Le variant d’histone CENP-A marque épigénétiquement le centromère. La présence de CENP-A au centromère permet le recrutement de protéines centromériques qui constituent la plateforme pour l’assemblage de kinétochores fonctionnels.Dans les cellules humaines, l'extrémité amino-terminale de CENP-A ainsi que la phosphorylation de la sérine 7, ont été signalées comme étant cruciales pour la progression de la mitose. Cependant, aucune phosphorylation de CENP-A dans d'autres espèces de métazoaires n'a été décrite. Ici, nous montrons que le domaine NH2-terminal CENP-A, mais pas sa séquence primaire, est nécessaire pour la mitose dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs). Nos données montrent que les défauts mitotiques résultant de la déplétion de CENP-A endogène peuvent être restaurés lorsque les MEFs expriment un mutant GFP-CENP-A dont l'extrémité NH2-terminal de CENP-A a été échangée par la queue phosphorylable de l'histone canonique H3. Inversement, dans ce même mutant, lorsque l’on remplace les deux serines phosphorylables par des résidus alanines, les défauts mitotiques persistent. En outre, le mutant de fusion non- phosphorylable de CENP-A, où les sept serines du domaine NH2-terminal ont été remplacées par des résidus alanines, a été également incapable de restaurer le phénotype mitotique des cellules déplétées en CENP-A endogène.Nous avons également identifié les trois premières sérines de la queue de CENP-A comme sites potentiels de phosphorylation. De plus, nos résultats montrent que l’absence de phosphorylation du domaine amino-terminal conduit à la délocalisation de la protéine centromérique CENP-C. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation mitotique de CENP-A est un événement potentiellement fréquent chez les métazoaires et essentiel à la progression mitotique.Dans la seconde partie de ce travail, nous avons voulu lier sans ambiguïté la fonction du domaine NH2-terminal du CENP-A à la mitose. Nous avons conçu une nouvelle méthode, appelée approche Hara-kiri, pour pouvoir éliminer le domaine NH2- terminal seulement pendant la mitose. Ceci afin de répondre à la question ci-dessus dans les cellules humaines. L'élimination du domaine NH2-terminal du CENP-A en utilisant l'approche Hara-kiri en début de mitose a conduit à une augmentation des défauts mitotiques dans les cellules. Prises collectivement, ces données montrent que le domaine NH2-terminal CENP-A est nécessaire pendant la mitose afin d’assurer le bon déroulement de la division cellulaire. / The histone variant CENP-A epigenetically marks the centromere. The presence of CENP-A at the centromeres allows the recruitment of centromeric proteins that constitute the platform for functional kinetochores.In human cells, the NH2-terminus of CENP-A and its phosphorylation at serine 7 in mitosis has been reported to be crucial for the progression of mitosis. However, no phosphorylation of CENP-A in other metazoan species has been described. Here, we show that the NH2-terminus of CENP-A, but not its primary sequence, is required for mitosis in mouse embryonic cells (MEFs). Our data show that the mitotic defects resulting from the depletion of the endogenous CENP-A can be rescued when MEFs expressing a GFP- CENP-A mutant where the NH2-terminus of CENP-A was swapped with the phosphorylatable tail of conventional histone H3. Conversely, no rescue was observed when the two phosphorylatable serines in the H3 tail mutant were replaced with alanines. Furthermore, a non-phosphorylatable fusion mutant of CENP-A where all seven serines in the amino-tail were replaced with alanines, was also unable to rescue the mitotic phenotype of CENP-A depleted cells.We also identified that the first three serines of the tail of CENP-A as potential sites for phosphorylation. Additionally, we were able to link the phosphorylation of CENP-A amino-tail to the proper localization of the key centromeric protein CENP-C. These results suggest that mitotic CENP-A phosphorylation is a potentially common event in metazoans essential for mitotic progression.In the second par of this work we wanted to unambiguously tie the NH2-terminus function of CENP-A to mitosis. To achieve this, we wanted to remove the CENP-A amino-tail only during mitosis and we devised a new method called the Hara-kiri approach in order to answer the above question in human cells. The removal of the NH2-terminal domain of CENP-A using the Hara-kiri approach at the onset of mitosis led to increased mitotic defects in cells. Taken collectively these data show that the CENP-A NH2- terminus is required during mitosis to assure proper cell division.

La ségrégation fidèle des chromosomes est dirigée par le centromère, un locus chromosomique spécialisé qui est requis pour l’assemblage des kinetochores actifs. Les centromères sont marqués épigénétiquement par la présence d’un nucléosome unique qui contient un variant centromérique de l’histone H3 appelé Centromere protein A (CENP-A). Une question fondamentale est comment CENP-A est spécifiquement déposé aux centromères. L’objectif de ma thèse a été d’identifier les facteurs spécifiques de la déposition de CENP-A. Pour identifier les facteurs spécifiques impliqués dans la déposition de CENP-A aux centromères, j’ai utilisé la méthode de purification TAP-TAG à partir d’une fraction nucléaire soluble de cellules HeLa exprimant stablement une copie ectopique de CENP-A (e-CENP-A). J’ai ainsi pu identifié la protéine Holliday Junction Recognition protein (HJURP). En utilisant un siRNA spécifique de HJURP, j’ai montré que la localisation et la déposition de CENP-A étaient fortement affectées. La protéine recombinante HJURP lie de manière stoechiométrique le tétramère CENP-A/H4 mais il ne lie pas le tétramère H3/H4. La liaison se fait grâce à un petit domaine conservé en position N-terminal de HJURP, dénommé CBD (CENP-A binding domain). De plus, j’ai pu mettre en évidence in vitro que HJURP facilitait la déposition du tétramère CENP-A/H4 sur de l’ADN satellite. L’ensemble de mes résultats démontre très clairement que HJURP est la principale chaperone responsable de la déposition de CENP-A aux centromères. / Centromere is a specialized chromosomal locus, where kinetochore assembles, which is required for correct chromosome segregation during cell division. In higher eukaryotes, centromere specification is independent of the DNA sequence and is determined epigenetically by the presence of a unique nucleosome that contains a histone H3 variant, called CENP-A. A fundamental question in centromere biology is that how CENP-A is specifically delivered to and maintained on centromeres. The aim of my thesis was to identify specific chaperone in human, responsible for CENP-A loading to centromeres, by using biochemical and proteomic strategies. To identify CENP-A deposition machinery, I purified the prenucleosomal CENP-A complex from HeLa cells stably expressing epitope tagged CENP-A. By mass spectrometry analysis of proteins present in CENP-A and H3.1 complex, I found HJURP uniquely in CENP-A prenucleosomal complex. Down regulation of HJURP by specific siRNA strongly diminished centromeric localization of CENP-A. Bacteriallyexpressed HJURP specifically binds to the CATD domain of CENP-A, via a highly conserved Nterminal domain, called CBD. Finally, I showed that HJURP is able to facilitate the efficient deposition of CENP-A/H4 tetramer on naked DNA. Taken together, my data demonstrate that HJURP is a key chaperone responsible for the targeting and deposition of newly synthesized CENPA at centromeres.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(生命科学) / 乙第13256号 / 論生博第18号 / 新制||生||54(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 松本 智裕, 教授 石川 冬木, 教授 上村 匡 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

Les centromères contribuent à garantir la distribution égale de l'ADN en mitose. Leur identité n'est pas codifiée par la séquence d'ADN, mais de manière épigénétique par le variant de l'histone H3 CENP-A. Dans des lignées cellulaires humaines transformées, CENP-A est incorporé au centromère par son chaperon HJURP, au début de la phase G1. Pendant ma thèse, j'ai utilisé le modèle murin pour étudier les particularités de la chromatine centromérique et son dysfonctionnement dans le cancer. J'ai montré que CENP-A est maintenu sur le génome paternel au cours de la spermatogenèse, contrairement aux autres histones, et peut constituer une marque transgénérationnelle du centromère. Nous avons généré une souris KO pour HJURP pour l'étudier in vivo, et avons détecté son amplification dans de multiples souches de souris. En parallèle, nous avons étudié l'interaction entre la dynamique des variants d'histone et la structure d'ordre supérieur de la chromatine centromèrique. Nous avons découvert que la réorganisation de l'hétérochromatine péricentrique au cours du cycle cellulaire contrôle les deux modes distinctifs d'incorporation des variants d'H2A et la stoechiométrie de CENP A. Pour explorer le lien entre la tumorigenèse et la surexpression de CENP A/HJURP dans des cancers humains, nous avons utilisé un modèle de transformation de fibroblastes murins embryonnaires. Dans le fond génétique nul pour p53 de ces cellules, la surexpression exogène des deux facteurs n'apportait pas un avantage prolifératif mesurable, mais leur accumulation était une conséquence de la transformation. Actuellement, nous analysons si cette surexpression contribue à augmenter la capacité de transformation. / Centromeres are genomic loci ensuring equal distribution of the two sets of chromosomes in mitosis. Their identity is not encoded in the underlying DNA sequence but specified epigenetically by the histone H3 variant CENP-A. In transformed human cell lines, CENP A is deposited at centromeres by the histone chaperone HJURP in a distinct window of the cell cycle. During my PhD I have taken advantage of the mouse model to address cell cycle and developmental features of centromeric chromatin, as well as its dysfunction in cancer.Using an organism-level approach, I could observe that contrary to most histones, CENP-A is retained on the paternal genome during spermatogenesis, acting as a transgenerational mark of the centromere. To study the role of HJURP in vivo, we generated a knockout mouse and discovered that its genomic locus underwent amplification in several mouse subspecies.In parallel, we addressed the crosstalk between histone variant dynamics and higher-order chromatin structure at the centromere, and revealed that the dynamic reorganization of pericentric heterochromatin during the cell cycle controls the distinct incorporation of H2A variants and CENP-A stoichiometry.Finally, to explore the connection between tumorigenesis and CENP-A/HJURP overexpression, recorded in a number of human cancers, we used a mouse embryonic fibroblast model of transformation. We determined that whereas their overexpression did not confer a measurable proliferative advantage in a p53-deficient background, CENP-A/HJURP upregulation was a consequence of transformation. Whether their accumulation has a functional role to enhance tumorigenesis in this system was further investigated.

Teppei Kitagawa, Kojiro Ishii, Kojiro Takeda and Tomohiro Matsumoto. The 19S proteasome subunit Rpt3 regulates distribution of CENP-A by associating with centromeric chromatin. Nature communications, 5;3597, DOI: 10.1038/ncomms4597 http://www.nature.com/ncomms/2014/140407/ncomms4597/full/ncomms4597.html / 京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第18625号 / 生博第316号 / 新制||生||42(附属図書館) / 31525 / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 松本 智裕, 教授 石川 冬木, 教授 上村 匡 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 新制・論文博士 / 博士(生命科学) / 乙第13550号 / 論生博第27号 / 新制||生||67(附属図書館) / 京都大学生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 杉田 昌彦, 教授 石川 冬木, 教授 松本 智裕 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

Submitted by Caio Cesar Corrêa Blóis null (caiocesarcb@hotmail.com) on 2017-03-29T03:23:55Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - versão final.pdf: 3484697 bytes, checksum: 705de45cfa60015fb25b63fb565a0e01 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-30T17:37:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 blois_ccc_me_mar.pdf: 3484697 bytes, checksum: 705de45cfa60015fb25b63fb565a0e01 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-30T17:37:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 blois_ccc_me_mar.pdf: 3484697 bytes, checksum: 705de45cfa60015fb25b63fb565a0e01 (MD5) Previous issue date: 2017-03-06 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A presente pesquisa visa analisar materiais de biologia pertencentes a dois currículos oficiais do Estado de São Paulo: a Proposta da Coordenadoria de Estudos e Normas Pedagógicas (CENP), implementada ao longo da década de 1980, e o “São Paulo Faz Escola”, empreendido desde 2008 na rede pública paulista. O intuito é verificar o compromisso democrático de ambos, já que, apesar de serem empreendidos em contextos diferentes, a pretensão de se formar para a cidadania seria uma característica hegemônica mantida. No entanto, embora a Proposta da CENP tenha essa característica reconhecida, o currículo “São Paulo Faz Escola” estaria sendo visto como um retrocesso enquanto política democratizante. Analisar a produção de discursos em torno da formação democrática dos jovens é de interesse da pesquisa, especialmente em momento no qual mudanças em relação à formação de nível médio estão para ser empreendidas. Como referencial analítico, pautou-se na teorização curricular crítica e na concepção tridimensional do discurso. Na leitura dos materiais, buscou-se compreender a maneira pela qual os currículos oficiais tratam os conflitos, partindo do pressuposto de que os conflitos são essenciais ao regime democrático e, por conseguinte, à formação democrática, cidadã. A abordagem dos conflitos no ensino das áreas científicas tem especial relevância, dado que seriam eles também propulsores de novos conhecimentos. Desse modo, partiu-se da análise da disciplina de biologia para refletir acerca dos sentidos de formação no ensino médio, questionando e complexificando, do ponto de vista disciplinar, o debate acerca da democracia, do currículo e do conflito. Em relação a potencialidade democrática, constatou-se que o currículo “São Paulo Faz Escola” constitui-se num retrocesso diante da redução e esvaziamento dos conflitos em seu discurso, quando comparado à Proposta da CENP. Tais reduções e negações do conflito são lacunas que podem sustentar espaços para ações contra-hegemônicas que visem tornar o currículo escolar mais formativo para a democracia. / In this research, I analyze Biological Science materials that belong to two official curricula of São Paulo state: the proposal of CENP (Coordination of Norms and Pedagogic Studies), which was implemented during the 1980s, and “São Paulo Faz Escola”, undertaken since 2008 in São Paulo public school system. The aim of this study is to verify their democratic commitment, since the pretension of educating for citizenship would be held, although they are undertaken in different contexts, as a hegemonic characteristic. However, in spite of such a characteristic being identified in the proposal of CENP, “São Paulo faz escola” curriculum would be seen as a regression qua democratizing policy. This research also seeks to examine the discourse production concerning the democratic education of young students and considering this period in which changes on High School education are to be implemented. The critical curricular theorizing and the three-dimensional conception of discourse are used as analytical references. Through the reading of those materials, I intend to comprehend the way by which the official curricula deal with these conflicts, from the assumption that the latter ones are essencial to the democratic regime and, consequently, to the democratic and citizen education. Besides, the approach of such conflicts during the teaching in scientific areas is relevant, granted that those would also boost new knowledge. Thus, from the analysis of the Biological Science discipline and through a disciplinary point of view, it is possible to reflect on the senses of High School education, by questioning and studying the debate on democracy, curriculum and that conflict. In relation to the democratic potential, it was verified that the "São Paulo Faz Escola" curriculum constitutes a step backwards in the face of the reduction and emptying of the conflicts in its discourse, when compared to the CENP Proposal. Such reductions and denials of conflict are gaps that can sustain spaces for counter-hegemonic actions that aim to make the school curriculum more formative for democracy.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-08-15T17:53:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) A_Marques_PhD_thesis_2016_FINAL.pdf: 9324057 bytes, checksum: 92c1de27f6fa947d7e6b3e74ae09a849 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-15T17:53:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) A_Marques_PhD_thesis_2016_FINAL.pdf: 9324057 bytes, checksum: 92c1de27f6fa947d7e6b3e74ae09a849 (MD5) Previous issue date: 2015-02-15 / capes / Cromossomos holocêntricos são caracterizados pela ausência de constrição primária e apresentam normalmente a proteína centromérica CENH3 distribuída ao longo de um eixo em cada cromátide. Embora muitos organismos com cromossomos monocêntricos apresentem sequências de DNA centroméricas específicas e associadas com a CENH3, nenhuma sequência centromérica havia sido identificada em organismos com cromossomos holocêntricos até o momento. Além disso, vários estudos reportam adaptações meióticas em espécies com cromossomos holocêntricos. Sendo observada em alguns casos uma inversão da ordem dos eventos meióticos (meiose invertida ou pós-reducional). Assim, o presente trabalho objetivou estudar a organização centromérica e a meiose de espécies com cromossomos holocêntricos do gênero Rhynchospora (Cyperaceae). Foi realizada uma análise citogenômica da organização e composição dos holocentrômeros de Rhynchospora pubera (2n = 10), sendo reportada a primeira descoberta de sequências centroméricas em espécies com cromossomos holocêntricos. Foi observado que os holocentrômeros de R. pubera são compostos principalmente por arranjos de DNA satélite (Tyba) e retroelementos centroméricos (CRRh) distribuídos pelo genoma. A análise detalhada da sucessão dos eventos meióticos de R. pubera e R. tenuis (2n = 4) reportou uma prófase inicial semelhante a de monocêntricos. No entanto, foi verificado que as cromátides-irmãs separam para polos opostos durante a anáfase I e os homólogos segregam somente durante a meiose II, comprovando uma meiose invertida para ambas as espécies. Curiosamente, durante a meiose de R. pubera foi observado uma organização diferencial dos centrômeros. Ao contrário do observado em mitose, durante meiose não foi observado a formação de holocentrômeros em forma de linha, sendo, na verdade, observado estruturas centroméricas aglomeradas. O restabelecimento de holocentrômeros em forma de linha se deu durante a primeira mitose do pólen. / Holocentric chromosomes are characterized by the absence primary constriction and normally show the centromeric protein CENH3 distributed along the axis of each chromatid. Although many monocentric organisms show centromere-specific DNA sequences associated to CENH3, no centromeric sequences had been identified in any holocentric organism so far. Furthermore, many studies report meiotic adaptations in holocentric species. In some cases is observed an inversion of the order of meiotic events. This type of meiosis has been named of inverted or post-reductional meiosis and would be exclusive of holocentric organisms. Thus, the present work aimed to study the centromere organization and meiosis of holocentric species of the genus Rhynchospora (Cyperaceae). A cytogenomic analysis of the composition and organization of the holocentromeres of Rhynchospora pubera (2n = 10) has been performed, being reported the first centromeric sequences from a holocentric species. It was observed that the holocentromeres of R. pubera are composed mainly by arrays of satellite DNA (Tyba) and centromeric retrotransposons (CRRh) distributed genomewide. The detailed analysis of the succession of meiotic events of R. pubera and R. tenuis (2n = 4) demonstrated an early meiotic prophase similar to that of monocentric. However, it was verified that sister chromatids separate to opposite poles during anaphase I, while homologs only segregate at meiosis II. These results prove the inverted meiosis for both species. Curiously, it was observed during meiosis of R. pubera a differential organization of centromere units. In contrast to the observed in mitosis, during meiosis we did not observed the formation of line-like holocentromeres, being in fact observed the formation of cluster-like holocentromeres. The reestablishment of a line-like holocentromere occurred during the first pollen mitosis.

La maturation de nombreuses protéines requiert une voire plusieurs modification(s) post-traductionnelle(s). Environ 60 oncoprotéines (Ras, Rheb, RhoB, CENP-E, -F) sont activées par une série de modifications post-traductionnelles incluant la prénylation, la protéolyse et la carboxyméthylation. La prénylation est l'ajout d'un groupement isoprénoïde sur le résidu cystéinyle localisé au niveau de la séquence C-terminale tétrapeptidique appelée "boîte CA1A2X" (A1A2: deux acides aminés aliphatiques; X: une méthionine ou une sérine pour la FTase et une leucine ou une isoleucine pour la GGTase-I). Cette réaction est catalysée par une métaloenzyme à zinc, la farnésyltransférase (C15) (FTase) ou la géranylgéranyltransférase (C20) (GGTase-I). La farnésylation apporte l'hydrophobie suffisante pour la localisation cellulaire adéquate de protéines suractivées dans certaines pathologies comme le cancer. Ce disfonctionnement peut être induit soit directement par mutation de la protéine farnésylée soit indirectement par mutation d'un activateur ou inactivateur de la protéine farnésylée. D'intenses études se sont donc focalisées pour concevoir des inhibiteurs de farnésyltransférase (FTis).<br />Actuellement, trois composés, avec une inhibition sélective de la FTase vis-à-vis de la GGTase-I, sont en essais cliniques. Une étude sur des lignées cellulaires cancéreuses a montré que plus de 70% de ces lignées sont sensibles aux FTis, mais leur mécanisme d'action exact reste encore inconnu. Une connaissance précise du nombre de protéines farnésylées et l'élucidation des conséquences de leur farnésylation faciliteraient la découverte de ce mécanisme. Cependant, l'excellente efficacité et la faible toxicité systémique sur des modèles précliniques animaux des FTis présentent ces inhibiteurs comme agents prometteurs dans la thérapie anti-cancéreuse.<br />Une des stratégies pour inhiber cette enzyme consiste à concevoir des peptidomimétiques de la "boîte CA1A2X". La connaissance de la FTase a permis le passage des FTis peptidomimétiques contenant des thiols à des molécules sans thiol, non-peptidiques, pouvant ou ne pouvant pas interagir avec l'atome de zinc. Sur la base de ce modèle et d'études de modélisation moléculaire, nous avons conçu trois séries de composés, dans lesquelles le chélateur de zinc, le 1-(4-cyanobenzyl)-5-méthylimidazole, est constant :<br />- une série dans laquelle l'espaceur est la 4-aminopipéridine-2-carboxylate de méthyle où la partie hydrophobe est substituée,<br />- deux séries où l'espaceur est le 1,4-diazépane substituté ou non par un phényle et dans lesquelles la partie hydrophobe est l'élément de modulation.<br />Les évaluations enzymatique et cellulaire (DU145 et PC3) des composés synthétisés nous ont permis de compléter les relations structure-activité, permettant ainsi de proposer de nouvelles structures. Les protéines associées aux centromères, CENP-E et CENP-F, sont des cibles pertinentes des FTis, puisque leur association fonctionnelle avec le fuseau mitotique nécessite une farnesylation. Nous avons également souhaité évaluer quelques FTis sélectionnés pour leur effet sur les CENP.

L’état local de la chromatine joue un rôle crucial dans tous les processus génétiques comme le contrôle de la transcription, de la réplication et de la réparation de l’ADN, de la signalisation, etc... La structure précise de l’organisation 3D du deuxième ordre de compaction de la chromatine, aussi appelé fibre de 30 nm, a été le sujet d’intenses débats durant les 40 dernières années. En se basant sur les données in vitro, deux modèles concurrents se distinguent: le solénoïde et le zigzag. Dans le modèle solénoïde, des nucléosomes consécutifs interagissent pour former une trajectoire hélicoïdale avec courbure de l’ADN de liaison. Dans le modèle zigzag, deux hélices d’empilement de nucléosomes se forment, reliées par l’ADN de liaison qui peut être droit ou tordu. Durant ma thèse, j’ai développé une nouvelle approche expérimentale biochimique, appelée ICNN (Identification of the Closest Neighbor Nucleosome), permettant de déchiffrer les interactions entre nucléosomes voisins au sein de la fibre et ainsi de définir sous quelle forme la chromatine se compacte. Nous avons démontré que dans une fibre compactée H1-dépendante, les nucléosomes N+2 sont les plus proches voisins d’un nucléosome N arbitrairement choisit. Ces résultats montrent, sans ambiguïté, l’organisation zigzag de la fibre de 30 nm. De plus, cette organisation reste indépendante de la longueur de l’ADN de liaison, démontrant ainsi que la longueur des nucléosomes (177-227 bp) n’affecte pas la structure de la chromatine et ne peut donc pas être responsable de l’hétérogénéité structurale décrite dans la littérature. La dynamique et la structure de la chromatine peuvent être affectées par l’incorporation de variants d’histones. Nos expériences utilisant des assemblages H2A.Z ne montrent aucune différence de repliement entre les fibres contenant H2A.Z et H2A. Ces données suggèrent que le mécanisme de régulation de la transcription spécifique de H2A.Z est indépendant du repliement de la chromatine. CENP-A est un élément de la chromatine centromérique indispensable à la division cellulaire. Les images cristallographiques montrent que les nucléosomes contenant CENP-A sont plus ouverts que le nucléosomes conventionnels à cause d’une hélice α-NCENP-A plus courte. Parallèlement, des résultats récents de notre laboratoire ont montré que H1 ne se lie pas d’une façon stable aux nucléosomes contenant CENP-A, ne conduisant à aucune organisation de l’ADN de liaison (données non publiées). Notre étude au niveau de la chromatine a confirmé l'absence de repliement de la fibre contenant CENP-A en présence de H1. De manière intéressante, le remplacement de CENP-A par un mutant α-NH3-CENP-A restaure la bonne liaison de H1 et le repliement de la fibre avec une conformation habituelle en zigzag comme dans une fibre contenant H3. / The local chromatin state plays a crucial role in all fundamental DNA-templated processes, such as transcription control, DNA replication or repair, signaling, etc. The precise 3D organization of the second level folding, the so-called 30 nm fiber, has been a matter of intense speculations and debates over the past 40 years. Two competing models have been proposed on the basis of in vitro data, the solenoid and zigzag arrangements. In the solenoid model, consecutive nucleosomes interact with each other and follow a helical trajectory with bent DNA linker. In the zigzag model, alternate nucleosomes interact with each other with straight, twisted or coiled linker DNA. During my thesis, I developed a new biochemical approach, called ICNN (Identification of the Closest Neighbor Nucleosomes), allowing a direct “visualization” of the neighboring nucleosomes within H1-dependent compacted chromatin. We showed that within H1-compacted regular nucleosomal array, N±2 nucleosomes are the nearest neighboring interaction partners of any arbitrary nucleosome N. This finding provides an unambiguous evidence for the zigzag two-start helix conformation of the 30 nm fiber. Furthermore, this organization remains independent on the DNA linker length, demonstrating that the nucleosome repeat length (177-227 bp) does not affect the chromatin structure and therefore cannot be a reason for chromatin structural heterogeneity as suggested in the literature. Chromatin structure and dynamics might be affected by the incorporation of histone variants. Our ICNN experiments with H2A.Z arrays showed no difference of folding between H2A.Z- and H2A-containing fibers. This finding suggests that the H2A.Z-specific transcriptional regulation involves mechanisms other than chromatin folding. CENP-A is a hallmark for centromeric chromatin that is indispensable for cell division. X-ray scattering in crystals showed that CENP-A-containing nucleosomes are more “open” than conventional ones due to the shorter α-NCENP-A helix. Besides, recent results in our lab showed that H1 does not stably bind to the CENP-A nucleosomes and that no stem organization of the linker is formed (not published). Our ICNN study at the chromatin level confirmed the absence of H1-induced folding of a regular CENP-A array. Interestingly, replacement of CENP-A with the α-NH3-CENP-A mutant restored proper H1 binding and folding of the fiber into the usual zigzag conformation, as does the conventional H3-containing fiber.