Submitted by Raquel Vasconcelos Guimarães de Castro null (rvgcastro@hotmail.com) on 2016-06-10T17:22:52Z No. of bitstreams: 1 Definitivo v11 VERSÃO IMPRESSA.pdf: 3954271 bytes, checksum: fbf5e7559a791827787906302174080b (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-15T17:22:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 castro_rvg_me_jabo.pdf: 3954271 bytes, checksum: fbf5e7559a791827787906302174080b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-15T17:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 castro_rvg_me_jabo.pdf: 3954271 bytes, checksum: fbf5e7559a791827787906302174080b (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A pele é um órgão extenso e de fácil acesso, e possui vários tipos celulares diferentes que estão em constante renovação. Dentre estas células, alguns tipos de células-tronco com potencial proliferativo, de autorrenovação e de diferenciação, são responsáveis pela manutenção da homeostase deste órgão e pela cura de feridas. Estudos anteriores sugerem a existência de um nicho de células-tronco presente no “bulge” dos folículos pilosos, que contém populações positivas para CD200 e CD34. Este trabalho foi realizado com o intuito de: 1- Obter tecidos derivados da pele de cães adultos e fetos, isolar e cultivar as células in vitro derivadas destes, empregando um método de isolamento celular através de digestão enzimática simples 2- Comprovar a presença de células do “bulge”, positivas para CD200 e CD34 após cultivo celular in vitro, comparando com a análise do tecido; Uma coloração por hematoxilina e eosina foi realizada da pele de cães adultos e fetos, e biopsias e células cultivadas in vitro foram caracterizadas pela presença das proteínas CD200 e CD34 através de imunofluorescência, imunocitoquímica e citometria de fluxo. Os resultados da imunofluorescência foram negativos para ambos CD200 e CD34 nas peles de feto e adulto. Na imunocitoquímica, as células foram positivas para CD34 e CD200, tanto em fetos quanto adultos. Adicionalmente, o marcador de pluripotência OCT4 foi testado, sendo expresso em células de feto. Por citometria de fluxo, a porcentagem média de células marcadas duplamente por CD200 e CD34 nos adultos foi de 3,1% e nos fetos de 0,33% (n=3). A marcação somente por CD200 foi encontrada somente nos adultos, sendo de 2,8% (n=3). Os resultados sugerem ser possível a obtenção de células-tronco do “bulge” do folículo piloso através do método de digestão enzimática simples, utilizado neste trabalho. Este estudo é o primeiro passo para novas pesquisas que envolvam esse nicho, na pele de cães. / Skin is an extensive and easily accessible organ, possessing various cell types which are in constant renovation. Some stem cell types found in the skin have the potential of self-renewal, proliferation and differentiation, processes which are responsible for the organ’s maintenance of homeostasis and the healing of wounds. Previous studies suggested the presence of a stem cell niche at the bulge region of the hair follicle, which contains cell populations positive for CD200 and CD34. Thus, this work sought to identify these cell populations in canine cultures using the following methods: 1. 1- Collecting samples of adult and fetus canine skin, isolating and culturing these cells in vitro using a method of simple enzymatic digestion; 2- Testing the cell cultures for CD200 and CD34 in vitro, comparing them with analyzed tissue material. Hematoxylin and eosin staining were conducted for the biopsies and analysis of fetal and adult canine skin, with the extracted cell cultures being characterized for the presence of the proteins CD200 and CD34 through immunofluorescence, immunocytochemistry and flow cytometry. In both adult and fetal tissue samples, CD200 and CD34 immunofluorescence results were negative. In immunocytochemistry, both fetal and adult cultures cells tested positive for CD34 and CD200. The pluripotency marker OCT4 was also tested, and was positive for fetal culture cells. Flow cytometer results showed that, for samples with a double staining of CD200 and CD34 the average percentage of marked cells was 3.1% in adults and 0.33% in fetal cells (n=3). For the CD200 marker alone, positive cells were found only in adult cultures, representing 2.8% of the total population (n=3). In conclusion, the results suggest that obtaining bulge stem cells from both fetuses and adults, with use of CD200 and CD34 markers, is validated through the simple enzymatic digestion and cell culture methods utilized in this study. The present work is the first step towards developing new research involving this niche in dogs.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA088.pdf: 670172 bytes, checksum: 978ec4d11d867f3e2959dae1534f76a9 (MD5) Previous issue date: 2012-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The viability evaluation of animal cells subjected to different cryopreservation strategies is important for studies in cell culture, application in animal cloning and the establishment and maintenance of gene banks. The aim of this study is optimize a method for cryopreservation of bovine somatic cells in different containers using different cryoprotectants. For this purpose, three experiments were conducted using bovine skin fibroblast cells obtained by ear biopsy explantation by ear biopsy of a female Flemish breed. In the first experiment the cells were cryopreserved in cryotubes at fixed concentration of 1x106 cells/mL and in three freezing culture medium (1) culture medium +10% DMSO, (2) culture medium + 10% propylene glycol, (3) culture medium + 10% ethylene glycol. In the second experiment the freezing was performed with the same solutions used in experiment 1, however, the cells were cryopreserved in 0.25 mL and 0.5 mL straws. In the third experiment cells in different concentrations, (0.33x106 cells/mL, 1x106 cells/mL, 3x106 cells/mL and 5x106 cells/mL) were cryopreserved in 0.5 mL straws with culture medium + 10% propylene glycol. In all experiments, the cells were thawed in waterbath at 37 oC for evaluation of cell survival by trypan blue method and by the cell growth curve after 72 h in culture, moreover, in the first experiment was carried out the population doubling time test (PDT). The data were analyzed by analysis of variance with pairwise comparisons between groups by the Tukey test, with significance level of 5%. In first experiment there was no significant difference between groups using different cryoprotectants and the time of cell division, estimated by PDT, ranged from 15.9 to 16.5 hours.In the second experiment no significant difference in the survival rate between groups was observed, regardless of the cryoprotectant used, and considering the 0.25 and 0.5 mL straws. In the growth curve, the survival performance of cells cryopreserved in 0.25 ml straws was statistically inferior to that frozen in 0.5 mL straws and cryovials. In this experiment all groups had significantly lower survival results campared to the control group. In the third experiment, the cell concentrations that presented a better survival rate after thawing were 0.33x106cells/ mL and 1x106 cells /mL. Based on the results obtained it follows that straws can be used for freezing cells and the straws of 0.5 mL showed results consistent with those obtained by cryotubes. Likewise the use of PG can be a viable alternative for the freezing somatic cells / A avaliação da viabilidade de células animais submetidas à criopreservação é importante para estudos em cultivo celular, aplicação em clonagem animal e para o estabelecimento e manutenção de bancos genéticos. O objetivo do trabalho é otimizar uma metodologia de criopreservação de células somáticas bovinas utilizando diferentes recipientes e crioprotetores. Para tanto, três experimentos foram conduzidos utilizando células fibroblásticas de origem cutânea foram obtidas por meio de biópsia auricular de uma fêmea da raça Flamenga. No primeiro experimento, as células foram criopreservadas em criotubos na concentração fixa de 1x106 células/mL em três soluções de congelamento (1) meio de cultivo +10% de DMSO; (2) meio de cultivo + 10% de Propileno glicol; (3) meio de cultivo + 10% de Etileno glicol. No segundo experimento, o congelamento foi realizado com as mesmas soluções crioprotetoras utilizadas no experimento um, porém as células foram criopreservadas em palhetas de 0,25 mL e 0,5 mL. No terceiro experimento, foram testadas diferentes concentrações celulares, (0,33x106 cel/mL, 1x106 cel/mL, 3x106 cel/mL e 5x106 cel/mL) que foram criopreservadas em palheta de 0,5 mL utilizando-se meio de cultivo + 10% propileno glicol. Em todos os experimentos, as células foram descongeladas em banho maria a 37 oC para avaliação da sobrevivência celular pelo método de azul de Tripan e avaliação da curva de crescimento celular após 72 h de cultivo, além disso, no primeiro experimento foi realizado o teste de population doubling time (PDT) e no segundo e terceiro experimento o grupo controle foi realizado com células criopreservadas em criotubo utilizando a solução de congelamento composta meio de cultivo +10% de DMSO. Os dados foram analisados através da análise de variância com comparações pareadas entre grupos pelo teste de Tukey, com nível de significância de 5%. No primeiro experimento, não houve diferença significativa entre os grupos utilizando diferentes crioprotetores e o tempo de divisão celular estimado pelo PDT variou de 15,9 a 16,5 horas. No segundo experimento, a taxa de sobrevivência pós descongelamento, considerando as palhetas de 0,25 e 0,5 mL, não apresentou diferença significativa entre os grupos, independente do crioprotetor utilizado. Já na curva de crescimento, a sobrevivência das células criopreservadas em palhetas de 0,25 mL apresentou um desempenho estatisticamente inferior às congeladas em palhetas de 0,5 mL e criotubos. Neste experimento todos os grupos apresentaram resultados de sobrevivência significativamente inferiores ao grupo controle. No terceiro experimento as concentrações celulares que apresentaram melhores resultados de sobrevivência após o descongelamento foram de 0,33x106 cel/mL e 1x106 cel/mL. Com base nos resultados obtidos conclui-se que é possível utilizar palhetas para o congelamento de células e que as palhetas de 0,5 mL apresentaram resultados compatíveis aos obtidos com criotubos. Da mesma forma o uso de PG pode ser uma alternativa viável para o congelamento de células somáticas

Submitted by Ana Carolina Picolo Pasian (ana_781@hotmail.com) on 2018-04-20T19:54:18Z No. of bitstreams: 1 PARA DESPÓSITO.pdf: 1930882 bytes, checksum: 397a91ec261857e9a2bea286ae3eeb52 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-04-23T13:24:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pasian_acp_me_bot.pdf: 1930882 bytes, checksum: 397a91ec261857e9a2bea286ae3eeb52 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-23T13:24:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pasian_acp_me_bot.pdf: 1930882 bytes, checksum: 397a91ec261857e9a2bea286ae3eeb52 (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / A medicina regenerativa é uma área em crescente expansão no Brasil e no mundo, a qual procura ampliar a capacidade natural de regeneração dos tecidos através da utilização de células, fatores de proliferação e biomateriais. Um dos ramos da medicina regenerativa é a terapia celular, vertente que utiliza células-tronco, visando a substituição de tecidos funcionalmente ou estruturalmente lesados, apresentando um caráter terapêutico. Na medicina LASERs e LEDs vem sendo estudados como ferramenta terapêutica, mostrando possuir capacidade bioestimulatória. Este campo é caracterizado por uma variedade de metodologias, que são utilizadas em uma gama considerável de aplicações. Na técnica de fotoestimulação, utiliza-se a luz para ativar moléculas e funções celulares, apresentando o potencial de afetar a proliferação e diferenciação e o metabolismo da célula, estimulando a fosforilação oxidativa e podendo reduzir a resposta inflamatória local. Entretanto para que essa resposta ocorra, inúmeros trabalhos afirmam sobre a importância da seleção de um comprimento de onda ideal, uma vez que a utilização de um comprimento inapropriado pode acarretar em resultados contrários aos esperados, como a bioinibição. Diante destes achados o presente trabalho propôs-se a avaliar a ação do LED 850nm, no regime pulsátil, nas doses de 3, 5 e 10J/cm² na cultura de célula-tronco mesenquimal (CTM) com Soro Fetal Bovino (SFB) e com Hormônios derivados de plaquetas (HDP), e na cultura de células de Linfoma linfoblástico tipo B, RAJI Cells na dose de 10J/cm². Em ambos experimentos de exposição a luz, o comprimento de onda 850 nm inibiu a proliferação celular. Na cultura de CTM o LED tornou o desdobramento celular mais lento e acarretou na diminuição da confluência celular, especialmente nas doses de 5 e 10J/cm². Na cultura de linfoma Linfoblástico tipo B, em apenas 1 semana de exposição o mesmo comportamento de bioinibição foi encontrado na dose de 10J/cm². O grupo não tratado apresentou 7,0 X 10 5 células, em média, por frasco enquanto que as células submetidas à irradiação sofreram diminuição do tempo de desdobramento sendo a concentração destas de 4,2X105 , em média, por frasco. / Regenerative medicine is a promising growing area worldwide, with the aim of restore and regenerate tissues and whole organs through the use of cells, proliferation factors and biomaterials. One branch of regenerative medicine is cell therapy, that uses stem cells, aiming at the substitution of functionally or structurally damaged tissues, presenting therapeutic fature. LASERs and LEDs are available as therapeutic tools, showing biostimulating ability. The photo-stimulation technique uses light to activate molecules and cellular functions, presenting potential to affect proliferation, cell differentiation and metabolism, stimulating oxidative phosphorylation and reducing the local inflammatory response. Data shows the importance of selecting an ideal wavelength, such as the use of an inappropriate choice, can lead to undisered results, such as bioinhibition. In the present work, we evaluated the action of LED 850nm, pulsatile, at the doses of 3, 5 and 10J/cm² in mesenchymal stem cells (CTM) with Bovine Fetal Serum (FBS) and with derived platelets – Hormones (HDP) and B-cell lymphoblastic cell culture, 10J /cm2 , RAJI cells. In all light exposure experiments, wavelength of 850 nm inhibited cell proliferation. CTM culture, LED had a low proliferation rate, resulting in a decrease in cellular confluence, especially at 5 and 10J/cm2 . Lymphoblastic lymphoma type B cells, in only one week of exposure presente the same behavior of bioinhibition at 10J/cm2 . The control group had 7.0 x 105 cells on per vial, while cells subjected to irradiation underwent the unfolding time at a concentration of 4.2 x 105 on average per vial.

Orientador: Luis Carlos Spolidorio / Banca: Ticiana Sidorenko de Oliveira Capone / Banca: Thallita Pereira Queiroz / Resumo: Os mecanismos de ação dos andrógenos sobre homeostase e regulação das células que participam do turnover ósseo em fêmeas ainda são pouco compreendidos. Este trabalho teve como principal objetivo avaliar a participação de andrógenos na diferenciação e atividade de osteoclastos in vitro. Células totais de medula óssea de fêmur e tíbia de camundongos fêmeas foram utilizadas como fonte de células precursoras de osteoclastos, sendo cultivadas utilizando-se α-MEM suplementado e em presença de RANK-L (30ng/mL) e M-CSF (50ng/mL). As células foram tratadas com testosterona (T) diidrotestosterona (DHT) e antagonistas de receptores de hormônios sexuais, como flutamida (FLU) e fulvestranto (FUL). O anastrozol (ANA) foi usado para inibição da enzima aromatase e o etanol (0,01%) foi utilizado como controle. Após cinco dias, as células foram fixadas, coradas com TRAP e contadas, considerando-se células TRAP-positivas com 3 ou mais núcleos. Para o ensaio de atividade, foram utilizadas placas revestidas com fosfato de cálcio inorgânico e a área de reabsorção foi calculada com o auxílio de software. O estágio de diferenciação osteoclástica foi avaliado por RT-qPCR e a modulação da expressão de receptores para hormônios sexuais foi avaliada por Western Blot. Os andrógenos (T e DHT) não exerceram efeitos sobre a diferenciação e atividade de osteoclastos (ANOVA; p>0,05). Por outro lado, os tratamentos com ANA, FLU e FUL, associados ou não a T, regularam positivamente a diferenciação e atividade d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The action mechanisms of androgens on homeostasis and the regulation of cells that participate in bone turnover in females are still poorly understood. This study had as main objective to evaluate the participation of androgens in the differentiation and activity of in vitro osteoclasts. Total bone marrow cells from femur and tibia of female mice were used as a source of precursor cells of osteoclasts, they were cultivated using supplemented α-MEM and in the presence of RANK-L (30ng/mL) and M-CSF (50ng/mL). The cells were treated with testosterone (T), dihydrotestosterone (DHT) and antagonists of sexual hormone receptors such as flutamide (FLU) and fulvestrant (FUL). Anastrozole (ANA) was used for inhibiting the aromatase enzyme and ethanol (0.01%) was used as a control. After five days, the cells were fixed, colored with TRAP and counted, considering TRAP-positive cells those ones containing 3 or more nuclei. For the activity assay, were used plaques covered with inorganic calcium phosphate and the area of reabsorption was calculated with the assistance of a software. The osteoclast differentiation stage was evaluated by RT-qPCR and the modulation of the expression of receptors for sexual hormones was assessed by Western Blotting. The androgens (T and DHT) did not exert effects in differentiation and activity of osteoclasts (ANOVA, p> 0.05). On the other hand, the treatments with ANA, FLU and FUL, associated or not to T, positively regulated the differentiation and activity ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Hiro Goto / Resumo: O objetivo do estudo foi avaliar o papel imunomodulatório das citocinas TGF-ß1, IL-10 e INF-g nos extratos de baço e de fígado e no sobrenadante de cultura de células brancas esplênicas, em cães machos assintomáticos e sintomáticos, naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi. Trinta cães oriundos da cidade de Araçatuba, SP, área endêmica para leishmaniose visceral, selecionados por reação sorológica ELISA positiva para Leishmania sp. foram divididos em dois grupos: cães sem sintomas (n=15) que constituíram o grupo assintomático, e os cães com pelo menos três dos sinais clínicos característicos (febre, dermatites, linfoadenopatias, onicogrifose, perda de peso, caquexia, problemas de locomoção, conjuntivite, epistaxe, hepato-esplenomegalia, edema, apatia), que constituíram o grupo sintomático (n=15). Após a eutanásia, fragmentos de baço e de fígado foram coletados para quantificação de TGF-ß1, IL-10 e INF-g ex vivo. O TGF-ß1 ativo naturalmente produzido in vitro também foi avaliado no sobrenadante de cultura de células esplênicas. O extrato de baço e de fígado do grupo de cães assintomáticos apresentou níveis médios maiores de TGF-ß1, quando comparado ao grupo de cães sintomáticos. A citocina IL-10 foi detectada em altas concentrações no extrato de baço e, principalmente, de fígado dos dois grupos de cães avaliados. O INF-g foi encontrado no extrato de baço, do grupo de cães assintomáticos, e de fígado, do grupo de cães sintomáticos. Embora a citocina INF-g tenha sido detectada na infecção canina, os níveis médios de TGF-ß1 e IL-10 no extrato de baço e de fígado foram mais elevados, sugerindo que tanto em cães assintomáticos quanto em sintomáticos a resposta imune predominante foi do tipo Ta2. / Abstract: The aims of this study were to evaluate the immunomodulatory role of TGF-ß1, IL-10, & INF-g in spleen and liver extracts and supernatant cultures of white spleen cells from male symptomatic and asymptomatic dogs, naturally infected by Leishmania (Leishmania) chagasi. Thirty dogs from Araçatuba, SP, an endemic leishmaniasis area, were selected by positive ELISA serological reaction for Leishmania sp. and divided into two groups: asymptomatic (n=15), and symptomatic (n=15) consisting of animals with at least three characteristic signs (fever, dermatitis, lymphoadenopathy, onychogryphosis, weight loss, cachexia, locomotion problems, conjunctivitis, epistaxis, hepatosplenomegaly, edema, and apathy). After euthanasia, spleen and liver fragments were collected for ex vivo quantification of TGF-ß1, IL-10, and INF-g. Naturally active in vitro produced TGF-ß1 was also evaluated in spleen cell culture supernatant. Spleen and liver extract of asymptomatic dogs had higher mean TGF-ß1 levels than symptomatic dogs. High concentrations of IL-10 were found in spleen, and mainly in liver extract of both groups. Higher INF-g concentrations were found in spleen extracts of asymptomatic dogs, and in liver extracts of symptomatic dogs. Although INF-g is being produced in canine infection, mean levels of TGF-ß1 and IL-10 from spleen and liver extracts were much higher, suggesting that immune response in both asymptomatic and symptomatic dogs was predominantly type Th2. / Mestre

Orientador: Juliane Maria Guerreiro-Tanomaru / Resumo: Nanopartículas de prata (NPsAg) apresentam ação bactericida e biocompatibilidade, mostrando potencial para aplicações na Odontologia. Farnesol (FAR) é um álcool encontrado em óleos essencias de frutas cítricas e apresenta atividade antibacteriana/antibiofilme. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana, antibiofilme e a citotoxicidade de soluções de NPsAg e FAR, para serem utilizadas na desinfecção de canais radiculares. O estudo foi dividido em duas publicações. Na Publicação 1, a atividade antimicrobiana foi avaliada sobre Enterococcus faecalis, Candida albicans ou Pseudomonas aeruginosa, por meio da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e microbicida mínima (CMM) pelo método de microdiluição e coloração com resazurina. A avaliação da atividade sobre a biomassa dos biofilmes foi realizada por meio do ensaio de cristal violeta. A capacidade anti-adesão de biofilme foi avaliada em blocos de dentina radicular bovina após tratamento da dentina com as soluções por 3 min. Foram realizadas análises em microscopia eletrônica de varredura (MEV) e contagem de UFC mL-1 log 10. Os dados foram submetidos à análise estatística (α=0,05). No teste antibacteriano sobre células planctônicas de E. faecalis, os valores de CIM/CMM das soluções de NPsAg e FAR foram de 42,5/50μM e 0,85/1,0%, respectivamente. Para C. albicans, os valores de CIM/CMM de NPsAg e FAR foram de 27,5/37,5μM e 1,75/2,5%, respectivamente. Para P. aeruginosa, os valores de CIM/CMM de NPsAg... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Silver nanoparticles (AgNPs) have potential for applications in dentistry due to bactericidal action and biocompatibility. Farnesol (FAR) is an alcohol found in essential oils of citrus fruits and it has antibacterial/antibiofilm activity. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial, antibiofilm activities and the cytotoxicity of AgNPs and FAR solutions used as root canal disinfectant. The study was divided into two publications. In Publication 1, antimicrobial activity was evaluated against Enterococcus faecalis, Candida albicans or Pseudomonas aeruginosa, by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum microbicidal concentration (MMC) by microdilution method and rezasurin staining. The anti-biofilm activity was performed by crystal violet assay. The anti-biofilm adhesion ability was evaluated using bovine root dentine blocks after treating them with tested solutions for 3 min. Scanning electron microscopy (SEM) analysis and CFU mL-1 log 10 counting were performed. Data were statistically analyzed (α=0.05). The antibacterial test against planktonic cells of E. faecalis showed MIC/MMC values of 42.5/50μM and 0.85/1.0% for AgNPs and FAR, respectively. The values of MIC/MMC of AgNPs and FAR for C. albicans were 27.5/37.5μM and 1.75/2.5% and for P. aeruginosa were 32.5/32.5μM and 2.5/2.75%, respectively. The anti-adhesion biofilm capacity assay showed smaller amount of biofilm adhered to the substrate treated with AgNPs and FAR when compared... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A asma é definida como uma doença inflamatória crônica de caráter multifatorial, caracterizada pela obstrução reversível das vias aéreas, denso infiltrado inflamatório e hiper-reatividade brônquica a estímulos externos. Clinicamente, a doença é marcada por sintomas episódicos de dispneia, sibilo, tosse seca e sensação de aperto no peito. A terapia convencional da asma compreende o uso de anti-inflamatórios e broncodilatadores. A budesonida é um glicocorticoide esteroide e é dos fármacos mais utilizados na terapêutica da asma. No entanto, a budesonida apresenta baixa biodisponibilidade oral e o uso prolongado pode levar a efeitos adversos graves como afinamento da pele e supressão adrenocortical. No desenvolvimento de novas formulações, a avaliação da toxicidade é de extrema importância. Por conseguinte, o uso de cultura celular é de grande valia no desenvolvimento de protocolos para avaliação da toxicidade de novas formulações. Adicionalmente, a nanotecnologia é uma ferramenta importante para resolver problemas de biodisponibilidade e para contornar efeitos adversos da terapêutica convencional. Desta forma, o objetivo desta tese foi desenvolver um novo sistema nanoestruturado na forma de pó seco para inalação (Dry powders inhalers – DPI), obtido por aspersão contendo budesonida encapsulada, visando o tratamento da asma aguda e crônica. Essa proposta foi baseada na obtenção de um sistema pulverulento nanoestruturado com tamanho reduzido e controlado, visando a entrega pulmonar da budesonida. Na etapa de pré-formulação foi realizado um estudo fatorial avaliando diferentes métodos de preparação das nanocápsulas e os adjuvantes de secagem utilizados. As análises de tamanho de partícula, da formulação selecionada (nanocápsulas contendo budesonida e secas por aspersão com leucina) mostraram um tamanho reduzido e adequado para a administração pulmonar (2,7 μm). A morfologia demonstrou que estas partículas possuem um tamanho reduzido, forma esférica e superfície irregular, características importantes para a administração pulmonar. Quando analisada a distribuição pulmonar in vitro, em Impactador de Andersen, a formulação apresentou uma fração de partículas finas (Fine Particle Fraction – FPF) de 28%. Analisando os resultados dos experimentos em modelos de asma aguda e crônica induzidos por ovalbumina, os resultados da mecânica respiratória e função pulmonar mostraram uma diminuição na resistência e na elastância pulmonar, quando a budesonida nanoencapsulada foi utilizada, quando comparada com uma formulação comercial de budesonida, nas duas doses utilizadas (0,5 e 1,0 mg/Kg). Esse tratamento com nanocápsulas também mostrou eficiência na redução da inflamação, pela redução do número de leucócitos totais no fluido de lavagem bronco alveolar (Broncho Alveolar Lavage Fluid – BALF) e, principalmente, redução significativa no número dos eosinófilos no infiltrado pulmonar. Corroborando esses resultados, a quantificação da eotaxina – 1 e das citocinas pró-inflamatórias foram reduzidas, quando comparadas ao tratamento comercial. A análise histopatológica mostrou que quando o tratamento com as nanocápsulas foi utilizado, a produção de muco foi reduzida, bem como a produção de fibrose sub-epitelial, sugerindo um possível efeito sobre o remodelamento tecidual. Os resultados de toxicidade utilizando linhagem celular epitelial pulmonar (H441) mostrou uma redução na toxicidade da budesonida, quando encapsulada nas nanopartículas, tanto na forma de suspensão como na forma pulverulenta. Essa redução da toxicidade foi de 75% e de 50%, na dose de 100 μg/mL, para a suspensão e para o DPI, respectivamente. O conjunto dos resultados obtidos mostrou a potencial aplicabilidade da budesonida nanoencapsulada para o tratamento da asma, utilizando esse novo sistema DPI. / Asthma is characterized as a chronic inflammatory disease developed by multifactorial aspects such as genetic predisposition and exposure to environmental factors such as pollution, smoke and microorganisms. The conventional asthma therapy comprises the use of bronchodilators and anti-inflammatory. Budesonide is a glucocorticoid and is the most frequently used therapy in the treatment of asthma. However, this drug has low oral bioavailability and long term use may lead to adverse effects such as skin thinning and adrenal suppression. The evaluation of the toxicity of new formulation has critical role in the pharmaceutical development. The use of cell culture experiments can help this aspect. Additionally, nanotechnology is an important tool to solve problems regarding bioavailability and to circumvent adverse effects of conventional therapy. The aim of this work was to develop a nanostructured system as dry powder inhaler (DPI) containing budesonide loaded, obtained by spray-drying, targeting the treatment of acute and chronic asthma. This proposal was based on obtaining a nanostructured powder system with reduced and controlled size, aiming an alternative to treatment of asthma. A factorial study comparing different methods to produce the nanocapsules as well as the type of drying adjuvants was performed. The particle size of the selected formulation was 2.7 μm, an adequate reduced size suitable for pulmonary administration. The morphology of these particles showed a small size, spherical shape and irregular surface. All these characteristics are important for pulmonary administration. When analyzed the in vitro pulmonary distribution of the DPI, using an Andersen Cascade Impactor, showed a fine particle fraction (FPF) of 28%. Analyzing the results of the biological experiments, the mechanical respiratory and pulmonary function showed a decrease in lung elastance and resistance when budesonide was used nanoencapsulated compared with a commercial formulation of budesonide in two doses (0.5 and 1.0 mg / kg). Both treatments also showed nanocapsules efficiency in reduction of inflammation by reducing the total of leukocytes in the bronchial alveolar lavage fluid (BALF) and especially significant reduction in eosinophil infiltration in the lung tissue. Corroborating with these results, the quantification of eotaxin - 1 and proinflammatory cytokines was reduced when compared to commercial budesonide treatment. Histopathological analysis showed that when treatment with the nanocapsules was used, mucus production was reduced and reversed the phenomena of airway remodeling. The cytotoxicity assay by Alamar blue using the bronchial epithelium cell line (H441) showed a reduction on the toxicity of budesonide when the nanocapsules were used even in suspension or in the DPI. The cytotoxicity reduction were 75 and 50%, at 100 μg/mL, for the suspension and the DPI, respectively. All these results show that budesonide-loaded nanocapsules in dry powder inhaler is a promising approach for the treatment of asthma.

abstract: Once perceived as an unimportant occurrence in living organisms, cell degeneration was reconfigured as an important biological phenomenon in development, aging, health, and diseases in the twentieth century. This dissertation tells a twentieth-century history of scientific investigations on cell degeneration, including cell death and aging. By describing four central developments in cell degeneration research with the four major chapters, I trace the emergence of the degenerating cell as a scientific object, describe the generations of a variety of concepts, interpretations and usages associated with cell death and aging, and analyze the transforming influences of the rising cell degeneration research. Particularly, the four chapters show how the changing scientific practices about cellular life in embryology, cell culture, aging research, and molecular biology of Caenorhabditis elegans shaped the interpretations about cell degeneration in the twentieth-century as life-shaping, limit-setting, complex, yet regulated. These events created and consolidated important concepts in life sciences such as programmed cell death, the Hayflick limit, apoptosis, and death genes. These cases also transformed the material and epistemic practices about the end of cellular life subsequently and led to the formations of new research communities. The four cases together show the ways cell degeneration became a shared subject between molecular cell biology, developmental biology, gerontology, oncology, and pathology of degenerative diseases. These practices and perspectives created a special kind of interconnectivity between different fields and led to a level of interdisciplinarity within cell degeneration research by the early 1990s. / Dissertation/Thesis / Ph.D. Biology 2013

O melanoma representa 4% dos tipos de neoplasias cutâneas e causa 79% de morte por doenças de pele no mundo. Um dos grandes problemas relacionados ao tratamento de melanoma advém da sua resistência às terapias convencionais e, assim, a terapia fotodinâmica surgiu como uma alternativa terapêutica promissora, devido ao seu papel no tratamento de diversos tipos de câncer, além de outras doenças de pele. Ela é baseada no acúmulo seletivo de uma molécula fotoativa no tecido alvo, seguida da iluminação por uma fonte de luz, cujo comprimento de onda é específico para a excitação dessa molécula, ocasionando no dano celular. Neste estudo, foram realizados experimentos in vitro investigando a resposta fotodinâmica em melanoma humano, através de um modelo de tumor tridimensional por levitação magnética. Inicialmente, um protocolo de obtenção dos tumores de melanoma foi desenvolvido para avaliação da terapia em diferentes doses de luz e concentrações de fotossensibilizador. Em seguida, ensaios de cinética e quantificação intracelular com dois fotossensibilizadores, Photogem® e Photodithazine®, também foram feitos com o intuito de averiguar a sua distribuição, bem como tempo de internalização nos tumores. Tendo estabelecido que a incubação por 16 horas com Photodithazine® foi o parâmetro experimental mais adequado, a terapia fotodinâmica foi realizada, em sessão única, com irradiação em 660 nm em tumores de duas diferentes espessuras. Logo, testes de citotoxicidade foram utilizados para comparar os resultados de ambas as condições, onde se notou que o aumento na espessura atenuou o dano oxidativo decorrente da terapia. Além disso, foi observado que o acréscimo na dose de luz não acarretou em mudanças muito significativas na morte celular. No entanto, o maior dano celular, de aproximadamente 90% de morte, foi obtido com 100 μg/mL de Photodithazine® e iluminação com 60 J/cm², resultando na desagregação dos tumores, efeitos promissores da terapia no melanoma. Uma possível alternativa sugerida para aprimorar a eficiência fotodinâmica, seria a aplicação de mais sessões de terapia fotodinâmica, uma vez que os experimentos realizados nesse trabalho foram com uma sessão e, esse procedimento, poderia ocasionar em maior morte celular. / Melanoma accounts for 4% of skin cancers and causes 79% of death from skin diseases worldwide. A major problem associated with melanoma treatment is due to its increasingly resistance to conventional therapies. Thus, photodynamic therapy has emerged as a promising alternative modality to several types of cancer and other skin disorders. It generally involves the selective accumulation of a photoactive molecule in target tissue, followed by illumination with light source of an appropriate wavelength, to excite this molecule, resulting in cell damage. This study sought to investigate the photodynamic response in human melanoma, through a three dimensional tumor model by magnetic levitation. Initially, a protocol to obtain melanoma tumors was developed, to evaluate the therapy at different doses of light and photosensitizer concentrations. Posteriorly, kinetic assays and intracellular quantification with two photosensitizers, Photogem® and Photodithazine®, were also carried out in order to ascertain its distribution, as well as time internalization in tumors. Having established that incubation for 16 hours with Photodithazine® was the most suitable experimental parameter, photodynamic therapy was performed in a single session, with irradiation of 660 nm in two tumors, different in thicknesses. Therefore, cytotoxicity tests were used to compare the results of both conditions, where it was noted that the increased tumor depth may attenuate oxidative damage, induced by the therapy. Furthermore, it was observed that the increase in light dose did not result in significant changes in cell death. Nevertheless, the greater cell damage, approximately 90% kill was obtained with 100 ug/mL Photodithazine® and illumination with 60 J / cm², causing tumor breakdown, which is a promising effect in melanoma therapy. An alternative suggested to enhance the photodynamic efficiency, would be to apply more sessions of photodynamic therapy, so this procedure could result in increased cell death.

Câncer é a denominação para um grupo de doenças devastadoras caracterizadas pelo crescimento e multiplicação descontrolados de células anormais que são capazes de invadir estruturas próximas e se espalhar por diversas regiões do organismo.Trata-se de um grande problema de saúde pública mundial, fazendo milhares de novas vítimas a cada ano. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA), são estimados cerca de 580 mil casos novos da doença no Brasil para 2014. A presente tese de doutorado teve como foco principal a identificação e o desenvolvimento de novas moléculas com atividade anticâncer, através de triagens biológicas de compostos de origem natural e sintética, e do estudo das relações entre a estrutura e atividade (SAR). Triagens in vitro de derivados sintéticos do ácido gálico, ácido protocatecuico e guanidínicos, além de uma variedade de produtos naturais, possibilitaram a identificação de agentes inibidores da migração e proliferação de células tumorais metastáticas. Uma série de derivados sintéticos indólicos e espirocicloexadienonas, com potente efeito inibitório da migração celular, teve caracterizada a sua ação frente à proteína tubulina, alvo molecular de compostos importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. Ensaios de imunofluorescência revelaram a ação dos compostos associada a alterações do citoesqueleto celular. Também foram realizados o planejamento e a síntese de três cadeias peptídicas por meio da metodologia de síntese peptídica em fase sólida. Os resultados da avaliação biológica dos peptídeos indicaram o efeito de inibição na migração e proliferação de células tumorais de mama. Finalmente, estudos de metabolômica de duas linhagens tumorais de mama foram conduzidos através de análises de RMN do material celular cultivado. / Cancer is a group of devastating diseases characterized by the abnormal growth of defective cells which invade adjacent tissues and eventually disseminate to several locations of the body. It is a major public health problem, affecting thousands of people each year. According to the brazilian National Institute of Cancer (INCA), approximately 580,000 new cases of cancer are predicted for the year of 2014 in Brazil. The main goal of this PhD thesis was the identification and development of new molecules possessing anticancer activity, through biological screenings of compounds from natural and synthetic sources, as well as the investigation of structure-activity relationships (SAR). In vitro screening of synthetic derivatives of gallic acid, protocatechuic acid and guanidines, along with a diverse set of natural products, allowed the identification of inhibitors of cellular migration and metastatic cell proliferation. A series of synthetic indolic derivatives and cyclohexanediones, having potent inhibitory activity in cellular migration, was characterized upon tubulin, an important macromolecular target for compounds such as taxol, vinblastine and colchicine. Immunofluorescence assays revealed that the compounds act by altering the cellular cytoskeleton. The design and synthesis of three polypeptides were also performed through solid phase synthesis. The biological evaluation of the peptides demonstrated their inhibition effects on the migration and proliferation of breast cancer cells. Finally, metabolomic studies of two strains of breast cancer cells were conducted by NMR analyses of cellular cultures.