstico e em vacinas experimentais. Esta proteína foi associada a diferentes adjuvantes, e as formulações testadas quanto ao seu potencial imunoprotetor em hamsters desafiados com cepa virulenta de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni. Para isso, a proteína LigAni foi produzida em sua forma recombinante (rLigAni) utilizando Escherichia coli como sistema de expressão e associada ao polissacarídeo xantana, em suas variantes xantana pruni cepas 106 (X1) e 101 (X2), xantana comercial, e também ao oligodinucleotídeo CpG (CpG ODN), nanotubos de carbono (CNTs) e hidróxido de alumínio (Alhydrogel). Formulações contendo rLigAni associada ao polissacarídeo xantana e aos CNTs induziram títulos de anticorpos IgG significativos e comparáveis aos induzidos quando a proteína foi associada ao Alhydrogel. Proteção contra o desafio letal foi observada em 100%, 100%, 67% e 50% dos hamsters imunizados com rLigAni-X1, rLigAni-CpG-X1, rLigAni-Alhydrogel e rLigAni-X2, respectivamente (Fisher test P < 0,05). As preparações contendo rLigAni associada aos CNTs, embora tenham induzido resposta de anticorpos, falharam em conferir imunoproteção. Adicionalmente, os adjuvantes xantana e CNTs não se mostraram tóxicos em células de ovário de hamster Chinês (CHO), in vitro. Os resultados desse estudo apontam a xantana como um novo adjuvante para vacinas de subunidade contra leptospirose, apresentando a propriedade de potencializar a resposta imune contra o antígeno, além de biocompatibilidade e a possibilidade de redução no número de doses requeridas para proteção.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_itaua_leston_araujo.pdf: 980896 bytes, checksum: 4007b4d62827e236b56c4fe512f94f29 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Glycoprotein D (gD) is essential for attachment and penetration of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) into susceptible cells, and is a major target of host immune systems, inducing strong humoral and cellular immune responses. The immunogenicity of recombinant BoHV-5 (rgD5) expressed in Pichia pastoris was evaluated in bovines. Vaccines formulated with 100 μg rgD5 dose and adjuvants (Montanide ISA50V2 or Aluminum Hydroxide) with or without inactivated BoHV-5 or rgD5 without adjuvants were administered intramuscularly. A commercial vaccine was also used as control. The vaccine formulation rgD5 + ISA50V2 stimulated humoral immune responses after two doses, and higher titer of neutralizing antibodies were obtained in all three oil-based adjuvants formulations when compared to Hydroxide Aluminium adjuvant or the commercial vaccine. The vaccine BoHV-5 + rgD5 + ISA50V2 stimulated titers of neutralizing antibodies approximately 8 log2, which demonstrated higher correlations on the Indirect ELISA. Together, the results suggest that the recombinant gD5 conserved neutralizing epitopes and was able to stimulate a efficient humoral immune response in bovines. / A glicoproteína D (gD) é essencial para ligação e penetração de herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) em células suscetíveis, e é um alvo importante do sistema imune do hospedeiro, induzindo respostas imunes humoral e celular. A imunogenicidade da glicoproteína D recombinante de BoHV-5 (rgD5) expressa em Pichia pastoris foi avaliada em bovinos. Vacinas formuladas com 100 μg de rgD5 por dose e adjuvante a base de óleo (Montanide ISA50V2) ou hidróxido de alumínio, com ou sem adição de BoHV-5 inativado foram administradas via intramuscular, e uma vacina comercial utilizada como controle. A vacina rgD5 + ISA50V2 estimulou resposta imune humoral após duas doses, e os mais elevados títulos de anticorpos neutralizantes foram obtidos em todas as três formulações de adjuvantes à base de óleo quando comparado com a formulação de vacinas de adjuvante de hidróxido de alumínio e vacina comercial. A vacina BoHV-5 + rgD5 + ISA50V2 estimulou títulos de anticorpos neutralizantes aproximadamente a 8 log2, demonstrando correlação significativa com o ELISA indireto. Em conjunto, os resultados sugerem que a rgD5 conservou epítopos neutralizantes e foi capaz de estimular uma resposta imune humoral eficiente em bovinos.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_luana_alves_dummer.pdf: 909354 bytes, checksum: d2af8cc0772177718829cf7f15391d43 (MD5) Previous issue date: 2008-06-12 / Outbreaks of fatal meningoencephalitis caused by Bovine Herpesvirus type 5 (BoHV-5) cause important economic losses in national trade of bovine beef. Commercial vaccines developed against Bovine Herpesvirus type 1 can protect cattle of neurological disease caused by BoHV-5. These cross-reactions are due to its genetic and antigenic similarities of both BoHV-1 and 5. However, these vaccines can not prevent latent infection of BoHV-5, even viral spread to healthy animals. This way, new vaccines strategies are based on envelope glycoproteins and are focusing safety, economic viability and on prevention of BoHV-5 latency and spread. This glycoprotein acts in initial steps of viral infection and glycoprotein D has drawn the attention in studies carried out with BoHV-1 and other homologous herpesvirus. The gD acts on viral membrane fusion with permissive cells through glycoproteins and host receptors interactions, so it is essential for viral entry. A vaccine that is capable to stimulate specific humoral and cellular immunity against BoHV-5 must be developed. The aim of this work was the production of a recombinant truncated form of gD of BoHV-5 in yeast Pichia pastoris and its antigenicity and immunogenicity evaluation. Data show that yeast P. pastoris can express the truncated form of BoHV-5 gD to the supernatant due to its secretion of ~190mg/L of recombinant protein, simplifying protein purification. The recombinant protein was successfully recognized by antibodies of animals immunized with BoHV-5, suggesting its antigenicity and immunogenicity and that native protein characteristic are conserved. The data presented herein allow the design of future studies aiming at expression optimization and further immunogenicity evaluation, as well as its capacity to neutralize the virus in biological models and on cattle. / Surtos de meningoencefalites fatais causadas pelo Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5) ocasionam importantes perdas econômicas no comércio nacional de carne bovina. Vacinas comerciais destinadas ao Herpesvírus Bovino tipo 1 são capazes de impedir o aparecimento de sintomatologia clínica do BoHV-5. Estas reações cruzadas se devem a existência de semelhanças genéticas e antigênicas existentes entre ambos os vírus. No entanto, estas vacinas não impedem o estabelecimento da infecção latente e a disseminação do BoHV-5 para animais não imunizados. Desta forma, estratégias que visem à produção de vacinas seguras, economicamente viáveis e que possam ser capazes de impedir a latência do BoHV-5 e sua disseminação estão focadas para glicoproteínas localizadas no envelope viral e que atuam nas etapas iniciais da infecção. Dentre estas, a glicoproteína D tem se destacado em estudos realizados com BoHV-1 e outros herpesvírus homólogos. A gD atua na fusão do envelope viral com a membrana da célula permissiva no hospedeiro através de interações com receptores celulares e com outras glicoproteínas virais, sendo essencial para a entrada do capsídeo na célula. Assim, uma vacina que seja capaz de estimular respostas humorais e celulares contra esta glicoproteína deve ser desenvolvida. Os objetivos deste trabalho foram à produção da forma truncada da gD do BoHV-5 em levedura Pichia pastoris e a avaliação desta quanto a sua antigenicidade e imunogenicidade. Os resultados demonstram que a Pichia pastoris expressou a forma truncada da gD de BoHV-5 secretando para o meio de cultivo ~190mg/L da proteína recombinante, facilitando a purificação da mesma. Testada quanto a sua a sua antigenicidade e imunogenicidade, a proteína recombinante foi reconhecida por anticorpos de animais imunizados com o BoHV-5, sugerindo que características da proteína nativa foram conservadas na proteína recombinante. Os dados apresentados irão permitir o desenvolvimento de estudos 6 futuros com o objetivo de aperfeiçoar a expressão da proteína recombinante e avaliar a sua capacidade de neutralizar o vírus na espécie-alvo.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_carina_moraes.pdf: 479524 bytes, checksum: 9bdbed7287bcee59185e68ac89b72108 (MD5) Previous issue date: 2008-10-13 / Strangles is a contagious disease of the upper respiratory tract of horses caused by Streptococcus equi subsp. equi. Asymptomatic carriers responsible for maintaining the infection in the herd can only be detected by serological or microbiological methods and vaccines used for the control of the disease induce levels of protection generally not exceeding 50%. Considering that S. equi SeM protein is considered the most promising antigen to protect against the disease, this research aimed to produce and evaluate as antigen for vaccines and for ELISA, a recombinant S. equi SeM protein (rSeM). rSeM was produced by cloning and expression in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. To test its immunogenicity isogenic female Balb-c mice 4-6 weeks-old were randomly divided and inoculated with 1 / 20th of the estimated dose of the vaccine for horses by the SC route, on days 0 and 21 of the experiment. One group was vaccinated with 250mL (12 mg mL-1) of rSeM without adjuvant, another with 300mL of vaccine containing 12 mg mL-1 of rSeM plus 20% of aluminiun hydroxide, two other groups were vaccinated with two commercial bacterins against Strangles, other two groups were vaccinated with the same commercial vaccines containing 12 mg mL-1 of rSeM and the remaining group was inoculated with a bacterin produced with a field strain. The control group was inoculated the same dose of sterile saline. Blood samples were collected from the retro-orbital venous plexus on days 0, 21, 42. The antibodies were titrated by ELISA using rSeM as antigen. rSeM was immunogenic for mice with a protection index of 100%. For the standardization of an ELISA, groups of 20 negative, vaccinated and positive animals were used. Using as Cut-off the mean plus two SD of the Optical Densities of the negatives, the test showed 100% sensitivity and specificity. / A Adenite Eqüina é uma enfermidade contagiosa do trato respiratório superior dos eqüídeos causada por Streptococcus equi subesp. equi. Animais portadores assintomáticos responsáveis pela permanência da infecção nos rebanhos só podem ser detectados por métodos microbiológicos ou sorológicos e as vacinas utilizadas no controle da doença induzem níveis de proteção geralmente não superiores a 50 %. Considerando que a proteína SeM de S. equi é o antígeno mais promissor na proteção contra a doença, este trabalho objetivou produzir a proteína SeM recombinante de S. equi, visando sua utilização como antígeno em vacinas e em ELISA. Proteína SeM recombinante (rSeM) foi produzida mediante a clonagem e expressão em Escherichia coli e purificada por cromatografia de afinidade. Para testar sua capacidade imunogênica, vacinas elaboradas com rSeM foram aplicadas a camundongos. Fêmeas Balb/c isogênicas com 4-6 semanas foram divididas aleatoriamente e inoculadas por via SC com 1/20 da dose vacinal estimada para cavalos, nos dias 0 e 21 do experimento. Um grupo foi vacinado com 250 mL (12 mg mL-1) de proteína recombinante sem adjuvante, outro com 300 mL de vacina contendo 12 mg mL-1 rSeM adicionada de 20% de hidróxido de alumínio, outros dois grupos com duas bacterinas comerciais contra Adenite Eqüina; dois grupos com as vacinas comerciais, acrescidas de 12 mg mL-1 de rSeM e o grupo restante com uma bacterina contendo cepas de campo. O grupo controle foi inoculado com o mesmo volume de solução salina estéril. Coletou-se sangue por punção do plexo venoso retro-ocular nos dias 0, 21 e 42. Os anticorpos foram titulados por ELISA utilizando a proteína rSeM como antígeno. A rSeM foi imunogênica em camundongos com índices de proteção de 100%. Para a padronização de um ELISA, utilizaram-se grupos de 20 soros equinos de animais negativos, vacinados e positivos. Utilizando um ponto de corte de média das densidades ópticas dos soros negativos acrescidos de dois desvios padrão, o teste teve 100% de sensibilidade e especificidade.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_lorena_leonardo_souza.pdf: 798251 bytes, checksum: b0213429356f32517eb7b25ac76b2eeb (MD5) Previous issue date: 2009-12-17 / The rabies virus has two major antigens: the nucleoprotein, a conserved internal protein antigenically and genetically and glycoprotein, a protein responsible for the external adsorption of virus two the host cell and induction of neutralizing antibodies. The development of recombinant DNA technology has opened a new perspective on the control of rabies, since recombinant vaccines have residual pathogenicity and are produced with the antigenic proteins of the virus, without their presence. Furthermore, recombinant proteins can be expressed in order to be used in diagnosis. The objective of this study was to review the literature about rabies, cloning and express the nucleoprotein and glycoprotein of rabies virus using the system Pichia pastoris and evaluate the antigenicity and the immunogenicity of these proteins by Dot blotting, SDS page, Western blotting and ELISA. Glycoprotein synthetic antigen proved to be recognized by anti-rabies from animals experimentally infected with rabies virus strain CVS. And recombinant nucleoprotein expression was confirmed by the techniques of Dot blotting and Western blotting to be recognized by monoclonal anti-histidine. Thus, we conclude that the cloning and expression of synthetic glycoprotein and cloinig and expression nucleoprotein rabies virus by the yeast P. pastoris has been effective, which makes these products an alternative for the production of immunobiological. / O vírus da raiva apresenta dois antígenos principais: a nucleoproteína, uma proteína interna conservada antigênica e geneticamente e a glicoproteína, uma proteína externa responsável pela adsorção do vírus à célula hospedeira e pela indução da produção de anticorpos neutralizantes. O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante iniciou uma nova perspectiva no controle da Raiva, já que vacinas recombinantes não têm patogenicidade residual e são produzidas com as proteínas antigênicas do vírus, sem sua presença. Além disso, as proteínas recombinantes podem ser expressas com a finalidade de serem usadas em diagnóstico. O objetivo deste trabalho foi clonar e expressar a glicoproteína e a nucleoproteína do vírus da raiva utilizando o sistema Pichia pastoris e avaliar a antigenicidade e imunogenicidade destas proteínas através do Dot blotting, SDS page, Western blotting, inibição da imunofluorescência e ELISA. A glicoproteína demonstrou ser antigênica ao ser reconhecida por anticorpos anti-rábicos provenientes de animais experimentalmente infectados com o vírus rábico cepa CVS. A nucleoproteína recombinante teve sua expressão confirmada pelas técnicas de Dot blotting e Western blotting ao ser reconhecida por anticorpos monoclonais anti-histidina. Podemos concluir que a levedura P. pastoris é um sistema eficiente para clonagem e expressão da nucleoproteína e glicoproteína do vírus rábico.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-17T14:43:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ImunoreatividadeTgfCaspase.pdf: 1588662 bytes, checksum: 11bae3a9256acce980d29907ea3977c8 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-10-31T15:08:31Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ImunoreatividadeTgfCaspase.pdf: 1588662 bytes, checksum: 11bae3a9256acce980d29907ea3977c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-31T15:08:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ImunoreatividadeTgfCaspase.pdf: 1588662 bytes, checksum: 11bae3a9256acce980d29907ea3977c8 (MD5) Previous issue date: 2007-11-30 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A hanseníase é uma doença infecto-contagiosa crônica que acompanha a humanidade há muitos anos. O Brasil ocupa o segundo lugar em números de casos, sendo que o estado do Pará é o que apresenta o maior número de casos absolutos. Este estudo teve como objetivo avaliar a imunorreatividade para TGF-β e caspase-3 nas formas clínicas virchowiana e tuberculóide do mal de hansen procurando correlacionar o padrão de imunomarcação com o controle tecidual da resposta imune do hospedeiro ao bacilo, através de um estudo de caso controle com 30 pacientes, sendo quinze apresentando na forma virchowiana e quinze com o tipo tuberculóide. Os pacientes seguiram o protocolo de diagnóstico de hanseníase segundo critérios do Ministério da Saúde do Brasil. Observou-se que a forma virchowiana da hanseníase apresentou uma correlação estatisticamente significativa (p=0,4630) entre o TGF-β a caspase-3, evidenciando que tanto a citocina quanto o imunomarcador da apoptose aumentam gradativamente e simultaneamente nesta forma polar e que indiretamente aponta para um papel do TGF-β no controle da resposta imunológica in situ à infecção pelo Mycobacterium leprae. / Leprosy is a chronic infect-contagious disease that accompanies the humanity for many years. Brazil occupies the second place in numbers of cases, and the state of Para is that presents the largest number of absolute cases. This study had as objective to evaluate the immunorreactivity for TGF-β and caspase-3 in the lepromatous and tuberculoid clinical forms of the leprosy evil trying to correlate the immunomarking pattern with the tissue control of the immune response of the host to the bacillus, through a retrospective study of paraffin enclosed tissue of 30 patients, being fifteen presenting in the lepromatous form and fifteen with the tuberculoid type of disease. The patients followed the protocol of leprosy diagnosis according to criteria of Health Ministry of Brazil and histopathologic features. It was observed that the lepromatous form of the leprosy presented a significant statistically correlation (p=0,4630) among TGF-β to caspase-3, evidencing that as the cytokine as the imunomarking of the apoptosis increase inch by inch and simultaneously in this polar form and that indirectly appear to a role of TGF-β in the control of the immunologic response in its place to the infection for the Mycobacterium leprae.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-18T12:59:24Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EstudoFuncaoTimica.pdf: 1549137 bytes, checksum: b42257328d96b7bfbaca2684aaff57e6 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-11-07T12:47:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EstudoFuncaoTimica.pdf: 1549137 bytes, checksum: b42257328d96b7bfbaca2684aaff57e6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-07T12:47:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EstudoFuncaoTimica.pdf: 1549137 bytes, checksum: b42257328d96b7bfbaca2684aaff57e6 (MD5) Previous issue date: 2017 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dos portadores de HTLV-1, 90% permanecem assintomáticos, 2-3% desenvolvem Leucemia Linfoma de Células T do Adulto (LLcTA) e 0,25-4% desenvolvem Paraparesia Espástica Tropical/ Mielopatia Associada ao HTLV (PET/MAH). Na PET/MAH, são encontrados infiltrados de células T CD8+ específicas na medula que destroem as células T CD4+ infectadas, levando a uma resposta imunológica ativada crônica. As células T recém-emigradas do timo (ou células T naïve) possuem círculos excisados pelo rearranjo do gene do receptor de células T (TREC) que não duplicam na proliferação celular, sendo um bom indicador para quantificar o número de células T naïve e assim avaliar a função tímica. O presente estudo almejou Verificar a função tímica de pacientes portadores da infecção pelo vírus HTLV-1 através da quantificação do número de TREC em células mononucleares do sangue periférico. Trata-se de um estudo transversal analítico, realizado com 39 pacientes, acima de 18 anos, divididos em dois grupos: com PET/MAH (PET) e sem PET/MAH (NPET). Foi realizada avaliação clínica e fisioterapêutica, coleta de sangue, separação das células linfomononucleares, extração de DNA e RNA, curva absoluta de TREC, quantificação de DNA e RNA, detecção e quantificação de partículas TREC, síntese de cDNA, expressão gênica da citocina IL-7 e análise estatística com os testes de Mann-Whitney e correlação de Spearman, com o valor de p ≤ 0,05 como nível de significância. Dos 39 pacientes estudados, dois foram excluídos do estudo por apresentarem doença autoimune. Quanto à comparação entre grupos da quantificação de TREC: há diferença entre o grupo PET e NPET (p = 0,01), nos pacientes com idade ≤59 anos entre os grupos PET e NPET (p = 0,04), nas pacientes do sexo feminino entre o grupo PET e NPET (p = 0,003) e o grupo com cadeira de rodas e sem cadeira de rodas (p = 0,05). Já com relação à comparação da expressão gênica de IL-7 entre grupos: no grupo NPET há diferença entre o grupo ≤59 anos e o ≥60 anos (p = 0,02), no sexo feminino há diferença entre o grupo PET e NPET (p = 0,04). A função tímica mostrou-se prejudicada em pacientes portadores de HTLV-1 com PET/MAH comparados àqueles sem PET/MAH, pois houve um prejuízo na produção de células T naïve nessa população, mostrada através das diferenças entre variáveis tanto no grupo PET e NPET com relação à quantificação de TREC. Apesar de ainda não estar clara a importância deste comprometimento no desencadeamento e/ou evolução da PET/MAH, infere-se que a redução da produção de células T naïve pode alterar a resposta imunológica nesses pacientes, repercutindo diretamente no quadro clínico dos mesmos. / In HTLV-1 infeccions 90% of carriers remain asymptomatic, 2-3% develop Adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL) and 0.25-4% develop HTLV-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). In HAM/TSP, specific CD8 + T cell infiltrates are found in the marrow that destroy infected CD4 + T cells, leading to a chronic activated immune response. Recently emigrated T cells (or naïve T cells) have excised circles by the rearrangement of T cell receptor (TREC) genes that do not double in cell proliferation, being a good indicator to quantify the number of naïve T cells and thus evaluate the thymic function. This study aimed to verify the thymic function of patients with HTLV-1 infection by quantifying the number of TREC in peripheral blood mononuclear cells. This is a cross-sectional, analytical study of 39 patients over 18 years of age, divided into two groups: HAM/TSP (PET) and without HAM/TSP (NPET). We performed a clinical and physiotherapeutic evaluation, blood collection, lymphomononuclear cell separation, DNA and RNA extraction, absolute TREC curve, DNA and RNA quantification, TREC particle detection and quantification, cDNA synthesis, cytokine IL-7 and statistical analysis with the Mann-Whitney tests and Spearman's correlation, with p ≤ 0.05 as significance level. Of the 39 patients studied, two were excluded from the study because they presented autoimmune disease. Regarding the comparison between groups of TREC quantification: there was a difference between the PET and NPET groups (p = 0.01), in patients with age ≤59 years between the PET and NPET groups (p = 0.04), in the (p = 0.003) and the group with a wheelchair and without a wheelchair (p = 0.05). As for the comparison of IL-7 gene expression between groups: in the NPET group there was a difference between the group ≤59 years and the ≥60 years (p = 0.02), in the female there was a difference between the PET and NPET groups (p = 0.04). Thymic function was impaired in patients with HTLV-1 with HAM/TSP compared to those without HAM/TSP, as there was a loss in naïve T cell production in this population, shown by the differences between variables in both PET and NPET groups With respect to the quantification of TREC. Although the importance of this compromise in the triggering and / or evolution of HAM/TSP is not yet clear, it is inferred that the reduction of naïve T cell production can alter the immunological response in these patients, directly affecting their clinical picture.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-18T13:08:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PolarizacaoRespostaMacrofagos.pdf: 4956070 bytes, checksum: dfbd8d87407fefda3b4ce020c4b6ec2f (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-11-07T16:22:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PolarizacaoRespostaMacrofagos.pdf: 4956070 bytes, checksum: dfbd8d87407fefda3b4ce020c4b6ec2f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-07T16:22:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PolarizacaoRespostaMacrofagos.pdf: 4956070 bytes, checksum: dfbd8d87407fefda3b4ce020c4b6ec2f (MD5) Previous issue date: 2016 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A hanseníase é uma doença espectral na qual o bacilo provoca alteração no ambiente tecidual e modificações no curso da resposta imunológica no espectro da doença. Os macrófagos são uma das principais células que participam da resposta contra o M. leprae sofrendo processo de diferenciação, modificando seu comportamento e polarizando a resposta entre a via clássica composta pelos macrófagos M1 que produzem mediadores pró-inflamatórios e a via alternativa conhecida como via reparadora tendo como representante os macrófagos M2 e seus subtipos que produzem citocinas anti-inflamatórias. Na doença de hansen, pouco são os estudos que abordaram os caminhos da polarização no espectro da doença. Neste contexto, no intuito de compreender melhor o comportamento da célula nas formas polares da doença, o presente estudo investigou os caminhos da polarização de resposta dos macrófagos e suas possíveis implicações na doença de hansen. Ao todo, foram utilizados 33 blocos com fragmentos de lesão de pele de pacientes com diagnóstico confirmado para a doença segundo os critérios de Ridley e Jopling. Na distribuição dos casos, 17 fizeram parte do grupo tuberculóide e 16 do grupo virchowiano. Para a investigação dos marcadores, CD68, CD163, Arginase 1, iNOS, STAT3, FGF b, TGF-β e das citocinas, IL-10, IL-13, IL-22 em lesões de pele, o método imunoistoquímico foi utilizado. De acordo com os dados obtidos, os resultados mostraram diferença estatística significante dentre os grupos estudados sendo que a expressão de CD68, CD163, enzimas, fatores de crescimento, STAT3 e de citocinas foram maiores na forma virchowiana quando comparadas a tuberculóide. Nas análises de correlação, foi observado a existência de sinergismo de reposta entre as citocinas anti-inflamatórias, fatores de crescimento, CD163 e arginase 1 na forma virchowiana da doença. No contexto da reposta da iNOS, no pólo suscetível da doença, o estudo sinaliza para uma nova abordagem envolvendo o comportamento da iNOS, STAT3 e IL-22 sendo que nesta nova relação, na doença de hansen, foi observada a correlação positiva estatisticamente significante entre os marcadores na forma virchowiana. Dessa forma, o presente estudo conclui que os marcadores que compõe a resposta dos macrófagos M1 e M2, surgem como alternativa para o maior entendimento da resposta imunológica inata, nas formas polares da doença reforçando o papel das citocinas, enzimas e receptores na resposta microbicida, de reparo e de supressão na forma virchowiana da doença. / Leprosy is a disease that causes changes in the tissue and in the course of the immune response. Macrophages are one of the main cells which participating in the response against M. leprae. These cells undergo a differentiation process, modifying their behavior and polarizing the response between the classical pathway, composed of M1 macrophages that produce pro-inflammatory mediators and the alternative pathway known as restorative pathway having as representative M2 macrophages and their subtypes that produce anti-inflammatory cytokines. In Hansen's disease, there are few studies that discuss the ways of polarization in the spectrum of the disease. In order to understand the behavior of the cell in the polar form soft he disease, this study investigated the ways of macrophage response polarization and its possible implications for Hansen's disease. We used 33 blocks with skin fragments of patients with confirmed diagnosis for the disease according to the Ridley and Jopling criteria. The distribution of cases: 17 were tuberculoid and 16 lepromatous. The immunohistochemical method was used for the investigation of the markers CD68, CD163, arginase 1, iNOS, STAT3, FGF b, TGF-β and cytokines, IL-10, IL-13, IL-22 in skin lesions. The results showed a statistically significant difference among the groups and the expression of CD68, CD163, enzymes, growth factors, cytokines and STAT3 were higher in lepromatous forms when compared tuberculoid form. In the correlation analysis, it was observed the synergism between the response of anti-inflammatory cytokines, growth factors, arginase 1 and CD163 in lepromatous form. In the context of iNOS response in susceptible pole of the disease, the study points to a new approach involving iNOS, STAT3 and IL-22 behavior and this new relationship in Hansen's disease, a statistically significant positive correlation was observed between the markers in the lepromatous form. This study concludes: the markers that compose the response of M1 and M2 macrophages are an alternative for a better understanding of innate immune response, in polar forms of the disease increasing the role of cytokines, enzymes, and receptors in the microbicidal response, repair and suppression in the lepromatous form of the disease.