Members of the Six4/5 family of homeobox transcription factors have been implicated in multiple human disorders, including type I mytonic dystrophy, branchio-oto-renal syndrome, and holoprosencephaly, suggesting a role for these factors in the nervous system development. Using a forward genetics approach, we identified unc-39, a C. elegans homologue of the human SIX5 gene, as a novel regulator of the development of a specific neuron, called RID. Our data support the role of unc-39 early in C. elegans development and suggest a possibility of complete absence of RID neuron in unc-39 mutants. unc-39 mutant has a similar locomotion phenotype to the RID-ablated animals, which provides further support to the hypothesis that the absence of RID contributes to the locomotion phenotype observed in the mutant. We show that unc-39 functions at multiple points in the lineage that gives rise to the RID neuron, and that its function is context-dependent.

ARS2 is a stable component of the nuclear cap-binding complex (CBC) and is critical for RNA Polymerase II transcript processing. As such, ARS2 functions in numerous RNA Polymerase II transcript processing events, which happen co-transcriptionally from initiation to termination, and post-transcriptionally during maturation and export into the cytoplasm. Developmentally, ARS2 is essential for stem cell maintenance and differentiation during embryogenesis and in neural stem cells. Two major questions in the field were: 1) how does ARS2 function in stem cell maintenance and/or differentiation? and 2) how does ARS2 distinguish between disparate RNA classes and processing complexes? In chapter 2, I show that ARS2 is required for the proliferation and cell fate decisions of progenitors in the mouse retina. Specifically, ARS2 knockdown delays cell cycle progression and leads to premature cell cycle exit. Additionally, ARS2 knockdown increases the proportion of cells expressing rod photoreceptor marker Nrl, and decreases Müller glial marker expression. Similarly, knockdown of FLASH, an essential component for replication-dependent histone transcript processing and cell cycle progression, increases the proportion of cells expressing the Nrl reporter, suggesting ARS2’s role in histone processing is contributing to cell cycle progression and fate specification in the developing retina. In chapter 3, I used bioinformatics analysis and homology modeling to classify four structural domains of mammalian ARS2, including a newly identified RNA recognition motif (RRM), and performed mutagenesis to assess their functions. The unstructured C-terminus is required for interaction with the CBC, the Mid domain is implicated in binding DROSHA, which is required for microRNA biogenesis, while the zinc finger and RRM are involved in binding FLASH. Moreover, the zinc finger is required for interacting with RNA. Collectively, this work establishes a model where ARS2 acts as a scaffold, using multiple domains to interact with distinct processing complexes in a mutually exclusive manner. It is also the first study describing the requirements of ARS2 in the developing retina. Understanding the molecular mechanisms governing progenitor proliferation and cell fate specification is crucial in order to design therapies for retinal degenerative diseases. / Graduate / 0487

L’établissement de l’identité cellulaire est un phénomène très complexe qui implique pléthore de signaux instructifs intrinsèques et extrinsèques. Cependant, malgré les progrès importants qui ont été faits pour l’identification des régulateurs clés, les liens mécanistiques entre facteurs de transcription, épigénome, et structure de la chromatine lors de la différenciation cellulaire, et de la transformation tumorigénique des cellules, sont peu connus. Pour résoudre ces problématiques nous avons utilisé deux modèles de transition de l’identité cellulaire : la différenciation neuronale et endodermique induites par un même morphogène, l’acide rétinoïque. Concernant la transformation tumorale des cellules nous avons utilisé un système de tumorigenèse par étape de cellules primaires humaines. Nous avons conduit des études intégratives incluant des données transcriptomiques, épigénomiques, et des données concernant l’architecture de la chromatine. Notre approche systématique pour caractériser l’acquisition de l’identité cellulaire, combinée à la modélisation de la transduction du signal, renforce donc nos connaissances sur les mécanismes responsables de la plasticité cellulaire. Une meilleure compréhension des mécanismes régulateurs de l’identité cellulaire non seulement nous éclaire sur les relations de cause à effet entre les différents niveaux de régulation dans la cellule, mais aussi ouvre de nouvelles possibilités en terme de transdifférenciation dirigée. / The cell fate acquisition is a highly complex phenomenon that involves a plethora of intrinsic and extrinsic instructive signals. However, despite the important progress in identification of key regulatory factors of this process, the mechanistic links between transcription factors, epigenome and chromatin structure which coordinate the regulation of cell differentiation and deregulation of gene networks during cell transformation are largely unknown. To address these questions for two model systems of cell fate transitions, namely the neuronal and endodermal cell differentiation induced by the morphogen retinoic acid and the stepwise tumorigenesis of primary human cells, we conducted integrative transcriptome, epigenome and chromatin architecture studies. Through extensive integration with thousands of available genomic data sets, we deciphered the gene regulatory networks of these processes and revealed new insights in the molecular circuitry of cell fate acquisition. The understanding of regulatory mechanisms that underlie the cell fate decision processes not only brings the fundamental understanding of cause-and-consequence relationships inside the cell, but also open the doors to the directed trans-differentiation.

During aging there is a decline in (MuSCs) and muscle regeneration, though the underlying reason is unknown. Interestingly, mitochondrial fragmentation is a common feature in aging, however, how this impacts MuSC function and maintenance has not been investigated. To address the effect of mitochondrial fragmentation in MuSCs, we generated a knockout mouse model using the Pax7CreERT2 inducible system to target deletion of the mitochondrial fusion protein Opa1 specifically within MuSCs (Opa1-KO). Analysis of MuSC function following muscle injury revealed a defect in the regenerative potential of Opa1-KO MuSCs. Moreover, following injury there was a substantial decrease in the number of MuSC in Opa1-KO animals with a concomitant increase in the number of committing cells, illustrating that loss of Opa1 drives MuSC towards commitment at the expense of self-renewal. Furthermore, loss of Opa1 in MuSCs alters the quiescence state, priming MuSCs for activation, as indicated by a reduction in quiescence-related genes, increased EdU incorporation, and enhanced cell cycle kinetics. To address the impact of mitochondrial dysfunction on muscle stem cell capacity, we generated a model of chronic Opa1 loss. Analysis of muscle stem cell function 3 months after Opa1 ablation revealed mitochondrial dysfunction and a defect in proliferation upon activation, leading to failed muscle regeneration. These data are the first to demonstrate a novel role for mitochondrial structure in the regulation of MuSC maintenance and regenerative capacity.

Die Entschlüsselung der Mechanismen zur Regulierung der Zellidentität im Kontext der zellulären Reprogrammierung ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung von Strategien, die die Qualität und Sicherheit reprogrammierter Zellen für medizinische Anwendungen gewährleisten. Die Bedeutung der verschiedenen Regulationswege und die Art und Weise, wie die ursprüngliche Zellidentität verloren geht, während die neue Zellidentität durch Reprogrammierung etabliert wird, sind noch nicht vollständig verstanden. Um diese Fragen zu klären, haben wir ein neuartiges System entwickelt, in dem Coelomozyten (CCs), die in C. elegans endocytische und hepatische Funktionen haben, durch Überexpression des GATA-Transkriptionsfaktors (TF) ELT-7 bzw. des ZNF-Transkriptionsfaktors (TF) CHE-1, sowohl in darm-, als auch in neuronenartige Zellen umprogrammiert werden können. Wir haben einen RNAi-Screen mit 732 Chromatinregulatoren durchgeführt, um neue Enhancer/Suppressor-Pathways zu identifizieren, die an der direkten Reprogrammierung von CCs beteiligt sind. Dabei konnten wir zeigen, dass die Deletion von Effektorproteinargonauten und von Komponenten des nuklearen RNAi-Pathways die Reprogrammierung von CCs in Neuronen oder Darmzellen unterdrückt. Argonaut NRDE-3, das aus dem Zytoplasma in den Zellkern wandert, zeigte bei seiner Deletion die stärkste Unterdrückung der Reprogrammierung. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die nukleäre RNAi-Maschinerie für die direkte zelluläre in vivo Reprogrammierung erforderlich sein könnte. Darüber hinaus haben wir ATAC-seq in FACs-sortierten CCs durchgeführt, um die Chromatinlandschaft während der CC-Reprogrammierung zu untersuchen. Darüber hinaus haben wir ein menschliches Transdifferenzierungsmodell etabliert, um die Rolle der nuklearen RNAi-Maschinerie und der zahlreichen konservierten Reprogrammierungsfaktoren, die in C. elegans während der direkten Reprogrammierung in vivo identifiziert wurden, zu erforschen. / Dissecting cell fate regulatory mechanisms in the context of cellular reprogramming is central to developing strategies that ensure the quality and safety of reprogrammed cells for medical applications. The importance of different regulatory pathways and how the original cell fate is shut down while establishing the new cell fate during reprogramming are not fully understood. To address these questions, we developed a novel system where coelomocytes (CCs), which have scavenging and hepatic function in C. elegans, can reprogram into both intestinal- and neuronal-like cells upon overexpression of GATA-type transcription factor (TF) ELT-7 and ZNF-type TF CHE-1, respectively. We performed an RNAi screen consisting of 732 chromatin regulators/remodelers to identify novel enhancer/suppressor pathways involved in the direct reprogramming of CCs. We showed that depletion of effector protein Argonauts and the nuclear RNAi pathway components suppresses CC reprogramming into either neurons or intestinal cells. Specifically, the core member Argonaut NRDE-3, which translocates from the cytoplasm to the nucleus, showed the most robust suppression in reprogramming upon its depletion. These findings suggest that nuclear RNAi machinery might be required for in vivo direct cellular reprogramming. Moreover, we also performed the ATAC-seq in FACs-sorted CCs to uncover accessibility in chromatin states during CC reprogramming. Furthermore, we established a human transdifferentiation model to reveal the role of nuclear RNAi machinery and the numerous conserved reprogramming factors identified in C. elegans during in vivo direct reprogramming.

Direkte zelluläre Reprogrammierung wird durch den Einsatz von Transkriptionsfaktoren (TFs) erreicht, die das Zellschicksal induzieren und die Umwandlung in einen gewünschten Zelltyp direkt einleiten. Die Fähigkeit der TFs, die Identität von Zelltypen umzuprogrammieren, wird jedoch durch den zellulären Kontext bestimmt und ist durch hemmende Mechanismen eingeschränkt. Diese hemmenden Mechanismen schützen und erhalten das Zellschicksal und wirken daher als Barrieren für die Reprogrammierung. Ein Faktor, der als Barriere der Reprogrammierung fungiert, ist das Histon-Chaperon FACT. Es ist jedoch nicht bekannt, wie FACT das Zellschicksal sichert. Dieses Projekt entschlüsselt die zugrundeliegenden Reprogrammierungsmechanismen bei der Deletion von FACT in C. elegans. Das Aurora-Kinase B kodierende Gen air-2 wurde als Promotor der Reprogrammierung identifiziert. Aurora-Kinase B fördert die Umwandlungdes Zellschicksals, indem sie das Chromatin durch Phosphorylierung von H3S10-Resten umgestaltet. Darüber hinaus identifiziere ich die Histon-Acetyltransferase CBP-1 als Promotor der Reprogrammierung durch die Acetylierung von H3K18 und H3K27. Die Deletion des Cytochrom c-Oxidase - 1 kodierenden Gens cco-1, einer Untereinheit des mitochondrialen Atmungskettenkomplexes, ermöglicht eine von CBP-1 abhängige Reprogrammierung von Darmzellen zu Neuronen. Diese Beobachtung wirft ein neues Licht auf die Art und Weise, wie zelluläre Störungen, die in verschiedenen Kompartimenten durch die Deletion zellulärer Schutzmechanismen entstehen, zu ähnlichen Effekten bei der Reorganisation des Chromatins führen können, welche die Reprogrammierung vorantreiben. Darüber hinaus beschreibe ich eine mögliche Rolle der mitochondrialen Funktion bei der durch FACT-Deletion vermittelten Reprogrammierung durch die Induktion des mitochondrialen Chaperons HSP60. Schließlich kläre ich auf, wie FACT zelluläre Schicksale schützt, indem es die Integrität des Chromatins während der Transkription bewahrt. / Direct cellular reprogramming is achieved by using cell fate-inducing transcription factors (TFs) that directly induce conversion to a desired cell type. However, the ability of TFs to reprogram cells is defined by cellular context and is usually restricted by inhibitory mechanisms. Studying barriers of cellular reprogramming in vivo is a crucial step to attaining its therapeutic potential and provides important insights into the basic biology of cell fate regulation. One factor that acts as a barrier of reprogramming is the histone chaperone FACT. However, how FACT safeguards cellular fate is not yet known. Here, we unravel the underlying reprogramming mechanisms upon FACT depletion in C. elegans. To this end, an enhancer/suppressor screen with epigenetic regulators was performed. This screen identified the kinase Aurora B encoding gene air-2 as a promotor of reprogramming, promoting cell fate conversion by remodelling chromatin through the phosphorylation of H3S10. Additionally, I identify the histone acetyltransferase CBP-1 as a promotor of cell fate conversion through the acetylation of H3K18 and H3K27. Moreover, I characterize another reprogramming event where CBP-1 promotes reprogramming. Depleting the cytochrome c oxidase – 1 encoding gene cco-1, a subunit of the mitochondrial respiratory chain complex, allows for gut-to neuron reprogramming that is dependent on CBP-1. FACT and cco-1-depletion-mediated reprogramming show an overlap in reprogramming pathways. This observation sheds new light on how cellular perturbations originating in different compartments through depletion of cellular safeguards can produce similar effects on chromatin reorganization that drive reprogramming. I describe a potential role for mitochondrial function in FACT-depletion-mediated reprogramming through the induction of the mitochondrial chaperone HSP60. Lastly, I elucidate how FACT protects cellular fates through its role as a safeguard of chromatin integrity during transcription.

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Zu den höheren kognitiven Fähigkeiten des menschlichen Neokortex gehören abstraktes Denken, komplexes Verstehen, Sprache und Lernfähigkeit. Die Bildung der Großhirnrinde beginnt in der mittleren Phase der Embryogenese und ist ein hochgradig organisierter und streng regulierter Prozess. Durch asymmetrische Teilung neuronaler Stammzellen entstehen unreife Neuronen, die im Anschluss an ihre Migration ihre spezifische Position innerhalb des Cortex einnehmen. Der korrekte Erwerb der axonalen Morphologie und die Spezifizierung des Dendritenbaums bilden die Grundlage für die Etablierung der kortikalen Konnektivität. Diese morphologischen Merkmale werden durch intrinsische genetische Programme der postmitotischen Differenzierung kodiert sowie durch entwicklungsbedingte Einflüsse im extrazellulären Milieu reguliert. Das im endoplasmatischen Retikulum lokalisierte Inositol-Requiring Enzyme 1α (Ire1α) ist einer der Hauptregulatoren der entfalteten Proteinantwort. In dieser Studie zeigen wir, dass Ire1α für die Spezifizierung der Neurone der oberen Cortexschichten sowie den Erwerb der neuronalen Morphologie von zentraler Bedeutung ist, indem es mRNA-Translationsraten reguliert. Diese Arbeit zeigt auch, dass frühe und späte kortikale neuronale Vorläuferzellen sowie früh und spät geborene postmitotische Neurone unterschiedliche Translationsraten aufweisen, was auf differenzierte Anforderungen an die Proteom-Synthesemaschinerie bezüglich der Entwicklung der kortikalen Schichten hinweist. Störungen in allen Phasen der kortikalen Entwicklung, welche entweder auf Umweltfaktoren oder Genmutationen zurückzuführen sind, können zu einer abweichenden Physiologie der kortikalen Schaltkreise führen. Eine große Anzahl solcher Anomalien kann zu schweren neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie oder komplexen Störungen mit Epilepsie wie Rett-Syndrom, Angelman-Syndrom, Mowat-Wilson-Syndrom, Lafora-Krankheit und/oder Kaufman-Okulozerebrofazial-Syndrom führen. / Higher cognitive abilities of human neocortex comprise abstract thinking, complex comprehension, language and learning capacity. Formation of the cerebral cortex begins in the middle of embryogenesis and is a tightly organized and highly regulated process. Asymmetric divisions of neuronal stem cells give rise to immature neurons that migrate to consequently assume their specific position in the cortical plate. Correct acquisition of a single-axon morphology and specification of the dendritic tree complexity sets grounds for establishment of cortical connectivity. These morphological characteristics are encoded by intrinsic genetic programs of postmitotic differentiation and regulated by developmental cues in the extracellular milieu. Endoplasmic Reticulum resident Inositol-Requiring Enzyme 1α (Ire1α) is one of the main regulators of the unfolded protein response. In this study, we demonstrate that Ire1α is pivotal for specification of upper layer cortical neurons and the acquisition of the neuronal morphology by regulating mRNA translation rates. This work also shows that early and late cortical neuronal progenitors and early- and late-born postmitotic neurons exhibit different translation rates, indicative of the specific requirements for the proteome synthesis machinery for the development of cortical layers. Disturbances of any cortical developmental milestones due to either environmental factors or gene mutations may result in aberrant physiology of cortical circuits. High number of such abnormalities can lead to serious neurological diseases such as epilepsy or complex disorders with epilepsy such as Rett syndrome, Angelman syndrome, Mowat-Wilson syndrome, Lafora disease and/or Kaufman oculocerebrofacial syndrome. One major hypothesis of the causes of epilepsy links its molecular pathology to alterations in excitation/inhibition (E/I) balance in the neuronal networks.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

DNS-Methylierung ist ein zentraler epigenetischer Prozess, der essentiell für die Differenzierung embryonaler Stammzellen ist, über dessen Funktion in somatischen Zellen allerdings wenig bekannt ist. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei Mausmodelle analysiert, um die Rolle der durch DNS Methyltransferase 1 (DNMT1) hergestellten DNS-Methylierung im adulten hämatopoetischen System zu untersuchen. Als erstes wurde ein „Knockout“-Modell gewählt, um DNMT1 im hämatopoetischen System zu eliminieren. Des Weiteren wurde eine Mausmutante mit reduzierter DNMT1 Expression analysiert. Die vollständige Entfernung von DNMT1 aus dem hämatopoetischen System adulter Mäuse resultierte in Zytopenie und Anämie, gefolgt vom raschen Tod aller Tiere. Die Analyse des Knochenmarks dieser Mäuse zeigte einen fast vollständigen Verlust von hämatopoetischen Stamm- sowie Vorläuferzellen. Dies zeigt, dass die durch DNMT1 erzeugte DNS-Methylierung essentiell für Homöostase und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen ist. Mäuse mit reduzierter DNMT1 Expression hingegen sind lebensfähig und zeigen einen niedrigen Grad an DNS-Methylierung in verschiedensten Geweben, einschließlich des hämatopoetischen Systems. Durch eine detaillierte phänotypische und funktionelle Analyse der hämatopoetischen Stammzellen zeigte sich, dass der veränderte DNS-Methylierungsgrad ein vermindertes Selbsterneuerungspotenzial zur Folge hat. Interessanterweise fehlen DNMT1 hypomorphen Mäusen lymphoide Vorläuferzellen sowie reife lymphoide Zellen, wohingegen myeloide und erythroide Zellpopulationen keine Veränderungen zeigten. Genomweite Expressionsanalysen von Stammzellen sowie myeloiden Vorläuferzellen zeigten, dass hypomethylierte Stammzellen eine verfrühte myeloerythroide Entwicklung vollziehen und liefern damit eine Erklärung für den Verlust des Selbsterneurungspotenzials und der lymphoiden Entwicklung. Diese Resultate identifizieren eine bis hierhin unbekannte Funktion von spezifischen DNS-Methylierungsgraden für die Steuerung von funktionellen Programmen wie Selbsterneuerung und Differenzierung in hämatopoetischen Stammzellen. / DNA methylation is one of the major epigenetic mechanisms which is known to play a role in embryonic stem cell fate, but its function in somatic stem cells is not well understood. In this thesis two different genetic mouse models were chosen to address the role of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) controlled DNA methylation in adult hematopoiesis. First, a conditional knockout approach was used to delete DNMT1 in the adult hematopoietic system. Second, DNMT1 hypomorphic mice with reduced DNMT1 expression were analyzed. Complete DNMT1 deletion in hematopoietic cells led to severe cytopenia and anemia causing rapid lethality of all animals. Bone marrow analysis revealed an almost complete absence of hematopoietic stem and progenitor cells in DNMT1 ablated primary mice as well as in secondary chimeric mice. These results indicated that DNMT1 controlled maintenance of DNA methylation is indispensable for HSCs preservation and differentiation. In contrast to complete DNMT1 deletion, mice with hypomorphic DNMT1 expression were viable, but showed low methylation levels in multiple tissues including the hematopoietic system. Detailed phenotypical and functional analysis of the hypomethylated hematopoietic stem cell (HSCs) compartment revealed an impaired homeostasis and self-renewal capacity. Intriguingly, mutant animals had profoundly reduced lymphoid cell compartments, whereas myeloid and erythroid compartments were unchanged. Expression profiling of stem and myeloid progenitor cells unexpectedly demonstrated that reduced DNA methylation forces the HSC to adopt a myeloid lineage identity. These results, showing the inability of hypomethylated HSCs to maintain an undifferentiated state, provided an explanation for their disturbed capability to self-renew and produce lymphocytes. Taken together, these findings suggest that distinct levels of DNA methylation are required to control different functional programs such as self-renewal and alternative lineage choices in HSCs, thus uncovering a previously unrecognized function for DNMT1 activity.