A criptosporidiose é considerada uma das principais infecções por protozoários em aves, e já foi descrita em mais de 30 espécies de aves de várias Ordens, como Anseriformes, Charadriformes, Columbiformes, Galliformes, Passeriformes, Psitaciformes e Struthioniformes. Três espécies de Cryptosporidium infectam aves: Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium galli e Cryptosporidium meleagridis. Além dessas espécies, há vários genótipos distintos geneticamente das espécies de Cryptosporidium já descritas em aves, como os genótipos I, II, III e IV de aves. Há vários relatos de infecção por Cryptosporidium nos tratos gastrintestinal, respiratório e na bursa de Fabricius, resultando em perdas econômicas e mortalidade. O objetivo desse estudo foi a detecção de Cryptosporidium e sua caracterização molecular, em amostras de fezes de aves domésticas e de aves exóticas mantidas em cativeiro no Brasil. Foram coletadas 966 amostras de fezes de 18 famílias de aves. As amostras foram conservadas em solução de dicromato de potássio 2,5% a 4º C, até o processamento. Para purificação e concentração dos oocistos, foi utilizada a técnica de centrífugo-flutuação em solução de Sheather seguida de análise microscópica, em 463 amostras, por meio da técnica de coloração negativa com verde malaquita e de extração do DNA genômico dos oocistos, em amostra positivas à microscopia, ou, alternativamente, a extração de DNA foi realizada, sem a realização prévia de microscopia, em outras 503 amostras. A análise molecular foi realizada por meio da reação de nested-PCR, para amplificação de fragmentos da subunidade 18S do gene do RNA ribossômico e do gene da actina. Foi observada amplificação para Cryptosporidium em 47 (4,86 %) amostras. O sequenciamento dos fragmentos amplificados possibilitou a identificação das três espécies que infectam aves: C. galli> em canário (Serinus canaria), galinha doméstica (Gallus gallus domesticus) e calopsita (Nymphicus hollandicus), C. meleagridis e C. baileyi em galinha doméstica (G. g. domesticus), Cryptosporidium genótipo I de aves em pavão azul (Pavocristatus) e canário (Serinus canaria), Cryptosporidium genótipo III de aves em agapornis (Agapornis roseicolis) e calopsita (N. hollandicus) e Cryptosporidium genótipo II de aves em avestruzes (Struthio camelus). / Cryptosporidiosis is considered a major protozoan infection in birds, and has been described in more than 30 species of birds of various orders, as Anseriformes, Charadriformes, Columbiformes, Galliformes, Passeriformes, Psitaciformes and Struthioniformes. Three species of Cryptosporidium are considered valid in birds: Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium galli and Cryptosporidium meleagridis. Besides these species, there are several genotypes genetically distinct from the species of Cryptosporidium described in birds, as avian genotypes I, II, III and IV. There are several reports of gastrointestinal, respiratory and bursa of Fabricius infections in birds, resulting in major economic losses and mortality. The aim of this study was the detection and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in fecal samples of domestic birds and in exotic birds kept in captivity in Brazil. A total of 966 samples from 18 families of birds were collected and stored in 2.5% potassium dichromate solution at 4º C until processing. Oocysts were purified in Sheather sugar solution following microscopic analyses, in 463 samples, by malachite green negative stain and extraction of genomic DNA of oocysts in samples positive by microscopy or, alternatively, DNA extraction was accomplished without previous microscopic analyses in another 503 samples. Molecular analyses were performed using n-PCR for amplification of fragments of the 18S subunit of rRNA gene and of the actin gene. It was observed amplification for Cryptosporidium DNA fragments in 47 (4.86%) samples. Sequencing of amplified fragments and phylogenetic analyses allowed the identification of the three species that infect birds: C. galli in canaries (Serinus canaria), domestic chicken (Gallus gallus domesticus) and calopsita (Nymphicus hollandicus), C. meleagridis and C. baileyi in domestic chicken (G. g. domesticus), Cryptosporidium avian genotype I in peacock (Pavo cristatus) and canary (Serinus canaria), Cryptosporidium avian genotype III in agapornis (Agapornis roseicolis) and cockatiel (N. hollandicus), and Cryptosporidium avian genotype II in ostriches (Struthio camelus).

Giardia e Cryptosporidium são protozoários cosmopolitas cuja epidemiologia é especialmente importante devido ao seu expressivo potencial zoonótico. Animais silvestres são frequentemente relatados como reservatórios da giardiose e criptosporidiose humanas, todavia, são escassas as evidências sobre sua real importância na manutenção e disseminação destas protozooses. No intuito de avaliar a ocorrência e determinar os genótipos responsáveis pela infecção de mamíferos neotropicais, 452 amostras fecais procedentes de 52 diferentes espécies, in situ e ex situ, de sete localidades distintas foram avaliadas por métodos de diagnóstico microscópico, seguidos por técnicas moleculares de amplificação (Nested PCR), sequenciamento e caracterização genotípica. Os resultados revelaram prevalência aparente de 6,2% para Giardia spp. e de 4,8% para Cryptosporidium spp. (n=343). Dezessete diferentes espécies de mamíferos silvestres foram positivas, sendo 11 para Giardia spp., nove para Cryptosporidium spp. e três para ambos os protozoários. A caracterização molecular revelou a predominante presença de genótipos zoonóticos em mamíferos cativos (Giardia duodenalis genótipo AI) e de genótipos hospedeiro-específicos em animais de vida livre (Cryptosporidium sp. rat genotype III e Cryptosporidium wrairi). Foram também identificados Giardia duodenalis genótipo D em cachorro-do-mato Cerdocyon thous e Cryptosporidium sp. deer mouse genotype IV em bugio-preto Alouatta caraya, ambos mantidos em cativeiro. Aspectos ecológicos, como habitat, guilda trófica, estratégia do uso do ambiente e influência antrópica, foram considerados relevantes para a ocorrência dos parasitas. Tais achados demonstraram que animais silvestres podem ser infectados por genótipos zoonóticos e específicos dos agentes, o que revela a importância de estudos envolvendo esta abordagem para sugerir possíveis relações entre os protozoários, hospedeiros humanos, animais domésticos e silvestres perante diferentes características ambientais. / Giardia and Cryptosporidium are cosmopolitan protozoans whose epidemiology is especially important due to its significant zoonotic potencial. Wild animals are often reported as reservoirs of human giardiosis and cryptosporidiosis, however, there is little evidence about their real importance in the maintenance and dissemination of these protozoosis. In order to evaluate the occurrence and determine the genotypes responsible for neotropical mammals infection, 452 fecal samples of 52 different species, in situ and ex situ, of seven locations were evaluated by microscopic methods of diagnosis, followed by molecular amplification (Nested PCR), sequencing and genotypic chacacterization techniques. The results revealed an apparent prevalence of 6,2% for Giardia spp. and 4,8% for Cryptosporidium spp. (n=343). Seventeen different species of wild mammals were positive, 11 for Giardia spp., nine for Cryptosporidium spp. and three for both protozoans. Molecular characterization shows predominant presence of zoonotic genotypes in captive mammals (Giardia duodenalis genotype AI) and host-specific genotypes in free-living animals (Cryptosporidium sp. rat genotype III and Cryptosporidium wrairi). Giardia duodenalis genotype D in crab-eating fox Cerdocyon thous and Cryptosporidium sp. deer mouse genotype IV in black howler monkey Alouatta caraya, both in captivity, were also identified. Ecological aspects, like habitat, trophic guilds, strategy of using the environment and human influence, were considered relevant to occurrence of the parasites. These findings could demonstrate wild mammals can be infected by zoonotic and specific genotypes of agents, which shows the importance of studies using this approach to suggest possible relationships between protozoans, human hosts, domestic animals and wildlife facing different environmental characteristics.

Os recursos genéticos vegetais apresentam um valor real e potencial para a agricultura em razão da sua importância em programas de melhoramento e conservação. Este estudo teve como objetivo principal caracterizar a diversidade genética e química do germoplasma de gengibre do Departamento de Genética da ESALQ/USP, por meio de 18 descritores fenotípicos, 13 combinações de marcadores AFLP e análise da composição química do óleo essencial. O germoplasma foi formado por acessos procedentes de distintos estados brasileiros, além de algúns acessos introduzidos da Colômbia. Durante as coletas, foram entrevistados 34 agricultores de três estados: São Paulo (SP), Espírito Santo (ES) e Paraná (PR), constatando-se que esta espécie é cultivada principalmente por agricultores familiares cuja fonte principal de renda é a agricultura. Na análise da composição química, um total de 61 compostos foram identificados, sendo que os acessos apresentaram variabilidade química segundo a análise de variância. O óleo essencial foi rico em monoterpenos (82,35%), destacando-se geranial (20,41%) e neral (13,36%) como os compostos mais abundantes. Os compostos α-zingibereno, 1,8-cineol, linalol e β-felandreno, foram importantes na análise da diversidade química e, portanto, determinantes no agrupamento baseado no método de ligação completa (LC-VD) que classificou o germoplasma em dois grupos de acessos: cultivares e cultivares locais. Na caracterização agromorfológica, pouca variação foi observada para variáveis qualitativas, enquanto que para variáveis quantitativas houve moderada a baixa variabilidade, embora alguns acessos divergentes foram identificados. A análise de componentes principais explicou 82% da variação total nos primeiros três componentes, sendo que a distribuição dos acessos no gráfico de dispersão foi congruente com os agrupamentos formados pelo método de otimização de Tocher, destacando-se os acessos Gen-18, Gen-24, Gen-65 e Gen-42 como os mais divergentes do germoplasma fenotípicamente. Na caracterização molecular, 13 combinações de primers AFLP geraram, em média, 113,5 locos polimórficos, com uma proporção de 96,85% de polimorfísmo na coleção global. As estimativas de diversidade genética de Nei (Hj), índice de Shannon (I) e número efetivo de alelos (ne), foram superiores nos acessos colombianos (0,501; 0,396 e 1,508, respectivamente), em relação aos acessos brasileiros. A AMOVA mostrou que a maior parte da variação (63%) ocorreu entre os dois países e o índice FST=0,153 corroborou este resultado, indicando alta diferenciação genética entre eles. Os agrupamentos fornecidos pelo Structure e o dendrograma baseado no complemento do coeficiente de Jaccard, foram consistentes entre si e demonstraram que a maioria dos acessos brasileiros são altamente similares, sendo que não há influência da procedência geográfica no padrão dos agrupamentos químicos, fenotípicos e moleculares. A introdução de novos materiais genéticos no Brasil, certamente contribuirá para uma base genética mais ampla deste cultivo. / Plant genetic resources exhibit a true and potential value for agriculture due to their importance in breeding and conservation programs. This study aimed to characterize the genetic and chemistry diversity of ginger germplasm of Genetics Department of the ESALQ/USP, through 18 phenotypic descriptors, 13 AFLP markers combinations and chemical composition analysis of essential oil. The germplasm was combined by accessions coming from diferent Brazilian states, along with some accessions introduced from Colombia. During the collection, 34 farmers were interviewed in three states: São Paulo (SP), Espírito Santo (ES) and Paraná (PR). Ginger is mainly cultivated by small farmers whose main income source is agriculture. In the chemical composition analysis, a total of 61 compounds were identified. The accessions presented chemical variability according to the analysis of variance. The essential oil was rich in monoterpenes (82.35%), being the geranial (20.41%) and the neral (13.36%), both referred to as citral, the most abundant compounds. The α-zingiberene, 1,8-cineole, linalool and β-phellandrene compounds were relevant in the chemical diversity analysis of the accessions, while the dendrogram based on the complete linkage method (LC-VD) classified the germplasm into two groups: landraces and cultivars accessions. In the agro-morphologic characterization, qualitative traits showed little variation, while moderate to low variability was observed for quantitative traits, although some divergent accessions were identified. The principal component analysis explained 82% of the total variation in the first three components, wherein the accessions distribution on the scatter plot was consistent with the groups formed by the Tocher method, with the Gen-18, Gen -24, Gen-65 and Gen-42 accessions as the most divergent ones from the phenotypically germplasm. In the molecular characterization, 13 AFLP markers combinations generated an average of 113.5 polymorphic loci, with a ratio of 96.85% of polymorphism in the overall collection. Estimates of Nei genetic diversity (Hj), Shannon index (I) and alleles effective number (ne) were higher in Colombian accessions (0.501; 0.396 and 1.508, respectively). The AMOVA showed that most of the variation (63%) occurs between the two countries and the FST=0.153 index suportted this result, indicating high genetic differentiation between Brazilian and Colombian accessions. The groupings provided by Structure and the dendrogram based on Jaccard coefficient complement were consistent with each other and showed that Brazilian accessions are genetically similar. In general, there is no influence of the accesses geographic origin in the chemical, phenotypic and molecular grouping pattern. The introduction of new genetic materials in Brazil, will certainly contribute to a broader genetic basis of this species.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-14T13:17:49Z No. of bitstreams: 1 Josiene Silva Veloso.pdf: 976122 bytes, checksum: 7669da38d458979fe12860f67c3c1a9c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-14T13:17:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Josiene Silva Veloso.pdf: 976122 bytes, checksum: 7669da38d458979fe12860f67c3c1a9c (MD5) Previous issue date: 2013-02-18 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The cowpea (Vigna unguiculata) is grown predominantly in the North and Northeast of brazil, with low yields due to a variety of factors, including the fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum. The present study aimed to characterize isolates of F. oxysporum associated with wilt in cowpea through observations of morphological characters, pathogenicity test and analysis of sequences of the translation elongation factor 1-α (tef1) gene. The colony color of the isolates varied from white to violet with dense aerial mycelium. The microconidia were oval to ellipsoid, slightly curved and unicelular, arranged in false heads formed on short monophyalides. The macroconidiaformed on sporodochia were falcate, slightly curved with three to five septa. Of the 27 isolates of F. oxysporum analyzed 20 were pathogenic to cowpea, causing disease with severity ranging from 1 to 99%. The neighbor-joining analysis based on tef1 grouped the isolates into six haplotypes that were not correlated with pathogenicity.. It is suggested from the results of the present study that f. sp. tracheiphilum represents at least three phylogenetic lineages behaving as polyphyletic and paraphyletic, indicating they have independent evolutionary origins. / O Feijão-caupi é uma leguminosa cultivada predominantemente nas regiões Norte e Nordeste do brazil , apresentando baixo rendimento devido a uma diversidade de fatores, dentre eles a murcha-de-fusário, causada pelo fungo Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum. O presente estudo teve como objetivo caracterizar isolados de F. oxysporum associados à murcha em feijão-caupi por meio de observações de caracteres morfológicos, teste de patogenicidade e análise de sequencias do gene fator de elongação 1-α (tef1). Os isolados apresentaram coloração variando do branco ao violeta com micélio aéreo bastante denso. Os microconídios apresentaram formato oval a elipsóide, ligeiramente curvado e sem septo, dispostos em falsas cabeças produzidos em monofiálides curtas. Os macroconídios formados em esporodóquios apresentaram formato falcado, ligeiramente curvado com três a cinco septos. Dos 27 isolados de F. oxysporum analisados 20 se mostraram patogênicos ao feijão-caupi, causando doença com severidade variando de 1 a 99%. A análise de neighbor-joining baseada na região tef1 agrupou os isolados em seis haplótipos independentemente de serem ou não patogênicos. Pode-se sugerir a partir dos resultados obtidos no presente estudo que a f. sp. tracheiphilum representa pelo menos três linhagens filogenéticas comportando-se como polifilética e parafilética, indicando assim terem origens evolucionárias independentes.

Giardia e Cryptosporidium são protozoários cosmopolitas cuja epidemiologia é especialmente importante devido ao seu expressivo potencial zoonótico. Animais silvestres são frequentemente relatados como reservatórios da giardiose e criptosporidiose humanas, todavia, são escassas as evidências sobre sua real importância na manutenção e disseminação destas protozooses. No intuito de avaliar a ocorrência e determinar os genótipos responsáveis pela infecção de mamíferos neotropicais, 452 amostras fecais procedentes de 52 diferentes espécies, in situ e ex situ, de sete localidades distintas foram avaliadas por métodos de diagnóstico microscópico, seguidos por técnicas moleculares de amplificação (Nested PCR), sequenciamento e caracterização genotípica. Os resultados revelaram prevalência aparente de 6,2% para Giardia spp. e de 4,8% para Cryptosporidium spp. (n=343). Dezessete diferentes espécies de mamíferos silvestres foram positivas, sendo 11 para Giardia spp., nove para Cryptosporidium spp. e três para ambos os protozoários. A caracterização molecular revelou a predominante presença de genótipos zoonóticos em mamíferos cativos (Giardia duodenalis genótipo AI) e de genótipos hospedeiro-específicos em animais de vida livre (Cryptosporidium sp. rat genotype III e Cryptosporidium wrairi). Foram também identificados Giardia duodenalis genótipo D em cachorro-do-mato Cerdocyon thous e Cryptosporidium sp. deer mouse genotype IV em bugio-preto Alouatta caraya, ambos mantidos em cativeiro. Aspectos ecológicos, como habitat, guilda trófica, estratégia do uso do ambiente e influência antrópica, foram considerados relevantes para a ocorrência dos parasitas. Tais achados demonstraram que animais silvestres podem ser infectados por genótipos zoonóticos e específicos dos agentes, o que revela a importância de estudos envolvendo esta abordagem para sugerir possíveis relações entre os protozoários, hospedeiros humanos, animais domésticos e silvestres perante diferentes características ambientais. / Giardia and Cryptosporidium are cosmopolitan protozoans whose epidemiology is especially important due to its significant zoonotic potencial. Wild animals are often reported as reservoirs of human giardiosis and cryptosporidiosis, however, there is little evidence about their real importance in the maintenance and dissemination of these protozoosis. In order to evaluate the occurrence and determine the genotypes responsible for neotropical mammals infection, 452 fecal samples of 52 different species, in situ and ex situ, of seven locations were evaluated by microscopic methods of diagnosis, followed by molecular amplification (Nested PCR), sequencing and genotypic chacacterization techniques. The results revealed an apparent prevalence of 6,2% for Giardia spp. and 4,8% for Cryptosporidium spp. (n=343). Seventeen different species of wild mammals were positive, 11 for Giardia spp., nine for Cryptosporidium spp. and three for both protozoans. Molecular characterization shows predominant presence of zoonotic genotypes in captive mammals (Giardia duodenalis genotype AI) and host-specific genotypes in free-living animals (Cryptosporidium sp. rat genotype III and Cryptosporidium wrairi). Giardia duodenalis genotype D in crab-eating fox Cerdocyon thous and Cryptosporidium sp. deer mouse genotype IV in black howler monkey Alouatta caraya, both in captivity, were also identified. Ecological aspects, like habitat, trophic guilds, strategy of using the environment and human influence, were considered relevant to occurrence of the parasites. These findings could demonstrate wild mammals can be infected by zoonotic and specific genotypes of agents, which shows the importance of studies using this approach to suggest possible relationships between protozoans, human hosts, domestic animals and wildlife facing different environmental characteristics.

O vírus da imunodeficiência felina (FIV) é um lentivirus que infecta gatos domésticos (Felis catus), causando uma imunodeficiência progressiva análoga a AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Humana). A ampla heterogeneidade molecular do FIV e a alta capacidade de promover mutações sob pressões imunológicas, farmacológicas ou ambientais são características inerentes aos lentivirus. A identificação do subtipo de vírus e o conhecimento da diversidade genética das cepas circulantes são fundamentais para o desenvolvimento estratégico de vacinas capazes de resultar na imunização do hospedeiro e no estabelecimento de testes diagnósticos. Objetivando isolar o material genético e realizar a caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina foram coletadas e analisadas amostras de sangue periférico de felinos portadores do FIV, co-habitantes de um abrigo aberto de felinos, em São Paulo, SP, em quatro momentos distintos, T0 (zero), no momento inicial da avaliação e seis, dez e quinze meses após a coleta inicial, correspondendo aos momentos T1, T2 e T3, respectivamente. Foram realizados testes hematológicos e bioquímicos nas quatro coletas com a finalidade de avaliar a evolução clínica da infecção. Adicionalmente foi realizado um estudo de variabilidade genética do FIV, com base no sequenciamento dos produtos amplificados dos gene env obtidos no estudo. Os envelopes clonados foram utilizados para transfectar células resultando na expressão das proteínas do envelope que possibilitaram estudos com os receptores celulares utilizados pelos isolados brasileiros. As análises das seqüências virais mostraram que todas as amostras, do abrigo, pertencem ao subtipo B. Foi observado um baixo percentual de mudança, da região estudada do vírus entre as quatro coletas. O fenômeno de "quasispecies" virais, bastante estudado no HIV, pode ser documentado em nossas amostras. Nos exames hematológicos e bioquímicos; hematócrito, hemoglobina, contagem total de leucócitos, proteína total e gamaglobulinas; dos animais infectados pelo FIV observou-se mudanças entre a primeira e quarta coleta demonstrando assim a importância dos testes utilizados no acompanhamento da infecção pelo FIV. Com relação aos dados com os receptores do FIV, os resultados apontam uma menor complexidade na interação entre os envelopes dos isolados do estudo com o receptor CD134 para proceder a infecção quando comparados com cepas virulentas do FIV. / FIV is an important viral pathogen that infects the domestic cat and causes a slow progressive degeneration of the immune system which eventually leads to a disease comparable to acquired immune deficiency syndrome (AIDS) in humans. Similar to all retroviruses, FIV has a relatively high evolutionary rate and genomic heterogeneity. The determination of subtype and the knowledge of genetic diversity of the current strains are very important to developing a protective vaccine and for the routine diagnosis of infection. The aim of this study was to isolate and characterize samples of feline immunodeficiency virus from cats from an open shelter in Sao Paulo, Brazil. All cats infected with FIV from this shelter were sampled on August 26th, 2007 (T0) and also six (T1), ten (T2) and fifteen (T3) months after the basal sampling (T0). In each sample, blood was analyzed for the following: complete hematology, clinical chemistry and serum protein electrophoresis. Hematological and clinical chemistry parameters were analyzed to determine laboratory parameters characteristic of disease progression which allow a better description of the chronic phase of the infection. Furthermore, analyses of the variants from each sample were performed in order to estimate the degree of divergence following infection with Brazilian strains. The FIV envelope glycoprotein gene from Brazilian FIV isolates cloned were transfected to investigate the receptor usage. The sequences of all virus of the study belong to subtype B. Little sequence variation was observed in circulating viruses between the samples from each infected cat. Quasispecies of FIV have been detected in this study. The following hematological and clinical chemistry parameters were changed in the FIV-infected cats between the first blood sampling and last blood sampling: packed cell volume (PCV), hemoglobin, total white blood cells (WBC), total protein and gamma globulin fractions. Monitoring of hematological and clinical chemistry parameters may prove useful for the evaluation of disease progress. Regarding receptors, our data are consistent with isolates of the study requiring a less complex interaction with CD134 for infection to proceed compared to the virulent FIV isolates.

Não consta resumo na publicação. / The α-amylase inhibitor from Phaseolus vulgaris is a glucoprotein with a Molecular Weight of 53,000 daltons and an isoelectric point of 4.35. It can be dissociated by SDS or guanidin in three subunities having molecular weight of 17,500, 16,000 and 13,500. The molecule has 400 amino acid residues and no disulfide brigde. The C and N terminal amino acid are respectively: leucine and tyrosine and threonine, alanine, and glutamic acid. It is resistent to proteolysis in the native state.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T16:29:26Z No. of bitstreams: 1 Tese_Marcia de Doutorado DEFINITIVA - Para entregar no PGBP.pdf: 21978043 bytes, checksum: 1d029677a684e2e22915d3841a8206d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T16:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Marcia de Doutorado DEFINITIVA - Para entregar no PGBP.pdf: 21978043 bytes, checksum: 1d029677a684e2e22915d3841a8206d3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O dengue tem se apresentado como um grave problema de saúde pública no Brasil, razão pela qual, vários estudos têm sido realizados com o intuito de esclarecer aspectos da epidemiologia dessa doença em diferentes localidades, com histórias distintas de circulação dos diferentes sorotipos dos vírus dengue (DENV). A implantação de um Programa de vigilância entomológica e virológica e, que desde 1986 visa detectar e monitorar a circulação dos sorotipos e genótipos DENV, resultou em distintas oportunidades, no isolamento de amostras de DENV de vetores e de casos humanos permitindo a caracterização molecular e a análise filogenética, fornecendo informações relevantes para a compreensão da interação vetor- vírus- humanos. O entendimento da variação genética no vírus quando este replica em mosquitos, e como essas variações atuam durante a transmissão entre humanos e mosquitos permanecem desconhecidos. Portanto, visando contribuir para um melhor conhecimento dos DENV e sua interação com o mosquito vetor, realizamos neste trabalho, a caracterização molecular e análise filogenética de DENV isolados de mosquitos naturalmente infectados e de casos humanos, provenientes de epidemias ocorridas entre 1986 e 2011 no Brasil. Foi demonstrado que os métodos moleculares foram fundamentais por facilitarem a rápida identificação dos vírus e consequentemente o monitoramento dos genótipos circulantes. A RT-PCR para a triagem de DENV em vetores se mostrou uma ferramenta útil para a vigilância virológica, com taxas de detecção que variaram de 0,78% a 25% no período estudado. A análise filogenética dos DENV-1 isolados de mosquitos e humanos mostrou que o genótipo V (Américas/África) continua o mesmo circulante desde a sua introdução, porém foi demonstrada a co-circulação de duas novas linhagens (II e III) no período de 2009 a 2011. O sequenciamento do genoma completo de DENV-3 isolado a partir de Ae. aegypti naturalmente infectados no Rio de Janeiro (RJ), assim como a análise da região 3´NC de vírus isolados em mosquitos e humanos, caracterizou estes vírus como pertencentes ao GIII e revelou a presença de inserções e deleções na região 3´NC do genoma. As deleções observadas na região 3´NC resultaram em estruturas secundárias porém nem todas as cepas com inserções nesta região apresentaram estrutura similar substituições exclusivas à cepa de DENV-3 isolada em mosquito foram observadas no gene NS5, incluindo a substituição que resultou na formação de um códon de terminação. O teste comercial Simplexa™ Dengue Real Time RT-PCR, disponível recentemente, foi utilizado pela primeira vez para detecção dos DENV e se mostrou um método molecular alternativo para as vigilâncias entomológica e virológica. O RT-PCR em Tempo Real possibilitou, pela primeira vez, a quantificação de DENV-1 e DENV-4 em fêmeas individuais naturalmente infectadas (1,6 x 104 cópias/mL e 1,08 x 103 cópias/mL, respectivamente). Considerando-se o elevado índice de infestação por Ae. aegypti em todo o país, o estudo da caracterização dos DENV circulantes torna-se de grande importância no conhecimento da relação vírus-vetor pela análise da variabilidade genética, dispersão e persistência de genótipos durante a transmissão destes vírus / Dengue has been a major public health problem in Brazil with several studies performed aiming to elucidate the disease epidemiology in geographically distinct areas with different dengue viruses (DENV) circulation. The establishment of an entomological and virological program since 1986 with the objective of detecting and monitoring DENV serotypes and genotypes resulted in distinct opportunities in DENV isolation from vectors and human cases, allowing the molecular characterization and phylogenetic analysis, providing relevant information for the understanding of the vector-virus-humans interactions. The understanding of the virus genetic variability when it replicates on mosquitoes and how those variations act during the transmission between humans and mosquitoes is not fully understood. Therefore, aiming to contribute for a better understanding of DENV and its interactions with the mosquito vector, we performed in this study the molecular characterization and phylogenetic analysis of viruses isolated from naturally infected mosquitoes and human cases, from epidemics occurred between 1986 and 2011 in Brazil. It has been shown that the molecular techniques were essential for allowing the rapid identification of the viruses and consequently the monitoring of the circulating genotypes. The RT-PCR for DENV screening in vectors has shown to be a useful tool for the virological surveillance, with detection rates varying from 0.78% to 25% in the studied period. The phylogenetic analysis from DENV-1 isolated from mosquitoes and human cases showed that genptype V (America/Africa) is still the same genotype circulating since this serotype introduction, however it was demonstrated the co-circulation of two distinct new viral lineages (II and III) from 2009 to 2011. The complete genome sequencing of a DENV-3 isolated from naturally infected Ae. aegypti in Rio de Janeiro (RJ) and the analysis of the 3´UTR region from viruses isolated from mosquitoes and humans, has characterized those viruses as belonging to genotype III (GIII) and revealed the presence of insertions and deletions in the 3´UTR region of the genome. The deletions observed in the 3´UTR region resulted in similar secondary structures, however not all strains with insertions were similar in structure. Exclusive substitutions to the DENV-3 isolated from the mosquitoes were observed in NS5, including a substitution leading to a stop codon formation. The Simplexa™ Dengue Real Time RT-PCR commercial kit, recently available, was used for the first time for DENV detection and it has been shown to be an alternative molecular method for the entomological and virological surveillances, The Real Time RT-PCR has allowed, for the first time the DENV-1 and DENV-4 quantification in single Ae. aegypti naturally infected (1.6 x 104 copies/mL e 1.08 x 103 copies/mL, respectively). Considering the high Ae. aegypti infestation index in the country, the characterization of DENV circulating is very relevant for the understanding of the virus-vector relations by the analysis of the genetic variability, spread and persistence of genotypes during the transmission of those viruses

Submitted by Tatiana Oliveira (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-06-02T21:57:40Z No. of bitstreams: 1 debora_rl_santos_ioc_bp_0004_2010.pdf: 851931 bytes, checksum: 53ba90215d519794dc32572e27e887e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-02T21:57:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 debora_rl_santos_ioc_bp_0004_2010.pdf: 851931 bytes, checksum: 53ba90215d519794dc32572e27e887e9 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Vírus da hepatite E (HEV) detectados em amostras de origem animal vêm sendo associados a casos humanos esporádicos de hepatite E aguda em regiões não endêmicas. No Brasil, a alta prevalência de anticorpos anti-HEV em suínos foi demonstrada em granjas comerciais sugerindo a grande disseminação deste vírus em rebanhos suinícolos. A fim de se comprovar a circulação do HEV no país três investigações foram conduzidas a partir de amostras obtidas de suínos, do ambiente, e de humanos. No primeiro estudo, foi realizado o acompanhamento sorológico de 26 animais desde o nascimento até a idade do abate em uma granja comercial e de 47 animais de uma fazenda modelo nos estados do Rio de Janeiro e Mato Grosso, respectivamente. Amostras de fezes foram coletadas de pocilgas de animais de diferentes faixas etárias. Ao fim deste estudo, a maioria dos animais era sororeativa para anti-HEV. Pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), o genoma parcial do HEV foi detectado e as amostras classificadas no genótipo 3, o mesmo que circula em outras populações suínas tanto de regiões endêmicas quanto não-endêmicas. Posteriormente, para se avaliar a incidência de animais com infecção corrente durante o abate, um estudo foi conduzido em três abatedouros fiscalizados pelo Serviço de Inspeção Estadual do Rio de Janeiro (SIE). Pela técnica de PCR em tempo real, o HEV foi detectado em 9,6% das amostras obtidas de animais.Foram realizadas coletas de efluentes não tratados dos abatedouros estudados e o genoma do HEV foi detectado em três pontos de coleta de um abatedouro. A quantificação média observada foi de 101 a 105 cópias/mL para as amostras animais de bile e de 102 cópias/mL para as amostras ambientais. A detecção do genoma parcial pela técnica de nested RT-PCR foi realizada, para caracterização molecular das amostras. Estas foram classificadas no genótipo 3 subtipo 3b do HEV, agrupando-se com as amostras caracterizadas do estudo anterior sugerindo a circulação endêmica do HEV no Rio de Janeiro. Em um estudo retrospectivo realizado com pacientes agudos de hepatite não A-C atendidos no Grupo de Atendimento para Hepatites Virais do IOC/Fiocruz foi identificado o primeiro caso humano confirmado de hepatite E do Brasil. Esta amostra agrupou-se no genótipo 3 subtipo 3b, também relacionada às amostras obtidas de suínos da granja e dos abatedouros. De acordo as informações epidemiológicas do paciente, o consumo de carne de porco pode ter sido a fonte de infecção. Os estudos apresentados foram os primeiros que constataram a circulação do HEV em suínos, amostras ambientais e em humanos no Brasil. / Hepatitis E virus (HEV) detected in samples of animal origin have been associated with sporadic human cases of acute hepatitis E in non-endemic regions. In Brazil, the high prevalence of anti-HEV in pigs on commercial farms has been demonstrated suggesting the wide spread of this virus in herds suinícolos. In order to check the movement of the country HEV three investigations were conducted on samples obtained from pigs, environmental, and human. In the first study, we performed a serological monitoring of 26 animals from birth until the age of slaughter at a commercial farm and 47 animals on a model farm in the states of Rio de Janeiro and Mato Grosso, respectively. Stool samples were collected from pens of animals of different ages. At the end of this study, the majority of animals was sororeativa for anti-HEV. The technique of polymerase chain reaction (PCR), a partial genome of HEV has been detected and classified the samples with genotype 3, which runs the same in other populations of both pork and non-endemic regions endemic. Subsequently, to evaluate the incidence of infected animals during slaughter chain, a study was conducted in three slaughterhouses inspected by the State Inspection Service of Rio de Janeiro (SIE). By PCR in real time, HEV was detected in 9.6% of samples of sampled animais.Foram of untreated effluent from slaughterhouses and studied HEV genome was detected in three sampling points of a slaughterhouse. Quantification was observed mean 101-105 copies / mL for animals samples of bile and 102 copies / mL for environmental samples. The detection of partial genome by the technique of nested RT-PCR was performed for molecular characterization of the samples. These were classified as genotype 3 HEV subtype 3b, grouping with samples characterized in the previous study suggesting the endemic circulation of HEV in Rio de Janeiro. In a retrospective study of patients with acute hepatitis non-AC treated at Care Group for Viral Hepatitis of the IOC / Fiocruz was identified the first confirmed human case of hepatitis E in Brazil. This sample was grouped with genotype 3 subtype 3b, also related to the samples obtained from pigs on the farm and the slaughterhouse. According to epidemiological information of the patient, the consumption of pork may have been the source of infection. The studies presented were the first who observed the circulation of HEV in swine, human and environmental samples in Brazil.

Submitted by Andrea Hartke (andreamh@fiocruz.br) on 2014-11-24T13:25:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruno Dias Ramos.pdf: 4916835 bytes, checksum: fa6000cbfecb89598eef24d308186fc7 (MD5) / Approved for entry into archive by Andrea Hartke (andreamh@fiocruz.br) on 2014-11-24T17:25:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruno Dias Ramos.pdf: 4916835 bytes, checksum: fa6000cbfecb89598eef24d308186fc7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-24T17:25:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruno Dias Ramos.pdf: 4916835 bytes, checksum: fa6000cbfecb89598eef24d308186fc7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil. / Desde sua descoberta, no inicio do século 20, o protozoário parasita causador da Doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, se tornou alvo de estudo em diversas instituições de pesquisa ao redor do mundo. Portador de características peculiares interessantes, T. cruzi é um excelente modelo de estudo de processo de regulação pós-transcricional. O parasita teve o seu genoma sequênciado em 2005, e foi observado que muitos dos genes contidas em seu genoma não apresentaram uma descrição funcional confiável, sendo anotados como codificadores de "proteínas hipotéticas". Tendo em vista essa ausência de caracterização funcional de uma parcela considerável do genoma de T. cruzi, o presente trabalho se propôs a realizar a caracterização molecular de um grupo de 10 proteínas de T. cruzi anotadas como "hipotéticas", e que se apresentavam diferencialmente expressas na forma celular tripomastigota metacíclica do parasita, a forma infectiva não-replicativa que inicialmente infecta o hospedeiro mamífero na via usual de transmissão da doença via o inseto vetor. Após amplificação, todos os dez genes selecionados no estudo foram clonados em vetor de entrada (pDONRTM221, Invitrogen), a partir do qual foi possível a transferência do fragmento gênico para outros vetores, visando diferentes abordagens de análise. Todos os genes foram transferidos com sucesso para o vetor de expressão pDESTTM17, de expressão em Escherichia coli, e nove para o vetor pTcGFP, de expressão no próprio T. cruzi e que fusiona à proteína uma etiqueta fluorescente. Dos genes inseridos no pDESTTM17, sete deles foram com sucesso expressos em E. coli, sendo obtidos anticorpos policlonais contra seis das proteínas expressas. Os ensaios de western blot realizados com os soros obtidos contra extratos das quatro formas celulares de T. cruzi corroboram os dados previamente obtidos de sequenciamento de mRNA. Foram realizados ensaios de imunolocalização com os soros obtidos, no entanto, os padrões encontrados nas imunolocalizações foram diferentes dos observados pelas proteínas fusionadas à etiqueta fluorescente GFP. Ensaios de nocaute gênico das proteínas estudadas foram iniciados, e em breve virão a contribuir para o trabalho. Espera-se que os dados obtidos com esse estudo venham melhorar a anotação funcional e a compreensão das proteínas selecionadas. / Since it discovery in early 20th century, the Chagas Disease causative protozoan parasite, Trypanosoma cruzi, became the subject of study in several research institutions around de world. Carrier of interesting peculiar characteristics, T. cruzi is an excellent study model of post-transcriptional regulation process. The parasite had its genome sequenced in 2005, and it was observed that several of it genes did not show a reliable functional description, been annotated as coding for "hypothetical proteins". Given this lack of functional characterization of a considerable portion of T. cruzi genome, the present study proposed to perform a molecular characterization of a group of ten T. cruzi proteins annotated as "hypothetical" that in mRNA studies had showed to be differentially expressed in the parasite metacyclic trypomastigotes cell form, the infective non-replicative that initially infect the mammalian host in the usual route of transmission of the disease via the insect vector. After been amplified all the ten genes selected in the study were cloned into entry vector (pDONRTM221, Invitrogen) from which it was possible to transfer the gene fragment to other vectors, targeting different approaches to analysis. All genes were successfully transferred to pDESTTM17 expression vector, for expression in Escherichia coli, and nine to the pTcGFP vector, for expression of the protein fused to a fluorescent tag in T. cruzi. From all genes inserted into pDESTTM17, seven were successfully expressed in E. coli, which six were purified and inoculated in mice for obtaining polyclonal antibody. Western blot assays performed against protein extracts of the four T. cruzi cell forms using this sera corroborate the date previously obtained by mRNA sequencing. Immunolocalization assays were performed, however, the localization patterns observed in the immunolocalizations were different from those observed by the proteins fused to the GFP fluorescent tag. Gene knockout assays of the studied proteins were started and soon will come to contribute to this characterization work. It is hoped that the data obtained from this study will improve the functional annotation and understanding of the selected proteins.