Les maladies neurodégénératives telles que les maladies de Huntington, de Parkinson et d'Alzheimer ont la caractéristique commune de présenter des agrégats de protéines spécifiques dans les neurones des patients atteints par ces pathologies. Le mécanisme par lequel ces structures se forment est encore inconnu. L'objectif de ce travail a consisté en l'étude du mécanisme d'agrégation des protéines à expansion de polyglutamine. Nous avons découvert que l'environnement cellulaire joue un rôle critique dans la capacité à s'agréger des protéines à expansion de polyglutamine (Rousseau et al., 2004). Ce travail suggère l'existence de modulateurs de l'agrégation des protéines à expansion de polyglutamine. En cherchant des modulateurs d'agrégation nous avons découvert que les sous unités chaperons du protéasome 19S, Rpt6 et Rpt4, augmentent l'agrégation de la protéine Huntingtine dans les cellules, alors que la réduction du niveau de Rpt6 par ARN interférence diminue la quantité de Huntingtine agrégée. Si la Huntingtine mutante est adressée au protéasome de manière ubiquitine indépendante, elle est très facilement dégradée. L'agrégation des protéines Huntingtine mutante n'est pas la conséquence d'une inhibition de l'activité protéolytique du protéasome mais fait suite à un découplage entre l'activité de dépliement médiée par le protéasome 19S et l'activité protéolytique du protéasome 20S. Ces travaux révèlent le rôle clef de l'environnement cellulaire et particulièrement du protéasome 19S dans le mécanisme d'agrégation des protéines à expansion de polyglutamine.

La thérapie chaperon représente une approche thérapeutique stratégique et innovante, en particulier dans le traitement des maladies lysosomales. Ces maladies génétiques rares ont une gravité variable, qui peut aller de la létalité avant la naissance jusqu'à la nécessité d‟une prise en charge permanente ; elles apparaissent à tous les stades de la vie. Des mimes du substrat appelé iminosucres, vont agir en allant au coeur du site actif de l'enzyme, stabiliser l'enzyme mutée qui est instable mais non inactive. Paradoxalement, la plupart des chaperons pharmacologiques sont des inhibiteurs de l'enzyme visée mais leur administration à faible concentration leur permet de réaliser leur mission de sauvetage de l'enzyme mutée. Dans cette optique, des recherches effectuées au sein de notre laboratoire ont fait état de la synthèse d'iminosucres, tels que les α-1-C-alkyl iminoxylitols qui sont de très bons inhibiteurs de la β-glucocérébrosidase, l'enzyme défaillante dans la maladie de Gaucher, mais aussi qui doublent l'activité enzymatique résiduelle. Une nouvelle voie de synthèse plus efficace a été réalisée afin d'obtenir plus efficacement ce type d'iminosucres et d'autres dérivés. Ces travaux ont également été l'occasion de développer des iminoxylitols structurellement simplifiés qui agissent comme chaperons pharmacologiques toujours pour le traitement de la maladie de Gaucher. Une partie de ces travaux a aussi été consacrée à la recherche d‟inhibiteurs de la β-galactocérébrosidase, l'enzyme impliquée dans la maladie de Krabbé, et qui pourront agir comme chaperons pharmacologiques. Différentes évaluations pharmacologiques ont été réalisées, notamment des tests d'inhibition et la détermination des effets chaperons.

La thérapie chaperon représente une approche thérapeutique stratégique et innovante, en particulier dans le traitement des maladies lysosomales. Ces maladies génétiques rares ont une gravité variable, qui peut aller de la létalité avant la naissance jusqu’à la nécessité d‟une prise en charge permanente ; elles apparaissent à tous les stades de la vie. Des mimes du substrat appelé iminosucres, vont agir en allant au coeur du site actif de l’enzyme, stabiliser l’enzyme mutée qui est instable mais non inactive. Paradoxalement, la plupart des chaperons pharmacologiques sont des inhibiteurs de l’enzyme visée mais leur administration à faible concentration leur permet de réaliser leur mission de sauvetage de l’enzyme mutée. Dans cette optique, des recherches effectuées au sein de notre laboratoire ont fait état de la synthèse d’iminosucres, tels que les α-1-C-alkyl iminoxylitols qui sont de très bons inhibiteurs de la β-glucocérébrosidase, l’enzyme défaillante dans la maladie de Gaucher, mais aussi qui doublent l’activité enzymatique résiduelle. Une nouvelle voie de synthèse plus efficace a été réalisée afin d’obtenir plus efficacement ce type d’iminosucres et d’autres dérivés. Ces travaux ont également été l’occasion de développer des iminoxylitols structurellement simplifiés qui agissent comme chaperons pharmacologiques toujours pour le traitement de la maladie de Gaucher. Une partie de ces travaux a aussi été consacrée à la recherche d‟inhibiteurs de la β-galactocérébrosidase, l’enzyme impliquée dans la maladie de Krabbé, et qui pourront agir comme chaperons pharmacologiques. Différentes évaluations pharmacologiques ont été réalisées, notamment des tests d’inhibition et la détermination des effets chaperons. / Chaperone Mediated Therapy represents an innovative and strategic approach to treat lysosomal storage disorders which a class of rare genetic diseases. Competitive inhibitors for some of these lysosomal enzymes can, at sub inhibitory concentrations, act as chaperones and rescue the mutant proteins. In fact, enzymes carrying some mutations are still catalytically active. α-1-C-alkyl iminoxylitols represent a class of iminosugars which mimic the “gluco” configuration of the substrate and give powerful inhibitors of β-glucocerebrosidase, the enzyme involved in Gaucher disease. Moreover, this class of iminosugars, synthesized by our group, act as pharmacological chaperones and are able to double the residual activity of the N370S mutant. In order to synthesize more efficiently these iminosugars, the synthetic strategy was improved and optimized. Moreover, we focused our investigations on structural variations on our lead compound (α-1-C9 iminoxylitol) and draw important conclusions on structure-activity relationship. Then, we extended our expertise on iminosugars as pharmacological chaperones to another lysosomal glycosidase. In paricular, we targeted β-galactocerebrosidase, the enzyme responsible for Krabbe disease, and synthesized a series of iminosugars which mimic the “galacto” configuration. Biological assays were performed on our compounds to determine their activity as inhibitors and for some of them, their chaperone effects.

Les fibroblastes activés qui composent les stromas tumoraux sont des acteurs majeurs des interactions tumeur-stroma impliquées dans la croissance et la dissémination des cellules tumorales. Ce processus d'activation des fibroblastes est caractérisé par l'expression de marqueurs protéiques spécifiques parmi lesquels figure l'alphaSMA et FAPalpha;. Le TGFbeta;, cytokine secrétée massivement par les cellules tumorales, est un des éléments impliqués dans l'activation des fibroblastes et la formation du stroma tumoral qui en résulte. L'EMMPRIN, glycoprotéine transmembranaire surexprimée dans les cellules tumorales est également un médiateur des interactions tumeur-stroma puisqu'il a la capacité d'induire la synthèse des MMPs par les fibroblastes péri-tumoraux accroissant ainsi la propagation des cellules tumorales à travers l'organisme. Nos travaux identifièrent que le TGFbeta secrété par les cellules tumorales induisait la synthèse du marqueur FAPalpha par les fibroblastes. L'EMMPRIN stromal apparaît comme récepteur de ces signaux tumoraux et est nécessaire à la synthèse du marqueur FAPalpha; par les fibroblastes. L'EMMPRIN participe donc à l'activation TGFbeta; dépendante des fibroblastes. Son inhibition dans ces cellules conduit à un dysfonctionnement de la signalisation médiée par les protéines Smad2/Smad3 aboutissant à une diminution de la synthèse du marqueur alphaSMA ainsi que de certaines protéines matricielles induites par le TGFbeta. L'étude du mécanisme d'action de l'EMMPRIN dans ce processus a permis d'identifier l'EMMPRIN comme nouvelle protéine chaperonne du récepteur de type I au TGFbeta;. / Tumor stroma activated fibroblasts are major actors of tumor stroma interactions taking to tumor growth and spreading. Activated fibroblasts are characterized by the expression of specific markers including alphaSMA and FAPalpha;. The TGFbeta;, a cytokine highly secreted by tumor cells, is one of the key factors involved in fibroblast activation and tumor stroma formation. EMMPRIN, a transmembrane glycoprotein overexpressed in tumor cells, is also a mediator of tumor-stroma interactions by its ability to induce the synthesis of MMPs by peri-tumor fibroblasts enhancing then tumor cells dissemination across the organism.Here, we demonstrate that TGFbeta; secreted by tumor cells is the tumor factor involved in the synthesis of FAPalpha; by fibroblasts. Stromal EMMPRIN appeared to be the receptor of these tumor-stroma interactions and is required for the synthesis of FAPalpha; by fibroblasts. EMMPRIN was also evidenced to take part in TGFbeta;-dependent fibroblast activation. Its inhibition in these cells correlate to a dysfunction in Smad2/Smad3 signaling leading to a decrease in the expression of alphaSMA and matrix proteins induced by TGFbeta;. The study of the mechanism used by EMMPRIN in this process evidenced this protein as a new chaperone for the type I TGFbeta; receptor.

Les protéines de la famille des AAA+ ATPases sont présentes dans de nombreux complexes moléculaires. Ces protéines sont capables de s’assembler en anneaux héxamériques (homomères ou hétéromères) pour former des moteurs moléculaires. Au cours de ma thèse, je me suis particulièrement intéressé à deux complexes macromoléculaires à AAA+ ATPases présentant un grand intérêt thérapeutique contre différents cancers : la particule régulatrice du protéasome 26S et l’hélicase du réplisome, Mcm2-7. Le protéasome 26S est la principale machinerie moléculaire impliquée dans la dégradation régulée des protéines poly-ubiquitinées tandis que l’hélicase mcm 2-7 est responsable du désappariement des brins de l’ADN chromosomique lors de la réplication de l’ADN. Ces deux complexes comprennent un anneau hétérohéxamérique de sous-unités AAA+ ATPases appelé Rpt1 à Rpt6 dans le cas du protéasome 26S et Mcm2 à Mcm7 dans le cas de l’hélicase mcm2-7. J’ai focalisé mes travaux sur l’étude du rôle du chaperon Hsm3/S5b dans l’assemblage du protéasome 26S d’une part, et le rôle spécifique de la sous-unité Mcm2 dans le transfert intergénérationnel des histones d’autre part. Le chaperon Hsm3/S5b se lie avec la sous-unité Rpt1. L’étude des complexes de levure Hsm3-Rpt1 et humain S5b-Rpt1 par cristallographie aux rayons X m’a permis de proposer que le chaperon d’Hsm3/S5b pourrait jouer un rôle de médiateur entre les sous-unités Rpt1, Rpt2 et Rpn1 lors de l’assemblage de la particule régulatrice. De plus, ce chaperon pourrait jouer également un rôle d’inhibiteur pour l’assemblage entre la particule régulatrice 19S et la particule cœur 20S du protéasome 26S. Certaines sous-unités AAA+ ATPase, telles que celles du réplisome, possèdent des domaines additionnels, leur conférant un rôle secondaire spécifique et indépendant de leur rôle principal de moteur moléculaire. C’est le cas de Mcm2, qui lie les histones H3-H4 par son domaine N-terminal. J’ai mis en évidence et caractériser cette interaction par différentes techniques biophysiques, en particulier la cristallographie aux rayons X, la RMN et le SEC-MALS. Ces résultats m’ont permis de proposer un modèle pour le transfert intergénérationnel des histones dans lequel Mcm2 joue un rôle crucial de chaperon moléculaire des histones directement intégré dans la machinerie de réplication. / AAA+ ATPases are involved in numerous molecular complexes. These proteins form homomeric or heteromeric hexamers and constitute molecular motors. During my Ph. D., I focused my work on two macromolecular complexes composed of AAA+ ATPases: the 26S proteasome regulatory particle and the Mcm2-7 helicase of the replisome. These complexes are implicated in the development of cancers and constitute interesting therapeutic targets. The 26S proteasome is the main machinery responsible for the regulated degradation of poly-ubiquitinated proteins and the helicase Mcm2-7 is responsible for the unwinding of the DNA during replication. These two complexes are composed of a heterohexameric ring of six AAA+ ATPases called Rpt1 to 6 for the 26S proteasome regulatory particle and Mcm2 to 7 for the replisome. I have studied the role of Hsm3/S5b in the assembly mechanism of the proteasome and the specific role of the subunit Mcm2 in the intergenerational transfer of the epigenetic information. X-ray structures of the complexes Hsm3-Rpt1 and S5b-Rpt1 allowed us to elucidate the dual functions of the assembly chaperone Hsm3/S5b which mediates the assembly of the subcomplex Rpt1-Rpt2-Rpn1 during the assembly of the regulatory particle. In addition, hsm3/S5b inhibits the association of a premature regulatory particle onto the core particle and protects the HbYX motif of Rpt1. Other AAA+ ATPases, like the replisome subunits, possess additional domains which confer specific roles. I also studied the interaction between the N-terminal domain of Mcm2 and the tetrameric form of histones H3-H4 by several methods like X-ray crystallography, NMR and SEC-MALS. I propose a model of the intergenerational transfer of histones H3-H4 in which Mcm2 plays a crucial role of molecular histones chaperone directly integrated in the replication machinery.

Au cours de la méiose, des centaines de cassures doubles brins (CDB) sont générées et réparées par recombinaison homologue. Ces CDB peuvent être réparés par deux voies différentes donnant lieu à des crossing-overs (CO) ou des non crossing-overs (NCO). Le choix entre les deux voies est finement régulé pour assurer un nombre suffisant de CO; les facteurs influençant ce choix n’ont pas encore été bien caractérisés. L’environnement chromatinien pourrait jouer un rôle important dans ce processus.Peu d’études ont été réalisées sur l’influence de la chromatine sur la recombinaison méiotique. Le but de ma thèse a été de caractériser les facteurs chromatiniens nécessaires au remaniement de la chromatine pendant la recombinaison méiotique chez Saccharomyces cerevisiae.J’ai pu montrer que CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) et Hir (Histone Regulator), deux protéines chaperons capables de réassembler les histones, s’associent aux sites de cassures doubles brins méiotiques lors de la recombinaison. L’absence de CAF-1 et Hir n’a pas d’effet sur la progression et la formation de CO. Cependant, par des études de recombinaison sur l’ensemble du génome, j’ai pu observer que l’absence de CAF-1 tend à réduire l’interférence des CO. Ce résultat suggère que CAF-1 pourrait être un des facteurs régulant la réparation au cours de la recombinaison méiotique. Pour finir, je me suis aussi intéressée à un troisième chaperon d’histone H3/H4, Asf1. J’ai aussi pu montrer que la délétion d’un autre chaperon Asf1 (Anti-silencing Function 1) entraîne des défauts de progression méiotique et de formation des spores.Ce travail aide à mieux comprendre l'impact de la chromatine sur la réparation de la méiose et le rôle des facteurs d'assemblage de la chromatine. / During meiosis, hundreds of programmed double strand breaks (DSB) are generated and repaired by homologous recombination. Meiotic DSB can be repaired by two major alternative pathways, which generate either crossing-over (CO) or non-crossing-over (NCO) products. The choice between the two repair pathways is tightly controlled to ensure sufficient and accurate CO formation. The chromatin environment could play a crucial role in this process that has not been elucidated yet. Little information is available about the importance of chromatin factors for meiotic recombination. The aim of my PhD was to study chromatin factors necessary for chromatin dynamic during meiotic recombination. I have shown that CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) and Hir (Histone Regulator), two chaperone proteins that are able to incorporate histones into chromatin, associate with DSB sites during meiotic recombination. CAF-1 and Hir deletion have no effect on the outcome of meiosis and CO formation. However, by genome-wide recombination studies, I have observed that the absence of CAF-1 histone chaperone results in a slight decrease in CO interference. The result suggests that CAF-1 could be one of the factors regulating DNA repair during meiotic recombination. Finally, I have also studied another H3/H4 chaperone, Asf1 (Anti-silencing Function1). Asf1 deletion gives rise to a defect in meiotic progression and spore formation. This work helps to better understand the impact of chromatin on meiotic repair and the role of chromatin assembly factors.

Hsp27 appartient à la famille des protéines dites de survie comme Bcl2 ou la survivine. C'est une protéine anti-apoptotique qui subit une dérégulation de son expression dans de nombreux types tumoraux. Elle est caractérisée comme étant une cible thérapeutique majeure. Au cours de ma thèse, j'ai isolé des peptides stabilisés, dit aptamères, capables d'inhiber fonctionnellement les activités anti-apoptotiques et tumorigènes d'Hsp27. Ces aptamères perturbent la biochimie structurale de Hsp27 et induisent le blocage du cycle cellulaire in vivo. Parallèlement à cette étude, j'ai caractérisé les effets de la déplétion de Hsp27 sur la formation de métastases et de tumeurs osseuses. J'ai aussi montré que la modification du taux de Hsp27 induisait la dégradation de différentes protéines, dites clientes, comme la caspase3, HDAC6 et STAT2.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Hsp27 appartient à la famille des protéines dites de survie comme Bcl2 ou la survivine. C’est une protéine anti-apoptotique qui subit une dérégulation de son expression dans de nombreux types tumoraux. Elle est caractérisée comme étant une cible thérapeutique majeure. Au cours de ma thèse, j’ai isolé des peptides stabilisés, dit aptamères, capables d’inhiber fonctionnellement les activités anti-apoptotiques et tumorigènes d’Hsp27. Ces aptamères perturbent la biochimie structurale de Hsp27 et induisent le blocage du cycle cellulaire in vivo. Parallèlement à cette étude, j’ai caractérisé les effets de la déplétion de Hsp27 sur la formation de métastases et de tumeurs osseuses. J’ai aussi montré que la modification du taux de Hsp27 induisait la dégradation de différentes protéines, dites clientes, comme la caspase3, HDAC6 et STAT2. / Hsp27 belongs to the class of survival proteins like Bcl2 or survivin. This protein was well categorized as a major anti apoptotic protein as displaying a high level of expression in lot of tumor types. Moreover, Hsp27 is referenced as a major therapeutic target in cancer. During my PhD, I characterized stable peptides called aptamers, which functionally blocked Hsp27 antiapoptotic and tumorigenic properties. These aptamers disrupted biochemical and structural states of Hsp27 and promoted cell cycle arrest in xenografts. In the same time, I have characterized the effect of Hsp27 depletion in metastasis establishment and bone marrow tumor growth. I have shown that targeting level of Hsp27 induced degradation of several of its client proteins like caspase3, HDAC6 and STAT2

Das SurA-Protein ist ein wichtiger Bestandteil der periplasmatischen Faltungsmaschinerie aus Escherichia coli. Trotz zahlreicher Erkenntnisse sind die Mechanismen der Substraterkennung und -bindung noch nicht abschließend geklärt. Das SurA-Protein ist aus einem Chaperonmodul und zwei PPIase-Domänen aufgebaut. Die Bindestelle eines artifiziellen Peptides wurde zu Beginn der Arbeit in der PPIase-inaktiven Parvulin-Domäne I publiziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob auch biologisch relevante, natürliche Peptide an dieser Bindestelle interagieren und ob es noch weitere Substratbindestellen innerhalb von SurA gibt. In ESR-spektroskopischen Versuchen wurde die Interaktion der isolierten Parvulin-Domäne I von SurA mit Peptiden aus einer LamB-Peptid-Bibliothek, sowie mit dem artifiziellen Peptid analysiert. Die Bindung des artifiziellen Peptides und eines Peptides aus der LamB-Peptid-Bibliothek an die isolierte Parvulin-Domäne I konnte nachgewiesen werden. Für weitere an SurA-bindende Peptide konnte an dieser Position keine Interaktion nachgewiesen werden. Mittels des genetischen Indikatorsystems ToxR wurden gezielt Kontaktpunkte zwischen dimerisierten SurA-Untereinheiten bzw. zwischen SurA und Peptid unterbunden, um deren Einfluss auf die wechselseitige Interaktion zu untersuchen. Hierbei wurden einzelne Positionen in isolierten SurA-Domänen identifiziert, die an einer Interaktion beteiligt sind. Die Mutation dieser Interaktionsstellen führten zu keinem signifikanten Verlust der in vivo-Funktion, welche mittels der Fähigkeit der SurA-Varianten zur Komplementation des synthetisch letalen Phänotypen einer surA skp-Doppelmutante untersucht wurde. Die Grundlagen für die Methodik der photoaktivierbaren, ortsspezifischen Quervernetzung von OMP-Polypeptiden an SurA- bzw. SurAI-Proteine wurden etabliert. / The SurA protein is an important part of the periplasmic folding machinery in Escherichia coli. Despite numerous findings are the mechanisms of substrate recognition and folding not yet completely resolved. The SurA protein consists of a chaperone module and two parvulin domains. In the beginning of this work a peptide binding site was published which was located in the PPIase inactive parvulin domain I. It was investigated in this thesis whether biological relevant, natural peptides would also bind with this binding site and if additional substrate binding sites exist within the SurA protein. In ESR-spectroscopy experiments both the interaction of the isolated parvulin domain I of SurA with peptides of a LamB peptide library and with the artificial peptide were examined. Binding of the artificial peptide and one peptide of the LamB peptide library to the isolated parvulin domain I could be detected. For the remaining tested peptides, which are confirmed to be SurA binders, no interaction could be verified at this position. By use of the genetic indicator system ToxR the contact points between dimerized SurA subunits respectively between SurA and peptide were prevented site-specifically to examine their influence on the mutual interaction. Here single positions in isolated SurA-domains were identified, which are part of an interaction. The mutation of these interaction sites lead to no significant loss of the in vivo function, which was analyzed by the capability of the SurA variants to complement the synthetic lethal phenotype of a surA skp double mutant. The fundamentals for the method of photoactivated site-specific crosslinking of OMP polypeptides to SurA respectively SurAI were established.