O reconhecimento da flagelina pelos NLRs Naip5 e NLRC4 leva à formação do complexo multiproteico denominado inflamassoma que culmina na ativação da caspase-1, com consequente clivagem da forma inativa das citocinas pró-inflamatórias IL-1b e IL-18 e morte da célula infectada. Neste trabalho pudemos observar que in vitro, a maturação de BMDCs com a estimulação com flagelina citosólica, inserida em vesículas lipídicas que permitem a transfecção da flagelina para o citosol, foi independente da ativação de NLRC4, caspase-1 e TLR5, mas somente de MyD88. Já a ativação de linfócitos T por estas BMDCs ativadas por flagelina citosólica é dependente de caspase-1 e MyD88. A neutralização da citocina IL-1a, levou à inibição da ativação de linfócitos T, indicando a contribuição desta para a montagem de resposta imune. A neutralização de IL-1a também levou a uma redução na produção de IL-12, que seria a citocina responsável pela polarização dos linfócitos para Th1. A imunização com flagelina leva ao desenvolvimento de imunidade protetora contra o desafio com S. typhimurium, igualmente dependente de caspase-1 e MyD88. Podemos dizer que a flagelina induz resposta imune tanto in vivo quanto in vitro e que, em ambos os casos, há a participação das moléculas caspase-1 e MyD88. / TLR5 activates inflammatory genes through MyD88 pathway whereas NLRC4 and NAIP5 assemble multiprotein complexes called inflammasomes, leading to caspase-1 activation and secretion of proinflammatory cytokines IL-1 and IL-18. Cytosolic flagellin (FLA-BSDot) induced upregulation of costimulatory molecules independent on TLR5, NLRC4 and Caspase-1, but dependent on MyD88. In addition, FLA-BSDot-stimulated OVA-pulsed BMDCs induced proliferation and production of IFN by OT-II splenocytes, dependent on caspase-1 and MyD88. FLA-BSDot stimulation leads to the secretion of IL-1 and IL-1. Neutralization of IL-1 inhibited BMDCs maturation in response to FLA-BSDot and led to decreased IFN production by OT-II splenocytes. Searching for the effector mechanism by which IL-1 induces Th1 polarization in response to FLA-BSDot, we observed a significant reduction in IL-12 production when IL-1 was neutralized. Also, we could see that adaptive immune responses induced by flagellin in vivo was protective against S.typhimurium lethal challenge, showing again a role for caspase-1 and MyD88. From these data we can infer that caspase-1 and MyD88 are both involved in the adaptive response induced by flagelin both in vitro and in vivo.

O reconhecimento da flagelina pelos NLRs Naip5 e NLRC4 leva à formação do complexo multiproteico denominado inflamassoma que culmina na ativação da caspase-1, com consequente clivagem da forma inativa das citocinas pró-inflamatórias IL-1b e IL-18 e morte da célula infectada. Neste trabalho pudemos observar que in vitro, a maturação de BMDCs com a estimulação com flagelina citosólica, inserida em vesículas lipídicas que permitem a transfecção da flagelina para o citosol, foi independente da ativação de NLRC4, caspase-1 e TLR5, mas somente de MyD88. Já a ativação de linfócitos T por estas BMDCs ativadas por flagelina citosólica é dependente de caspase-1 e MyD88. A neutralização da citocina IL-1a, levou à inibição da ativação de linfócitos T, indicando a contribuição desta para a montagem de resposta imune. A neutralização de IL-1a também levou a uma redução na produção de IL-12, que seria a citocina responsável pela polarização dos linfócitos para Th1. A imunização com flagelina leva ao desenvolvimento de imunidade protetora contra o desafio com S. typhimurium, igualmente dependente de caspase-1 e MyD88. Podemos dizer que a flagelina induz resposta imune tanto in vivo quanto in vitro e que, em ambos os casos, há a participação das moléculas caspase-1 e MyD88. / TLR5 activates inflammatory genes through MyD88 pathway whereas NLRC4 and NAIP5 assemble multiprotein complexes called inflammasomes, leading to caspase-1 activation and secretion of proinflammatory cytokines IL-1 and IL-18. Cytosolic flagellin (FLA-BSDot) induced upregulation of costimulatory molecules independent on TLR5, NLRC4 and Caspase-1, but dependent on MyD88. In addition, FLA-BSDot-stimulated OVA-pulsed BMDCs induced proliferation and production of IFN by OT-II splenocytes, dependent on caspase-1 and MyD88. FLA-BSDot stimulation leads to the secretion of IL-1 and IL-1. Neutralization of IL-1 inhibited BMDCs maturation in response to FLA-BSDot and led to decreased IFN production by OT-II splenocytes. Searching for the effector mechanism by which IL-1 induces Th1 polarization in response to FLA-BSDot, we observed a significant reduction in IL-12 production when IL-1 was neutralized. Also, we could see that adaptive immune responses induced by flagellin in vivo was protective against S.typhimurium lethal challenge, showing again a role for caspase-1 and MyD88. From these data we can infer that caspase-1 and MyD88 are both involved in the adaptive response induced by flagelin both in vitro and in vivo.

Os campos elétricos alternados de frequência intermediária (10 KHz a 1MHz) e baixa intensidade têm efeitos inibitórios sobre o crescimento de várias linhagens celulares de tumores humanos e murinos. O objetivo geral do presente trabalho é conhecer os efeitos biológicos da aplicação externa de Campos Elétricos Alternados de intensidades de 10 V e 5 V nas frequências de 200kHz, 1Mhz e 2Mhz; em culturas de células de melanoma murino (B16F10) e fibroblastos humanos normais (FN1), durante 24 horas. Foram estudados os efeitos biológicos antiproliferativos e pró-apoptóticos através das seguintes análises: Citometria de Fluxo para identificar a distribuição das populações celulares nas fases do ciclo celular, Colorimétrico MTT para avaliar a viabilidade celular e Peroxidação Lipídica para avaliar a produção de radicais livres lipídicos poliinsaturados. Os resultados mostraram que em fibroblastos humanos normais o campo elétrico alternado induziu efeito antiproliferativo, indutor de necrose e apoptose, porém em menor efeito tóxico quando comparado às células de melanoma (B16F10), principalmente na frequência de 200 kHz. Por outro lado, na frequência de 2MHz e intensidade 10V, as células de melanoma presentes no sobrenadante e aderentes expressaram diferencialmente número de células mortas por apoptose (Anexina-V) e caspase-3 fosforilada. Os diferentes efeitos produzidos entre as duas linhagens estudadas atentam para o fato de que a compreensão dos mecanismos biofísicos da regulação do reparo e da proliferação celular envolve fenômenos celulares e vias de sinalização altamente complexas. / Electric fields of alternating intermediate frequency and low intensity have inhibitory effects on the growth of various tumor cell lines. The objective of this study was to evaluate the biological effects of external application of external alternating electric field (CEAE) intensities of 10 V and 5 V in the frequency 200kHz, 1MHz and 2MHz; in cultured murine melanoma cells (B16F10) and human fibroblasts normal (FN1). We studied the antiproliferative and pro-apoptotic by flow cytometry to identify the distribution of cell populations in the phases of the cell cycle, Colorimetric MTT to evaluate cell viability and lipid peroxidation to evaluate the production of free radicals lipid acids. The results showed that in fibroblasts (FN 1) the normal CEAE induced antiproliferative effect, inducing apoptosis and necrosis, but at a lower cytotoxic potential when applied to melanoma cells (B16F10), mainly in the frequency of 200 kHz. Moreover, the frequency of 2MHz and intensity 10V, the melanoma cells in supernatant and the members expressed differentially number of dead cells by apoptosis and caspase-3 phosphorylated. The different effects between the two strains studied to undermine the fact that understanding the biophysical mechanisms of regulation of repair and cell proliferation involves cellular phenomena and signaling pathways highly specific and complex.

A eliminação de células-alvo por linfócitos T citotóxicos (CTLs) exerce um papel importante na imunidade protetora contra patógenos e células tumorais, o que pode ser desencadeada pela ação de perforina e granzima, ou pelas interações Fas-FasL. A interação Fas-FasL promove a apoptose pela formação de DISC, que é composto pela cauda citoplasmática de Fas, a proteína adaptadora FADD e a pro-caspase-8. Nesse complexo, a caspase-8 é ativada e induz a clivagem das caspases efetoras -3, -6 e -7, e/ou BID - membro da família Bcl-2, desencadeando o sinal apoptótico. Devido à sua relevância na sinalização apoptótica, a caspase-8 é alvo de inúmeros estudos. Uma correlação entre mutações no gene CASP8 de células tumorais e alta atividade citolítica foi demonstrada, sugerindo que a deficiência em caspase-8 pode representar um mecanismo de evasão imune. Nesse projeto, nosso objetivo foi avaliar o efeito da deficiência em caspase-8 na eliminação de células-alvo por linfócitos T CD8&#43. Para isso, nós estabelecemos uma técnica de citotoxicidade in vitro utilizando blastos de camundongos OTI como células efetoras e células RMA como alvo. Nesse ensaio, as células-alvo foram marcadas e pulsadas com diferentes concentrações de peptídeo OVA e colocadas em co-cultura a diferentes razões efetora: alvo (E:A) com linfócitos OTI, estimulados por 7 dias com ConA e rIL-2. A eliminação específica foi avaliada após 16 horas de co-cultura. Como controle para avaliar a especificidade ao MHC de classe I, utilizamos as células RMA-S, uma vez que expressam níveis reduzidos desta molécula na superfície. Os resultados demonstraram que o ensaio estabelecido é eficiente e antígeno-específico. Foi também observado que a eliminação das células RMA-S é menor em comparação com as células RMA, sendo essa diferença melhor discriminada em condições com números limitados de células efetoras. Para avaliar o efeito da caspase-8, células RMA caspase-8-suficientes e -deficientes, obtidas pela técnica CRISPR-Cas9, foram utilizadas como alvo nesse ensaio. Os resultados demonstram que, em condições com menor número de células efetoras, as células caspase-8-deficientes são significativamente mais resistentes à eliminação por linfócitos T CD8&#43, em comparação com as células caspase-8-suficientes. Portanto, nossos dados corroboram com a ideia de que a deficiência em caspase-8 poderia representar um mecanismo de evasão imune, principalmente na eliminação por linfócitos T CD8&#43. / The killing of target cells by cytotoxic T lymphocytes (CTLs) plays a major role in protective immunity to pathogens and tumor cells, which can be triggered by either the action of perforin and granzymes or FAS-FASL interactions. The Fas-FasL interaction leads to apoptosis through the formation of DISC, which is composed by the cytoplasmic tail of Fas, the adaptor protein FADD and the pro-caspase-8. At the complex, caspase-8 become activated and transduce the apoptotic signal by cleaving the effector caspases-3, -6 and -7 and/or the Bcl-2 family member Bid. Due to its role on apoptotic signaling, caspase-8 is the target of several studies. Recently, it has been demonstrated a correlation between mutations in CASP8 in tumors from patients with high cytolytic activity, suggesting that deficiency in caspase-8 may represent an immune evasion mechanism. Our project aimed to evaluate the effect of caspase-8 deficiency on the elimination of target cells by CD8&#43 T lymphocytes. In order to assess this elimination, we have established an in vitro cytotoxic assay using as effector, blasts from OTI mice, and as target, RMA cells. In this assay, the target cells were labeled, pulsed with OVA peptide at different concentrations and then co-cultured with OTI lymphocytes, which were stimulated with ConA and rIL-2, at different effector: target (E: T) ratios. The specific elimination was evaluated after 16 hours of co-culture. As a control to assess the specificity to MHCI of our assay, RMA-S cells were used because they have reduced levels of MHCI at surface. The results have shown that OTI blasts have effector capacity and that our established assay is antigen-specific. In addition, we observed that RMA-S elimination is reduced in comparison to RMA cells. The difference between RMA and RMA-S is better detected in conditions with limited number of effector cells. In order to assess the effect of caspase-8 in the resistance to elimination by CD8&#43 T cells, caspase-8-sufficient and deficient RMA cells (obtained by CRISPR-Cas9 technique) were used as targets in this assay. Our results demonstrate that caspase-8-deficient cells are more resistant to elimination than wild-type counterparts. This difference is better detected at conditions with reduced number of effector cells. Thus, our data suggests the deficiency in caspase-8 results in lower elimination by CD8&#43 T lymphocytes, suggesting this might represent an immune evasion mechanism.

Os campos elétricos alternados de frequência intermediária (10 KHz a 1MHz) e baixa intensidade têm efeitos inibitórios sobre o crescimento de várias linhagens celulares de tumores humanos e murinos. O objetivo geral do presente trabalho é conhecer os efeitos biológicos da aplicação externa de Campos Elétricos Alternados de intensidades de 10 V e 5 V nas frequências de 200kHz, 1Mhz e 2Mhz; em culturas de células de melanoma murino (B16F10) e fibroblastos humanos normais (FN1), durante 24 horas. Foram estudados os efeitos biológicos antiproliferativos e pró-apoptóticos através das seguintes análises: Citometria de Fluxo para identificar a distribuição das populações celulares nas fases do ciclo celular, Colorimétrico MTT para avaliar a viabilidade celular e Peroxidação Lipídica para avaliar a produção de radicais livres lipídicos poliinsaturados. Os resultados mostraram que em fibroblastos humanos normais o campo elétrico alternado induziu efeito antiproliferativo, indutor de necrose e apoptose, porém em menor efeito tóxico quando comparado às células de melanoma (B16F10), principalmente na frequência de 200 kHz. Por outro lado, na frequência de 2MHz e intensidade 10V, as células de melanoma presentes no sobrenadante e aderentes expressaram diferencialmente número de células mortas por apoptose (Anexina-V) e caspase-3 fosforilada. Os diferentes efeitos produzidos entre as duas linhagens estudadas atentam para o fato de que a compreensão dos mecanismos biofísicos da regulação do reparo e da proliferação celular envolve fenômenos celulares e vias de sinalização altamente complexas. / Electric fields of alternating intermediate frequency and low intensity have inhibitory effects on the growth of various tumor cell lines. The objective of this study was to evaluate the biological effects of external application of external alternating electric field (CEAE) intensities of 10 V and 5 V in the frequency 200kHz, 1MHz and 2MHz; in cultured murine melanoma cells (B16F10) and human fibroblasts normal (FN1). We studied the antiproliferative and pro-apoptotic by flow cytometry to identify the distribution of cell populations in the phases of the cell cycle, Colorimetric MTT to evaluate cell viability and lipid peroxidation to evaluate the production of free radicals lipid acids. The results showed that in fibroblasts (FN 1) the normal CEAE induced antiproliferative effect, inducing apoptosis and necrosis, but at a lower cytotoxic potential when applied to melanoma cells (B16F10), mainly in the frequency of 200 kHz. Moreover, the frequency of 2MHz and intensity 10V, the melanoma cells in supernatant and the members expressed differentially number of dead cells by apoptosis and caspase-3 phosphorylated. The different effects between the two strains studied to undermine the fact that understanding the biophysical mechanisms of regulation of repair and cell proliferation involves cellular phenomena and signaling pathways highly specific and complex.

Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) é um dos agentes etiológicos da disenteria bacilar. Seu processo fisiopatológico é desencadeado pela expressão de fatores de virulência, que proporcionam sua invasão e sobrevivência nas células do hospedeiro, ativando o sistema imune inato e adaptativo da mucosa intestinal. Trabalhos recentes têm salientado a importância do sistema de secreção e da flagelina bacteriana como agonista de receptores da imuninade inata dos macrófagos, em especial alguns dos receptores do tipo NLR. Uma vez que esta espécie de E. coli também é capaz de expressar flagelina e fazer a montagem completa do flagelo e do sistema de secreção do tipo III, a nossa proposta foi avaliar o papel da flagelina e do sistema de secreção de EIEC na resposta imune dos macrófagos murinos. Para isso, utilizamos três cepas de EIEC: a cepa selvagem; a cepa mutante no gene responsável pela síntese da flagelina; e a cepa sem o plasmídio de virulência plnv, deficiente no sistema de secreção, para a infecção de macrófagos peritoniais de camundongos C57BI/6, caspase-1-/-, IPAF-/- e ASC-/-. Neste estudo foi possível observar que o escape bacteriano e a morte dos macrófagos infectados por EIEC, assim como a ativação da caspase-1 e posterior secreção de IL-1β é independente da flagelina bacteriana, mas dependente do sistema de secreção, além disso, a ativação da caspase-1 de macrófagos infectados por EIEC é dependente do receptor IPAF e parcialmente da proteína adaptadora ASC. Assim, no nosso modelo, a ativação da caspase-1 dos macrófagos infectados por EIEC parece estar envolvida com o processamento e secreção de IL-1β e, possivelmente na secreção de IL-18, mas não na morte celular. No modelo de infecção in vivo, o sistema de secreção bacteriano foi importante para a sobrevivência bacteriana no hospedeiro, assim como para a indução de uma resposta inflamatória no local da infecção. Ainda, a caspase-1 parece ter um papel importante para o controle da infecção in vivo por EIEC, podendo assim contribuir para uma resposta imune protetora do hospedeiro. / Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) is one of the etiologic agents responsible for bacillary dysentery. The pathophysiological process induced by this bacteria is triggered by the expression of virulence factors that provide the invasion and survival in host cells, resulting in activation of innate and adaptive immune system present on intestinal mucosa. Recent studies have emphasized the importance of the secretion system and bacterial flagellin as agonist of innate immune receptors present in macrophage, especially NLR (Nod like receptors). Then, our proposal was evaluate the role of flagellin (f1iC) and secretion system of EIEC in the induction of immune response of murine macrophages using the EIEC strains wild type (WT), mutant flagellin gene (f1iC), and a strain deficient in secretion system (DSS) for infection of peritoneal macrophages of C57Bl/6, caspase-1-/-, IPAF-/- and ASC-/-- mice. In this study we observed that the bacterial escape and death of infected macrophages with EIEC, the caspase-1 activation and subsequent IL-1β secretion is independent of bacterial flagellin, but dependent of secretion system, moreover, the caspase-1 activation in infected macrophages is IPAF-dependent and partially dependent of the adapter protein ASC. Thus, in our model, the caspase-1 activation in EIEC infected macrophages seems to be involved with the processing and secretion of IL-1β and possibly with the secretion of IL-18, but not involved with cell death. In the infection model in vivo, bacterial secretion system was important for bacterial survival in the host, as well as for the inflammatory response induction at the infection site. In addition, caspase-1 seems to have an important role to the control of in vivo infection by EIEC and can contribute to a protective immune response of the host.

Fragestellung: Um die Auswirkungen von genetischen Varianten für CASP1 in vivo analysieren zu können, sollte in dieser Arbeit ein Tiermodell generiert werden. Dadurch könnten die zugrundeliegenden Pathomechanismen der an „ICE-Fieber“ leidenden Patienten in einem gesamten Organismus aufgeklärt werden, da die Untersuchung von Patientenmaterial nur sehr eingeschränkt möglich ist. Ein Mausmodell stellt eine der besten Alternativen zur Analyse von Primärmaterial dar, da die Immunsysteme von Maus und Mensch sehr ähnlich sind. Ergebnisse: Um die natürliche Expression und Regulation der Procaspase-1 im Mausmodell zu gewährleisten, wurde für die Generierung ein BAC-Transgen verwendet. Mittels homologer Rekombination wurde die künstliche Variante C284A von Casp1 inseriert. Diese führt zu einer Zerstörung des enzymatischen Zentrums der Caspase-1 und zum vollständigen Verlust der enzymatischen Aktivität. Nach zwei Pronukleusinjektionen konnten lediglich drei Gründertiere mit mosaikartiger Expression des zufällig im Genom integrierten Transgens Casp1C284A und in der F1-Generation nur ein Tier mit stabil integriertem Transgen identifiziert werden. Die Nachkommen dieses transgenen Tieres zeigten keine basale Expression von Casp1C284A, jedoch konnte nach Stimulation von BMDCs mit LPS in vitro die Expression sowohl auf RNA- wie auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Ebenfalls eine erhöhte Sekretion der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-6 wurde in den Zellen der transgenen Tiere detektiert. Gleichfalls konnte nach Stimulation mit LPS in vivo eine gesteigerte Entzündungsreaktion in den Tieren mit Casp1C284A gezeigt werden, da ein stärkerer und länger anhaltender Abfall der peripheren Körpertemperatur und außerdem eine gesteigerte Sekretion von TNF-α und IL-6 zu verzeichnen war. Eine gesteigerte Inflammation des fetalen Gewebes, ausgelöst durch die integrierte künstliche Variante der Procaspase-1, könnte die Frage nach der geringen Anzahl der generierten Gründertiere beantworten. Hierfür wurde weiterführend eine Maus mit einem konditionalen Casp1C284A-Konstrukts generiert, welches zusätzlich eine zeit- als auch zelltyp-spezifische Expression der Procaspase-1 mit zentraler Mutation ermöglicht. Nach erfolgreichem Screening der ES-Zellen konnten diese in Blastozysten mikroinjiziert und Chimäre identifiziert werden. Eine embryonale Letalität des transgenen Konstrukts konnte durch die Verpaarung der ki-Tiere R26_Casp1C284A mit PGK-Cre-Tieren, die Cre-Rekombinase ubiquitär exprimieren, nahezu ausgeschlossen werden, da die Nachkommen alle lebensfähig waren und eine basale Expression des „knock-ins“ in mehreren Organen und auch in BMDCs nachgewiesen wurde. Ferner konnte nach Induktion einer Inflammation in vivo mit einer subletalen Dosis von LPS ein gesteigerter und länger anhaltender peripherer Temperaturabfall in den ki-Tieren ähnlich zu den transgenen Tieren detektiert werden. Desgleichen wurde eine Tendenz zu einer gesteigerten Sekretion der Zytokine TNF-α und IL-6 verzeichnet. Schlussfolgerungen: Mit dem transgenen Casp1C284A-Mausmodell als auch mit dem konditionalen R26_Casp1C284A-Modell konnte gezeigt weren, dass eine inaktive Variante der Procaspase-1 zur Entstehung einer gesteigerten Inflammation in einem gesamten Organismus führen kann. Somit können die im Rahmen dieser Arbeit generierten Tiermodelle zur Analyse der Pathomechanismen der an „ICE-Fieber“ leidenden Patienten herangezogen werden. In künftigen Studien kann ferner geklärt werden, ob die Entzündungsreaktionen durch eine verstärkte Interaktion von Casp1C284A mit der Kinase RIP2 verursacht werden und dadurch ähnlich wie im Patienten eine Aktivierung des proinflammatorischen Moleküls NFκB ausgelöst wird. Im Anschluss könnte eine spezifische Inhibierung des RIP2-Signalweges in diesen Mausmodellen getestet werden und schließlich im Patienten Anwendung finden. Die in dieser Arbeit generierten Mausmodelle könnten somit zur Erprobung zukünftiger therapeutischer Konzepte dienen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Das angeborene und adaptive Immunsystem 1.2 Sensoren des angeborenen Immunsystems 1.2.1 Membran-gebundene Rezeptoren 1.2.2 Intrazelluläre PRRS 1.2.3 Inflammasome als Multiproteinkomplexe 1.2.4 Das NLRP3-Inflammasom 1.2.5 Metabolische Krankheiten, die mit Inflammasom-Aktivität assoziiert werden 1.2.6 Inflammasom-assoziierte autoinflammatorische Erkrankungen 1.2.6.1 Das Cryoporin-assoziierte periodische Syndrom (CAPS) 1.2.6.2 Familian Mediterranean Fever (FMF) 1.2.6.3 Pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne syndrome (PAPA) 1.3 Caspase-1 1.3.1 Caspasen im Allgemeinen 1.3.2 Der Caspase-1 Gen-Lokus und das Caspase-1 Gen 1.3.3 Das Caspase-1 Protein 1.3.4 Funktionen von Caspase-1 1.3.4.1 Prozessierung der Zytokine pro-IL-1ß und pro-IL-18 1.3.4.2 Induktion von Pyroptose 1.3.4.3 Aktivierung der Caspase-1 durch ER-Stress 1.3.4.4 Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB 1.3.4.5 weitere Funktionen 1.3.5 Caspase-1 Genvarianten und Entzündung 1.4 Mausmodelle 1.4.1 NLRP3 1.4.2 Pyrin 1.4.3 Caspase-1 2 Zielsetzung 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Antibiotika 3.1.2 Antikörper 3.1.3 Bakterienstämme 3.1.4 BAC-Klon 3.1.5 Plasmide 3.1.6 Zelllinie 3.1.7 Chemikalien und Substanzen 3.1.8 Enzyme 3.1.9 Größenstandards 3.1.10 Oligonukleotide 3.1.11 Kommerzielle Kits 3.1.12 Puffer und Lösungen 3.1.13 Mauslinien 3.1.14 Medien 3.1.15 Geräte 3.1.16 Software 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Agarosegelelektrophorese 3.2.2 Amplifikation von Nukleinsäuren mittels Polymerasekettenreaktion 3.2.3 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 3.2.4 Aufreinigung von BAC-DNA mittels Elektroelution 3.2.5 Aufreinigung von Subklon-Plasmid-DNA für die Elektroporation von ES-Zellen 3.2.6 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit von DNA und RNA 3.2.7 c-DNA-Synthese 3.2.8 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatresten 3.2.9 DNA-Isolierung 3.2.9.1 DNA-Isolierung aus Bakterienzellen 3.2.9.2 DNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen 3.2.10 DNA-Sequenzierung 3.2.11 Enzymatische Restriktionsspaltung von DNA-Fragmenten 3.2.12 Homologe Rekombination von DNA-Sequenzen 3.2.13 Ligation von DNA-Fragmenten mit linearisierten Vektoren 3.2.14 Phenol-Chloroform-Extraktion 3.2.15 Pulsfeldgelelektrophorese 3.2.16 Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) 3.2.17 RNA-Isolation aus eukaryotischen Zellen und Geweben 3.2.18 Southern Blot 3.3 Mikrobiologische Methoden 3.3.1 Kultivierung von Bakterien 3.3.2 Hitzschock-Transformation von E.coli 3.3.3 Kryokonservierung 3.4 Proteinbiochemische Methoden 3.4.1 CBA (cytokine bead assay) 3.4.2 Proteinbestimmung 3.4.3 Immunpräzipitation mit Caspase-1 p10 (M-20) Antikörper von Santa Cruz 3.4.4 Immunpräzipitation mit AntiFlag M2 Affinity Gel von Sigma 3.4.5 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 3.4.6 Western Blot 3.4.7 Immunchemische Detektion von Proteinen 3.5 Zellbiologische Methoden 3.5.1 Bestimmung der Zellzahl 3.5.2 Isolierung und Generierung von BMDCs 3.5.3 Kryokonservierung von Zellen 3.5.4 Kultivierung von Zelllinien 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Genotypisierung 3.6.2 Haltung 3.6.3 Hautbiopsie 3.6.4 Retroorbitale Blutentnahme und Herzpunktion 3.6.5 Injektion von LPS 3.6.6 Organentnahme 4 Ergebnisse 4.1 Generierung eines Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.1 Identifikation und Verifizierung des BAC-Klons 4.1.2 Klonierung des Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.2.1 Entfernung der wt-loxP-Stelle vom Vektorrückrat 4.1.2.2 Insertion eines Flag-Tags 4.1.2.3 Einführung der Punktmutation C284A 4.1.3 „Shaving“ des generierten Casp1C284A-BAC-Konstrukts 4.1.4 Aufreinigung des Casp1C284A-BAC-Konstrukts und Pronukleusinjektion 4.1.5 Genotypisierung der transgenen Casp1C284A Gründertiere 4.2 Charakterisierung der transgenen Casp1C284A-Tiere (tg) 4.2.1 In vitro-Stimulation von BMDCs mit LPS 4.2.2 In vivo-Stimulation der transgenen Casp1C284A-Tiere 4.3 Generierung eines konditionalen Casp1C284A-Konstrukts 4.3.1 Klonierung des Targetingvektors pSerc_Casp1C284A_Flag und des Kontroll-Targetingvektors pSerc_Casp1_Flag 4.3.2 Screening von ES-Zellen 4.3.3 Genotypisierung der Chimäre und Verpaarung mit PGK-Cre Tieren 4.3.4 Expressionsanalyse der R26_Casp1C284A del-Tiere 4.3.5 In vivo-Stimulation der R26_Casp1C284A del-Tiere 5 Diskussion 5.1 Entwurf eines Mausmodells für ICE-Fieber 5.2 Konstruktion des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.3 Identifizierung von Casp1C284A-transgenen Tieren 5.4 Funktionelle Analyse des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.5 Konstruktion des konditionalen Mausmodells R26_Casp1C284A 5.6 Aktivierung des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A durch Cre-mediierte Rekombination in vivo 5.7 Funktionelle Analyse des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A 5.8 Relevanz eines Mausmodells für den Patienten 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang A. Abbildungsverzeichnis B. Tabellenverzeichnis / Problem: In order to recapitulate the effects of the CASP1 variants found in the patients a mouse model should be generated. The analysis of material from the patients unfortunately is very restricted and therefore the generation of a mouse model represents the best alternative to see if the in vitro hypothesis of the IFG group really applies to an in vivo situation. Results: To generate a transgenic mouse model the artificial variant Casp1C284A was inserted into a BAC to enable a natural expression and regulation of Casp1C284A. This mutation results in a disruption of the active centre and to a complete loss of the enzymatical activity of caspase-1. After two pronuclei injections we received 180 pubs of TG mice. Only three of them harboured transgenic sequences and only one animal in the F1 generation harboured the complete Casp1C284A sequence. Expression analyses of the offspring of this mouse revealed no basal transcriptional expression of the transgene. Hence, protein expression could not be detected in unstimulated cells. However, stimulation with LPS upregulated transcription and low-level translation of Casp1C284A in BMDCs and an elevated secretion of the proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 was detected as well. Likewise, after in vivo stimulation of transgenic mice with LPS i.p. the drop of body temperature was significantly enhanced in comparison to the control mice. And also the level of the proinflammatory cytokines was increased. Furthermore, a conditional R26_Casp1C284A construct allowing a temporal or a celltype specific expression of the caspase-1 with the central mutation was generated. Positive screened ES cell clones were injected into blastocysts and thereafter chimera could be identified. An embryonic lethality due to the integration of the enzymatically inactive caspase-1 could be excluded by the crossing with ubiquitious expressing PGK-Cre mice. All the corresponding mice were alive and a basal transcriptional as well translational expression was demonstrated. Concordantly with the results of the transgenic mice the conditional R26_Casp1C284A mice showed an enhanced drop of the body temperature in comparison to control mice after stimulation with sublethal dose of LPS in vivo. Likewise, a trend to an elevated secretion of TNF-α and IL-6 was observed. Conclusion: With the generated transgenic Casp1C284A as well as the conditional R26_Casp1C284A animal models we showed that an inactive variant of the procaspase-1 could result in a proinflammatory cytokine response and a development of an increased inflammation of a whole organism. Thus, these data support the previous postulated model of the IFG group for proinflammatory effects induced by variants of procaspase-1 with reduced enzymatic activity. Hence, the mouse models established in this work are suited for further analysis of the pathomechanism in the patients with ICE fever. For instance the cellular mechanism could be examined if the inflammation is provoked by an increased interaction of the mutated procaspase-1 with the kinase RIP2 and therefore the NFκB activation is increased, respectively. Also a further medicinal inhibition of the RIP2 signaling or other therapeutic testings in this mouse models are conceivable.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Das angeborene und adaptive Immunsystem 1.2 Sensoren des angeborenen Immunsystems 1.2.1 Membran-gebundene Rezeptoren 1.2.2 Intrazelluläre PRRS 1.2.3 Inflammasome als Multiproteinkomplexe 1.2.4 Das NLRP3-Inflammasom 1.2.5 Metabolische Krankheiten, die mit Inflammasom-Aktivität assoziiert werden 1.2.6 Inflammasom-assoziierte autoinflammatorische Erkrankungen 1.2.6.1 Das Cryoporin-assoziierte periodische Syndrom (CAPS) 1.2.6.2 Familian Mediterranean Fever (FMF) 1.2.6.3 Pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne syndrome (PAPA) 1.3 Caspase-1 1.3.1 Caspasen im Allgemeinen 1.3.2 Der Caspase-1 Gen-Lokus und das Caspase-1 Gen 1.3.3 Das Caspase-1 Protein 1.3.4 Funktionen von Caspase-1 1.3.4.1 Prozessierung der Zytokine pro-IL-1ß und pro-IL-18 1.3.4.2 Induktion von Pyroptose 1.3.4.3 Aktivierung der Caspase-1 durch ER-Stress 1.3.4.4 Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB 1.3.4.5 weitere Funktionen 1.3.5 Caspase-1 Genvarianten und Entzündung 1.4 Mausmodelle 1.4.1 NLRP3 1.4.2 Pyrin 1.4.3 Caspase-1 2 Zielsetzung 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Antibiotika 3.1.2 Antikörper 3.1.3 Bakterienstämme 3.1.4 BAC-Klon 3.1.5 Plasmide 3.1.6 Zelllinie 3.1.7 Chemikalien und Substanzen 3.1.8 Enzyme 3.1.9 Größenstandards 3.1.10 Oligonukleotide 3.1.11 Kommerzielle Kits 3.1.12 Puffer und Lösungen 3.1.13 Mauslinien 3.1.14 Medien 3.1.15 Geräte 3.1.16 Software 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Agarosegelelektrophorese 3.2.2 Amplifikation von Nukleinsäuren mittels Polymerasekettenreaktion 3.2.3 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 3.2.4 Aufreinigung von BAC-DNA mittels Elektroelution 3.2.5 Aufreinigung von Subklon-Plasmid-DNA für die Elektroporation von ES-Zellen 3.2.6 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit von DNA und RNA 3.2.7 c-DNA-Synthese 3.2.8 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatresten 3.2.9 DNA-Isolierung 3.2.9.1 DNA-Isolierung aus Bakterienzellen 3.2.9.2 DNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen 3.2.10 DNA-Sequenzierung 3.2.11 Enzymatische Restriktionsspaltung von DNA-Fragmenten 3.2.12 Homologe Rekombination von DNA-Sequenzen 3.2.13 Ligation von DNA-Fragmenten mit linearisierten Vektoren 3.2.14 Phenol-Chloroform-Extraktion 3.2.15 Pulsfeldgelelektrophorese 3.2.16 Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) 3.2.17 RNA-Isolation aus eukaryotischen Zellen und Geweben 3.2.18 Southern Blot 3.3 Mikrobiologische Methoden 3.3.1 Kultivierung von Bakterien 3.3.2 Hitzschock-Transformation von E.coli 3.3.3 Kryokonservierung 3.4 Proteinbiochemische Methoden 3.4.1 CBA (cytokine bead assay) 3.4.2 Proteinbestimmung 3.4.3 Immunpräzipitation mit Caspase-1 p10 (M-20) Antikörper von Santa Cruz 3.4.4 Immunpräzipitation mit AntiFlag M2 Affinity Gel von Sigma 3.4.5 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 3.4.6 Western Blot 3.4.7 Immunchemische Detektion von Proteinen 3.5 Zellbiologische Methoden 3.5.1 Bestimmung der Zellzahl 3.5.2 Isolierung und Generierung von BMDCs 3.5.3 Kryokonservierung von Zellen 3.5.4 Kultivierung von Zelllinien 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Genotypisierung 3.6.2 Haltung 3.6.3 Hautbiopsie 3.6.4 Retroorbitale Blutentnahme und Herzpunktion 3.6.5 Injektion von LPS 3.6.6 Organentnahme 4 Ergebnisse 4.1 Generierung eines Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.1 Identifikation und Verifizierung des BAC-Klons 4.1.2 Klonierung des Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.2.1 Entfernung der wt-loxP-Stelle vom Vektorrückrat 4.1.2.2 Insertion eines Flag-Tags 4.1.2.3 Einführung der Punktmutation C284A 4.1.3 „Shaving“ des generierten Casp1C284A-BAC-Konstrukts 4.1.4 Aufreinigung des Casp1C284A-BAC-Konstrukts und Pronukleusinjektion 4.1.5 Genotypisierung der transgenen Casp1C284A Gründertiere 4.2 Charakterisierung der transgenen Casp1C284A-Tiere (tg) 4.2.1 In vitro-Stimulation von BMDCs mit LPS 4.2.2 In vivo-Stimulation der transgenen Casp1C284A-Tiere 4.3 Generierung eines konditionalen Casp1C284A-Konstrukts 4.3.1 Klonierung des Targetingvektors pSerc_Casp1C284A_Flag und des Kontroll-Targetingvektors pSerc_Casp1_Flag 4.3.2 Screening von ES-Zellen 4.3.3 Genotypisierung der Chimäre und Verpaarung mit PGK-Cre Tieren 4.3.4 Expressionsanalyse der R26_Casp1C284A del-Tiere 4.3.5 In vivo-Stimulation der R26_Casp1C284A del-Tiere 5 Diskussion 5.1 Entwurf eines Mausmodells für ICE-Fieber 5.2 Konstruktion des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.3 Identifizierung von Casp1C284A-transgenen Tieren 5.4 Funktionelle Analyse des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.5 Konstruktion des konditionalen Mausmodells R26_Casp1C284A 5.6 Aktivierung des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A durch Cre-mediierte Rekombination in vivo 5.7 Funktionelle Analyse des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A 5.8 Relevanz eines Mausmodells für den Patienten 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang A. Abbildungsverzeichnis B. Tabellenverzeichnis

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Embora já tenha sido comprovada a ação adjuvante da SBA-15, pouco se sabe sobre o seu mecanismo molecular que leva a modulação positiva da resposta imunológica. Foi avaliada a ativação do inflamassoma NLRP3, sobre estímulos de SBA-15, em macrófagos de camundongos C57BL/6. Como parâmetro dessa ativação, foi analisada a produção de IL-1β por ELISA. A SBA-15 foi capaz de induzir a produção de IL-1β a níveis semelhantes quando comparado com um agonista de NLRP3 (Nano-SiO2), sugerindo a ativação do inflamassoma. Para avaliar o envolvimento da caspase-1, nos resultados obtidos com a SBA-15, os macrófagos foram estimulados com sílica na presença do inibidor de caspase-1, e como esperado, a produção de IL-1β foi restaurada para o seu nível basal. A ativação do inflamassoma, por estímulos da SBA-15, parece ser parcialmente dependente da fagocitose e da produção das espécies reativas do oxigênio. Além disso, foi visto que a SBA-15 não induz a produção de IL-6, confirmando que essa sílica está envolvida na via do inflamassoma e não em outras vias, como por exemplo, NF-κB. / Although it has already been proven adjuvant action of SBA-15, little is known about its molecular mechanism leading to positive modulation of the immune response. NLRP3 inflammasome activation was evaluated on SBA-15 stimulation in C57BL/6 mice macrophages. As this parameter activation, it analyzed the production of IL-1β by ELISA. The SBA-15 was able to induce the production of IL-1β at levels similar when compared to an agonist of NLRP3 (Nano-SiO2), suggesting the activation of the inflammasome. To assess the involvement of caspase-1, the results obtained with SBA-15, the macrophages were stimulated with silica in the presence of caspase-1 inhibitor, and as expected, IL-1β production was restored to its baseline level. Activation of the inflammasome, by stimuli of SBA-15, appears to be partly dependent on phagocytosis and production of reactive oxygen species. In addition, it was seen that the SBA-15 does not induce IL-6 production, confirming that silica is involved inflammasome the path of and not in other ways, eg, NF-κB.

O presente estudo teve por objetivo estudar a participação da apoptose na carcinogênese hepatocelular, quantificando os corpos apoptóticos imunomarcados por caspase-3 clivada em amostras de carcinoma hepatocelular (CHC) em pacientes com ou sem cirrose, comparando também estes achados com amostras correspondentes de fígado não tumoral. Visou também à análise semi-quantitativa da imuno-expressão da proteína p53, Bax e Citocromo-C, relacionadas à via mitocondrial da apoptose em busca de eventuais relações com as variáveis clínicopatológicas dos carcinomas hepatocelulares. A análise comparativa da distribuição das diversas proteínas aqui estudadas foi ainda efetuada, com vistas à possível demonstração de sua interação no processo de apoptose em CHC. Amostras selecionadas de 79 casos de CHC foram distribuídas em micromatriz tecidual e submetidas a pesquisa imuno-histoquímica com amplificação por polímeros curtos de dextran ligados a peroxidase. IA foi maior nos CHC que nas amostras não-neoplásicas, mostrando ainda tendência a associação com o grau histológico do CHC .A imuno-expressão de p53 foi maior nos CHC em fígado cirrótico (CHC-C), em casos com invasão vascular, e nos graus histológicos altos. Houve maior imunoexpressão de citocromo c em CHC-C, sendo importante sua associação com p53. Bax mostrou apenas tendência a associação com o tamanho do CHC. Essas evidências contribuem para a compreensão da importância da via mitocondrial da apoptose mediada pela proteína p53 no CHC, destacando também prováveis diferenças do mecanismo carcinogenético na presença ou não de cirrose / This study aimed at the assesment of aspects of the role of apoptosis in hepatocellular carcinogenesis, quantifying apoptotic bodies immunomarked by cleaved caspase-3 in samples of hepatocellular carcinoma (HCC) in patients with or without cirrhosis, further comparing these findings to those from samples in non-tumoral areas of these livers. We also aimed herein to semiquantitate the immunoexpression of p53, Bax, Cytochrome-C, participants of the mitochondrial pathway of apoptosis, searching for possible relations with clinico-pathological variables in HCC. Samples from 79 cases of HCC were arranged in tissue microarrays were and submitted to immunohistochemical reaction with signal amplification achieved by the short-polymer-peroxidase system. Apoptotic index measured by immunoexpression of cleaved-caspase 3 was higher in HCC than in samples from non-neoplastic areas. p53 immunoexpression was higher in HCC occurring in cirrhotic livers, (HCC-C), in cases with vascular invasion and in higher histological grades. Cytochrome-c immunoexpression was also higher in HCC-C and, interestingly, was directly related to p53. Bax immunoreactivity showed only a trend for a relation with the size of HCC. The evidences from the present study further demonstrate the importance of p53-mediated pathway of apoptosis in HCC, and also point for possible differences in carcinogenesis in cirrhotic versus non-cirrhotic livers