Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas / Acinetobacter baumannii emergiu como um dos patógenos hospitalares mais importantes em UTIs nos últimos anos devido principalmente a sua maior resistência aos antimicrobianos. Os fatores de risco associados a PAV por A. baumannii variam de acordo com a unidade e há controvérsias sobre sua virulência e mortalidade atribuída. O objetivo deste estudo foi avaliar os fatores de risco e a mortalidade hospitalar no prazo de 30 dias em pacientes com PAV por A. baumannii bem como diferenças quanto a essa mortalidade hospitalar e o uso de terapêutica adequada ou inadequada em pacientes com PAV por A. baumannii multirresistente versus não-multirresistente. Um estudo de pacientes com PAV por A. baumannii (casos) versus pacientes em uso de ventilação mecânica sem PAV (controles) quanto aos fatores de risco e evolução, foi realizado na UTI de adultos, mista, do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia no período de 09/2008 a 08/2009. O hospital de Clínicas é de ensino e assistência terciária e sua UTI tem 15 leitos. O diagnóstico de PAV foi por critérios clínicos, radiológicos e microbiológicos com contagem &#8805;106 UFC/mL. A identificação das amostras foi feito com o Kit BD BBL Crystal Nonenteric e o antibiograma por difusão de disco seguindo as orientações do CLSI. Os resultados foram submetidos a análise univariada e multivariada e a investigação foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa da UFU. As PAVs foram usualmente tardias (90,0%), com A. baumannii como o segundo agente etiológico mais frequente (25,7%) seguindo a Pseudomonas aeruginosa (32,5%). Os fatores de riscos significantes associados à infecções por este microrganismo na análise univariada foram: gênero masculino (p= 0,0144; OR= 4,814), diagnóstico clínico na admissão (p= 0,0129. OR=0,239), diagnóstico cirúrgico na admissão (p= 0,0321, OR= 4.607) ventilação mecânica &#8805; 7 dias (p= 0,0315, OR= 5,939), tempo de internação na UTI &#8805; 20 dias (p=0,0002, OR= 9,578), uso prévio de antibióticos (p=0,0006, OR=6,333) e uso prévio de carbapenêmicos (p< 0,0001, OR=10,250), persistindo como fatores independentes na análise multivariada uso prévio de carbapenêmicos (p=0,0249, OR= 6,280) e tempo de internação na UTI &#8805; 20 dias (p=0,0148, OR= 7,427). A. baumannii foi responsável por cerca de um quarto das PAVs, com o uso prévio de carbapenêmicos e internação na UTI &#8805; 20 dias comportandose como fatores de risco independentes. Embora a mortalidade hospitalar nas PAVs por este microrganismo não fosse diferente do grupo controle, elas foram causadas na sua maioria (87,5%) por amostras multiresistentes em pacientes em uso de terapêutica antibiótica empírica incorreta (87,5%).

Breast cancer is the most common malignancy among women and represents a serious health problem around the world. Despite of the progression in cancer research, there is a few biomarker validated to be used in clinical routine. Thus, this work aimed to investigate the levels of four serum proteins related with the mostly earlier events of breast cancer. For this purpose, serum levels of EGFR1, HER-2, TSP-1 and RANKL were investigated in twenty-eight patients with breast cancer in the early and advanced stage by ELISA method. Nineteen volunteers with no breast cancer were included in this study as controls. The results showed that serum EGFR1 (sEGFR1) levels decrease with disease progression. The mean sEGFR1 concentration in control group was 61.7 ng/mL, 38.0 ng/mL in initial breast cancer and 34.2 ng/mL in metastatic breast cancer. The best cutoff value was 46.85 ng/mL, it was able to distinguish volunteers and breast cancer patients with 75% sensitivity, and 94.7% specificity. Regarding sHER-2, its levels were found to increase with disease progression. Serum HER-2 (sHER-2) median in control group was 5.13 ng/mL, and in initial breast, and metastatic breast cancer women the mean was 5.99 ng/mL and 6.18 ng/mL, respectively. A cutoff value of 5.38 ng/mL of HER-2 was able to distinguish healthy and breast cancer individuals with 81.5% of sensitivity and 78.9% of specificity. Regarding TSP-1, women with metastatic breast cancer had significantly lower levels than control group and initial breast cancer. Besides although initial patients tend to have a higher concentration than control group, no statistical difference was observed. Concerning serum RANKL no differences was observed between the groups. In conclusion, our results bring evidence that sEGFR1 and sHER-2 should be investigated in a large clinical trial in an attempt to validate these proteins as potentials biomarkers for earlier detection of breast cancer. / O câncer de mama é a neoplasia maligna mais comum entre as mulheres e representa um sério problema de saúde pública em todo o mundo. Apesar dos avanços em pesquisas na área de cancerologia, há poucos biomarcadores validados para uso na rotina clínica. Assim, este trabalho teve como objetivo investigar os níveis de quatro proteínas do soro relacionadas com os eventos em sua maioria anteriores do câncer de mama. Para este efeito, os níveis séricos de EGFR1, HER-2, TSP-1 e RANKL foram investigados em vinte e oito pacientes com câncer de mama em estádio inicial e avançado, pelo método de ELISA. Dezenove voluntárias sem câncer de mama foram incluídas neste estudo como grupo controle. Os resultados mostraram que os níveis séricos de EGFR1 (sEGFR1) diminui com a progressão da doença. A concentração média de sEGFR1 no grupo controle foi de 61,7 ng/mL, 38,0 ng/mL no câncer de mama inicial e 34,2 ng/mL no câncer de mama metastático. O melhor valor de cutoff foi 46,85 ng/mL, com sensibilidade de 75% e 94,7% de especificidade para distinguir entre pacientes com câncer de mama e grupo controle. Com relação ao sHER-2, as concentrações foram encontradas para aumentar com a progressão da doença. A concentração mediana de sHER-2 no grupo de controle foi de 5,13 ng/mL, e em pacientes com a neoplasia em sua fase inicial e com câncer de mama metastático a mediana foi de 5,99 ng/mL e 6,18 ng/mL, respectivamente. Um valor de cutoff de 5,38 ng/mL de HER-2 foi capaz de distinguir indivíduos saudáveis e de câncer de mama, com 81,5% de sensibilidade e 78,9% de especificidade. Quanto à sTSP-1, mulheres com câncer de mama metastático têm níveis mais baixos do que o grupo controle e pacientes com câncer inicial. Além disso, embora as pacientes iniciais tendessem a ter uma concentração mais elevada do que o grupo controle, não houve diferença estatística. Quanto ao sRANKL nenhuma diferença foi observada entre os grupos. Por último, os nossos resultados trazem evidências de que os níveis de sEGFR1 e sHER-2 devem ser investigados em ensaios clínicos com tamanho amostral significativo na tentativa de se validar estas proteínas como potenciais biomarcadores para a detecção precoce do câncer de mama. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

CHAPTER I: Leishmania spp are obligate intracellular protozoan that can cause a complex of known infectious diseases such as leishmaniasis, affecting millions of people worldwide. The host-pathogen interaction involves the parasite surface molecules and cellular receptors that culminate in phagocytosis. This internalization process involves changes in cytoskeleton through interaction with proteins related to actin polymerization, as AFAP, Arp 2/3 complex, Galectin-3, Septins and WASp, as well as activation and signaling pathways. It is known that L. amazonensis promastigotes after entry into phagocytes are present in phagosomes, and these vesicles undergo a maturation process, forming phagolysosome, important for differentiation of the promastigote forms to amastigotes. This study aimed to understand which proteins related to actin cytoskeleton exert role in the process of invasion and multiplication of L. amazonensis and which signaling pathways are involved in the formation of phagolysosome, the invasion and multiplication of this protozoan process the host cell. For this, we did invasion and multiplication assays with macrophages C57 BL/6 and BALB/c peritoneal treated or not with cytochalasin D, invasion assay with macrophages C57 BL/6 previously fixed in formaldehyde (0.01%), assay with macrophages C57 BL/6 knockdown for AFAP-1L1, Arp2, Galectin-3, Septin 4, 14 and WASP proteins compared to wild type cells. And yet, assays phagolysosome kinetics of formation and proliferation and invasion assays using inhibitors of Akt, ERK2, MEK1, MEK1/2, mTOR, PI3K and Ras signaling pathways. The results show that L. amazonensis invaded cells defective in actin polymerization, as well as fixed cells as well as decreased expression of Arp2, Galectin-3 and WASp proteins increased internalization of these parasites. The signaling pathways MEK1/2, ERK2 and AKT delayed the recruitment of the lysosomes to phagosome, and inhibition of PI3K, MEK1/2 and ERK2 pathways drastically decreased internalization of the parasite in the cells. We concluded that L. amazonensis were able to actively invade phagocytic cells, and that the Arp2, Galectin-3 and WASp proteins are involved in the process of entry into host cells. In addition, the MEK1/2, AKT and ERK2 signaling pathways are involved in the formation of phagolysosome as well as PI3K, MEK1/2 and ERK2 pathways seem to favor infection with L. amazonensis. CHAPTER II: The flagellate protozoan Trypanosoma cruzi is the causative agent for Chagas disease. It is estimated that there are eight million people infected worldwide. T. cruzi has different surface proteins related to cell invasion. In this context, our research group identified in T. cruzi, a protein of 21 kDa (P21) showed that pro-phagocytic and chemotactic activities, playing an important role in the internalization of this parasite in vitro. This study aimed to evaluate the role of recombinant protein P21-His6 based on native P21 of T. cruzi in Leishmania amazonensis in order to seek greater understanding of the mechanism of action of this protein and its relationship with the host in vivo. To this end, the footpad infect BALB/c mouse treated with 40&#956;g of active and denatured recombinant P21, BSA and PBS for 6 weeks and assess the footpad size, parasitic load (real time PCR) and cytokine production of IL-1&#946; in the paws, the popliteal lymph nodes and spleen. The results showed an increase in the footpad area, as well as increased parasite load in the infected and treated animals with P21-His6. Also, increased production of IL-&#946; in the footpad and the popliteal lymph nodes also in animals treated with P21-His6. We conclude that the P21 protein plays a role in pro-phagocytic also in vivo experiments, favoring infection. / CAPÍTULO I: Leishmania spp são protozoários intracelulares obrigatórios, que podem causar um complexo de doenças infecciosas conhecidas como leishmanioses, que afetam milhões de pessoas mundialmente. A interação entre patógeno-hospedeiro envolve moléculas de superfície do parasito e receptores celulares que culminam na fagocitose. Este processo de internalização envolve modificações no citoesqueleto celular por meio da interação com proteínas relacionadas à polimerização de actina, como AFAP, Complexo Arp2/3, Galectina-3, Septinas e WASp, bem como a ativação de vias de sinalização. Sabe-se que formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis após a entrada nos fagócitos, estão presentes em fagossomos, e essas vesículas sofrem um processo de maturação, formando o fagolisossomo importante para a diferenciação da forma promastigota em amastigota. Este trabalho teve como objetivo, entender quais proteínas relacionadas ao citoesqueleto de actina exercem papel no processo de invasão e na multiplicação de L. amazonensis, bem como, quais vias de sinalização estão envolvidas no processo de formação do fagolisossomo, na invasão e na multiplicação deste protozoário na célula hospedeira. Para isso, fizemos ensaios de invasão e multiplicação em macrófagos imortalizados C57 BL/6 e peritoneais de BALB/c tratados ou não com citocalasina D, ensaio de invasão em macrófagos C57 BL/6 previamente fixadas em formaldeído, ensaio com macrófagos C57 BL/6 knockdown para as proteínas AFAP-1L1, Arp2, Galectina-3, Septina 4 e 14 e WASp, comparando com células Wild Type. E ainda, ensaios de cinética de formação do fagolissomo e ensaios de invasão e multiplicação utilizando inibidores das vias de sinalização envolvendo Akt, ERK2, MEK1, MEK1/2, mTOR, PI3K e Ras foram realizados. Os resultados mostram que L. amazonensis invadiu células deficientes na polimerização de actina, e também células fixadas, bem como a diminuição da expressão das proteínas Arp2, Galectina-3 e WASp aumentaram a internalização desses parasitos. As vias de sinalização MEK1/2, ERK2, AKT atrasaram o recrutamento de lisossomos para o fagossomo, e a inibição das vias PI3K, MEK1/2 e ERK2 diminuíram drasticamente a internalização do parasito nas células. Concluímos que L. amazonensis foi capaz de invadir ativamente células fagocíticas, e que as proteínas Arp2, Galectina-3 e WASp estão envolvidas no processo de entrada na células hospedeira. Além disso, as vias de sinalização MEK1/2, ERK2 e AKT estão envolvidas na formação do fagolisossomo, bem como as vias PI3K, MEK1/2 e ERK2 parecem favorecer a infecção por L. amazonensis. CAPÍTULO II: O protozoário flagelado Trypanosoma cruzi é o causador da Doença de Chagas. Estima-se a existência de 8 milhões de pessoas infectadas em todo o mundo. T. cruzi apresenta diferentes proteínas de superfície relacionadas ao processo de invasão celular. Nesse contexto, nosso grupo de pesquisa identificou em T. cruzi, uma proteína de 21 kDa (P21) que apresentou atividades pro-fagocíticas e quimiotáticas, exercendo papel importante na internalização desse protozoário in vitro. O presente trabalho teve como finalidade avaliar o papel da proteína recombinante P21-His6 baseada na P21 nativa de T. cruzi na infecção por Leishmania amazonensis, a fim de buscar maior entendimento no mecanismo de ação dessa proteína e sua relação com o hospedeiro in vivo. Para isso, infectamos as patas de animais BALB/c e tratamos os animais com 40&#956;g de P21 recombinante ativa e desnaturada, PBS e BSA por 6 semanas e avaliamos o tamanho da pata, a carga parasitária (PCR em tempo real) e a produção da citocina IL-1&#946; nas patas, linfonodos do poplíteo e baços. Os resultados mostraram aumento na área da pata, bem como aumento da carga parasitária nos animais infectados e tratados com a P21-His6. E ainda, aumento da produção da citocina Il-1&#946; na pata e no linfonodo do poplíteo também nos animais tratados com a P21-His6 também foram observados. Concluímos que a proteína P21 exerce papel pro-fagocítico também em experimentos in vivo, favorecendo a infecção. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-13T14:14:46Z No. of bitstreams: 1 michellealvesvicentini.pdf: 761505 bytes, checksum: 2f59d68ce4001875ae7881a93f5e4930 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-22T12:56:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 michellealvesvicentini.pdf: 761505 bytes, checksum: 2f59d68ce4001875ae7881a93f5e4930 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-22T12:56:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 michellealvesvicentini.pdf: 761505 bytes, checksum: 2f59d68ce4001875ae7881a93f5e4930 (MD5) Previous issue date: 2008-03-05 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / As parasitoses intestinais representam um importante problema médico-sanitário, tendo em vista o grande número de pessoas acometidas e as inúmeras alterações orgânicas que podem provocar no hospedeiro. Infecções provocadas por Strongyloides venezuelensis apresentam uma resposta imune local tanto nos pulmões quanto no intestino, predominantemente do tipo Th2, caracterizada pela produção das citocinas IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10, resultando em eosinofilia, aumento da produção de muco, mastocitose e altas concentrações de IgE. Por outro lado, infecções provocadas por micobactérias estimulam uma imunidade predominantemente do tipo Th1 caracterizada pela produção de IFN-, IL-12, TNF- e óxido nítrico. A tuberculose, causada pelo patógeno intracelular Mycobacterium tuberculosis, é uma das doenças infecciosas mais importantes, sendo responsável por aproximadamente 2,9 milhões de óbitos e 8 milhões de novos casos por ano. Ainda são escassos os trabalhos envolvendo co-infecções, e devido às complexas relações existentes entre parasitos e entre eles e seu hospedeiro, faz-se necessário observações criteriosas. No presente trabalho avaliou-se o efeito modulatório que o Mycobacterium bovis virulento exerce sobre a resposta imune de camundongos co-infectados com S. venezuelensis. Os resultados demonstraram que o perfil de resposta imune durante a infecção por S. venezuelensis parece ser diretamente influenciado pela presença do M. bovis, uma vez que o perfil de resposta Th2, específico ao verme, esteve diminuído nos animais co-infectados. Tal diminuição pôde ser constatada pelo aumento do número de ovos e vermes nos animais co-infectados quando comparado com os animais infectados somente com S. venezuelensis; assim como a diminuição dos níveis de IgE específica à larva L3 do verme detectada em diferentes pontos da infecção; diminuição dos níveis de IL-10 produzida por células de baço estimuladas in vitro com antígeno da larva L3 do verme; diminuição dos níveis de IL-4, IL-5 e IL-13 no intestino; diminuição da expressão de CD80, CD86 e CD25 em células de baço e linfonodo e aumento da expressão de CD28 em células de linfonodos mesentéricos. Em conjunto, esses resultados sugerem que a infecção por M. bovis, e a conseqüente ativação do perfil de resposta imune do tipo Th1, foi capaz de modular o desenvolvimento do perfil de resposta imune do tipo Th2 contra S. venezuelensis nos animais co-infectados, deixando-os mais susceptíveis à infecção com S. venezuelensis. Esse trabalho é o primeiro a avaliar os mecanismos imunoregulatórios envolvidos na co-infecção S. venezuelensis versus M. bovis. / The intestinal parasites are a major medical-health problem, in view of the large number of people involved and the numerous organizational changes which may result in the host. Infections caused by Strongyloides venezuelensis have a local immune response in both lungs as in the intestine, predominantly from the Th2 type, characterized by the production of cytokines IL-4, IL-5, IL-13 and IL-10, resulting in eosinophilia, increased production of mucus, mastocytosis and high levels of IgE. In addition, infections caused by mycobacteria stimulate predominantly an Th1-type immune response characterized by the production of IFN-, IL-12, TNF- and nitric oxide. Tuberculosis, caused by intracellular pathogen Mycobacterium tuberculosis, is one of the most important infectious diseases, accounting for approximately 2.9 million deaths and 8 million new cases per year. Are still scarce papers involving co-infections, and because of the complex relationship between parasites and between them and their host, it is necessary criterious evaluations. This study evaluated the modulatory effect that the virulent Mycobacterium bovis has on the immune response of mice co-infected with S. venezuelensis. The results showed that the profile of immune response during infection with S. venezuelensis seems to be directly influenced by the presence of M. bovis, because the profile of Th2 response, specific to the worm, was reduced in co-infected animals. This decline could be observed by increasing the number of eggs and worms in animals co-infected when compared with animals infected only with S. venezuelensis, as well as decreased levels of IgE specific to the L3 larvae of the worm detected at different points of infection, decreased levels of IL-10 produced by spleen cells stimulated in vitro with L3 larvae antigen; decreased levels of IL-4, IL-5 and IL-13 in the intestine, reducing the expression of CD80, CD86 and CD25 cells in the spleen and lymph nodes and increased expression of CD28 cells in mesenteric lymph nodes. Together, these results suggest that infection with M. bovis, and the consequent activation of the profile of Th1-type immune response, was able to modulate the development of the profile of Th2 type of immune response against S. venezuelensis in co-infected animals, leaving them more susceptible to infection with S. venezuelensis. This work is the first to evaluate the mechanisms involved in imunoregulatory mechanisms involved in co-infection S. venezuelensis versus M. bovis.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-12-15T13:04:14Z No. of bitstreams: 1 marinamarquespardini.pdf: 1130678 bytes, checksum: 6b0cced1c7d41de2488ba773203968cd (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-12-15T14:16:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marinamarquespardini.pdf: 1130678 bytes, checksum: 6b0cced1c7d41de2488ba773203968cd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-15T14:16:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marinamarquespardini.pdf: 1130678 bytes, checksum: 6b0cced1c7d41de2488ba773203968cd (MD5) Previous issue date: 2008-06-05 / As infestações por carrapatos em bovinos reduzem a produtividade do gado de corte e leiteiro causando grandes perdas econômicas à pecuária. Os prejuízos acarretam desde debilidade física e transmissão de doenças ao rebanho, como anaplasmose e babesiose, até a morte dos indivíduos mais vulneráveis. Os carrapatos permanecem por longos períodos fixados em seus hospedeiros sendo expostos ao sistema de defesa do bovino, o que provoca inflamação e ativa elementos da resposta imune humoral e celular do hospedeiro. Em contrapartida, componentes imunogênicos da glândula salivar do carrapato modulam a resposta bovina para perfis de citocinas favoráveis à hematofagia. Existem poucos estudos sobre mecanismos imunes que guiam a interação parasito-hospedeiro e determinam o sucesso ou não do parasitismo. Trabalhos recentes apontam para importância de fatores genéticos relacionados à resistência ao carrapato em determinadas raças bovinas, além de estudos que mostram o papel crítico das citocinas na prevenção e progressão de quadros patológicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar a resposta imunológica de bovinos infestados artificialmente pelo carrapato Boophilus microplus através de ensaios de proliferação celular e detecção de óxido nítrico (NO) e interferon-gama (IFN-) em células mononucleares do sangue periférico a fim de verificar diferentes níveis de resistência bovina. Seis bovinos mais resistentes e seis mais susceptíveis de uma população F2 de 332 animais, originária do cruzamento de F1 (½ Holandês : ½ Gir), foram selecionados com base na contagem de carrapatos e valor genético. Amostras de sangue foram coletadas nos pontos 0, 5º e 12º dias pós-infestação para cultura de células e estimulação in vitro com antígenos do B. microplus. A proliferação celular e os níveis de NO e IFN- foram avaliados respectivamente pelos métodos de MTT, Griess e ELISA. As células dos animais resistentes (R) tenderam ao aumento de proliferação no 5º dia quando estimuladas com antígenos do carrapato retornando aos níveis iniciais no 12° dia. Já nos animais susceptíveis (S), a estimulação pareceu inibir a proliferação das células no dia 0 e não alterou os índices do 5° e 12° dia. Apesar disso, não houve diferença significativa na proliferação celular entre os grupos R e S. Quando as células obtidas no dia 0 foram cultivadas na ausência de estímulo, os níveis de NO dos animais R tenderam a ser mais altos que dos animais S. A estimulação com antígenos de carrapato pareceu inibir a produção de NO no 5º dia por células de animais R. Também não houve diferença significativa nas produções de NO e de IFN- entre os grupos R e S. Os resultados sugerem que o NO possa ter um papel no início da resposta imune que delineia o mecanismo de resistência ao carrapato, uma vez que as alterações mais importantes foram detectadas até o 5º dia após a infestação. É possível que o mecanismo de resistência esteja associado à regulação negativa da resposta imune a fim de não incitar a modulação desta pelo carrapato, porém sendo eficaz o suficiente para eliminá-lo. A avaliação da resposta imunológica nos primeiros momentos após a fixação do carrapato no couro bovino, bem como um acompanhamento mais detalhado dos pontos temporais da infestação poderia fornecer dados mais conclusivos. / Tick infestations in cattle reduce its beef and dairy productivity causing great economic losses to livestock. The potential damages are physical weakness, transmission of diseases to the herd, as anaplasmosis and babesiosis, and even vulnerable animals deaths. Thus, the tick control has been considered priority in tropical regions worldwide. The ticks remain fixed to their hosts for long periods being exposed to the cattle defense system; it causes inflammation and activates the host’s humoral and cellular immune response. Nevertheless, immunogenic components of the salivary gland of cattle tick modulate the response to profiles of cytokines that promote the blood-feeding. There are few studies approaching immune mechanisms that lead to host-parasite interaction and determine the success or unsuccessful of parasitism. Recent works suggest the importance of genetic factors related to the resistance to ticks in Bos taurus and Bos indicus breeds. In addition, studies show the critical role of cytokines in the prevention and progression of diseases. The aimed of this work was to evaluate the immune response in cattle artificially infested by Boophilus microplus through cell proliferation assays and detection of nitric oxide (NO) and interferon-gamma (IFN-) in peripheral blood mononuclear cells, in order to establish different resistance levels in Girolando breed. Six tick-resistant and six tick-susceptible animals from a F2 population of 332 animals originated from crossing cattle F1 (½ Holstein : ½ Gir) were selected based on the ticks counting and breeding value. Blood samples were collected for cell culture and stimulation in vitro with antigens of B. microplus in the points 0, 5 and 12 days after infestation. The cell proliferation and the NO and IFN- levels were evaluated by MTT, Griess and ELISA, respectively. There was a tendency of increasing proliferation of resistant animals (R) cells in the 5th day when they were stimulated with the tick antigens, returning to initial levels at 12th day. In the other hand, for the susceptible animals (S) the stimulation seemed to inhibit proliferation of cells in day 0, and did not altered the rates of 5th and 12th day. There was no significant difference between the cell proliferation of the groups R and S. When the cells obtained in the day 0 were cultured in the absence of stimulation, the levels of NO of animals R tended to be higher than that of the animals S. The stimulation with tick antigens inhibited the NO production by cells of animals R in the 5th day. In addition, there was no significant difference in NO and IFN- production between the groups R and S. The results suggest that NO may play a role in the early immune response that outlines the mechanism of resistance to ticks, since the most important changes were detected until the 5th day after the infestation. It is possible that the resistance mechanism is associated to the downregulation of immune response in order not to encourage the modulation by the ticks, although being effective enough to eliminate it. An evaluation of the immune response in the first moments after the tick fixation to cattle leather, as well as a more detailed monitoring of the temporal points of the infestation, could provide more conclusive data.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-15T10:47:06Z No. of bitstreams: 1 julianaalvesresende.pdf: 4187528 bytes, checksum: 3a29cc184829c26eb33ffecc869ae841 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T12:21:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 julianaalvesresende.pdf: 4187528 bytes, checksum: 3a29cc184829c26eb33ffecc869ae841 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T12:21:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 julianaalvesresende.pdf: 4187528 bytes, checksum: 3a29cc184829c26eb33ffecc869ae841 (MD5) Previous issue date: 2013-12-16 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Digestão anaeróbia é uma alternativa sustentável para utilização de dejetos animais como insumo energético. Neste contexto, a dinâmica da comunidade microbiana, inativação de patógenos ou mesmo disseminação de genes de resistência durante o processo de biodigestão se torna relevante. Este trabalho avaliou a diversidade taxonômica (domínios Bacteria e Archaea) e a persistência de grupos bacterianos de relevância e resistência a drogas antimicrobianas, em dois biodigestores contínuos de escala piloto operados a temperatura ambiente em duas estações, verão e inverno. O substrato era composto de fezes bovinas frescas diluídas com água de lavagem dos pisos (sólidos totais de 2 a 3%). Amostras do biogás foram coletadas para determinação dos teores de metano. Para análises físico-químicas dos afluentes (carregamento inicial) e efluentes, alíquotas foram coletadas ao longo de 60 dias de fermentação para análises de sólidos totais, voláteis e pH. Análises das comunidades microbianas foram realizadas por PCR quantitativo (qPCR), PCR-single strand conformation polymorphism (SSCP) e análise metagenômica. A densidade de diferentes grupos bacterianos foi realizada por contagem direta. Linhagens bacterianas foram identificadas bioquimicamente utilizando kits comerciais. A susceptibilidade a drogas foi determinada por diluição em ágar. Quantificação de genes que codificam resistência aos macrolídeos (ermB), aminoglicosídeos (aphA2) e beta-lactâmicos (blaTEM-1) foram observadas por qPCR. A taxonomia de bactérias clinicamente relevantes foi ainda avaliada, por similaridade, a partir de um banco de dados criado com 30 sequências de DNA codificadoras para o 16S rRNA de bactérias potencialmente patogênicas. Independente da estação, o processo de biodigestão apresentou desempenho semelhante, com taxas de rendimento médio e teores de metano, 59,2% no verão e 53,7% no inverno. A dinâmica e os valores médios do número de cópias do gene V3 Bacteria e Archaea também foram semelhantes. Ocorreram alterações na composição (filo e famílias) das comunidades microbianas entre as estações e estas mudanças não influenciaram na produção de metano. Provavelmente, ocorreu uma redundância de grupos capazes de realizar funções similares. Foram verificadas reduções significativas de grupos bacterianos de relevância clínico-microbiológica viáveis em ambas as estações. Apesar disso, bactérias multirresistentes foram detectadas tanto nos afluentes como nos efluentes. Cocos Gram-positivos (CGP), o grupo mais prevalente, foi resistente à penicilina e levofloxacino, enquanto resistência à ampicilina, ampicilina-sulbactam e cloranfenicol foi observado com maior frequência entre os bacilos Gram-negativos da família Enterobacteriaceae (ENT) e não fermentadores (BGN NF). Enterococcus spp. foram os CGP isolados com maior frequência e entre os BGN, Escherichia coli foi o mais abundante. Houve redução no número de cópias de todos os genes de resistência (ermB, aphA2 e blaTEM-1) durante o processo de biodigestão, porém mantidos níveis preocupantes nos efluentes. Taxonomia bacteriana avaliada por similaridade das sequências mostrou Clostridium spp., Acinetobacter e Strenotrophomonas como as bactérias mais identificadas. Apesar dos dados apresentados nesse estudo endossarem a digestão anaeróbia como solução importante para reciclagem e produção de energia, levanta preocupações sobre riscos de caráter sanitários durante o processo. Além disso, discussões a respeito do uso de antimicrobianos na pecuária leiteira são necessárias. / Anaerobic digestion is a sustainable alternative to using animal waste as an energy source. In this context, the dynamics of the microbial community, inactivation of pathogens or even spread of resistance genes during the process of digestion becomes relevant. This study evaluated the taxonomic diversity (Bacteria and Archaea domains) and the persistence of bacterial groups of relevance and resistance to antimicrobial drugs, analyzing two continuous pilot scale digesters operated at ambient temperature in two seasons, summer and winter. The substrate was composed fresh cow dung diluted with water for washing floors (total solids 2 to 3%). Biogas samples were collected to determine the levels of methane. For physico-chemical analysis of influent (initial load) and effluent, aliquots were collected during 60 days of fermentation for analyzes of total volatile solids and pH. Analyzes of microbial communities were performed by quantitative PCR (qPCR), PCR-single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis and metagenomics. The density of different bacterial groups was performed by direct counting. Bacterial strains were identified biochemically using commercial kits. The drug susceptibility was determined by the agar dilution method. Quantification of genes encoding resistance to macrolides (ermB), aminoglycosides (aphA2) and beta-lactams (blaTEM-1) were observed by qPCR. The taxonomy of clinically relevant bacteria was further evaluated by similarity from a database created with 30 DNA sequences coding for 16S rRNA of potentially pathogenic bacteria. Independent of season, the process of digestion showed similar performance, with rates average yield and percent methane, 59.2% in summer and 53.7% in winter. The dynamics and the average values of the number of copies of the gene V3 Bacteria and Archaea were also similar. Changes occurred in the composition (phylum and families) of the microbial communities between seasons and these changes did not influence the production of methane. Probably occurred a redundancy group able to perform similar functions. Significant reductions of bacterial groups of clinical and microbiological relevance viable in both seasons were observed. Despite this, multiresistant bacteria were detected in both the affluents and effluents. Gram-positive cocci (GPC), the most prevalent group was resistant to penicillin and levofloxacin, while ampicillin, ampicillin-sulbactam, chloramphenicol was observed more frequently among Gram-negative rods of the Enterobacteriaceae family (ENT) and not fermenters (NF GNR). Enterococcus spp. were most frequently GPC isolated and among the GNR, Escherichia coli was the most abundant. There was reduction in the number of copies of all the resistance genes (ermB, aphA2 and blaTEM-1) during the process of digestion, however, the effluent still showing concerning levels. Bacterial taxonomy evaluated by similarity of the sequences showed Clostridium spp., Acinetobacter and Strenotrophomonas were the bacteria more identified. In spite the data presented in this study showed anaerobic digestion as an important solution to recycling and energy production, raises concerns about health risks of character during the process. In addition, discussions regarding the use of antimicrobials in dairy farming are needed.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dis Bruna D de S Silva 2010.pdf: 942780 bytes, checksum: 696823192ee17b463193f279bf7aed38 (MD5) Previous issue date: 2010-11-19 / Tuberculosis (TB) is a disease that afflicts mankind catastrophically, causing millions of new cases and deaths worldwide. It is estimated that one third of the world population is infected with the TB bacillus, Mycobacterium tuberculosis. Currently, the major challenges in TB control are the iden-tification of latent individuals, who are have increased chances to become ill, and the effective treat-ment of individuals with active disease. Understanding the immunology of this disease is of crucial importance for the development of new diagnostic tests and vaccines to combat this disease effec-tively. In order to elucidate the cellular immune response in tuberculosis, we evaluated the subpopu-lations of TCD4+ Th1, Th17 and T regulatory cells of patients with active pulmonary tuberculosis and rheumatoid arthritis against the recombinant antigen GLcB of M. tuberculosis. Peripheral blood mononuclear cells were obtained from twenty one patients with active pulmonary tuberculosis, re-cruited at Anuar Auad Hospital, twenty five patients with rheumatoid arthritis (RA), eleven individu-als with latent tuberculosis (TST+) and twelve healthy subjects (TST-). These cells were cultured, stimulated with antigen recombinant GLcB and Th1, Th17 and T regulatory subsets cells were eva-luated by flow cytometry. It was found that patients with active pulmonary tuberculosis have a high-er response of Th1 (8.2&#61617;1.9), Th17 (3.92.1) and T regulatory (2.81.2) antigen-specific recombi-nant GLcB when compared with individuals with latent infection (Th17=2.81.3; Treg=3.11.2) and healthy controls (Th17=1.40.8; Treg=0.60.3). Individuals with latent infection have only a signifi-cant percentage of Th1 cells specific (4.61.1) to GLcB when compared to controls (1.71.0). RA Patients that developed tuberculosis had immune response similar to those with only TB. Given these results, we conclude that the Th1 cells, Th17 and regulatory T cells are directly involved in active disease. / A Tuberculose (TB) é uma doença que atinge a humanidade de forma catastrófica, causando milhões de casos novos e de mortes no mundo todo. Estima-se que um terço da população mundial esteja infectada com o bacilo da TB, Mycobacterium tuberculosis. Atualmente, os principais desafios no controle da TB são: a identificação dos indivíduos latentes, que são os principais indivíduos com potencial desenvolvimento da doença e o tratamento efetivo dos indivíduos com doença ativa. O entendimento da resposta imunológica nessa doença é de crucial importância para o desenvolvimen-to de novos testes diagnósticos e novas vacinas para combater de forma efetiva essa enfermidade. Com o intuito de elucidar a resposta imune celular envolvida no desenvolvimento da tuberculose ativa, avaliamos as subpopulações de células TCD4+ Th1, Th17 e T reguladoras de pacientes com tuberculose pulmonar e pacientes com artrite reumatóide ativa frente ao antígeno recombinante GLcB do M. tuberculosis. Foram obtidas células mononucleares do sangue periférico de vinte e um pacientes com tuberculose pulmonar ativa, recrutados no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Au-ad, vinte e cinco pacientes com artrite reumatóide, onze indivíduos com tuberculose latente (PT+) e doze indivíduos saudáveis (PT-). Estas células foram cultivadas, estimuladas com o antígeno recom-binante GLcB e as subpopulações Th1, Th17 e T reguladoras foram avaliadas através da análise das citocinas IFN-&#61543;, IL-17 e TGF-&#61538; e IL-10, respectivamente, por citometria de fluxo. Constatou-se que pacientes com tuberculose pulmonar ativa apresentam maior resposta de células Th1 (8.2&#61617;1.9), Th17 (3.92.1) e T reguladoras (2.81.2) específicas ao antígeno recombinante GLcB quando comparados com indivíduos com infecção latente (Th17=2.81.3; Treg=3.11.2), e controles saudáveis (Th17=1.40.8; Treg=0.60.3). Indivíduos com infecção latente apresentam somente porcentagem significativa de células Th1 (4.61.1) específicas ao GLcB quando comparado aos controles (1.71.0). Pacientes com AR não apresentaram diferença significativa na porcentagem destas células quanto à classificação em PT+ e PT-. Porém, pacientes com AR que desenvolveram tuberculose a-presentaram resposta semelhante aos pacientes com TB. Diante destes resultados, podemos concluir que as células Th1, Th17 e T reguladoras estão diretamente envolvidas na doença ativa.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-03-24T11:22:47Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tatiana Marlene Galvez Sánchez - 2017.pdf: 3124839 bytes, checksum: 942aa6d4fa9aa30babb4eb0d7e04a805 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-24T12:39:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tatiana Marlene Galvez Sánchez - 2017.pdf: 3124839 bytes, checksum: 942aa6d4fa9aa30babb4eb0d7e04a805 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-24T12:39:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tatiana Marlene Galvez Sánchez - 2017.pdf: 3124839 bytes, checksum: 942aa6d4fa9aa30babb4eb0d7e04a805 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Outro / Tuberculin skin test (TST) identifies a previous exposed to M. tuberculosis (Mtb) using an intradermal inoculation of purified protein derivates (PPD) that result in a delayed hypersensitivity reaction (DTH). Interferon-gamma release assay (IGRA) was suggested to replace TST. The IGRA uses antigens, ESAT-6 and CFP-10, absent in all BCG strains and some non tuberculous mycobacteria (NTM). However, reproducibility and high cost were limitations for endemic countries. For this reason, the development of new diagnose test for latent TB is necessary. Fusion proteins developed by our group has been recognized by the immune response generated by the infection with Mycobacterium tuberculosis. Thus the aim of this work was to evaluate the capacity of CMX or ECMX to be used in a Skin test for tuberculosis. BALB/c mice infected with Mtb were euthanized forty-five days after infection. Spleens, lungs and draining lymph nodes of infected mice were processed and evaluated by flow cytometry Both CD4 and CD8 IFN+ cells were able to recognize rCMX and rECMX. The skin test followed an evaluation of thickness/swelling ≥ PPD 2UT (positive control) to consider positive DTH. Based on thickness, at 24 h, rCMX 25μg (0.37±0.02) and rECMX 15-25μg (0.38±0.03/0,62±0,12) induced a positive DTH response. At 48h, rCMX 25μg (0.28±0.03) and rECMX 25μg (0.5±0.04) induced also a positive DTH reaction. In conclusion, fusion proteins rCMX and rECMX are recognized by infected mice with Mtb and skin test using rECMX 25μg induced better DTH response that of conventional PPD. / A prova tuberculínica (PT) é um teste cutâneo que identifica a exposição prévia ao M. tuberculosis (Mtb), mediante a inoculação via intradérmica do derivado protéico purificado (PPD) de Mtb, o que resulta em uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH). O ensaio de liberação de IFN-γ (IGRA) foi indicado para substituir a PT. O IGRA usa os antígenos ausentes na BCG e algumas micobactérias não causadoras de TB (MNT), ESAT-6 e CFP-10. Porém, apresenta falta de reprodutibilidade e alto custo quando usado em populações endêmicas para TB. Diante disso, o desenvolvimento de novos testes de diagnóstico é necessário. Nosso grupo desenvolveu proteínas de fusão que são reconhecidas por linfócitos gerados pela infecção com Mtb. Assim, o trabalho propõe avaliar a utilização das proteínas rCMX e rECMX no desenvolvimento de um teste cutâneo de diagnóstico para tuberculose. Camundongos BALB/c foram infectados com Mtb H37Rv. Após 45 dias, a infecção induziu linfócitos T CD4+ e CD8+ produtores de IFN-γ específicos para rCMX e rECMX no baço, pulmões e linfonodos drenantes. Enquanto ao teste cutâneo realizado 45 dias após a infecção, a leitura de espessura/inchaço ≥ PPD 2UT (controle positivo) indicou uma reação de DTH positiva. Avaliando a espessura 24h após o inóculo, rCMX 25μg (0.37±0.02) e rECMX 15-25μg (0.38±0.03/0,62±0,12) induziram reação de DTH positiva. As 48h, rCMX 25μg (0.28±0.03) e rECMX 25μg (0.5±0.04) também apresentaram reação positiva. Enquanto o inchaço as 24h, só a rECMX apresentou DTH positiva. Em conclusão, este trabalho mostra que as proteínas rCMX e rECMX são reconhecidas pela resposta celular de camundongos infectados com Mtb, e quando usadas no teste cutâneo induziram reação de DTH positiva comparável e até superior ao PPD convencional. Dessa forma, é recomendada a avaliação das proteínas de fusão em outros modelos animais e posteriormente em humanos.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-03T11:38:10Z No. of bitstreams: 1 flaviamarciadecastroesilva.pdf: 2659537 bytes, checksum: 1c8331ace53624c1553f76ae25681622 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-03T15:37:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 flaviamarciadecastroesilva.pdf: 2659537 bytes, checksum: 1c8331ace53624c1553f76ae25681622 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-03T15:37:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 flaviamarciadecastroesilva.pdf: 2659537 bytes, checksum: 1c8331ace53624c1553f76ae25681622 (MD5) Previous issue date: 2015-04-10 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A asma e a obesidade são doenças inflamatórias crônicas de perfis imunológicos opostos. Contudo, estudos clínicos e epidemiológicos demonstram uma associação entre as duas patologias, através da observação de que indivíduos obesos asmáticos representam um fenótipo clínico distinto da asma alérgica clássica, apresentando aumento na gravidade dos sintomas e resistência a terapias convencionais. Entretanto, os mecanismos imunológicos envolvidos na associação obesidade e asma não estão esclarecidos, devido à escassez de estudos e a uma heterogeneidade nos dados encontrados em modelos experimentais. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da obesidade sobre a inflamação alérgica pulmonar. Para isso, a obesidade foi induzida por dieta com alto teor de gordura durante dez semanas nos animais dos grupos OB e OB/AP, enquanto os animais dos grupos CN e AP foram alimentados com a dieta padrão. Da sexta a décima semana do protocolo de indução da obesidade, os animais dos grupos AP e OB/AP foram submetidos a subsequentes sensibilizações e desafios com a ovalbumina. As análises foram realizadas em 24 e 48 horas após o último desafio com a OVA. Os resultados demonstraram que após os desafios com o alérgeno, os animais do grupo AP apresentaram características marcantes da resposta imune alérgica, com elevado número de eosinófilos no LBA, no tecido pulmonar e na medula óssea, correlacionando com os níveis elevados de CCL11 e peroxidase eosinofílica, além de citocinas de eperfil Th2 como IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-25, IL-33 e TSLP e de IgE sérica anti-OVA. Contudo, foi observado em 48 horas um declíneo na resposta de perfil Th2 nos animais deste grupo. Já os animais do grupo OB/AP apresentaram em 24 horas, um menor número de eosinófilos no lavado broncoalveolar, no tecido pulmonar e na medula óssea, associado a menores níveis de CCL11, EPO e de IL-4, IL-5, TSLP e IL-25 assim como de IgE sérica anti-OVA. Em 48 horas, as análises de citocinas no grupo OB/AP demonstraram um aumento nos níveis de IL-1β, IL-4, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17A, TNF-α e IFN- associado ao maior influxo de macrófagos M1. Surpreendentemente, em 48 horas após o último desafio com a OVA, houve um aumento significativo de neutrófilos na medula óssea e de mieloperoxidase no tecido pulmonar. Paralelamente, os animais do grupo OB/AP, apresentaram um número maior de mastócitos e células caliciformes em ambos os tempos analisados, quando comparado aos animais do grupo AP. Conclusão: Somados estes resultados sugerem que a obesidade desenvolvida em camundongos BALB/c, foi capaz de influenciar a resposta imune no pulmão dos animais após as sensibilizações e os desafios com alérgeno, interferindo no desenvolvimento da resposta imune Th2 clássica e acarretando um atraso no desenvolvimento da resposta imune inflamatória. Adicionalmente, os animais obesos asmáticos apresentaram exacerbada resposta imune Th2, Th9 e altos níveis de IL-17A associada a um maior influxo de neutrófilos para o pulmão e a uma intensa produção de muco, sugerindo que estes animais apresentaram um perfil inflamatório mais grave de alergia pulmonar. / Asthma and obesity are chronic inflammatory diseases with opposite immune profiles. Although, clinical and epidemiological studies reveal the association between them, as obese asthmatic individuals represent a distinct phenotype from the classic allergic asthma. However, the immune mechanisms involved in this association are not established yet, due to the lack of studies and the heterogeneity of the data obtained in experimental models. Therefore, the present study aimed to evaluate the influence of obesity over the immune response pulmonary allergic. Female Balb/c mice were fed with high fat diet during ten weeks so as to induce obesity. From the sixth to the tenth week of the protocol, PA and PA/OB groups were sensitized and challenged with ovalbumin. The following analyses were performed 24 and 48 hours after the last OVA challenge. Striking features of the allergic immune response were observed in the PA group, as elevated eosinophil count in BAL, lung tissue bone marrow, in association with high IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-25, IL-33, TSLP and anti-OVA IgE levels. There was also elevated production of CCL11 and EPO correlated with the eosinophilia. In contrast, IL-4, IL-5, TSLP and IL-25 levels were diminished in PA/OB group. In association with the reduced eosinophil count, low levels of CCL11, EPO and Anti-OVA IgE were detected. However, 48 hours after the last challenge, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17A, TNF-α and IFN- level were higher in the PA/OB, the was also an increased M1 macrophage influx. There was also more neutrophils in the bone marrow and MPO in the lung tissue, indicating their increased influx to the lung of PA/OB animals. Mast cells and goblet cells count was increased in this group, 24 and 48 hours after the last challenge. Taken together these results suggest that obesity developed in BALB/c mice was able to influence the immune response in the lungs of animals after sensitization and challenge with allergen, interfering with the immune response classical Th2 and causing a delay in the development inflammatory immune response. Additionally, asthmatic obese animals showed exaggerated Th2 immune response, Th9 and high IL-17A levels associated with an increased influx of neutrophils into the lung and an intense mucus production, suggesting that these animals showed an allergy more severe inflammatory profile lung.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-11T13:29:19Z No. of bitstreams: 1 micheliaantoniadonascimentogusmao.pdf: 2029497 bytes, checksum: 4ab5e6f5d64e0b6010c2ea583d1ed036 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-20T18:43:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 micheliaantoniadonascimentogusmao.pdf: 2029497 bytes, checksum: 4ab5e6f5d64e0b6010c2ea583d1ed036 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T18:43:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 micheliaantoniadonascimentogusmao.pdf: 2029497 bytes, checksum: 4ab5e6f5d64e0b6010c2ea583d1ed036 (MD5) Previous issue date: 2013-03-06 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A esquistossomose é uma doença que acomete cerca de 200 milhões de pessoas no mundo causando grande morbidade. Devido à falta de vacina para essa doença, muitos antígenos são pesquisados. Um domínio antigênico B (r156-195) da ATPDase 2 de Schistosoma mansoni foi previamente descrito, e dois peptídeos sintéticos (SmB1LJ, r155-176; SmB2LJ, r175-194) derivados deste domínio foram obtidos com o objetivo de avaliar a imunogenicidade dessa proteía. O inóculo de cada peptídeo em camundongos BALB/c induziu atividade imunoestimulatória significativa, elevando os níveis de anticorpos IgG1 e IgG2, como detectado por ELISA. Os anticorpos policlonais anti-SmB1LJ e anti-SmB2LJ, quando imobilizados em Proteína A-Sepharose, imunoprecipitaram aproximadamente 42-96% da atividade ADPásica da preparação de verme adulto. Por “Western blots” do complexo imunoprecipitado, três bandas de 76, 63 e 55 kDa foram identificadas pelos dois soros imunes, confirmando a identidade da ATPDase 2, e sugerindo que esta proteína está sujeita a vários processamentos pós-tradução, tais como glicosilação e proteólise, resultando finalmente em uma proteína secretada de 55 kDa. Adicionalmente, anticorpos policlonais anti-SmB2LJ inibiram 62% e 37% das atividades ATPásica e ADPásica, respectivamente, enquanto anticorpos policlonais anti-SmB1LJ inibiram ADPase (92%), mas não atividade ATPásica, sugerindo que o domínio B da ATPDase 2 do S. mansoni está envolvido na regulação catalítica da enzima, sendo um novo alvo para o desenho de inibidores. Imunomarcação com anticorpos policlonais anti-SmB2LJ de cortes de fígado de camundongo infectado revelaram reações positivas na superfície externa do miracídio no ovo de S. mansoni. Fluorescência intensa foi detectada na região entre o miracídio e o lado interno da casca do ovo, localizada no envelope de von Lichtenberg, a qual é uma região de produção de componentes imunogênicos. Fluorescência foi também detectada no lado de fora da casca do ovo, aprisionada pelos microespinhos de superfície, confirmando que esta proteína, como no verme adulto, é também secretada de ovos de S. mansoni. Nenhuma reatividade foi observada nos tecidos granulomatosos circundantes. Amostras de plasmas de camundongos Swiss infectados com S. mansoni foram testadas por ELISA usando SmB1LJ or SmB2LJ como antígeno. Reatividade significativamente maior de anticorpos IgG, IgG1 ou IgG2a foi detectada com SmB1LJ, enquanto somente anticorpo IgG1 foi altamente reativo com SmB2LJ. A reatividade de amostras de plasma (diluídas 1:200) de camundongos Swiss previamente inoculados com apirase de batata ou r-potDomínio B, um polipeptídio com cauda de hexahistidina derivado do domínio B (r78-117) da apirase de batata, e homólogo ao domínio B da ATPDase 2, foi também testada por ELISA usando os peptídeos como antígenos. Anticorpos policlonais IgG e IgG1 anti-apirase de batata reagiram significativamente com SmB1LJ, enquanto somente IgG1 reagiu com SmB2LJ. Anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B não reagiram significativamente com SmB2LJ. Comparado aos controles, amostras de plasma (diluídas 1:200) destes animais pré-imunizados com apirase de batata ou r-potDomínio B e desafiados com S. mansoni não reagem significativamente com os peptídeos. Os resultados confirmaram que o domínio B da ATPDase 2 está potencialmente envolvido na resposta imune do hospedeiro, e os peptídeos SmB1LJ e SmB2LJ podem ser usados em estudos da esquistossomose. / Schistosomiasis is a disease that affects approximately 200 million people worldwide causing great morbidity. Due to lack of vaccine for this disease, many antigens are searched. An antigenic domain B (r156-195) from the Schistosoma mansoni ATPDase 2 isoform was previously described, and two synthetic peptides (SmB1LJ, r155-176; SmB2LJ, r175-194) belonging to this domain were obtained. Inoculation of each peptide in healthy BALB/c mice induced significant immunostimulatory activity, increasing the IgG1 and IgG2a antibody levels, as detected by ELISA. The polyclonal anti-SmB1LJ and anti-SmB2LJ antibodies, when immobilized on Protein A-Sepharose, immunoprecipitated approximately 42-96% of the ADPase activity from the adult worm preparation. By Western blots of immunoprecipitated complex, three bands of 76, 63 and 55 kDa were identified by the two immune sera, confirming the ATPDase 2 identity, and suggesting that this protein is subject to several posttranslational processing, such as glycosylation and proteolysis, resulting finally in a secreted protein of 55 kDa. Additionally, polyclonal anti-SmB2LJ antibodies inhibited 62% and 37% of the ATPase and ADPase activities, respectively, whereas polyclonal anti-SmB1LJ antibodies inhibited ADPase (92%), but not ATPase activity, suggesting that the domain B from the S. mansoni ATPDase 2 is involved in enzyme catalytic regulation, being a new target for inhibitor design. Immunolabelled cryostat sections of infected mouse liver by the anti-SmB2LJ polyclonal antibodies revealed positive reactions on the external surface from the miracidium in the S. mansoni egg. Intense fluorescence was detected in the region between the miracidium and the inner side of the egg-shell, located in von Lichtenberg’s envelope, which is a region of production of immunogenic components. Fluorescence was also detected in the outer side of the egg-shell and entrapped by the surface microspines, confirming that this protein, like in the adult worm, is also secreted from the S. mansoni eggs. No reactivity was observed in the surrounding granumomatous tissues, which are rich en inflammatory cells. Serum samples from S. mansoni-infected Swiss mice were tested by ELISA using SmB1LJ or SmB2LJ as coating antigen. Significantly higher IgG, IgG1 or IgG2a antibody reactivity was detected against SmB1LJ, whereas only IgG1 antibody was highly reactive against SmB2LJ. The reactivity of plasma samples (diluted 1:200) from Swiss mice previously inoculated with potato apyrase or r-potDomain B, a 6xHis tag polypeptide belonging to the domain B (r78-117) from the potato apyrase, homologue to the domain B from the ATPDase 2, was also tested by ELISA using the peptides as coating antigens. Polyclonal IgG and IgG1 anti-potato apyrase antibodies significantly reacted with SmB1LJ, whereas only IgG1 reacted with SmB2LJ. Polyclonal anti-r-potDomain B antibodies did not significantly react with SmB2LJ. Compared to controls, plasma samples (diluted 1:200) from these animals pre-immunized with potato apyrase or r-potDomain B and challenged with S. mansoni did not react significantly with peptides. The results confirmed that the domain B from the ATPDase 2 is potentially involved in the host immune response, and peptides SmB1LJ and SmB2LJ can be used in schistosomiasis studies.