O carcinoma mucoepidermóide de pulmão, um tipo histológico que deriva das glândulas mucosas traqueobrônquicas, manifesta-se com sintomas obstrutivos e tende a comprometer a traqueia. Com finalidade curativa ou paliativa da doença, atualmente há uma forte tendência na oncologia em desenvolver estratégias terapêuticas que visam à administração de compostos com elevado potencial de otimizar o efeito do tratamento com a radiação ionizante, de modo a aumentar a morte de células tumorais e preservar íntegras as células dos tecidos sadios adjacentes. A intensa busca por tais estratégias evidenciou resultados promissores apresentados pelo composto denominado Resveratrol (3,4,5-trihidroxiestilbeno), tornando-o amplamente divulgado e alvo de intensas pesquisas. O principal objetivo do presente estudo foi determinar o efeito do resveratrol em cultura celular de carcinoma mucoepidermóide de pulmão exposta a diferentes doses de radiação ionizante. Para tal, os estudos de citotoxicidade utilizando o método de incorporação do vermelho neutro, e da determinação da dose letal 50 % (DL50) da radiação ionizante, foram realizados em cultura de células da linhagem NCI-H292 [H292] (ATCC® CRL-1848TM), CCIAL069. Com base nos resultados do IC50% (401,5 μM) e da DL50 (693 Gy) foram realizados o teste in vitro do micronúcleo e os ensaios para avaliar o efeito do resveratrol no ciclo celular, reparo da lesão no DNA e processo de lesão radioinduzida, necrose e apoptose celular. Os resultados evidenciaram que o resveratrol na concentração de 30 μM apresenta uma importante capacidade em promover danos às células NCI-H292 após 24 h da irradiação. / Mucoepidermoid lung carcinoma is a histological type that derives from the tracheobronchial mucous glands. It is manifested by trachea symptoms. Curative or palliative purpose for the disease, nowadays presents a strong oncology tendency to develop therapeutic strategies aimed at the administration of high potential compounds to improve the ionizing radiation treatments, so as to increase the radiation effects on tumor cells while minimizing these effects to surrounding normal tissues. The intensive search for such strategies showed promising results by the compound called Resveratrol, making it widely available and subject of many studies. The main of this study was to determine in vitro resveratrol effect in mucoepidermoid lung carcinoma cells NCI-H292 [H292] (ATCC® CRL-1848TM), CCIAL069, exposed to ionizing radiation doses. For this purpose, there were performed in vitro cytotoxicity studies by neutral red uptake assay, as well as the lethal dose 50 % (LD50) of ionizing radiation. On the basis of the IC50% (401.5 μM) and LD50 (693 Gy) results, there were performed in vitro micronucleus test and other tests in order to evaluate the cell cycle, repair and injury processes, cellular apoptosis and necrosis inductions. The results showed that resveratrol in 30 μM concentrations showed an important capability to injury NCI-H292 cells after 24 h of irradiation.

A ação metastática do BPV permanece não clara. Este estudo avaliou a ação do BPV na transição epitélio-mesênquima (TEM), empregando linhagens celulares de papiloma (P), fibropapiloma (FB) e carcinoma de esôfago (CE). Os resultados mostraram a presença de infecção produtiva e o aumento do potencial proliferativo nestas células. Porém, foi verificada a redução do potencial de membrana mitocondrial em relação à pele saudável (controle) e o aumento do estresse oxidativo, resultante da ação da oncoproteína E6, justificando a clastogenicidade e a aquisição do fenótipo-tronco descrito nas linhagens de P, FB e CE. Estas linhagens mostram capacidade migratória decorrente do sequestro citoplasmático de E-caderina, e o aumento dos níveis de expressão de vimentina, vinculina e N-caderina como consequência da ativação dos fatores STAT3 e SLUG, sugerindo a ação do vírus na indução da TEM. Tais resultados foram validados em amostras de tecido, reforçando a ação do vírus na TEM, bem como demostrando o potencial destas linhagens celulares como modelo de estudo da metástase. / BPV metastatic action remains unclear. This study evaluated the BPV action on epithelial-mesenchymal transmition (EMT), using cell lines form papilloma (P), fibropapilloma (FB) and esophageal carcinoma (EC). Results showed the productive infection presence and the proliferative potential increase in these cells. However, it was verified the mitochondrial membrane potential loss in relation to normal skin (control) and the oxidative stress increase as result of E6 oncoprotein, justifying the clastogenicity and stem-cell phenotype acquisition described in P, FB and EC cells. This cell lines showed a migratory capability as result of cytoplasmic sequester of E-cadherin, and the increase levels of vimentin, vinculin and N-cadherin as consequence of STAT3 and SLUG factors activation, suggest the virus action on EMT. These results were also verified in tissue samples, reinforcing the BPV action on EMT, as well as demonstrating the potential of these cell lines as model to study the metastasis.

As reabsorções radiculares externas são conseqüências decorrentes de lesões traumáticas severas como a avulsão e a intrusão. O estudo de medicamentos que possam auxiliar no controle e prevenção desses processos é de grande interesse. O objetivo desse estudo foi avaliar a citotoxicidade do alendronato de sódio e da calcitonina, aplicados em forma de pasta em cultura de fibroblastos humanos de gengiva. Foi utilizado para o experimento meio condicionado pelas substâncias a serem testadas, divididas em quatro grupos: alendronato de sódio (ALN) a 10-6M; ALN a 10-7M; ALN a 10-8M; e calcitonina (CAL). Como grupos controle usou-se meio de cultura não condicionado e meio de cultura condicionado apenas pelo veículo das pastas (talco farmacêutico e solução salina). A sobrevivência celular foi analisada pelo método de contagem de células viáveis nos tempos experimentais de 1 e 24 horas. Os resultados foram analisados estatisticamente e mostraram que o veículo empregado e as pastas de ALN nas concentrações de 10-7 e 10-8 M não apresentaram diferença significante do grupo controle. Conclui-se que os produtos oriundos das pastas formuladas com ALN a 10-6 M e com CAL a 0,002% apresentaram citotoxicidade para fibroblastos de gengiva humana na forma e período empregados. / External root resorption is a common consequence of dental trauma injuries, mainly in dental avulsion and extrusion. Doubtful prognoses awake the interesting in studying medications, which could help in controlling and preventing these resorption processes. The aim of this study was to evaluate the citotoxicity of sodium alendronate (ALN) and calcitonin, used in a paste formulation in human gingival fibroblasts. Products leached from the pastes were divided into four experimental groups and had conditioned cellular medium: ALN 10-6 M, ALN 10-7 M, ALN 10-8 M and calcitonin 0,002%. Such groups were taking under: fresh media and conditioned media with vehicle (talcum powder and saline). On experimental times, 1 and 24 hours, citotoxicity analyses were performed using the Trypan blue dye exclusion assay. The results were statistically analyzed and showed that the vehicle used and ALN concentrations 10-7 M and 10-8 M did not lead to differences from the control group with fresh media. In contrast, the calcitonin and the ALN pastes in a higher concentration, 10-6 M, demonstrated cell growth reduction. In conclusion, this research showed that products leached from pastes with calcitonin and ALN 10-6 were cytotocic for human gingival fibroblasts in vitro. Meanwhile, substances leached from ALN 10-7 M and 10-8 M were biocompatible.

O princípio da regeneração tecidual guiada (RTG) baseia-se na utilização de membranas biocompatíveis com a finalidade de impedir a migração dos tecidos conjuntivo e epitelial para a ferida, permitindo que células do ligamento periodontal repovoem a superfície radicular e regenerem o aparato de inserção do dente. A RTG tem sido utilizada em diversas situações clínicas para facilitar o reparo de defeitos ósseos e periodontais, sendo as membranas de politetrafluoretileno expandido (e-PTFE) as mais utilizadas. O objetivo deste estudo foi avaliar a biocompatibilidade in vitro de uma nova membrana do compósito de poli(vinilideno-trifluoretileno)/titanato de bário (P(VDF-TrFE)/BT). Para isso, osteoblastos, fibroblastos e queratinócitos, células com as quais a membrana entrará em contato durante o processo de RTG, foram cultivados sobre membranas de P(VDF-TrFE)/BT e PTFE (controle). Os seguintes parâmetros foram avaliados: 1) adesão celular por contagem em hemocitômetro; 2) proliferação celular por MTT e 3) adesão e morfologia celular por fluorescência, para as linhagens osteoblástica, fibroblástica e de queratinócitos; 1) medida do conteúdo de proteína total; 2) medida da atividade de fosfatase alcalina (ALP) e 3) formação de matriz mineralizada, para as linhagens osteoblástica e fibroblástica; 1) imunolocalização de ALP por fluorescência; 2) detecção histoquímica in situ da atividade de ALP e 3) expressão dos genes Runx2, Colágeno I (COL I), Ostepontina (OPN), ALP, Sialoproteína óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Bax, Bcl-2 e Survivina (SUR) por PCR em tempo real, para a linhagem osteoblástica; 1) expressão dos genes Periostin (PRT), Periodontal Ligament Specific 17 (PDLs17), Calcium-binding protein (S100A4), Fibromodulina (FBM), Bax, Bcl-2 e SUR por PCR em tempo real, para a linhagem fibroblástica e 1) expressão dos genes Involucrina (IVL), Queratina 1 (QRT-1), Queratina 10 (QRT-10), Queratina 14 (QRT-14), Bax, Bcl-2 e SUR por PCR em tempo real, para a linhagem de queratinócitos. Os dados quantitativos foram submetidos ao teste estatístico Mann-Whitney (nível de significância: 5%). A adesão de células osteoblásticas foi semelhante entre P(VDF-TrFE)/BT e PTFE em 30 min, 2 e 4 h (p>0,05). A proliferação de células osteoblásticas foi maior em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 1, 7 e 10 dias (p<0,05). A epifluorescência indicou que as células osteoblásticas estavam aderidas e mais espraiadas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 30 min, 4 e 24 h. A imunofluorescência revelou presença de ALP apenas em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias. O conteúdo de proteína total foi semelhante entre as duas membranas em 10 dias (p>0,05) e maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). Não houve diferença estatisticamente significante para atividade de ALP em 7 dias (p>0,05), entretanto em 10 e 14 dias (p<0,05) a atividade de ALP foi maior em culturas sobre o P(VDFTrFE)/ BT. A detecção histoquímica in situ revelou atividade de ALP apenas em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT, tanto aos 7 quanto aos 14 dias. A formação de matriz mineralizada ocorreu apenas em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT. A expressão dos genes Runx2, COL I, OPN, ALP, BSP, OC, Bax e SUR foi maior em células cultivadas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). Não houve expressão de Bcl-2 em culturas sobre as duas membranas. A adesão de células fibroblásticas foi semelhante entre P(VDFTrFE)/ BT e PTFE em 30 min (p>0,05) e maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 2 e 4 h (p<0,05). A proliferação de células fibroblásticas foi estatisticamente semelhante entre as duas membranas em 3 dias (p>0,05) e maior em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 1 e 7 dias (p<0,05). Os ensaios de fluorescência direta revelaram que as células fibroblásticas estavam aderidas sobre as duas membranas, porém em estágios mais avançados de espraiamento sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 30 min, 2 e 4 h. O conteúdo de proteína total foi maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 10, 14 e 21 dias (p<0,05). Não se observou atividade de ALP em culturas fibroblásticas sobre as membranas de P(VDF-TrFE)/BT e PTFE aos 7 dias. Contudo, em 14 dias (p>0,05) a atividade de ALP foi semelhante entre as duas membranas e em 21 dias (p<0,05) foi estatisticamente significante em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT. Aos 21 dias não se notou formação de matriz mineralizada em ambas as membranas. A expressão dos genes PRT, PDLs17, S100A4, FBM, Bax e SUR foi maior em culturas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). A expressão de Bcl-2 foi maior em células fibroblásticas cultivadas sobre o PTFE em 7 e 14 dias (p<0,05). A adesão de queratinócitos foi semelhante entre P(VDF-TrFE)/BT e PTFE em 30 min, 2 e 4 h (p>0,05). A proliferação de queratinócitos foi estatisticamente semelhante entre as duas membranas em 4, 7, 10 e 14 dias (p>0,05) e maior sobre culturas crescidas sobre P(VDF-TrFE)/BT em 1, 17 e 21 dias (p<0,05). Por fluorescência direta notou-se que células cultivadas sobre ambas as membranas exibiam morfologia predominantemente arredondada em 30 min, 4 e 24 h. A expressão do gene IVL foi semelhante em culturas crescidas sobre as duas membranas em 7 dias (p>0,05) e maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 14 dias (p<0,05). Os genes QRT-1, QRT -10 e QRT -14, Bax e SUR estavam mais expressos em culturas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). A expressão de Bcl-2 foi maior em queratinócitos crescidos sobre o PTFE em 7 dias (p<0,05) e semelhante entre as duas membranas em 14 dias (p>0,05). Por favorecer eventos relacionados ao desenvolvimento tecidual, como a adesão, proliferação e diferenciação celular, a membrana de P(VDF-TrFE)/BT pode representar uma boa alternativa ao PTFE para procedimentos de RTG. / The principle of guided tissue regeneration (GTR) is based on the use of physical barrier to isolate periodontal defects of the gingival connective and epithelial tissues so that bone, periodontal ligament, and cementum can be regenerated from their own cells. RTG procedure has been used in many clinical situations to promote bone and periodontal regeneration. Membranes of expanded polytetrafluoroethylene (e-PTFE) are the most commonly used material for GTR. However, several membranes have been tested to be applied in GTR. The purpose of this study was to evaluate the in vitro biocompatibility of the membrane of poly(vinylidene-trifluoroethylene/barium titanate (P(VDF-TrFE)/BT) composite. For that, osteoblasts, fibroblasts and keratinocytes, cells that will interact with the membrane during RTG, were culture P(VDF-TrFE)/BT and PTFE (control) membranes for up to 21 days. The following parameters were evaluated: 1) cell adhesion by counting in hemocytometer, 2) cell proliferation and 3) cell morphology by fluorescent labeling, for osteoblastic, fibroblastic and keratinocyte lineages; 1) total protein content; 2) alkaline phosphatase (ALP) activity and 3) mineralized bone-like nodule formation, for osteblastic and fibroblastic lineages; 1) immunolocalization of ALP by fluorescent labeling; 2) histochemistry detection in situ of ALP activity and 3) gene expression of Runx2, Collagen I (COL I), Ostepontin (OPN), ALP, Bone Sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OC), Bax, Bcl-2 and Survivin (SUR) by real-time PCR, for osteoblastic lineage; 1) gene expression of Periostin (PRT), Periodontal ligament specific (PDLs17), Calcium-binding protein (S100A4), Fibromodulin (FBM), Bax, Bcl-2 and SUR by real-time PCR, for fibroblastic lineage; 1) gene expression of Involucrin (IVL), Keratin-1 (QRT-1), Keratin-10 (QRT-10), Keratin-14 (QRT- 14), Bax, Bcl-2 and SUR days by real-time PCR, for keratinocyte lineage. Data were submitted to Mann-Whitney test (level of significance: 5%). The adhesion of osteoblastic cells was similar between P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 30 min, 2 and 4 h (p>0.05). Cell proliferation was higher in ostegenic cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 1, 7 and 10 days (p<0.05). Epifluorescence showed that osteoblastic cells grown on P(VDF-TrFE)/BT were more adhered and spread compared to PTFE at 30 min, 4 and 24 h. Immunofluorescence revealed the presence of ALP only in osteogenic cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days. Total protein content was similar between the membranes at 10 days (p>0.05) and higher on the P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). There was no differences in ALP activity at 7 days (p>0.05). However, ALP activity was higher in osteogenic cultures on the P(VDF-TrFE)/BT at 10 and 14 days (p<0.05). The histochemistry reveals that only ostegenic cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT had ALP activity in situ at 7 and 14 days. Bone-like nodule formation occurred only in cultures on the P(VDF-TrFE)/BT at 21 days. Gene expression of Runx2, COL I, OPN, ALP, BSP, OC, Bax and SUR was higher in cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). There was no expression of Bcl-2 in cultures on both membranes. The adhesion of fibroblastic cells was similar between P(VDFTrFE)/ BT and PTFE at 30 min (p>0.05) and greater in fibroblastic cultures on P(VDFTrFE)/ BT at 2 and 4 h (p<0.05). Cell proliferation was similar in fibroblastic cultures grown on both membranes at 3 days (p>0.05) and higher in cultures on P(VDF-TrFE)/BT at 1 and 7 days (p<0.05). Epifluorescence showed that fibroblastic cells grown on P(VDF-TrFE)/BT were more adhered and more spread compared to PTFE at 30 min, 4 and 24 h. Total protein content was greater on P(VDF-TrFE)/BT at 10, 14 and 21 days (p<0.05). There was no ALP activity in fibroblastic cultures grown on both membranes at 7 days. The ALP activity was similar between P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 14 day (p>0.05) and higher on P(VDFTrFE)/ BT at 21 days (p<0.05). Bone-like nodule formation was not observed in fibroblastic cultures on both membranes at 21 days. Gene expression of PRT, PDLs17, S100A4, FBM, Bax and SUR was higher in cultures on the P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). Bcl- 2 expression was higher in fibroblastic cultures on the PTFE at 7 and 14 days (p<0.05). Keratinocyte adhesion was similar for P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 30 min, 2 and 4 h (p>0.05). Keratinocyte proliferation was statistically similar on both membranes at 4, 7, 10 and 14 days (p>0.05) and higher in cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 1, 17 and 21 days (p<0.05). Keratinocytes displayed a round morphology and was not observed any evidence of cell spreading at 30 min, 4 and 24 h. The gene expression of IVL was similar in cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 7 days (p>0.05) and higher on the P(VDF-TrFE)/BT at 14 days (p<0.05). Genes expression of QRT-1, QRT-10, QRT-14, Bax and SUR was greater in keratinocytes grown on P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). Bcl-2 expression was higher in keratinocytes cultured on PTFE at 7 days (p<0.05) and similar on both membranes at 14 days (p>0.05). Our study indicates that P(VDF-TrFE)/BT membrane promote events related to tissue development/regeneration, such as cell adhesion, proliferation and differentiation. Thus, the membrane of P(VDF-TrFE)/BT could be used as an advantageous alternative to PTFE in GTR procedures.

Comparadas com células de mamífero, as células de inseto são mais fáceis de cultivar, não acumulam quantidade significativa de sub-produtos tóxicos e apresentam maiores rendimentos na expressão de proteínas heterólogas, porém apresentam uma menor capacidade de realizar modificações pós-traducionais. Células de inseto podem ser empregadas na produção in vitro de baculovírus, usados como pesticidas biológicos. As células Sf-9 estão entre as células de inseto com uso mais difundido. Entender o metabolismo destas células permitirá melhorias nos processos que as empregam, entretanto, ainda há relativamente pouca informação sobre o assunto. Considerando mais especificamente o uso dessas células para produção de baculovírus, também é necessário mais entendimento sobre o processo infectivo e parâmetros que o afetam. Este trabalho teve como objetivo estudar a influência da suplementação do meio de cultivo com diferentes aminoácidos no desenvolvimento das células Sf-9 e determinar a concentração de oxigênio dissolvido ideal para o cultivo destas células, visando elaborar uma metodologia de cultivo em biorreator otimizada e, paralelamente, estudar o processo de infecção de cultivos dessas células com o baculovírus Spodoptera frugiperda (SfMNPV) em diferentes escalas. Para estudar a influência que a adição de aminoácidos ao meio tem sobre o crescimento celular, células Sf-9 foram cultivadas em frascos schotts de 100 e 500 mL, com 20 mL do meio SF900III SFM (serum free medium) suplementados com cisteína, prolina, serina ou asparagina. Os resultados foram comparados com cultivos feitos sem suplementação (controles). A condição que apresentou o melhor resultado em frasco schott foi replicada em biorreator de 1 L de volume útil. Para estudar a influência do oxigênio dissolvido (O.D.) foram testados diferentes setpoints de O.D. em cultivos em biorreator. Em tais ensaios foram testadas as concentrações de O.D de 10%, 30% e 50% da saturação com o ar. Para o estudo do processo de infecção, foram realizadas infecções em frascos schotts de 500 mL, com 20 mL de cultivo, e em biorreator de 1 L. Também foram realizadas infecções em garrafas T-25 como forma de controle de virulência do inóculo viral e do vírus produzido. As principais variáveis analisadas foram µmáx, Xvmáx YX/Glc. Nos ensaios de influencia de O.D., analisou-se também qO2 e qCO2 e, nos ensaios de infecção, a porcentagem de células contendo poliedros. A suplementação com prolina foi prejudicial ao cultivo. A adição de asparagina não teve qualquer influência no desenvolvimento celular. Os resultados das adições de cisteína e serina não foram muito conclusivos, em alguns ensaios houve aumento de Xvmáx, já em outros não foi notado efeito significativo. Nos ensaios em biorreator, todos os valores de O.D. testados apresentaram resultados semelhantes, já a adição de cisteína ao meio em biorreator foi bastante maléfica ao crescimento celular. Os ensaios de infecção mostraram que células Sf-9 são bastante susceptíveis à infecção pelo baculovírus Spodoptera frugiperda e boas produtoras de poliedros virais, e que a vazão gasosa tem efeito negativo na concentração viral na fase líquida dos cultivos em biorreator (título viral). / Compared to mammalian cells, insect cells are easier to culture, do not accumulate significant amounts of toxic byproducts and are capable of higher heterologous protein yields, but have a lower ability to perform post-translational modifications. Insect cells may be employed in the in vitro production of baculoviruses, used as biological pesticides. Sf-9 cells are among the most used insect cell lines. Understanding the metabolism of these cells would allow improvements in the processes that employ them, however, Howeverreports on the metabolism and physiology of Sf-9 cells and insect cells in general are scarce. When considering the use of these cells for baculovirus production, it is also necessary more understanding about the infective process and parameters that can affect it. This work aimed to study the influence that the supplementation of the culture medium with different amino acids have on the development of Sf-9 cells and to determine the ideal dissolved oxygen concentration for the culture of these cells, aiming to elaborate an optimized bioreactor culture methodology and, in parallel, to study the infection process of these cells with the Spodoptera frugiperda baculovirus (SfMNPV) at different scales. To study the influence that the addition of amino acids to the medium has on cell growth, Sf-9 cells were cultured in 100 and 500mL schott flasks with 20mL SF900III SFM (serum free medium) supplemented with cysteine, proline, serine or asparagine. The results were compared with cultures without supplementation (controls). The condition that presented the best result in schott flasks was replicated in a 1L bioreactor. To study the influence of dissolved oxygen (O.D.), experiments with different values of O.D. were conducted at a 1L bioreactor. The O.D. tested were 10%, 30% and 50% of air saturation. To study the infection process, infections were carried out in 500 mL schotted flasks, with 20 mL of culture, and in a 1L bioreactor. Infections were also carried out in 25 cm² T-flasks as a form of virulence control of the viral inoculum and virus produced. The main variables analyzed were µmax, Xvmax YX/Glc. In the O.D. tests, qO2 and qCO2 were also analyzed and, in the infection assays, the percentage of cells containing polyhedra. Proline supplementation was detrimental to the culture. The addition of asparagine had no influence on cellular growth. The results of cysteine and serine additions were not very conclusive, in some studies there was an increase of Xvmax, while in others no significant effect was observed. In the bioreactor trials, all O.D. tested showed similar results and the addition of cysteine to the medium was quite harmful to cell growth. Infection assays showed that Sf-9 cells are quite susceptible to infection by the Spodoptera frugiperda baculovirus and good producers of viral polyhedra, and that the gas flow has a negative effect on the viral concentration in the liquid phase of the bioreactor cultures (viral titer).

A expressão da conexina 32 e 43 nas células gigantes trofoblásticas foi analisada em condições de cultura celular com e sem influência de hormônios sexuais. Placentônios bovinos foram coletados de vacas prenhes em abatedouro nos diferentes períodos gestacionais e divididos em três grupos, primeiro terço (I), segundo terço (II), terceiro terço (III) e transportados ao laboratório em condições assépticas à temperatura de 4ºC em solução de PBS com antibiótico. No laboratório as células foram isoladas e cultivadas em meio D-MEM com 10% SFB por cinco dias. As detecções das conexinas 32 e 43 foram realizadas através de munofluorescencia, pelo método de amplificação da tiramida-fluoresceina, utilizando anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho, anti-conexina 32 e 43 de camundongo. Os resultados mostraram que as células gigantes trofoblásticas expressam conexinas 32 e 43 nos três períodos gestacionais com exceção da Cx32 no primeiro terço gestacional sem adição de hormônios, a qual passou a expressar fluorescência após a adição de hormônios. A distribuição da Cx43 evoluiu com a progressão da gestação, permanecendo limitada ao interior das células gigantes trofoblásticas, sem formar junções comunicantes. O terceiro terço gestacional mostra a Cx43 na CGTT localizada no interior do núcleo. A adição de hormônios ao meio de cultura vem confirmar que a progesterona e o estrógeno podem ter um papel no controle da Cx32. Para Cx43 onde se adicionou progesterona os níveis de expressão foram baixos no início aumentando no decorrer da gestação, o mesmo foi encontrado para o conjugado de progesterona/ estrógeno. Para o estrógeno no grupo I os níveis de expressão foram menores se comparados aos três grupos diminuindo no grupo II e voltando a aumentar no grupo III. / The trophoblast cells expression of connexins 32 and 43 was studied in cell culture conditions with or without influence of sexual hormones. Bovine placentomes were collected from pregnant cows in slaughterhouses in different gestational periods and so divided into three groups, first term (I), second term (II), and third term (III), and transported to the laboratory in aseptic conditions at a temperature of 40C in PBS solution with antibiotics. At the laboratory the cells were isolated and cultivated in D-MEM environment with 10% SFB for five days. The detections of connexins 32 and 43 were achieved through immunofluorescence, by the tyramide-fluorescein amplification method, using a rabbit polyclonal primary antibody anti-connexin 32 and 43 of mice. The results showed that the trophoblast cells expressed connexins 32 and 43 in the three gestational periods with an exception of the Cx32 at the first gestational period. However, after the addition of sexual hormones, they began to express the connexins in the cytoplasm in the first stage. The distribution of the Cx43 evolved with the progression of the gestation, remaining limited to the trophoblast`s cells interior, without formation of gap junctions. The third gestational term shows the Cx43 located inside the nuclei of the CGTT. Addition of hormones in the culture environment confirmed that estrogen and progesterone may have an important action controlling Cx32. For Cx43, the expression was low after prosterone was added to the culture medium, but increased as the gestation evolved, the same was found for a combined compost of estrogen\\ progesterone. For estrogen, in group I the expression levels were inferior when compared to the three groups decreasing in group II and increasing again in group III. We may conclude that the sexual hormes, specially estrogen, affect the expression of connexins in trophoblastic cells.

No presente estudo foi analisado o perfil eletroforético de 15 amostras de rotavírus, sendo 11 de bezerros, 02 de leitões e 02 de criança, que foram cultivadas até a sexta passagem em células da linhagem MA104, com o monitoramento realizado pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). O objetivo foi comparar o perfil eletroforético de amostras fecais e após o isolamento As amostras leitões não revelaram mudanças de migração aparente, mas uma amostra apresentou um segmento adicional entre os segmentos 5 e 6, tanto no material anterior ao cultivo, quanto na amostra isolada. Em relação as amostras de crianças, uma apresentou diferença na velocidade de migração eletroforética. Além disso, uma amostra de bezerro apresentou um segmento adicional entre os segmentos 5 e 6. Estes dados ressaltam a importância da PAGE como uma técnica de triagem de amostras, que podem, posteriormente serem analisadas por técnicas moleculares mais especificas. As mudanças de comportamento na migração eletroforética dos segmentos genômicos do RNA viral podem ser sugestivas de alteração nas propriedades antigênicas, além do fato de que mudanças que ocorreram in vitro poderão, também, ocorrer in vivo. / In the present work, we have analyzed the electrophoretic profile of 15 samples of rotavírus, 11 of calves, 02 of pigs and 02 of children, that have been cultivated on MA,104 cell up to the sixth passage. The polyacrilamide gel electrophoresis(PAGE) was used to confirm the viral isolation. The aim of the work was to compare the electropherotic profile of fecal samples before and after isolation in MA104 cells. The samples from pigs did not reveal apparent changes in bands migration. However, an additional segment, betweem segments 5 and 6 was detected, in one fecal sample and after isolation. Furthermore, one child sample showed differences in the electrophoretic mobility and also an additional segment was detected between segments 5 - 6 in one sample from a calf. The results emphasize the importance of PAGE as a technique to screen samples that could be analyzed posteriorly by more specific molecular techniques. The changes in the electrophoretic profiles of genomic segments of viral RNA might be suggestive of changes in the antigenic properties, besides the fact that changes that occurred in vitro may also happen in vivo.

O Sistema renina-angiotensina (SRA) tem sido relatado como um importante modulador de processos inflamatórios e imunológicos, incluindo a doença periodontal (DP). Estudos sugerem neste sistema um eixo alternativo (ECA-2 /ANG(1-7) /MAS) que atuaria como um contra-regulador de efeitos mediados pelo clássico eixo (ECA /ANGII /AT1). Sabe-se que bactérias periodontopatogênicas, como a Porphyromonas gingivalis (Pg), possuem componentes bioativos de membrana (ex. lipopolissacarídeos-LPS) capazes de induzir uma forte resposta imune no hospedeiro devido à liberação de citocinas nas células, entre elas Interleucina (IL)- 1&#x3B2;. Neste contexto, fibroblastos são as células mais abundantes nos tecidos periodontais e possuem em sua superfície celular receptores necessários para o reconhecimento da invasão bacteriana, ativando cascatas intracelulares, que levam à produção de citocinas. O objetivo deste estudo foi verificar se os eixos ECA/ ANGII/ AT1 e ECA-2/ ANG(1-7)/ MAS contribuem para a produção e/ ou regulação de citocinas inflamatórias (CI) por fibroblastos de gengiva humana (HGF) e ligamento periodontal humano (HPLF) estimulados por IL-1&#x3B2;. Após o pré-tratamento com Losartan e Ang (1-7) ou silenciamento mediado por RNA de interferência (RNAi) de AT1, HGF e HPLF foram estimulados por IL-1&#x3B2; por 3 horas (RNAm) ou 24 horas (proteína). Expressão de RNAm para AT1, MAS, ECA, ECA-2, IL-1&#x3B2;, TNF-&#x3B1;, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-&#x3B2;, CXCL12, RANK-L e OPG foram avaliados por RT-qPCR e das proteínas IL-6, IL-8, ECA e ECA-2 por ELISA. Foi realizado também Western Blot para detecção de AT1 e ECA nos extratos celulares e dosagem de nitrito no sobrenadante das culturas. Ambos os subtipos de fibroblastos mostraram aumento da expressão de RNAm para AT1, IL-1&#x3B2;, IL-6, IL-8, TNF-&#x3B1; e OPG, quando estimulados por IL-1&#x3B2;. No entanto, apenas em HPLF foi observado aumento para MAS, ECA e TGF-&#x3B2;. Losartan e Ang (1-7) não modularam o transcrito, a secreção de CI e nem a produção de nitrito no sobrenadante das culturas, tanto em HGF como em HPLF. O silenciamento do receptor AT1 reduziu a secreção de IL-6 e IL-8 induzida por IL-1&#x3B2; em cultura de HGF e HPLF e aumentou a expressão gênica de OPG somente em HGF. Estes resultados sugerem que o silenciamento de AT1, mas não o bloqueio farmacológico deste receptor pelo antagonista Losartan, em HGF e HPLF, pode controlar a produção de IL-6 e IL-8, que por sua vez contribuem para a patogênese periodontal. / The renin-angiotensin system (RAS) has been reported as an important modulator of inflammatory and immune responses, including periodontal disease (PD). Studies suggest an alternative axis as part of this system (ACE-2 / ANG (1-7) / MAS) that would act as counter-regulatory to the classical axis (ECA / ANGII / AT1). It is known that periodontal bacteria such as Porphyromonas gingivalis (Pg) have bioactive components in their membrane (such as lipopolysaccharide-LPS) capable of inducing a strong immune response in the host due to the release of cytokines in cells, including interleukin (IL) - 1&#x3B2;. In this regard, fibroblasts are the most abundant cells in periodontal tissues and receptors needed for the recognition of bacterial invasion by activating intracellular cascades that lead to cytokine production. The aim of this study was to determine whether the axes ACE / ANGII / AT1 and ACE-2 / ANG (1-7) / MAS contribute to the production and / or regulation of inflammatory cytokines (IC) by fibroblasts of human gingiva (HGF) and human periodontal ligament (HPLF) stimulated IL-1&#x3B2;. After pre-treatment with Losartan, Ang (1-7) or silencing mediated by RNA interference (RNAi) of AT1, HGF and HPLF were stimulated by IL-1&#x3B2; for 3 hours (RNAm) or 24 hours (protein). Expression mRNA for AT1, MAS, ACE, ACE-2, IL-1&#x3B2;, TNF-&#x3B1;, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-&#x3B2;, CXCL12, RANK-L and OPG was assessed by RT- qPCR and proteins IL-6, IL-8, ACE and ACE-2 by ELISA. Western Blot for the detection of AT1 and ECA and dosage of nitrite was also performed. Experiments stimulated by IL-1&#x3B2; showed a positive control for gene expression AT1, IL-1&#x3B2;, IL-6, IL-8, TNF-&#x3B1; and OPG in HGF and HPLF and MAS, ACE and TGF-&#x3B2; only HPLF. Losartan and Ang (1-7) did not modulate the transcription and secretion of IC and no nitrite production in the culture supernatant of HGF and HPLF. The silencing AT1 reduced IL-6 secretion and IL-8 induced by IL- &#x3B2; in cultured HGF and HPLF and increased OPG gene expression only HGF. These results suggest that silencing AT1, but not pharmacological blockade of this receptor by Losartan in HPLF and HGF, can control the production of IL-6 and IL-8, which in turn contribute to the pathogenesis of periodontal disease.

Estudo anterior de nosso grupo demonstrou que superfície de titânio (Ti) com nanotopografia obtida por condicionamento com H2SO4/H2O2 e funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção promove o aumento da mineralização de culturas primárias de células osteogênicas. O presente estudo teve como objetivos avaliar: 1) os efeitos da pós-adsorção de proteínas principais do plasma- albumina, fibrinogênio e fibronectina, em superfícies de Ti controle e com nanotopografia, funcionalizadas com GDF-5 a 200 ng/mL por simples adsorção, sobre a formação de matriz mineralizada in vitro; 2) parâmetros moleculares e fenotípicos característicos da aquisição do fenótipo osteogênico in vitro sobre superfícies de Ti funcionalizadas com GDF-5 por simples adsorção ou por filmes LbL; 3) parâmetros de formação óssea adjacente a implantes de Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 pelos dois métodos, em modelo de tíbia de coelhos. Os resultados mostraram que a pós-adsorção de proteínas plasmáticas não afetou o potencial osteogênico in vitro, com exceção para o efeito inibidor da albumina, quando pós-adsorvida isoladamente. Tanto a superfície de Ti como o método de funcionalização de GDF-5 afetaram, quantitativamente, as formações de matriz mineralizada, com a maior diferenciação osteogênica para Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção e a menor, para os filmes LbL, independentemente das superfícies sobre as quais eles eram montados. A atividade de ALP foi maior em culturas sobre nanotopografia de Ti, incluindo aquelas funcionalizadas com GDF-5, cujos valores, no entanto, não corresponderam, necessariamente, à maior atividade osteogênica. Apesar disso, todos os grupos exibiram expressão de marcadores de diferenciação osteoblástica, com sobre-expressão de osteopontina e osteocalcina para culturas sobre LbL. As análises microtomográfica, histológica e histomorfométrica não revelaram diferenças qualitativas e quantitativas in vivo entre nanotopografias de Ti funcionalizadas ou não com GDF-5, ainda que uma tendência à maior formação óssea tenha sido observada para as superfícies funcionalizadas e, entre essas, para os filmes LbL. Considerados conjuntamente, os resultados do presente estudo contribuem para o melhor entendimento das respostas de osteoblastos e do tecido ósseo quando se propõe a estratégia de funcionalização de superfícies de Ti com GDF-5 visando à otimização da osseointegração. / It has been demonstrated that a nanostructured titanium (Ti) surface obtained by treatment with H2SO4/H2O2 and functionalized with GDF-5 by simple adsorption promotes the enhancement of mineralized matrix formation in osteogenic cell cultures. This study aimed to evaluate: 1) the effects of post-adsorption of major plasma proteins, i.e. albumin, fibrinogen and fibronectin, on control and nanostructured Ti surfaces, functionalized with 200 ng/mL GDF-5 by simple adsorption, on mineralized matrix formation by calvarial osteogenic cell cultures; 2) molecular and phenotypic parameters characteristics of the acquisition of the osteogenic phenotype in vitro on Ti surfaces functionalized with GDF-5 by either simple adsorption or layer by layer (LbL) films; 3) parameters of bone formation adjacent to Ti implants with a nanostructured surface functionalized with GDF-5 by the two methods described in item 2, in a rabbit tibia model. The results showed that the post-adsorption of plasma proteins did not affect the osteogenic potential of cultures, except for the inhibitory effect of albumin when post-adsorbed alone. Either the Ti surface topography or the method for GDF-5 functionalization quantitatively affected mineralized matrix formation, with the higher osteogenic differentiation for nanostructured Ti functionalized with GDF-5 by simple adsorption and the lower one for LbL films, irrespective of the Ti surface topography on which they were mounted. ALP activity was higher for cultures grown on nanostructured Ti, including those functionalized with GDF-5, whose values, however, did not necessarily correspond to the higher osteogenic activity. Despite that, all groups expressed osteoblast differentiation markers, with a remarkable increase in osteopontin and osteocalcin mRNA levels for cultures grown on LbL films. The microtomographic, histologic and histomorphometric analyses revealed no qualitative or quantitative differences in vivo among the nanostructured Ti implants, yet a tendency for enhanced bone formation was observed for the functionalized surfaces and, between them, for the LbL films. Taken together, the results of the present in vitro and in vivo studies contribute to a better understanding of osteoblast and bone tissue responses to the functionalization of Ti surfaces with GDF-5 aiming to optimize osseointegration.

A causa mais comum da osteoporose é o declínio do hormônio sexual feminino, o estrógeno, que ocorre após a menopausa. Esse hormônio regula a produção de citocinas que influenciam a proliferação dos osteoclastos, aumentando a reabsorção óssea. Os efeitos da cafeína no metabolismo ósseo são controversos e podem estar associados ao aumento significativo de doenças periodontais, fraturas, aumento do cálcio urinário e redução da densidade mineral óssea, por exercer efeitos inibidores sobre as funções dos osteoblastos. O principal objetivo deste estudo foi avaliar o efeito in vitro de diferentes concentrações de cafeína no metabolismo de células osteoblásticas da medula óssea de ratas osteoporóticas. Após aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais, ratas Wistar foram divididas em dois grupos experimentais: controle (C) e submetidas à ovariectomia (OVX). Após 60 dias da cirurgia, as ratas foram sacrificadas para coleta dos fêmures e das células mesenquimais da medula óssea, que foram induzidas à diferenciação em osteoblastos com meio osteogênico com três concentrações de cafeína (1, 3 e 5 mM - grupos OVX1, OVX3 e OVX5) e cultivadas em placas de 24 poços (n = 5) para avaliação da proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP) bioquímica e in situ, detecção e quantificação de nódulos mineralizados e análise da expressão de genes relacionados à atividade osteoblástica através de PCR em tempo real. Os ensaios foram realizados em triplicata e analisados por meio do software estatístico GraphPad Prism, com nível de significância fixado em 5%. A proliferação celular foi menor nos grupos osteoporóticos com adição de cafeína, tendo a menor queda o grupo com adição de 1mM. O método bioquímico de ALP não foi significante nos períodos analisados, entretanto, aos 10 e 14 dias, a atividade aumentou quando a concentração de cafeína era maior. Já na atividade de ALP in situ, o grupo OVX1 foi o que apresentou melhor resultado nos períodos avaliados (p < 0,05), com pico aos 14 dias. A quantificação de matriz mineralizada foi maior no grupo OVX comparado ao grupo C; entre as concentrações, a maior quantificação dos nódulos de cálcio se deu no grupo com 1mM de cafeína. Os resultados obtidos no PCR mostraram que o gene para fosfatase alcalina teve maior expressão no grupo OVX, seguido do grupo OVX1 aos 7 e 10 dias; a expressão gênica de osteocalcina foi maior para o grupo OVX1 aos 10 e 14 dias e esse grupo apresentou a maior expressão em todos os períodos para os genes Runx2 e RankL. No caso do Bmp4, o grupo OVX3 foi o mais expresso aos 10 e 14 dias. Os genes osteoprotegerina e osteopontina variaram sua expressão de acordo com o período e grupo avaliado. A expressão de osterix foi similar entre os grupos aos 7 e 10 dias, enquanto a expressão de Bsp, aos 7 e 14 dias, mostrou semelhança entre os grupos controle e OVX1. Frente aos resultados obtidos, sugere-se que a concentração de 1mM de cafeína pareceu ser a menos prejudicial ao metabolismo das células osteoblásticas neste modelo experimental de osteoporose. / The most common cause of osteoporosis is the decrease of estrogen after menopause. This hormone regulates the production of cytokines that influence osteoclast proliferation, increasing bone resorption. The effects of caffeine in bone metabolism are controversial and may be associated to periodontal disease, bone fractures, increase of urinary calcium levels and reduction of mineral bone density due to inhibition of osteoblast activities. Thus, the goal of this investigation was to evaluate the in vitro effect of different caffeine concentrations in the metabolism of bone marrow osteoblastic cells from osteoporotic rats (OVX). After Ethical Committee approval, wistar female rats were divided in two experimental groups: control (C) and submitted to ovariectomy (OVX). After 60 days of surgery, femurs were removed to isolate bone marrow mesenchymal cells, which were induced to osteoblastic differentiation in osteogenic medium along with three different concentrations of caffeine (1, 3 and 5 mM - OVX1, OVX3 e OVX5 respectively) and posteriorly seeded in 24-well plates (n = 5) to evaluate cell proliferation, alkaline phosphatase activity and its in situ detection, detection and quantification of mineralized nodules as well as assess quantitative expression of genes associated to osteoblastic activity by means of real time PCR. All the experiments were performed in triplicate and analyzed by means of the statistical software GraphPad Prism for p<0.05. Cell proliferation was diminished in the all osteoporotic groups that received caffeine, with group OVX1 being the less affected. Biochemical assay of ALP activity did not show differences among the groups in the periods analyzed; nevertheless there was a tendency to a higher activity proportional to the higher concentration of caffeine. The in situ detection of ALP showed better results in group OVX1 after 14 days of culture. Mineralized matrix quantification was higher in OVX groups when compared to control group; among the concentrations, the higher quantification of calcium nodules was in group OVX1. The results obtained with PCR showed that the gene for ALP had its highest expression in OVX group, followed by OVX1 at 7 and 10 days; expression of osteocalcin was higher in OVX1 after 10 and 14 days and this same group presented higher expression in all periods for genes Runx2 e Rankl. Analysis of Bmp4 gene showed that it was expressed in group OVX3 after 10 and 14 days. The genes that code for osteoprotegerin and osteopontin had different expression values in accordance to the period and group evaluated. The expression of osterix was similar between the groups after 7 and 10 days, whereas the expression of Bsp was similar between control and OVX1 groups after 7 and 14 days. The results suggest that the concentration of 1mM of caffeine is the most beneficial to the metabolism of osteoblastic cells in a model of osteoporosis.