Contrôle de la signalisation oncogénique du mutant L858R de l'EGFR par la protéine suppresseur de tumeur p14ARF dans les adénocarcinomes pulmonaires. Le récepteur à l'EGF (EGFR) est un oncogène puissant impliqué dans le développement des cancers du poumon. Dans ces cancers, la présence de mutations activatrices de l'EGFR (majoritairement L858R et Del19) est un facteur prédictif de réponse aux agents pharmacologiques qui ciblent spécifiquement ce récepteur (EGFR-TKI). Cependant, l'association entre réponse thérapeutique et mutation est plus complexe que prévue, soulignant la nécessité d'approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans développement de ces cancers. Nous avons précédemment montré que la quasi-totalité des tumeurs pulmonaires avec des mutations activatrices de l'EGFR présente une expression faible ou indétectable de la protéine suppressive de tumeur p14ARF. Ces résultats nous ont conduites à émettre l'hypothèse que l'expression de p14ARF était un frein essentiel à l'expansion clonale de ces cellules. Nous décrivons pour la première fois une relation fonctionnelle entre p14ARF et du mutant L858R de l'EGFR dans laquelle p14ARF inhibe la croissance de cellules exprimant ce mutant en induisant leur apoptose. Les effets suppresseurs de tumeur de p14ARF impliquent une fonction pro-apoptotique originale de STAT3 qui conduit à l'inhibition de l'expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. De plus, nous montrons que les cellules EGFR-L858R maintiennent leur avantage de croissance en inhibant l'expression de p14ARF et la signalisation pro-apoptotique STAT3/Bcl-2 qui en découle. Nos résultats identifient également p14ARF comme une nouvelle cible transcriptionnelle de STAT3, mettant ainsi en évidence une boucle de rétrocontrôle positif entre ces deux protéines qui pourrait entretenir la signalisation pro-apoptotique médiée par STAT3. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que la réactivation de la voie p14ARF/STAT3/Bcl-2 pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique dans le traitement de ces cancers. / Control of EGFR-L858R oncogenic signaling pathway by the p14ARF tumor suppressor in lung adenocarcinoma. The EGF receptor (EGFR) is a strong oncogene involved in lung carcinogenesis. In these cancers, sensitivity to inhibitors of the EGFR tyrosine kinase activity (EGFR-TKI) has been shown to be related to the presence of activating mutations in the TK domain of EGFR (mainly L858R and Del19). However, the association between mutations and responsiveness to EGFR-TKI based treatment is more complex than previously envisioned, underlying the pressing need to study thoroughly the molecular mechanisms of lung cancer growth. We previously showed that almost all lung cancer with EGFR activated mutations has very low or undetectable levels of the p14ARF tumor suppressor protein. These results led us to postulate that expression of p14ARF is an efficient break against clonal proliferation of these cells. We report for the first time a relationship between p14ARF and mutant EGFR-L858R in which p14ARF inhibits the growth of EGFR-L858R expressing cells by inducing apoptosis. The p14ARF tumor suppressor effects involve an original STAT3 pro-apoptotic function that drives the inhibition of the anti-apoptotic Bcl-2 protein. Moreover, we show that the EGFR-L858R mutant maintains their survival and proliferation characteristics by inhibiting p14ARF expression and consequently the STAT3/Bcl-2 pro-apoptotic pathway. Our results also identify p14ARF as a new transcriptional target of STAT3, therefore providing evidence of a positive feed-back loop that could maintain STAT3 pro-apoptotic pathway. Based on these data, we suggest that manipulation of this pathway could be a therapeutic strategy for lung cancer treatment.

Cette thèse porte sur la prise en compte des incertitudes et du mouvement dans le traitement des tumeurs pulmonaires en radiothérapie, que ce soit par photons, par protons ou par ions légers (hadronthérapie). L’accent est mis sur les méthodes de prise en compte du mouvement dites "passives". Ces méthodes, ne nécessitant pas d’asservissement respiratoire pour la délivrance de la dose, sont moins lourdes à mettre en place, et limitent l’introduction de nouvelles sources d’incertitudes. Des contributions cliniques et méthodologiques sont proposées. Tout d’abord, l’imagerie tomodensitométrique (TDM) pour la planification des traitements doit faire l’objet d’une attention particulière dans le cas de tumeurs soumises aux mouvements respiratoires. Nous avons évalué l’influence de la présence d’artéfacts de mouvements dans les images TDM sur la qualité de la planification. Nous avons également proposé des méthodologies et des recommandations pour l’optimisation des paramètres d’acquisition ainsi qu’un algorithme original de détection automatique des artéfacts dans les images TDM 4D. L’une des principales sources d’incertitudes lors de la planification de traitements en radiothérapie concerne la délinéation des volumes cibles. Nous avons évalué la variabilité inter-observateur de délinéation du volume cible macroscopique (GTV) et du volume cible interne (ITV) via une méthode originale permettant de l’intégrer dans le calcul des marges de sécurité. La réduction des incertitudes dues au mouvement respiratoire peut être réalisée en associant au système de contention une compression abdominale afin de limiter l’amplitude du mouvement respiratoire. Nous avons proposé une étude visant à évaluer l’impact de l’utilisation d’un tel système en fonction de la localisation dans le poumon. En radiothérapie par photons, une stratégie appelée mid-position consiste à irradier la tumeur dans sa position moyenne pondérée dans le temps et permet de réduire les marges par rapport à une stratégie ITV tout en conservant une couverture dosimétrique correcte. Une partie du travail de la thèse a consisté à participer à l’élaboration d’une étude clinique visant à comparer les deux stratégies, ITV et mid-position. Dans la plupart des cas, le mouvement respiratoire a une distribution de probabilité non-gaussienne et asymétrique, pouvant invalider la recette de calcul de marges de van Herk pour des mouvements tumoraux fortement asymétriques et de grande amplitude. Nous avons proposé un modèle numérique afin de prendre en compte cette asymétrie. Enfin, la prise en compte du mouvement respiratoire en hadronthérapie par des marges de sécurité doit faire l’objet de considérations spécifiques, en particulier en raison de la sensibilité du dépôt de dose aux variations de densité sur la trajectoire du faisceau. Dans une dernière partie, la définition des marges de sécurité pour prendre en compte le mouvement respiratoire de manière optimale est discutée. / This PhD thesis focuses on the uncertainties and motion management in lung radiation therapy and particle therapy. Passive motion management techniques are considered. They consist in delivering the dose without any respiratory beam monitoring which may be difficult to set up or may introduce additional uncertainties. Clinical and methodological contributions about different treatment steps are proposed. First of all, computed tomography (CT) images for treatment planning must be carefully acquired in the presence of respiration-induced tumor motion. We assessed the impact of motion artifacts on the quality of treatment planning. We also proposed methodologies and recommendations about the optimization of 4D-CT acquisition parameters and an original method for automated motion artifact detection in 4D-CT images. Target delineation introduces one of the main source of uncertainties during radiation therapy treatment planning. We quantified inter-observer variations in the delineation of the gross tumor volume (GTV) and the internal target volume (ITV) using an original method in order to incorporate them in margin calculation. Reduction of motion uncertainties can be achieved by combining an abdominal pressure device with the immobilization system to reduce the amplitude of respiratory motion. We proposed a study to evaluate the usefulness of such a device according to the tumor location within the lung. Delivering the dose to the ITV implies an important exposure of healthy tissues along the tumor trajectory. An alternative strategy consists in irradiating the tumor in its time-averaged mean position, the mid-position. Margins are reduced compared with an ITV-based strategy while maintaining a correct tumor coverage. One part of the work consisted in participating in the implementation of a clinical trial in photon radiation therapy to compare the two strategies, ITV and mid-position. In the margin recipe proposed by van Herk, a Gaussian distribution of all combined errors is assumed. In most cases, respiratory motion has an asymmetric non-Gaussian distribution and the assumption may not be valid for strongly asymmetric tumor motions with a large amplitude. We proposed a numerical population-based model to incorporate asymmetry and non-Gaussianity of respiratory motion in margin calculation. Finally, when taking respiratory motion into account in particle therapy with safety margins, one must consider various parameters, particularly the dose deposit sensitivity to density variations. The last part is dedicated to a discussion on the defining of safety margins in order to optimally take into account respiratory motion.

Le but principal de ce projet est de préparer l’implantation clinique du système Clarity qui utilise une sonde ultrasonore pour visualiser l’anatomie interne du patient. Ce système est utilisé pour les cas de prostate et nécessite d’être adapté pour les cas de poumon. L’utilité de ce système est de suivre un substitut afin d’inférer la position d’une tumeur pulmonaire. L’hypothèse de cette étude est qu’un substitut interne serait mieux corrélé avec une tumeur pulmonaire que le seraient des marqueurs externes. Les sous-objectifs sont : 1) aborder l’adaptation du montage pour faire des acquisitions sur des patients ; 2) explorer la performance des algorithmes de détection de mouvements ainsi que des métriques de qualité d’image sur des images US et ciné IRM; 3) démontrer que la corrélation entre un substitut interne et une structure pulmonaire est plus grande que celle avec un substitut externe. Pour les acquisitions d’images US, la sonde est placée sur les volontaires et fixée à la table de traitement à l’aide d’un bras mécanique. Il a été démontré qu’une pression insuffisante peut causer une perte de signal dû à la forme curviligne de la sonde. La diminution de la moyenne des intensités de l’image et de l’écart-type confirme une perte de signal lors d’amplitudes respiratoires élevées justifiée par une perte de contact entre la sonde et la peau malgré la fixation de la sonde. Entre les algorithmes de corrélation croisée normalisée (NCC), d’erreur moyenne quadratique (RMS) et de flux optique, la méthode NCC semble la plus robuste pour suivre le substitut interne (structure dans le foie) dans les images IRM pour 5/9 volontaires sains ( = 0, 050). Cette méthode est utilisé présentement pour les cas de prostate. Le flux optique s’est montré plus efficace pour des cas spécifiques ce qui démontre l’intérêt d’adapter l’algorithme pour les cas de poumons. Enfin, il a été démontré sur les images IRM qu’un substitut interne au niveau du foie est plus efficace pour la majorité des volontaires (8/9) en comparaison avec un marqueur sur la peau placé dans la région abdominale. Le marqueur abdominal possède une meilleure corrélation qu’un marqueur thoracique (9/9) illustrant l’importance du positionnement d’un marqueur externe pour le suivi d’une tumeur pulmonaire. / The main objective of this thesis is to prepare the clinical implementation of the Clarity ultrasound system for indirect lung tumours tracking using a surrogate. It is currently used for motion management during prostate treatments and requires adaptation. Our hypothesis is that an internal marker would have a better correlation with the tumour’s position than an external surrogate. The sub-objectives are : 1) test different setups for the image acquisition on patients ; 2) explore the algorithms’ performance for motion detection as well as the image quality metrics on US and dynamic MRI images ; 3) evaluate the correlation between surrogates and a lung structure to determine which performs best. The ultrasound probe is fixed on the treatment couch for the acquisition on healthy volunteers using a mechanical arm. Low pressure on the patient’s skin results in a loss of signal due to the curvilinear shape of the probe. We observed a loss of contact between the probe and the volunteers’ skin due to ample movements causing a deterioration of the image quality. We tested three different motion detection algorithms on dynamic MRI images : normalized cross-correlation (NCC), root mean square error (RMS) and optical flow. The NCC algorithm is the most robust out of the three for 5/9 volunteers for the internal surrogate tracking ( < 0.050). In specific cases, the optical flow method performed better indicating an interest in developping a new algorithm for indirect lung tracking. Finally, the correlation between the surrogates and a lung structure were calculated using the MRI images. The internal surrogate inside the liver was proven more efficient for indirect lung tumour tracking for 8/9 volunteers. External markers give a greater prediction error. It has also been shown that the positioning of the external marker on the patient’s skin impacts the correlation. The abdominal marker is better than the thoracic one for all the volunteers.

Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer chez les hommes et les femmes dans le monde. Malgré les avancées majeures dans les traitements, les thérapies à base de platine restent la thérapie standard pour les patients atteints du cancer du poumon induit par la mutation KRAS. Bien que les composés de platine aient un premier effet sur ces patients, l’apparition d’une rechute constitue le principal défi au niveau clinique.Dans ce contexte, notre projet actuel vise à caractériser l’activation de la voie Notch dans la réponse aux sels de platines d’adénocarcinomes mutés pour K-Ras ainsi que son rôle dans l’acquisition de la résistance à ce traitement. Nous avons mis en évidence que la voie Notch est activée en réponse à divers agents induisant des dommages à l’ADN dans des lignées de cancer du poumon. Nous avons montré que cette activation est dépendante de la voie de checkpoint de Réponse aux Dommages de l’ADN (DDR) via ATM, ATM qui est une des principales kinases de la réponse cellulaire aux lésions de l’ADN telles que les cassures double-brin, causé notamment par la chimiothérapie conventionnelle. Parmi les nombreux substrats d’ATM en réponse à ces dommages, nous montrons un effet direct de MDM2 dans l’activation de la voie Notch en réponse aux dommages à l’ADN causé par le carboplatine. Nos données montrent une nouvelle interaction entre ATM, MDM2 et Notch, lors du traitement au carboplatine, qui pourrait jouer un rôle dans la cascade de signalisation favorisant la survie des cellules tumorales pulmonaires.En utilisant des xénogreffes dérivées de patients atteints d’adénocarcinomes du poumon, ainsi qu’un modèle cellulaire de xénogreffe résistant à la carboplatine, nous avons montré que l’association d’inhibiteurs de Notch et de MDM2 associé au traitement au carboplatine ont un effet accru sur le ralentissement de la croissance de la tumeur et sur la survie, en comparaison avec le traitement actuel de référence que représente le carboplatine.Nos résultats offrent une nouvelle possibilité de thérapie pour les adénocarcinomes de poumons mutés pour KRAS, et pourrait donc répondre à un besoin clinique urgent notamment pour contrecarrer la résistance aux chimiothérapies conventionnelles à base de sels de platine. / Lung cancer is the leading cause of cancer death among men and women worldwide. Despite the major advances in the treatments, platinum-based therapy remains the standard of care for patients affected by KRAS-driven lung cancer. Even though the platinum-compounds display an initial effect on these patients, the onset of the relapse constitutes the main challenge for the clinic. The molecular mechanisms underlying lung adenocarcinoma (LUAD) relapse are not completely elucidated yet, thus it is fundamental to understand them in order to improve survival of patients. Our data show that upon carboplatin treatment, the Notch pathway is activated in vitro. Since this effect was common for several other DNA damage insults, our driving hypothesis connected the DNA Damage Response (DDR) to the activation of the Notch pathway. Our data demonstrates that protein kinase ataxia telangiectasia-mutated (ATM) is a key mediator in the activation of the Notch pathway during DNA damage signalling. ATM is well-known as the chief mobilizer of the cellular response to the most toxic lesions to the DNA, the double-strand breaks which are also the type of damage caused by the conventional chemotherapy. Among the several substrates of ATM in response to the damage, there is the mouse double minute 2 protein (MDM2) that it is known to interact with the Notch pathway. Our data uncovered a new pathway connecting ATM, MDM2 and NICD during carboplatin treatment in LUAD cells.Using LUAD Patient-Derived Xenografts and a new generated carboplatin resistant cellular model, we show in vivo that the combination of Notch and MDM2 inhibitors with carboplatin showed a therapeutic benefit in tumour growth and survival compared to the standard of care, i.e. carboplatin.Our results can offer a new therapeutic window for KRAS-driven LUAD that become resistant to platinum-based therapy, hence tackling an urgent and unmet clinical need.

Les particules atmosphériques sont responsables de 3,2 millions de morts par an, cette mortalité faisant suite à des cardiopathies, bronchopathies ou encore des cancers. De nombreuses études épidémiologiques et mécanistiques associent l’augmentation de la prévalence des cancers pulmonaires avec l’exposition à la pollution atmosphérique et aux particules fines (PM2.5), d’où leur classification très récente comme cancérogène avéré pour l’homme par le Centre International de Recherche contre le Cancer (CIRC groupe 1). Les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la pathogénicité pulmonaire des polluants atmosphériques restent encore très controversés, ceci étant notamment lié à l’utilisation de modèles de culture cellulaire très éloignées des conditions in vivo. De plus, les PM2.5 présente une complexité physico-chimique (taille, nombre, morphologie et composition chimique) et une grande variabilité temporelle. En effet, ces particules sont constituées de nombreux polluants toxiques organiques, notamment des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP), ou encore des métaux, et ce à des teneurs parfois importantes. La complexité de leur composition rend les données toxicologiques difficilement interprétables, d’autant plus que la majorité des études toxicologiques publiées jusqu’à récemment ont souvent négligé la détermination de leur caractéristiques physico-chimiques.Mon projet de thèse a pour objectif d’évaluer le rôle des PM2.5, prélevées sur un site urbain (Lille), dans la cancérogenèse pulmonaire et ce, par une approche pluridisciplinaire qui permettra d’établir un lien étroit entre la physico-chimie et la toxicologie de ces particules.La première partie de mon projet est consacrée aux prélèvements des PM2.5, à Lille, au cours de deux saisons contrastées, et à l’évaluation de leurs principales caractéristiques physico-chimiques, à savoir leur granulométrie, leur composition chimique (métaux et HAP) ou encore leur bioaccessibilité dans des milieux de culture cellulaire ou des fluides bronchiques.La seconde partie consiste au développement d’un modèle de cellules épithéliales bronchiques humaines, issues de sujets sains et de patients atteints de Broncho-Pneumopathies Chroniques Obstructives (BPCO), différentiées à l’interface air/liquide, puis exposées de manière réitérée à des concentrations relativement faibles des PM2.5 prélevées à Lille. Ce modèle innovant permet de mieux intégrer un certain nombre de facteurs liés à la préexistence d’un état inflammatoire chronique et d’obtenir un état de différenciation cellulaire le plus proche possible des conditions d’exposition in vivo. Sur ce modèle cellulaire, après exposition, le phénotype inflammatoire, l’état de stress oxydatif ainsi que les modifications génétiques et épigénétiques sont étudiés.Les résultats de ce travail contribueront par une approche pluridisciplinaire à mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à la toxicité voire la cancérogénicité des PM2.5, et à expliquer pourquoi les individus atteints de BPCO sont plus sensibles que les sujets sains à l’exposition à long terme à des niveaux usuels de PM2.5. / Atmospheric particles are responsible for 3.2 million deaths per year, this mortality is due to heart diseases, bronchial diseases or cancers. Numerous epidemiological and toxicological studies associate the lung cancer prevalence increase with exposure to air pollution and particularly fine particulate matter (PM2.5). PM2.5 were recently classified as carcinogen to humans by International Agency for Research in Cancer (IARC group 1). Cellular and molecular mechanisms involved in air pollutants pulmonary pathogenicity are still very controversial. This is particularly related to the use of cell culture models far from in vivo conditions. In addition, PM2.5 have a physico-chemical complexity (size, number, morphology and chemical composition) and a high temporal variability. Indeed, these particles contain many toxic organic pollutants, including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), or metals, and sometimes at significant levels. The complexity of their composition makes the toxicological datas difficult to interpret, especially as the majority of toxicological studies published until recently have often overlooked the determination of their physicochemical characteristics.My thesis project aims at assessing the role of PM2.5, sampled on an urban site (Lille), in lung carcinogenesis through a multidisciplinary approach which will establish a tight connection between chemistry and toxicology of these particles.The first part of my project consisted of the PM2.5 sampling, in Lille, during two contrasting seasons, and the evaluation of their main physical and chemical characteristics, as their size, chemical composition (metals and PAHs ) or their bioavailability in cell culture media or bronchial fluids.The second part consisted of the development of human bronchial epithelial cells from healthy subjects and patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), differentiated in air / liquid interface conditions, and exposed to repeated low concentrations of PM2.5 collected in Lille. This innovative model better integrates a number of factors related to the pre-existence of a chronic inflammatory state and gets the closest cell differentiation state possible to the in vivo exposure conditions. On this cellular model, after exposure, the inflammatory phenotype, the oxidative state as well as genetic and epigenetic status were studied.Using a multidisciplinary approach, the results of this work will contribute to better understand the molecular mechanisms related to PM2.5 toxicity or carcinogenicity, and to explain why COPD patients are more sensitive than healthy people to PM2.5 long term exposure.

En épidémiologie des rayonnements ionisants, les erreurs de mesure d’exposition et l’incertitude sur le calcul de la dose absorbée à l’organe constituent des sources d’incertitude importantes entrant en jeu dans la modélisation et l’estimation des relations dose-réponse d’intérêt. Celles-ci peuvent être de nature très complexes dans le cadre d’études de cohortes professionnelles et sont ainsi rarement prises en compte dans ce domaine. Pourtant, lorsque les erreurs de mesure d’exposition ne sont pas ou mal prises en compte, elles peuvent mener à des estimateurs de risque biaisés, à une perte de puissance statistique ainsi qu’à une déformation de ces relations dose-réponse. L’objectif de ce travail est de promouvoir l’utilisation de l’approche hiérarchique bayésienne pour la prise en compte explicite et simultanée des erreurs de mesure d’exposition et des incertitudes de dose intervenant dans les estimations de risques sanitaires radio-induits dans les études de cohortes professionnelles. Plus spécifiquement, des modèles hiérarchiques ont été proposés et inférés afin d’affiner l’estimation actuelle du risque de décès par cancer du poumon associé à une exposition chronique et à faibles doses au radon et ses descendants à vie courte à partir de données issues de la cohorte française des mineurs d’uranium. Ces modèles, connus pour leur souplesse et leur pertinence pour la prise en compte de sources d’incertitude multiples et complexes, sont basés sur une combinaison de sous-modèles probabilistes conditionnellement indépendants. Afin de quantifier l’impact de l’existence d’erreurs de mesure d’exposition partagées et non-partagées sur l’estimation du risque et sur la forme de la relation exposition-risque dans les études de cohortes professionnelles, une étude par simulations a été conduite dans laquelle différentes structures complexes mais réalistes d’erreurs de mesure (pouvant par ailleurs varier dans le temps) ont été considérées. Une élicitation de lois a priori reflétant l’incertitude relative au débit respiratoire - un paramètre important intervenant dans le calcul de la dose absorbée au poumon – a été conduite auprès de trois experts des conditions d’exposition dans les mines d’uranium française et des méthodes de combinaison de dires d’experts ont été mises en œuvre et comparées. Enfin, des algorithmes Monte-Carlo par Chaînes de Markov ont été implémentés sous Python pour mener l’inférence bayésiennes des différents modèles hiérarchiques proposés et ainsi, obtenir des estimations corrigées du risque de décès par cancer du poumon radio-induit dans la cohorte française des mineurs d’uranium. / In radiation epidemiology, exposure measurement error and uncertain input parameters in the calculation of absorbed organ doses are among the most important sources of uncertainty in the modelling of the health effects of ionising radiation. As the structures of exposure and dose uncertainty arising in occupational cohort studies may be complex, these uncertainty components are only rarely accounted for in this domain. However, when exposure measurement is not or only poorly accounted for, it may lead to biased risk estimates, a loss in statistical power and a distortion of the exposure-response relationship. The aim of this work was to promote the use of the Bayesian hierarchical approach to account for exposure and dose uncertainty in the estimation of the health effects associated with exposure to ionising radiation in occupational cohorts. More precisely, we proposed several hierarchical models and conducted Bayesian inference for these models in order to obtain corrected risk estimates on the association between exposure to radon and its decay products and lung cancer mortality in the French cohort of uranium miners. The hierarchical appraoch, which is based on the combination of sub-models that are linked via conditional independence assumptions, provides a flexible and coherent framework for the modelling of complex phenomena which may be prone to multiple sources of uncertainty. In order to compare the effects of shared and unshared exposure uncertainty on risk estimation and on the exposure-response relationship we conducted a simulation study in which we supposed complex and potentially time-varying error structures that are likely to arise in an occupational cohort study. We elicited informative prior distributions for average breathing rate, which is an important input parameter in the calculation of absorbed lung dose, based on the knowledge of three experts on the conditions in French uranium mines. In this context, we implemented and compared three approaches for the combination of expert opinion. Finally, Bayesian inference for the different hierarchical models was conducted via a Markov chain Monte Carlo algorithm implemented in Python to obtain corrected risk estimates on the lung cancer mortality in the French cohort of uranium miners associated with exposure to radon and its progeny.

Le cancer du poumon non-à-petites-cellules (CPNPC) représente 85% des cas de cancer du poumon. Cependant, les modèles utilisés de culture cellulaire en deux dimensions (2D) représentent partiellement les caractéristiques physiopathologiques du CPNPC. Notre objectif est de réaliser un modèle in vitro plus représentatif des caractéristiques de ce type de cancer. La culture tridimensionnelle (3D) dans laquelle les cellules forment un sphéroïde, est considérée comme un modèle plus fidèle aux tumeurs retrouvées chez les patients grâce à la structure et aux interactions intercellulaires du modèle. Pour mieux représenter le microenvironnement tumoral, nous intégrons une lignée cellulaire de fibroblastes dans le sphéroïde de CPNPC, afin d’imiter l’interaction entre cellules cancéreuses et cellules stromales. En effet, bien que les fibroblastes représentent un faible pourcentage des cellules au sein des tumeurs de CPNPC, elles jouent un rôle prépondérant dans la biologie tumorale et la réponse aux médicaments. Nous avons testé différentes lignées de fibroblastes et différents ratios de co-culture afin de déterminer les conditions optimales de notre modèle de co-culture 3D. Après 7 jours de co-culture, les cellules cancéreuses démontrent un potentiel migratoire plus élevé lorsque mesuré dans des chambres de Boydens. Cet effet n’est dépendant ni de la prolifération, ni d’un changement de phase dans le cycle cellulaire. Nous avons caractérisé la localisation des fibroblastes au sein du sphéroïde par des expériences de microscopie à fluorescence. L’expression de la protéine α-SMA du cytosquelette a aussi été déterminée par immunofluorescence. Nous avons par la suite établi un modèle de co-culture sur 24 jours afin de maximiser la communication entre les cellules cancéreuses et les fibroblastes. Ce modèle de co-culture long terme a par la suite été analysé selon son contenu en cytokines, chimiokines et métabolites. Enfin, nous avons réalisé un criblage de médicaments au jour 24 de notre co-culture long terme afin d’évaluer une réponse thérapeutique des cellules cancéreuses, dans des conditions plus semblables au microenvironnement tumoral. / Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for 85% of all lung cancer cases. However, the two-dimensional (2D) cell culture models used represent partially the pathophysiological characteristics of NSCLC. Our goal is to develop an in vitro model that is more representative of the characteristics of this type of cancer. The three-dimensional (3D) culture, in which the cells form a spheroid, is considered to be a model more faithful to the tumors found in patients due to the structure and intercellular interactions of the model. In order to better represent the tumor microenvironment, we are integrating a fibroblast cell line into the spheroid of NSCLC to mimic the interaction between cancer cells and stromal cells. Although fibroblasts represent a small percentage of cells in NSCLC tumors, they play a major role in tumor biology and drug response. We tested different fibroblast cell lines and co-culture ratios to determine the optimal conditions of our 3D co-culture model. After 7 days of co-culture, the cancer cells show a higher migratory potential when measured in Boydens chambers. This effect is not dependent on proliferation or change of phase in the cell cycle. We characterized the localization of fibroblasts within the spheroid by fluorescence microscopy experiments. The expression and localization of the cytoskeletal protein α-SMA was also determined by immunofluorescence. We then established a 24-day co-culture model to maximize communication between cancer cells and fibroblasts. This long-term co-culture model was subsequently analyzed for cytokine, chemokine and metabolite content. Finally, we performed drug screening on day 24 of our long-term co-culture to evaluate a therapeutic response of cancer cells under conditions more similar to the tumor microenvironment.

Problématique. Le tabagisme est le facteur de risque le plus important de cancer du poumon, cependant, d'autres facteurs comme les combinaisons de prédispositions génétiques, d'expositions environnementales et d'autres facteurs liés au mode de vie peuvent également contribuer au risque. Cette étude vise à déterminer les associations entre les expositions professionnelles courantes et le risque de cancer du poumon. Méthodes. Une étude cas-cohorte nichée dans l'étude CARTaGENE a été utilisée. Les cas comprenaient tous les participants avec un diagnostic incident de cancer du poumon de 2009 à 2016 (n= 147). Au départ, une sous-cohorte de 1 032 individus a été échantillonnée. La matrice d'exposition professionnelle du Canada (CANJEM) a été utilisée pour déterminer les expositions professionnelles de l’emploi occupé le plus longtemps par les participants. Vingt-huit agents avec ≥ 5 cas exposés ont été retenus pour les analyses. Différents modèles de régression logistique multivariée avec des estimateurs de variance robuste ont été utilisés pour estimer les ratios des côtes (RC) et les intervalles de confiance (IC) à 95% pour les associations entre chaque agent et le risque de cancer du poumon tout en contrôlant pour les facteurs de risque établis. Résultats. Un risque accru de cancer du poumon a été observé chez les personnes exposées aux cendres (RC = 4.42; IC 95%: 1.75-11.15), au sulfate de calcium (RC = 4.13; IC 95%: 1.20-14.20), au chlorure d'hydrogène (RC = 3.79; 95% IC: 1.07-13.41), au formaldéhyde (RC = 3.73; IC 95%: 1.51-9.19), aux fumées de cuisson (RC = 2.92; IC 95%: 1.33-6.42), aux alcanes (RC = 4.33; IC 95%: 1.41-13.29), aux aldéhydes aliphatiques (RC = 3.94; IC 95%: 1.41-10.98) et aux agents de nettoyage (RC = 2.60; IC 95%: 1.50-4.52). Une diminution de l'incidence du cancer du poumon a été observée chez les participants exposés au monoxyde de carbone (RC = 0.29; IC 95%: 0.12-0.74) et aux hydrocarbures aromatiques polycycliques de pétrole (RC = 0.18; IC 95%: 0.05-0.60). Conclusion. Nos résultats soutiennent le rôle de plusieurs agents professionnels, pour lesquels nous avons des connaissances limitées, dans la contribution au risque de cancer du poumon. / Background. Smoking is the strongest risk factor for lung cancer; however, other factors like the combinations of genetic predisposition, environmental exposures, and other lifestyle factors may also contribute to risk. This study aims to determine associations between prevalent occupational exposures and lung cancer risk. Methods. A case-cohort design was nested within the CARTaGENE study. Cases included all participants with an incident diagnosis of lung cancer from 2009-2016 (n=147). A sub-cohort of 1,032 individuals was sampled at baseline. The Canadian Job Exposure Matrix was used to determine occupational exposures in participants’ longest-held job. Twenty-eight agents with ≥5 exposed cases were retained for analysis. Separate multivariable logistic regression models with robust variance estimators were used to estimate odds ratios (OR) and 95% confidence intervals (CI) for the associations between each agent and lung cancer risk while controlling for established risk factors. Results. Increased lung cancer risk was found among those exposed to ashes (OR=4.42; 95% CI: 1.75-11.15), calcium sulfate (OR=4.13; 95% CI: 1.20-14.20), hydrogen chloride (OR=3.79; 95% CI: 1.07-13.41), formaldehyde (OR=3.73; 95% CI: 1.51-9.19), cooking fumes (OR=2.92; 95% CI: 1.33-6.42), alkanes (OR=4.33; 95% CI:1.41-13.29), aliphatic aldehydes (OR=3.94; 95% CI: 1.41-10.98), and cleaning agents (OR=2.60; 95% CI: 1.50-4.52). A decrease in lung cancer incidence was found among participants exposed to carbon monoxide (OR=0.29; 95% CI:0.12-0.74) and polycyclic aromatic hydrocarbons from petroleum (OR=0.18; 95% CI: 0.05-0.60). Conclusion. Our findings support the role of several occupational agents, for which we have limited knowledge, in contributing to lung cancer risk.

Les tumeurs solides sont infiltrées par des cellules immunes (TIIC) dont la nature, la fonction et la composition varient d’un patient à l'autre. Ces cellules inflammatoires influencent l'invasion tumorale en contrôlant la croissance et le potentiel métastatique d’une tumeur. Ainsi, il est proposé d’utiliser cette infiltration comme outil diagnostic et pronostic de routine. Certaines cellules sont bien connues pour jouer un rôle important dans le contrôle de la progression tumorale, comme c’est le cas des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ alors que d’autres possèdent un rôle contradictoire. Étant donné la dépendance des tumeurs sur l’équilibre entre ces différentes cellules, il est important d’identifier les fonctions précises des cellules immunes au sein de la tumeur. De nombreuses études sont réalisées afin d’identifier des marqueurs descriptifs du phénotype et la fonction des cellules immunes dans la tumeur. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- Identifier la méthode de désagrégation des tissus tumoraux altérant le moins la biologie des TIIC pour leur caractérisation. 2- Caractériser l’expression de la molécule d’adhérence CD146 dans les TIIC et en identifier l’origine. L’identification de marqueurs pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des TIIC a été réalisée, entre autres, par la détection de protéines exprimées par la cellule. Dans la première partie de ce projet, nous avons démontré que les méthodes utilisées pour désagréger les tissus tumoraux dans le but d’isoler les TIIC induisent des changements dans la biologie de ces cellules ce qui peut fausser les conclusions qui en dérivent. Nous avons donc comparé l'impact de trois méthodes de désagrégation : une dissociation mécanique utilisant la MédimachineTM et deux digestions enzymatiques utilisant une collagénase de type I seule ou combinée à de la collagénase de type IV et de la DNase I de type II. Nous nous sommes intéressés à l'effet de ces méthodes sur des paramètres tels que la viabilité cellulaire, l’altération des protéines de surface et la capacité des cellules à proliférer. Nous avons démontré que ces méthodes affectent la viabilité des cellules de manière comparable, alors que la détection de certaines protéines de surface et la capacité de proliférer est réduite/inhibée par les traitements enzymatiques. Nous concluons qu’une méthode mécanique utilisant la MédimachineTM est mieux adaptée à la caractérisation des TIIC afin de conserver leurs propriétés. Dans la deuxième partie de notre projet, nous avons adapté cette méthode à la caractérisation des TIIC. Nous avons porté une attention particulière à la molécule d’adhérence CD146 dont l’implication dans la migration des cellules immunes à travers l’endothélium vers les sites d’inflammation est de plus en plus étudiée dans les maladies autoimmunes. Nous avons mis en évidence une augmentation des proportions de cellules immunes exprimant CD146 dans les tumeurs comparativement au sang de patients de cancers. Cette expression est induite par les cellules tumorales tout en étant accrue par la nécrose de celles-ci. Nous démontrons que ces cellules sont majoritairement des lymphocytes T CD4+ présentant un profil immunosuppressif. En conclusion, nos résultats suggèrent que CD146 participe à la mise en place du contexte immunitaire dans la tumeur et augmente la capacité de migration des lymphocytes T CD4+. L’induction par les cellules tumorales de cette molécule d’adhérence dans les cellules suppressives pourrait contribuer aux mécanismes immunorégulateurs mis en place par la tumeur. CD146 pourrait être un marqueur d’intérêt pour l’identification des cellules immunosuppressives et pour le développement de nouvelles thérapies. / Solid tumors are infiltrated by immune cells (TIIC), which vary in function and proportion from patient to patient. These inflammatory cells may contribute positively or negatively to tumor invasion, by controlling the growth and the metastatic potential of tumors. It has therefore been proposed to use infiltration as a diagnostic and prognosic tool. Certain cells play an important role in the control of tumor progression, as is the case of cytotoxic CD8+ T lymphocytes, whereas others present an ill-defined role. Since the progression of tumors depends on the balance between these cell types, it is important to identify their specific functions within the tumor. Many studies have therefore focused on identifying markers, which are suggestive of phenotype and function of immune cells in the tumor. This project is divided into two parts: 1 – The identification of a tumor tissue disaggregation method which induced minimal effects on TIIC biology. 2 – The characterization of the expression of the adhesion molecule CD146 in TIIC and understand its regulation. Marker identification for phenotypic and functional characterization of TIIC is carried out by detection of cell proteins. In the first part of this project, we showed that methods used to disaggregate tumor tissue in order to isolate TIIC induce changes in cell biology, which may alter results. We thus compared the effects of three disaggregation methods: mechanical disruption using MedimachineTM and two enzymatic digestions using a type I collagenase alone or combined with type IV collagenase and type II DNase I, on parameters such as cell viability, cell surface marker detection and cell proliferation. We showed that these methods affect cell viability in a comparable manner, whereas the detection of certain surface proteins and proliferative capacity of cells was reduced by enzymatic treatments. We concluded that a mechanical method using MedimachineTM is more suitable for the characterization of TIIC. In the second part of our project, we adapted this method to the characterization of TIIC. We focused on CD146, an adhesion molecule that was shown to be involved in immune cell migration in autoimmune disease. We demonstrated an increase of CD146+ immune cells in tumors compared to the blood of the same patients. This expression was shown to be induced by tumor cells and increased by necrosis. We showed that these cells are predominantly CD4+ T lymphocytes with an immunosuppressive profile. In conclusion, our results suggest that CD146 is involved in the establishment of the tumor immune environment and may increase the migratory capacity of CD4+ T cells toward tumors. Tumor cell induction of this adhesion molecule by suppressor cells could contribute to the immunoregulatory mechanisms established by tumors. CD146 may be a useful marker for the identification of immunosuppressive cells and development of new therapies.

Les complications respiratoires restent la première cause des complications postopératoiresen chirurgie thoracique oncologique. Le développement des ces complications sont le plussouvent de nature infectieuse. Leur fréquence reste élevée (30 %) et représente la premièrecause de mortalité hospitalière. Des données récentes suggèrent que ces complicationsrespiratoires soient liées à une colonisation périopératoire des voies aériennes. Plusieurstravaux fondés sur l’analyse phénotypique de mise en culture traditionnelle démontrentl’existence d’une colonisation bronchique proximale chez près de 40 % des malades.Néanmoins, les liens entre colonisation et complications respiratoires restent controversés.Une des principales limites demeure les méthodes de cultures employées qui ne permettentl’identification que d’une faible partie (< 1%) des espèces microbiologiques potentiellementexistantes dans la biosphère. Nous avons formulé l’hypothèse que des techniques debiologie moléculaire d’amplification universelle des ADN présents dans les échantillonssuivies du clonage des produits de PCR et du séquençage de ces clones, appliquées à deséchantillons obtenus des bronches distales et de biopsies pulmonaires, permettraientl’identification de pathogènes bactériens, viraux ou émergents. Nos résultats suggèrent quel’identification précise et exhaustive de ces colonisations ne peut être réalisée que par uneapproche moléculaire moderne, innovante et systématique. Cette approche permetd’envisager, d’une part, un lien plus précis entre colonisation et complications respiratoires etd’autre part, l’identification de pathogènes difficilement cultivables ou émergents. / Postoperative respiratory complications remain the most frequent and seriouscomplications, as well as being the primary cause of hospital death after thoracic oncologicsurgery. Their incidence is relatively high and concern near 30 % of patients submitted forsurgery. These complications are notoriously infectious and airways colonizations (AWC)have been suggested to be an essential first step in the pathogenesis of this respiratorymorbidity. Previous studies have documented that AWC are presents in near 40 % of cases.However, correlation between AWC and respiratory complications remains controversial.One of the limits is the traditional phenotypic methods of cultures that precludes for definitiveconclusions when considering that majority of microbiological species required modern andinnovating techniques of culture to be identified. Recent data have demonstrated that 99% oforganisms seen microscopically are not cultivated by routine techniques and requiredmolecular techniques to be identified. We have postulated that instead of culture test,molecular detection (DNA genes amplification and sequencing of the bacterial 16S ribosomalRNA) applied to distal bronchial samples or to lung biopsies, should allow identifyingbacteria, virus or emerging pathogens. Our results suggest that molecular cultureindependenttechniques applied in the context of AWC will provide in the future a greatopportunity to precise correlation between colonization and respiratory complications and tothe other hand, to discover new and/or emerging pathogens that are currently unknown.