Au cours de ce travail de thèse, nous avons établi un modèle global pour le réseau de kinases dépendantes des cyclines (Cdks) qui contrôle la dynamique du cycle cellulaire chez les mammifères. Le modèle contient quatre modules Cdk régulés par phosphorylation-déphosphorylation, par des inhibiteurs de Cdk, et par la synthèse ou la dégradation de protéines. Les facteurs de croissance suscitent la transition d’un état stationnaire stable, état de quiescence, à un état de prolifération caractérisé par des oscillations entretenues du réseau de cyclines/Cdk. Ces oscillations correspondent à l’activation transitoire et répétitive des complexes cycline D/Cdk4-6 en phase G1, cycline E/Cdk2 à la transition G1/S, cycline A/Cdk2 en phase S et à la transition S/G2, et cycline B/Cdk1 à la transition G2/M. Le modèle rend compte de plusieurs propriétés majeures du cycle cellulaire des mammifères :(1) oscillations entretenues du réseau de Cdk en présence d’un niveau suffisant d’un facteur de croissance ;(2) contrôle de la progression dans le cycle cellulaire par la balance entre les effets antagonistes du suppresseur de tumeur pRB et du facteur de transcription E2F ;(3) existence d’un point de restriction situé dans la phase G1, au-delà duquel la cellule n’a plus besoin de la présence d’un facteur de croissance pour compléter son cycle de division cellulaire ;(4) entraînement du cycle cellulaire par l’horloge circadienne. Le modèle rend compte également du phénomène d’endoréplication qui correspond au découplage entre réplication de l’ADN et mitose :la cellule duplique à de multiples reprises son ADN sans entrer en phase de mitose. En incorporant des points de contrôle («checkpoints») dans le modèle pour le cycle cellulaire, et en particulier le point de contrôle de réplication de l’ADN régulé par les kinases ATR et Chk1, nous montrons comment ce point de contrôle ralentit la dynamique du cycle cellulaire et mène à une meilleure séparation des phases de réplication de l’ADN et de mitose. Le modèle pour le cycle cellulaire des cellules de mammifères montre comment la structure de régulation du réseau de cyclines/Cdk suscite son auto-organisation temporelle, menant à l’activation répétitive et séquentielle des quatre modules Cdk qui assurent la progression ordonnée dans les différentes phases du cycle cellulaire./We propose an integrated computational model for the network of cyclin-dependent kinases (Cdks) that controls the dynamics of the mammalian cell cycle. The model contains four Cdk modules regulated by reversible phosphorylation, Cdk inhibitors, and protein synthesis or degradation. Growth factors trigger the transition from a quiescent, stable steady state to self-sustained oscillations in the Cdk network. These oscillations correspond to the repetitive, transient activation of cyclin D/Cdk4-6 in G1, cyclin E/Cdk2 at the G1/S transition, cyclin A/Cdk2 in S and at the S/G2 transition, and cyclin B/Cdk1 at the G2/M transition. The model accounts for the following major properties of the mammalian cell cycle: (1) repetitive cell cycling in the presence of supra-threshold amounts of growth factor ;(2) control of cell cycle progression by the balance between antagonistic effects of the tumor suppressor pRB and the transcription factor E2F ;(3) existence of a restriction point in G1, beyond which completion of the cell cycle becomes independent of growth factor ;(4) entrainment of the cell cycle by the circadian clock. The model also accounts for endoreplication and for self-sustained oscillations in the presence of only Cdk1 or in the absence of pRB. Incorporating the DNA replication checkpoint mediated by kinases ATR and Chk1 slows down the dynamics of the cell cycle without altering its oscillatory nature and leads to better separation of the S and M phases. The model for the mammalian cell cycle shows how the regulatory structure of the Cdk network results in its temporal self-organization, leading to the repetitive, sequential activation of the four Cdk modules that brings about the orderly progression along cell cycle phases. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The PRL family of enzymes constitutes a unique class of protein tyrosine phosphatase, consisting of three highly homologous members (PRL-1, PRL-2, and PRL-3). Family member PRL-3 is highly expressed in a number of tumor types and has recently gained much interest as a potential prognostic indicator of increased disease aggressiveness and poor clinical outcome for multiple human cancers. PRL-1 and PRL-2 are also known to promote a malignant phenotype in vitro, however, prior to the present study, little was known about their expression in human normal or tumor tissues. In addition, the biological function of all three PRL enzymes remains elusive and the underlying mechanisms by which they exert their effects are poorly understood. The current project was undertaken to expand our knowledge surrounding the normal cellular function of the PRL enzymes, the signaling pathways in which they operate, and the roles they play in the progression of human disease. We first characterized the tissue distribution and cell-type specific localization of PRL-1 and PRL-2 transcripts in a variety of normal and diseased human tissues using in situ hybridization. In normal, adult human tissues we found that PRL-1 and PRL-2 messages were almost ubiquitously expressed. Only highly specialized cell types, such as fibrocartilage cells, the taste buds of the tongue, and select neural cells displayed little to no expression of either transcript. In almost every other tissue and cell type examined, PRL-2 was expressed strongly while PRL-1 expression levels were variable. Each transcript was widely expressed in both proliferating and quiescent cells indicating that different tissues or cell types may display a unique physiological response to these genes. In support of this idea, we found alterations of PRL-1 and PRL-2 transcript levels in tumor samples to be highly tissue-type specific. PRL-1 expression was significantly increased in 100% of hepatocellular and gastric carcinomas, but significantly decreased in 100% of ovarian, 80% of breast, and 75% of lung tumors as compared to matched normal tissues from the same subjects. Likewise, PRL-2 expression was significantly higher in 100% of hepatocellular carcinomas, yet significantly lower in 54% of kidney carcinomas compared to matched normal specimens. PRL-1 expression was found to be associated with tumor grade in the prostate, ovary, and uterus, with patient gender in the bladder, and with patient age in the brain and skeletal muscle. These results suggest an important, but pleiotropic role for PRL-1 and PRL-2 in both normal tissue function and in the neoplastic process. These molecules may have a tumor promoting effect in some tissue types, but inhibit tumor formation or growth in others. To further elucidate the signaling pathways in which the PRLs operate, we focused on PRL-1 and used microarray and microRNA gene expression profiling to examine the global molecular changes that occur in response to stable PRL-1 overexpression in HEK293 cells. This analysis led to identification of several molecules not previously associated with PRL signaling, but whose expression was significantly altered by exogenous PRL-1 expression. In particular, Filamin A, RhoGDIalpha, and SPARC are attractive targets for novel mediators of PRL-1 function. We also found that PRL-1 has the capacity to indirectly influence the expression of target genes through regulation of microRNA levels and we provide evidence supporting previous observations suggesting that PRL-1 promotes cell proliferation, survival, migration, invasion, and metastasis by influencing multi-functional molecules, such as the Rho GTPases, that have essential roles in regulation of the cell cycle, cytoskeletal reorganization, and transcription factor function. The combined results of these studies have expanded our current understanding of the expression and function of the PRL family of enzymes as well as of the role these important signaling molecules play in the progression of human disease.

La sénescence cellulaire est un arrêt stable du cycle cellulaire qui empêche la prolifération des cellules endommagées par des stress génotoxiques, tels que l'irradiation. En général, les lésions de l'ADN initient rapidement une réponse aux dommages et un blocage transitoire du cycle cellulaire nécessaire à la réparation de l'ADN. Cependant, les phénotypes associés à la sénescence, tels que l'arrêt de la prolifération stable et le sécrétome pro-inflammatoire, se manifestent plusieurs jours après le stress. Nous avons récemment démontré que l'établissement de la sénescence induite par l'irradiation est un processus en plusieurs étapes qui nécessite un événement prolifératif en présence de foyers de dommages de l'ADN persistants pour former de l'instabilité génomique. L'instabilité génomique secondaire, et non les dommages primaires de l'ADN, est responsable de nombreux phénotypes de sénescence. Le but de notre projet était d'évaluer l'impact de p16INK4a, un inhibiteur de kinase dépendant des cyclines, sur la reprise de la prolifération observée dans notre modèle initial en caractérisant la reprise de la prolifération, les phénotypes de sénescence lorsque p16INK4a est fortement exprimé, et de comprendre sa dynamique d'activation. Notre hypothèse était que l'expression de p16INK4a réduirait la reprise de la prolifération après l'irradiation, ce qui diminuerait la formation d'instabilité génomique et altérerait l'expression de certains phénotypes de sénescence. Nous avons induit la sénescence par irradiation dans des fibroblastes humains normaux qui présentent des niveaux endogènes différents d'expression de p16INK4a. Nous avons également utilisé une lignée qui surexprime et une autre qui déplète p16INK4a pour évaluer les conséquences de son expression sur la reprise de la prolifération et son impact sur les phénotypes de sénescence. Nos résultats suggèrent que p16INK4a réduit la reprise de la prolifération, diminuant l'instabilité génomique et réduisant à terme l'expression des facteurs du phénotype sécrétoire. De plus, de manière surprenante, nous avons observé que l'expression de p16INK4a n'a pas besoin d'être présente uniquement au moment de la reprise de la prolifération pour l'empêcher. Elle peut durer 24 heures au moment de l'irradiation, soit avant la reprise de la prolifération, pour la prévenir. Les données présentées dans ce mémoire aident à mieux comprendre le mécanisme de sénescence médié par l'irradiation et l'impact de l'expression de p16INK4a sur les différents phénotypes de sénescence. / Cellular senescence is a stable cell cycle arrest that prevents proliferation of cells damaged by genotoxic stresses, such as irradiation. In general, DNA damage initiates a DNA damage response and a transient cell cycle arrest required for DNA repair. However, senescence-associated phenotypes, such as stable senescence-associated proliferation arrest and pro-inflammatory secretome are established several days later. We have recently shown that the establishment of irradiation-induced senescence is a multi-step process that requires a proliferation event in the presence of persistent DNA damage foci to form genomic instability. Secondary genomic instability, but not primary DNA damage, leads to the establishment of senescence phenotypes. The aim of our project was to evaluate the impact of p16INK4a, a cyclin-dependent kinase inhibitor, on the bypass of the transient cell cycle arrest we observed in our initial model by characterizing the bypass and senescence phenotypes when p16INK4a was highly expressed and to understand its activation dynamics. Our hypothesis was that p16INK4a expression would reduce the percentage of bypass after irradiation which would decrease genomic instability formation and ultimately alter the expression of some senescence phenotypes. We induced senescence by irradiation in normal human fibroblasts with different endogenous levels of p16INK4a expression. We also used a cell line that overexpresses and another that depletes p16INK4a to evaluate the consequences of its expression on the bypass and its impact on senescence phenotypes. Our results suggest that p16INK4a decreases the bypass, thus reducing the genomic instability and, therefore, reduces expression of secretory phenotype factors. Moreover, interestingly, we observed that p16INK4a expression does not need to be present only at the time of reproliferation to prevent it, i.e. it can last 24 hours at the time of irradiation. These results contribute to improve our knowledge about the mechanism of establishment of irradiation-mediated senescence and the impact of p16INK4a expression on different senescence phenotypes.

Le gène par-4 code pour une kinase à sérine/thréonine très conservée qui régule la polarisation précoce et la division cellulaire asymétrique de l’embryon de C. elegans. Une mutation de par-4 entraîne la létalité embryonnaire en perturbant trois processus: la ségrégation asymétrique des déterminants cellulaires, la régulation asynchrone de la progression du cycle cellulaire et la contractilité du réseau d’actomyosine. Pour identifier des régulateurs des voies de signalisation de PAR-4, nous avons procédé à un criblage pour des suppresseurs de la létalité embryonnaire associée à une mutation de par-4. Nous avons identifié 6 gènes qui codent pour des homologues conservés avec des activités définies telles que la phosphorylation, l’ubiquitination, la protéolyse et l’échafaudage. En employant l’imagerie quantitative pour suivre des événements cellulaires dépendants de PAR-4, nous avons déterminé quels processus sont contrôlés par chaque suppresseur durant le développement embryonnaire de C. elegans. Des analyses moléculaires de ces suppresseurs ont révélé des détails sur le mécanisme par lequel PAR-4 régule la polarisation cellulaire et promeut la division cellulaire asymétrique. / The gene lkb1 codes for a highly conserved serine/threonine kinase. The orthologue of lkb1 in the nematode Caeonorhabditis elegans, termed par-4, regulates early polarization and asymmetric cell division in the embryo. A mutation in par-4 causes embryonic lethality by perturbing three main cellular processes: asymmetric segregation of cell fate determinants, asynchronic regulation of cell cycle progression and contractility of the actomyosin network. To identify regulators of the PAR-4/LKB1-dependent pathways, we performed a screen for suppressors of the embryonic lethality associated with a mutation in par-4. We identified 6 genes that have conserved homologs with defined activities including protein phosphorylation, ubiquitination, proteolysis and scaffolding. We used quantitative imaging of specific PAR-4-dependent cellular events to determine which of these are controlled by each suppressor during early C. elegans embryonic development. Molecular analysis of these suppressors revealed details on the mechanism through which PAR-4 regulates cell polarization and promotes asymmetric cell division.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Mammalian target of rapamycin (mTOR) is a key regulator of protein synthesis. Dysregulation of mTOR signaling occurs in many human cancers and its inhibition causes arrest at the G1 cell cycle stage. However, mTOR’s impact on mitosis (M-phase) is less clear. Here, suppressing mTOR activity impacted the G2-M transition and reduced levels of M-phase kinase, Aurora A. mTOR inhibitors did not affect Aurora A mRNA levels. However, translational reporter constructs showed that mRNA containing a short, simple 5’-untranslated region (UTR), rather than a complex structure, is more responsive to mTOR inhibition. mTOR inhibitors decreased Aurora A protein amount whereas blocking proteasomal degradation rescues this phenomenon, revealing that mTOR affects Aurora A protein stability. Inhibition of protein phosphatase, PP2A, a known mTOR substrate and Aurora A partner, restored mTOR-mediated Aurora A abundance. Finally, a non-phosphorylatable Aurora A mutant was more sensitive to destruction in the presence of mTOR inhibitor. These data strongly support the notion that mTOR controls Aurora A destruction by inactivating PP2A and elevating the phosphorylation level of Ser51 in the “activation-box” of Aurora A, which dictates its sensitivity to proteasomal degradation. In summary, this study is the first to demonstrate that mTOR signaling regulates Aurora-A protein expression and stability and provides a better understanding of how mTOR regulates mitotic kinase expression and coordinates cell cycle progression. The involvement of mTOR signaling in the regulation of cell migration by its upstream activator, Rheb, was also examined. Knockdown of Rheb was found to promote F-actin reorganization and was associated with Rac1 activation and increased migration of glioma cells. Suppression of Rheb promoted platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) expression. Pharmacological inhibition of PDGFR blocked these events. Therefore, Rheb appears to suppress tumor cell migration by inhibiting expression of growth factor receptors that in turn drive Rac1-mediate actin polymerization.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Autophagy is a conserved cellular process that involves sequestration and degradation of cytosolic contents. The cell can engulf autophagic cargo (lipids, long-lived proteins, protein aggregates, and pathogens) through a double bound membrane called an autophagosome that fuses with a lysosome where hydrolases then degrade these contents. This process is one of the main defenses against starvation and is imperative for newborns at birth. Research on this process has increased exponentially in the last decade since its discovery almost a half a century ago. It has been found that autophagy is an important process in many diseases, continues to be at the forefront of research, and is clearly not fully understood. Our preliminary cell culture data in endothelial and epithelial cells show that a blockade of the de novo ceramide synthesis pathway, during treatment with an autophagy stimulus (cigarette smoke extract exposure), does not result in any reduction in autophagy or autophagic flux. Conversely, when acid sphingomyelinase (ASM) is pharmacologically inhibited, which prevents the generation of ceramide from sphingomyelin in an acidic environment, a profound increase in autophagy is observed. In this work, we hypothesize that (ASM) is an endogenous inhibitor of autophagy. ASM has two forms, a secreted form and a lysosomal form. N-terminal processing in the Golgi determines its cellular fate. In the lysosomal form, the phosphodiesterase is bound in the lysosomal membrane. The pharmacological inhibition mechanism is to release ASM from the membrane and allow other hydrolases to actively degrade the enzyme which, in turn, decreases the activity of ASM. This suggests that either the activity of ASM is a regulator of autophagy or that the presence of ASM, activity aside, is required for the lysosomal nutrient sensing machinery (LYNUS) to function properly. Here, we show that ASM is, in fact, an endogenous inhibitor of autophagy in vitro. The phosphorylation status of P70 S6k, a downstream effector of mammalian target of rapamycin (mTOR), which is part of the LYNUS, shows that dissociation of ASM from the membrane regulates mTOR and disturbs the LYNUS in such a manner as to signal autophagy.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Fanconi anemia (FA) is a heterogenous genetic syndrome characterized by progressive bone marrow failure, aneuploidy, and cancer predisposition. It is incompletely understood why FA-deficient cells develop gross aneuploidy leading to cancer. Since the mitotic spindle assembly checkpoint (SAC) prevents aneuploidy by ensuring proper chromosome segregation during mitosis, we hypothesized that the FA signaling network regulates the mitotic SAC. A genome-wide RNAi screen and studies in primary cells were performed to systematically evaluate SAC activity in FA-deficient cells. In these experiments, taxol was used to activate the mitotic SAC. Following taxol challenge, negative control siRNA-transfected cells appropriately arrested at the SAC. However, knockdown of fourteen FA gene products resulted in a weakened SAC, evidenced by increased formation of multinucleated, aneuploid cells. The screen was independently validated utilizing primary fibroblasts from patients with characterized mutations in twelve different FA genes. When treated with taxol, fibroblasts from healthy controls arrested at the mitotic SAC, while all FA patient fibroblasts tested exhibited weakened SAC activity, evidenced by increased multinucleated cells. Rescue of the SAC was achieved in FANCA patient fibroblasts by genetic correction. Importantly, SAC activity of FANCA was confirmed in primary CD34+ hematopoietic cells. Furthermore, analysis of untreated primary fibroblasts from FA patients revealed micronuclei and multinuclei, reflecting abnormal chromosome segregation. Next, microscopy-based studies revealed that many FA proteins localize to the mitotic spindle and centrosomes, and that disruption of the FA pathway results in supernumerary centrosomes, establishing a role for the FA signaling network in centrosome maintenance. A mass spectrometry-based screen quantifying the proteome and phospho-proteome was performed to identify candidates which may functionally interact with FANCA in the regulation of mitosis. Finally, video microscopy-based experiments were performed to further characterize the mitotic defects in FANCA-deficient cells, confirming weakened SAC activity in FANCA-deficient cells and revealing accelerated mitosis and abnormal spindle orientation in the absence of FANCA. These findings conclusively demonstrate that the FA signaling network regulates the mitotic SAC, providing a mechanistic explanation for the development of aneuploidy and cancer in FA patients. Thus, our study establishes a novel role for the FA signaling network as a guardian of genomic integrity.

La sénescence cellulaire est une barrière à la progression tumorale qui est contournée par les cellules cancéreuses. Elle se met en place suivant différents événements tels que l’activation constante d’oncogènes comme H-RAS et correspond à un arrêt stable du cycle cellulaire. Un autre aspect des cellules sénescentes est la dégradation spécifique des protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire, la biogenèse des ribosomes, l’homéostasie mitochondriale et le métabolisme cellulaire. Dans cette étude, nous voulions identifier quelles sont les contributions de la dégradation des protéines spécifiques à l’homéostasie mitochondriale, au métabolisme cellulaire ainsi qu’à la biogenèse des ribosomes. De plus, nous voulons voir comment la dégradation des protéines impliquées dans ces voies affecte la sénescence cellulaire. Afin de répondre à ces questions, nous avons divisé nos travaux en 2 parties. La première s’est concentrée sur les ribosomes et les altérations de la biogenèse ribosomale dans la sénescence. La deuxième partie s’est focalisée sur la contribution de la dégradation des protéines importantes pour le métabolisme cellulaire et l’homéostasie mitochondriale. Premièrement, nous avons identifié que la mise en place de la sénescence s’accompagne d’une désynchronisation de la biogenèse des ribosomes. Plus précisément, certains ARNr sont moins transcrits alors que la transcription de certaines protéiques ribosomiques n’est pas altérée. Ceci entraîne un déséquilibre entre la quantité des protéines ribosomiques et celle des ARN ribosomiques. Il provoque l’accumulation de ribo protéines en dehors des ribosomes. Ces protéines acquièrent en conséquence de nouvelles fonctions. Nous avons identifié RPL29 comme une ribo protéine libre du ribosome. Elle est accumulée dans les cellules sénescentes et peut être utilisée comme nouveau biomarqueur afin d’identifier les cellules senescent in vitro et in vivo. L’identification d’un nouveau biomarqueur de cellules sénescentes est cruciale car aucun marqueur spécifique de la sénescence n’est encore disponible. Par ailleurs, nous avons identifié RPS14 comme une protéine qui peut interagir avec le complexe CDK4-cyclin D1 et ainsi, en inhibant son activité, elle limite la prolifération cellulaire. L’arrêt du cycle cellulaire initié par cette protéine ribosomqiue hors du ribosome est indépendant de la protéine suppressive p53. Ceci pourrait offrir une opportunité thérapeutqiue pour le traitement des tumeurs déficientes pour l’expression de p53. La deuxième partie de ce travail s’est concentrée sur les altérations du métabolisme cellulaire en particulier le métabolisme du NAD et l’homéostasie mitochondriale. Dans un premier temps, nous avons confirmé que la perte d’expression de protéines impliquées dans l’homéostasie mitochondriale favorise la mise en place de la sénescence via l’accumulation de NADH et la stabilisation de p53. De plus, nous avons observé que la diminution des régulateurs de l’homéostasie redox NAD+ et NADPH est suffisante pour induire l’entrée en sénescence. A l’inverse la normalisation de ce paramètre est à l’origine d’un contournement de la sénescence. Dans ce cadre, nous avons identifié un nouveau complexe protéique formé par l’enzyme malique, la malate déshydrogénase et la pyruvate carboxylase dont les actions concertées transfèrent l’ion hydrure du NADH vers le NADPH. Nous avons nommé ce complexe HTC pour complexe de transfert d’hydrure. Les réactions métaboliques des protéines de l’HTC permettent la normalisation des niveaux de NAD+ et de NADPH. L’augmentation des niveaux de NAD+ et de NADPH a déjà été associé à la tumorigénèse. A travers ces travaux, nous avons constaté que la surexpression des protéines qui forment le complexe HTC coopère avec l’oncogène Ras à la transformation de cellules primaires. Par ailleurs, les enzymes du complexe HTC sont fortement exprimées in vivo au niveau des cancers de la prostate d’origine murine ou humaine. De plus, inactivation d’une proteine du complexe HTC déclenche l’entrée en sénescence des cellules tumorales y compris en l’absence de p53. Nous avons ainsi caractérisé un nouveau complexe multi-enzymatique qui peut reprogrammer le métabolisme et empêcher la mise en place de la sénescence cellulaire. L’inhibition de la formation du complexe HTC pourrait permettre de cibler spécifiquement sa fonction de novo tout en limitant de bloquer l’activité physiologique normale des ces enzymes en dehors de ce complexe. Par l’ensemble de ces travaux, nous avons mis en évidence l’importance des défauts de biogénèse des ribosomes ainsi que des altérations métaboliques dans la mise en place et le maintien de la sénescence. D’une part, l’accumulation de RPS14 en dehors des ribosomes constitue un nouveau mécanisme de régulation du cycle cellulaire. De plus, l’accumulation de RPL29 dans le nucleole constitue un nouveau biomarker de la senescence. D’autre part, l’identification du complexe HTC a mise en évidence une nouvelle façon de contourner la sénescence et ainsi de contribuer à la transformation de cellules primaires. Ces observations renforcent l’importance de la sénescence cellulaire en tant que mécanisme de suppression tumorale. Ces découvertes créent de nouvelles opportunités thérapeutiques afin de réactiver la sénescence dans les cellules cancéreuses. / Cellular senescence is a barrier to tumor progression that is circumvented in cancer cells. Senescence is a stable cell cycle arrest and can be triggered by various oncogenic events, such as constant activation of the oncogene H-RAS. Other critical aspects of senescent cells include a specific degradation of proteins implicated in cell cycle regulation, ribosome biogenesis, mitochondrial homeostasis, and cellular metabolism. In this study, we wanted to identify the contributions of the specific protein degradation to mitochondrial homeostasis, cellular metabolism, and ribosome biogenesis and how the degradation of proteins implicated in those pathways affects the senescence response. In order to answer our question, we divided our research into two aspects. The first aspect was focused on ribosomes and the alterations in ribosome biogenesis in senescence. The second aspect was the contribution of degradation of proteins implicated in cellular metabolism and mitochondrial homeostasis. First, we identified that a desynchronization of ribosome biogenesis accompanies senescence, meaning that certain rRNA are less transcribed, whereas specific ribosomal proteins do not decrease their transcription leading to an imbalance in ribosomal protein and ribosomal RNA. This imbalance causes an accumulation of ribosomal free riboproteins. Those accumulated riboproteins acquire novel functions. We identified RPL29 as a ribosomal free riboprotein that accumulated in senescent cells and can be used as a novel biomarker to identify senescent cells in vitro and in vivo. Identification of novel senescent cell biomarkers is crucial as no specific marker of senescence is available. Furthermore, we identified RPS14 as a protein that can interact with the CDK4-cyclinD1 complex and decrease cell cycle progression. Of utmost importance is that cell cycle repression was even possible in cancer cells devoided of p53 highlighting novel strategies for p53 null cancer treatments. In the second part, we focused on alterations in cellular metabolism, particularly in light of NAD metabolism and mitochondria homeostasis. We could confirm that the degradation of proteins implicated in mitochondrial homeostasis can induce senescence via the accumulation of NADH and p53 stabilization. Furthermore, we confirmed that the decrease in redox homeostasis regulators, namely NAD+ and NADPH, can trigger senescence. In the same idea, we showed that the normalization of those redox potentials could bypass the senescence response. Most importantly, we identified a novel protein complex formed by malic enzyme, malate dehydrogenase,and pyruvate carboxylase. The concerted actions of those three metabolic enzymes can transfer the hydride ion from NADH towards NADPH. Thus, we coined this complex HTC for hydride transfer complex. These metabolic reactions in HTC allow for two things, the normalization of NAD+ levels and the normalization of NADPH levels. Intruguenlty, both NAD+ and NADPH level increase were previously linked to transformation, and indeed, we were able to show that expression of HTC in combination with oncogenic Ras is sufficient to transform primary cells. Moreover, HTC enzymes are highly expressed in vivo in mouse and human prostate cancer models, and their inactivation triggers senescence even in the absence of p53. We provide evidence for a new multi-enzymatic complex, with de novo functions that reprogram metabolism and prevent cellular senescence. Inhibition of formation of the HTC complex might allow targeting specifically the de novo function of this complex with fewer effects on normal enzyme function. All in all, we highlighted the contributions of ribosome biogenesis and metabolic alterations in inducing and maintaining the senescence response. Furthermore, RPS14 accumulation allows for a novel cell cycle regulation mechanism, and the accumulation of RPL29 in the nucleolus can be used as a novel biomarker for cellular senescence. Moreover, the expression of HTC demonstrated a novel way of avoiding senescence, thus promoting cellular transformation. Both pathways highlight the importance of cellular senescence as a tumor suppressors mechanism, and these discoveries allow for novel strategies for cancer drug development. / Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen in der westlichen Welt. Aus diesem Grund ist es von hoher Bedeutung die molekularen Prozesse die eine Zelle entarten, also zum Krebs werden lassen besonders genau zu untersuchen. Im Allgemeinen haben Zellen Mechanismen, die das Entarten verhindern sollen, jedoch sind diese Mechanismen nicht immer fehlerfrei. Ein solcher Mechanismus ist die Zellseneszenz. Dieser Schutzmechanismus kann auf verschiedene Weise, wie zum Beispiel durch das Mutieren eines Onkogenes, aktiviert werden. Die Zellseneszenz ist dadurch charakterisiert, dass sie potentielle Krebszellen an ihrer Zellteilung hindert und es deswegen zu keiner Entstehung eines Karzinoms kommt. Wie bereits angedeutet sind die Mechanismen, welche die Entartung von Zellen stoppen sollen nicht fehlerfrei und die Inaktivität dieser Schutzmechanismen kann zur Entartung - auch maligne Transformation genannt - einer Zelle führen. In dieser Doktorarbeit haben wir aufgezeigt, welche molekularen Prozesse in der Zelle aktiviert bzw. verändert werden und dann dazu führen, dass der Schutzmechanismus der Zellseneszenz umgangen wird. Im Allgemeinen haben wir zwei Prozesse, die während der malignen Transformation verändert werden, untersucht. Dies ist auf der einen Seite die Veränderung von ribosomer Entwicklung und auf der anderen Seite sind es die Veränderungsprozesse im Zellstoffwechsel. Ribosome sind makromolekulare Komplexe in Zellen, die aus speziellen Proteinen und RNA aufgebaut sind und besonders wichtig für die Zelle sind, da sie die Produktion von Proteinen ermöglichen. Wir haben aufgezeigt, dass während der Aktivierung von Zellseneszenz die Produktion von Ribosomen ungleichmäßig in der Zelle heruntergefahren wird. Dies führt dazu, dass bestimmte Proteine, die wichtig für die Ribosomen sind sich im Zellkern bzw. im Kernkörperchen ansammeln. Hier seien besonders zwei Protein zu nenen, RPS14 and RPL29. Wir haben festgestellt, dass diese Ansammlung von RPL29 im Kernkörperchen als Biomarker für die Ermittlung von Zellseneszenz in vivo dienen kann. Außerdem haben wir dargestellt, dass die Ansammlung von dem Protein RPS14 dazu führt, dass der Zellzyklus gestoppt wird. Die Entdeckung von RPS14 als Regulator für den Zellzyklus ist insofern wichtig, da dieser Prozess unabhängig von p53, einem Protein welches in über 50 Prozent aller Krebsarten inaktiv ist, stattfinden kann. Bisher waren zwei Mechanismen zur Zellzyklus Regulierung bekannt. Die Beschreibung von RPS14 im Zellzyklus erlaubt uns einen weiteren Mechanismus hinzuzufügen. Die ist ein wichtiger Schritt zur Erforschung von neuen Inhibitoren der Zellteilung. Im zweiten Teil der Arbeit haben wir untersucht inwiefern der Zellstoffwechsel sich während der Zellseneszenz verändert. Wir haben herausgefunden, dass sich das Niveau von wichtigen Co- Faktoren, die den Redoxstatus der Zelle regulieren währender Zellseneszenz verändert. Insbesondere das Molekül NAD+ zeigte eine starke Verringerung im Niveau. Weiterhin wussten wir, dass das Niveau von NAD+ und auch das Niveau von NADPH, ein Molekül ähnlich dem NAD, in Krebszellen besonders hoch ist. Wir haben festgestellt, dass in der Zelle ein Proteinkomplex aus Stoffwechsel Proteinen entstehen kann, welcher die Level von NAD+ und NADPH durch die Stoffwechselaktion dieser Proteine wieder normalisiert. Dieser Komplex besteht aus drei Proteinen Malic Enzyme 1, Malate Dehydrogenase 1 und Pyruvate Carboxylase. Besonders hervorzuheben hierbei ist unsere Entdeckung, dass Pyruvate Carboxylase in Krebszellen nicht nur in den Mitochondrien vorhanden ist, sondern auch im Zellplasma. Die Aktivierung dieses Proteinkomplexes ermöglicht Zellen die normalerweise in die Zellseneszenz gehen würden, diesen Schutzmechanismus zu umgehen und dabei bösartig zu entarten. Diese Entdeckung ist besonders interessant, da der Zellstoffwechsel von Krebszellen seit langem untersucht wird, es jedoch bisher noch nicht bekannt war das dieser Proteinkomplex in der Lage ist die Zelle bösartig zu transformieren. Wir konnten nachweisen, dass die Proteinlevel von unserem Komplex in Prostatakrebs im Vergleich zu normalem Prostatagewebe erhöht sind. Darüber hinaus waren wir in der Lage zu zeigen, dass die Inaktivierung von einem der Proteine aus dem Komplex dazu führt, dass die Zelle ihren Zellzyklus verlangsamt und weniger aggressiv in einem Kanzerogenitätstest ist. Dies ist selbst dann möglich, wenn die Krebszelle über kein aktives p53 Protein mehr verfügt. Besonders hervorzuheben diese Entdeckung, weil das p53 Protein eines der wichtigsten Proteine ist, welches die Zelle vor einer bösartigen Transformation schützt. Zusammenfassend ist zu sagen, dass wir zwei neue Mechanismen aufgezeigt haben die Veränderung der Ribosomenproduktion und die Stoffwechselprozesse, die sich während der malignen Transformation von Zellen verändern. In der Zukunft wird unsere Forschung versuchen zu verstehen inwiefern diese neuen Erkenntnisse dazu genutzt werden können neue Moleküle zu entwickeln die speziell die beschriebenen Prozesse nutzen, um den Zellzyklus von Krebszellen zu verlangsamen.