O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a diversidade bacteriana endofítica cultivável associada a plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck sintomáticas e assintomáticas para a doença Greening, com destaque para Methylobacterium spp. Simultaneamente, como objetivo secundário, foi realizado o estudo da comunidade bacteriana endofítica de Methylobacterium spp. presente em plantas de laranja doce com e sem sintomas da Clorose Variegada dos Citros (CVC). Assim, em período chuvoso (novembro de 2008 e fevereiro de 2009) e seco (maio de 2009) foram amostradas dez plantas sadias e dez plantas doentes (Greening e/ou CVC), em dois municípios citrícolas da região central do estado de São Paulo. A confirmação da presença e/ou ausência dos fitopatógenos Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, agentes causadores do Greening e, também, de Xylella fastidiosa, agente causador da CVC foram realizadas para todas as amostras pela técnica PCR a partir da utilização de iniciadores específicos para os respectivos fitopatógenos. Em relação à comunidade bacteriana estudada, foi realizado o isolamento e posterior quantificação do número de unidades formadoras de colônia (UFCs) totais e de Methylobacterium, caracterizadas pela presença de coloração rósea. A análise do sequenciamento parcial da região do gene 16S DNAr e agrupamentos filogenéticos dos isolados amostrados foram as metodologias adotadas para a geração dos resultados. Os resultados revelaram que a quantidade de Methylobacterium spp. isoladas em plantas sintomáticas para as doenças Greening e CVC foi expressivamente superior em relação as plantas sadias, destacando-se as espécies M. fujisawaense e M. radiotolerans, que foram os filotipos mais encontrados nas referidas amostras. As amostras vegetais coletadas em período seco, também, apresentaram maior presença da comunidade metilotrófica. A observação dos resultados da comunidade endofítica cultivável total associada a plantas sintomáticas e assintomáticas para Greening, mostrou que não houve diferenças relevantes quanto as UFCs encontradas nas plantas doentes e sadias. Foram encontradas as classes: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria e Firmicutes e os gêneros mais frequentes foram Brevundimonas, Alcaligenes e Pantoea. Em relação às características adaptativas de Methylobacterium spp. quanto a situações de estresses, foram verificadas in vitro a produção da enzima ácido aminociclopropano-1-carboxilato deaminase (ACCd) e tolerância aos metais pesados cádmio e chumbo. Dos 62 isolados avaliados, 63% foram capazes de utilizar a molécula de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) como fonte de nitrogênio para seu desenvolvimento. Os testes para tolerância ao metais pesados revelaram que apenas 3 isolados foram capazes de crescer em meio CHOI suplementado com sulfato de cádmio nas concentrações de 2,5 e 5,0 mM. Somente dois isolados se mostraram tolerantes ao chumbo, presente no meio CHOI suplementado com nitrato de chumbo nas concentrações 2,5 mM. Já em 5 mM, apenas um isolado foi capaz de se desenvolver. Os resultados, apresentados mostram a importância de Methylobacterium spp., sobre a comunidade endofítica cultivável de citros em dois diferentes patossistema avaliados, uma vez que em ambos foi observada uma maior quantidade de isolados do gênero em plantas doentes, sugerido uma associação com os respectivos fitopatógenos. A produção de ACCd por Methylobacterium está relacionada entre outros fatores, a interrupção da rota de síntese do etileno, composto relacionado ao estresse vegetal. Assim, a grande quantidade de Methylobacterium em plantas doentes e a produção de ACCd pelas mesmas, possivelmente, estão relacionadas ao favorecimento do patógeno mediante a redução da capacidade de resposta da planta / The aiming of this study was the evaluation of the diversity of endophytic culturable bacterial community associated with Huanglongbing (HLB) symptomatic and no-symptomatic Citrus sinensis (L.) Osbeck plants, highlighting the Methylobacterium spp. Simultaneously, it was evaluated the endophytic Methylobacterium community in sweetie orange with and without Citrus Variegated Chlorosis (CVC) symptoms. Thus, it was sampled ten healthy and no-health plants with HLB and CVC symptoms in raining (November 2008 and February are 2009) and dryed (may 2009) seasons in two provinces at São Paulo State. The presence or absence of the plant-pathogens Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, HLB agents and Xylella fastidiosa, CVC agent, was confirmed using specific primer by PCR for all plant samples. The bacterial communities was accessed by isolation and posteriori quantification of colony forming unit (CFU) to total and Methylobacterium group that was identified according its pink coloration. To the identification and phylogenetic clusterization of the isolates was partially sequenced the 16S DNAr gene. The results showed a higher amount of isolated Methylobacterium spp. from symptomatic plants to HLB and CVC than healthy plant. M. fujisawaense and M. radiotolerans were present in these samples. The plants sampled in dryed season showed a high amount of methilotrific isolates. It was not observed a significant difference of the amount of total bacteria isolated from HLB symptomatic and no-symptomatic plants The identified classes was: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria and Firmicutes. Brevundimonas, Alcaligenes and Pantoea were the most frequent genera. It was verified the acid aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACCd) production and the lead and cadmium tolerance as the adaptative characteristic of Methylobacterium to stress conditions. 63% of the 62 evaluated isolates were able to use the aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) as nitrogen source. Just 3 isolates were able to grow in supplemented CHOI media at 2.5 e 5.0 mM of sulphate of cadmium. Two isolates showed lead tolerance in the same media supplemented with nitrate of lead at 2.5 mM and just one at 5.0mM.The results showed the importance of Methylobacterium spp. to citrus culturable endophytic community in two pathossystem. In both the amount of methylotrofic isolates was higher in symptomatic plants, suggesting its association with the plant-pathogens. The Methylobacterium ACCd production has a relationship with the breaking of ethylen route. This compound is associated with vegetal stress. For this reason the high amount of Methylobacterium from symptomatic plants and the ACCd production probably is correlated with the disease development under the reduction of plant response capacity

Bacteriocinas são proteínas antimicrobianas produzidas por bactérias com importante papel na ecologia microbiana. Neste trabalho foram avaliados a produção e os efeitos destas proteínas numa fração da comunidade bacteriana de citros, pertencente aos gêneros Methylobacterium e Curtobacterium, isolada de Citrus sinensis (laranjeiras - plantas saudáveis, sintomáticas para CVC, assintomáticas para CVC) e Citrus reticulata (tangerina). Foi observada, para ambos os gêneros, uma alta freqüência de isolados produtores de bacteriocinas na comunidade endofíticas avaliada. Foi observado que esta freqüência foi maior em populações provenientes de plantas assintomáticas para CVC e em plantas de tangerina. Em Methylobacterium, as populações obtidas de plantas de tangerina e de plantas sintomáticas para CVC apresentaram uma maior freqüência de isolados produtores de bacteriocinas. Por outro lado, a população de Curtobacterium provenientes de plantas sintomáticas para CVC, apresentou a menor freqüência de isolados produtores bacteriocina. Proteínas de 3 isolados de C. flaccumfaciens foram parcialmente caracterizadas bioquimicamente, permitindo a sua classificação como bacteriocinas que foram denominadas de endoficinas. Uma destas bacteriocinas, a endoficina L foi escolhida para ser melhor caracterizada. A endoficina L parcialmente purificada apresentou um peso molecular estimado de 14 kDa e atividade in gel, e atingiu seu nível máximo de produção na fase estacionária e foi ativa contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo patógenos humanos e de plantas. Para a caracterização do gene envolvido na produção desta bacteriocina uma biblioteca, em cosmídeo, de fragmentos de DNA com 40 kb foi construída e um clone exibindo atividade bacteriocinogênica foi subclonado e parcialmente seqüenciado. Esta análise revelou um operon de 2,0 kb consistindo de pelo menos três genes preditos envolvidos na produção desta bacteriocina. Análises in silico sugeriram que a endoficina L deva ser uma bacteriocina do tipo toxina que pode ser uma candidata em potencial como agente no controle biológico de X. fastidiosa e outros fitopatógenos. Os resultados obtidos sugerem que, quando C. flaccumfaciens produtores de bacteriocinas estão presentes em plantas de citros podem inibir X. fastidiosa. Por outro lado, o crescimento de X. fastidiosa parece ser favorecido pela presença de Methylobacterium a qual produz bacteriocinas contra Curtobacterium. A primeira interação poderia ser mediada por bacteriocinas como a endoficina L. Sugere-se uma interação cíclica entre tais microrganismos. O conhecimento da interação entre tais bactérias endofíticas representa um avanço no entendimento dos aspectos ecológicos da interação planta-microrganismo. / Bacteriocins are antimicrobial proteins produced by bacteria, which play a role in microbial ecology. In this work we examined the bacteriocin production and it effects under a citrus bacterial communities belonged to Curtobacterium and Methylobacterium genera isolated from Citrus sinensis (sweet orangeuninfected, symptomatic, CVC-asymptomatic) and Citrus reticulata (tangerine) . We found a high levels of bacteriocin production for both genera, these frequencies were higher in asymptomatic and tangerine plants. The highest production frequencies for Methylobacterium strains were from tangerine and symptomatic plants. C. flaccumfaciens strains from symptomatic plants presented the lowest bacteriocin frequency. Proteins from three strains of C. flaccumfaciens were partially biochemically characterized and further classified as bacteriocins termed endophycins. One of them the endophycin L, was picked for deep investigation. The endophycin L partially purified had a molecular weight estimated of 14 kDa and exhibited in gel activity. Endophycin L production started at the exponential phase and reached its highest point during the stationary phase. It was capable of inhibiting the growth of Gram-positive and Gram-negative bacteria, incluiding several human and plant pathogens. In order to characterize the related to this bacteriocin production. One cosmid clone containing a 40-Kb fragment from a genomic library of C. flaccumfaciens was selected for its bacteriocinogenic ability The fragment was subcloned and DNA sequencing revealed a 2-kb operon consisting of at least three putative genes related to endophycin production. In silico analyses suggested that endophycin L is a toxin-like bacteriocin, this bacteriocin could be a potential candidate as biological control agent against X. fastidiosa and other plant pathogens. The data indicated that when C. flaccumfaciens producers are present it inhibits X. fastidiosa, conversely X. fastidiosa growth seems to be favored by Methylobacterium species and the first interaction could be mediated by endophycins, such as endophycin L. Thus, we suggest a cyclic interaction among these microorganisms. We demonstrated that knowledge of the interaction among those endophytic bacteria represent an advance about plantmicroorganism ecological aspects.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram.negativa, fastidiosa, que vive limitada ao xilema de plantas causando várias doenças de importância econômica como a doença de Pierce em videiras nos Estados Unidos e a Clorose Variegada dos Citros (CVC) no Brasil. A CVC tem afetado severamente a citricultura do estado de São Paulo pondo em risco milhares de empregos e milhões de dólares em geração de divisas. O sequenciamento do genoma de X. fastidiosa revelou genes envolvidos em possíveis mecanismos de patogenicidade dessa bactéria, entre eles um operon possivelmente envolvido na produção de um exopolissacarídeo extracelular denominado goma fastidiana. Supõe.se que esse exopolissacarídeo seja o responsável pela manutenção dos biofilmes bacterianos que causam a oclusão dos vasos xilemáticos levando ao surgimento dos sintomas da CVC. Para estudar esse operon, denominado operon gum, foram construídos vetores para a inativação dos genes gumB, gumD e gumF por duas estratégias: mutagênese por inserção.deleção e mutagênese por troca alélica. A mutagênese por inserção.deleção envolve a integração via recombinação homóloga com uma permuta.de um plasmídeo contendo uma cópia truncada do gene alvo. A mutagênese por troca alélica, por sua vez, envolve duas permutas e se caracteriza pela troca do gene alvo selvagem por uma cópia interrompida por um marcador de seleção. Nenhum mutante gum foi obtido usando.se a estratégia de troca alélica, todavia, mutantes para os genes gumB e gumF foram obtidos com sucesso pela estratégia de mutagênese por inserção.deleção. Nenhum mutante para o gene gumD foi obtido, sugerindo que essa mutação possa ser letal para a célula. A análise de células e colônias desses mutantes crescidos em meio sólido ou em suspensão não mostrou diferenças morfológicas em relação a linhagem selvagem. A inativação dos genes gumB e gumF não influenciou a capacidade de X. fastidiosa se aderir a vidro. Com o uso do gene repórter CAT, que codifica para a enzima clorafenicol acetil transferase a qual confere à bactéria resistência ao antibiótico clorafenicol foi possível verificar que a glicose não influencia na expressão desse operon ao nível de transcrição. Com o uso desse gene reporter, também foi possível identificar uma região transcrita a partir de um promotor não caracterizado, localizada na fita antisenso do operon gum. A comparação do perfil cromatográfico de proteínas solúveis totais dos mutantes e da linhagem selvagem mostrou diferenças significativas nesses pefis, indicando um efeito pleiotrópico dessas mutações. O estudo da função dos genes gumB e gumF na patogenicidade de X. fastidiosa foi impossibilitado por se ter verificado recentemente que a linhagem usada na construção dos mutantes não coloniza a planta eficientemente para a indução de sintomas em citros e tabaco em condições experimentais após inoculação mecânica. / Xylella fastidiosa is a fastidious, xylem restricted, gram.negative bacteria, that causes several economically important diseases as Pierce's disease of grapevine in USA and the Citrus Variegated Chlorosis (CVC) in Brasil. CVC affects severely the São Paulo State citriculture jeopardizing thousands of jobs and millions of dollars of incomes. The genome sequence of X. fastidiosa has revealed several genes possibly involved in the pathogenicity mechanisms of this bacterium, among them, an operon containing nine genes possibly involved in the synthesis of an exopolisaccharide named fastidian gum. This gum is possibly involved in the bacterial biofilm maintenance that causes the xylem occlusion leading to CVC symptoms development. To study this operon, named gum operon, vectors were constructed to inactivate the gumB, gumD and gumF genes by two strategies, insertion.duplication mutagenesis and allelic exchange mutagenesis. The insertion.duplication mutagenesis involves the integration a whole plasmid containing a truncated copy of the target gene by homologous recombination with one crossing over. The allelic exchange mutagenesis involves homologous recombination with two crossing overs that substitutes the wild.type copy of the target gene by a truncated copy interrupted by a selectable marker gene. No gum mutant was obtained using the allelic exchange strategy; however gumB and gumF mutants were obtained by insertion-duplication mutagenesis strategy. GumD mutant was not obtained, suggesting that the mutation in this gene is lethal to the cell. Analysis of cells and colonies of these mutants growing in solid media and in suspension hasn't reveal any morphological difference to the wild.type strain. The disruption of the gumB and gumF genes does not influenced the adhesion capacity of X. fastidiosa to the glass, used as a substrate. Using the reporter gene CAT, wich codes for cloramphenicol acetil transferase enzime confering resistance to cloramphenicol, we verified that glucose has no influence in the expression of this operon at the transcription level. Using this reporter gene, we also identified a transcribed region directed by a non characterized promoter, localized in the antisense strand of the gum operon. A comparison between the soluble protein profile of the mutants and the wild.type strain, obtained by liquid chromatography, showed significative differences, indicating a pleiotropic effect of these mutations. The study of the function of the gumB and gumF genes in the pathogenicity of X. fastidiosa was not concluded because we verified recently that the strainm, used to generate the mutants, do not colonize the plants efficiently to induce symptoms in citrus and tobacco plants after mechanical inoculation.

A interação bactéria-planta é um processo complexo que envolve diversos fatores bióticos e abióticos, podendo resultar em interações neutras, benéficas ou patogênicas. O gênero Methylobacterium tem sido descrito como endófito em diferentes plantas hospedeiras, podendo beneficiá-las por meio da promoção de crescimento vegetal e do controle de fitopatógenos. Em citros, este endófito coloniza o mesmo nicho que patógenos, e, assim, muitas espécies desse gênero são interessantes candidatas ao controle simbiótico contra Xylella fastidiosa. É conhecido que o processo de interação Methylobacterium-bactéria é coordenado por genes cuja expressão é regulada pelo sistema Quorum Sensing (QS), o qual utiliza N-acil-homoserina lactonas (AHLs) como moléculas sinalizadoras, importantes, entre outras coisas, para a formação de biofilme, encontrado em muitas plantas como estratégia de colonização bacteriana. No entanto, os mecanismos envolvidos na interação Methylobacterium-planta são ainda pouco compreendidos. Dessa forma, o presente trabalho buscou estudar, de diferentes maneiras, a interação entre Methylobacterium spp. e citros, avaliando os efeitos dessas bactérias sobre o crescimento de plântulas e a variação da expressão gênica. Neste contexto, foi verificado que a especificidade da interação bactéria-planta e a escolha do método de inoculação das bactérias são importantes para a geração de resultados benéficos sobre a germinação de sementes e o desenvolvimento da planta hospedeira. Possivelmente, a produção de AIA e a fixação biológica de nitrogênio foram os mecanismos envolvidos na promoção de crescimento de citros por Methylobacterium spp. neste estudo. Com relação à origem, essas bactérias parecem ser transmitidas horizontalmente em plantas cítricas. Visando empregar Methylobacterium spp. no controle de fitopatógenos em citros, M. extorquens AR1.6/2 foi geneticamente modificada para expressar uma endoglicanase A (EglA). Por meio de microscopia eletrônica de varredura, foi verificado que a bactéria modificada colonizou a superfície e o interior de Catharanthus roseus, planta modelo para experimentos com bactérias endofíticas e X. fastidiosa. Além disso, quando inoculada junto com X. fastidiosa, essas bactérias compartilharam o xilema das plântulas, sugerindo que durante a colonização e estabelecimento no hospedeiro estas bactérias poderiam interagir. Estudando a ação de uma AHL sobre a expressão de genes envolvidos na interação entre M. mesophilicum SR1.6/6-planta, foi observado que a presença dessa molécula foi importante na ativação da expressão dos genes mxaF, relacionado ao estabelecimento e metabolismo metilotrófico da bactéria; pat, relacionado a vantagens adaptativas e competitivas durante a colonização da planta; e acdS, envolvido com o metabolismo bacteriano e modulação de níveis hormonais na planta. A expressão dos genes crtI e sss, envolvidos com respostas a estresse e transporte de compostos, respectivamente, e do gene phoU, relacionado com patogenicidade, não foram alterados na presença da AHL nas condições avaliadas Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que Methylobacterium spp. interagem com plântulas de Citrus spp., demonstrando especificidade entre a espécie de planta e da bactéria endofítica. Foi observado também que esta interação ocorre não somente com a planta, mas possivelmente com outras bactérias que habitam o xilema de citros. Além disso, esta interação Methylobacterium-citros-bactérias do xilema pode ser regulada por AHLs. / The bacterium-plant interaction is a complex process that involves several biotic and abiotic factors that may result in neutral, beneficial or harmful interactions. The Methylobacterium genus has been described as endophytic bacterium in different host plants. It could benefit the plants by growth promotion and control of phytopathogens. In citrus, this endophyte colonizes the same pathogen-niche, and therefore many species of this genus are interesting candidates to symbiotic control against X. fastidiosa. It is known that the process of Methylobacterium-bacteria interaction is coordinated by genes whose expression is regulated by the Quorum Sensing (QS), which uses N-acyl homoserine lactones (AHLs) as signaling molecules. Its importance is associated with the biofilm formation, found in many plants as a strategy for bacterial colonization. However, the mechanisms in Methylobacterium-plant interactions are still poorly understood. Thus, this work studied in different ways, the interaction between Methylobacterium spp. and citrus, evaluating the effects of these bacteria on the seedling growth and the variation of gene expression. In this context, it was found that the specificity of bacteria-plant interactions and the bacterial inoculation methods are important to generate beneficial results on seed germination and host plant development. Possibly, IAA production and nitrogen biological fixation were the major involved mechanisms in citrus growth promotion by Methylobacterium spp. These bacteria seem to be transmitted horizontally in citrus plant. Aiming to employ Methylobacterium spp. to control phytopathogens in citrus plant, M. extorquens AR1.6/2 was genetically modified to express an endoglucanase A (EglA) enzyme. Using scanning electron microscopy was observed that the modified bacteria colonized the surface and interior of the Catharanthus roseus, a model plant for experiments with endophytic bacteria and X. fastidiosa. Furthermore, when inoculated with X. fastidiosa, these bacteria shared the seedlings xylem, suggesting that during the colonization and establishment in the host, these bacteria could interact. Studying the action of a AHL on the expression of genes involved in the interaction between M. mesophilicum SR1.6/6- plant it was observed that the presence of this molecule was important in the activation of genes expression mxaF (related to the establishment and methylotrophic metabolism); pat (related to adaptive and competitive advantages during the plant colonization); acdS (involved in bacterial metabolism and modulation of hormone levels in the plant). Expression of crtI and sss, involved in bacterial stress and transport of compounds, respectively, and phoU, related with pathogenicity were not altered in the presence of AHL in the evaluated conditions. The results of this study demonstrated that Methylobacterium spp. interact with seedlings of Citrus spp., showing specificity between plant species and endophytic bacteria. Also, it was observed that this interaction occurs not only with the plant molecular modification levels, but possibly with other bacteria that inhabit the xylem of citrus. Also, this interaction Methylobacteriumcitrus- xylem bacteria may be regulated by AHLs.

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T07:11:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_WillianEduardoLino_M.pdf: 4114093 bytes, checksum: f064932e99a8077c41524b40c01c7dbe (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A citricultura brasileira representa um setor comercial muito rico, porém a produtividade brasileira é baixa, sobretudo em razão de pragas e doenças, como a Clorose Variegada do Citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa que afeta todas as variedades de laranja doce (Citrus sinensis). O melhoramento genético de citros é um desafio em virtude da baixíssima variabilidade genética e do grande avanço de pragas e doenças. Uma alternativa para acelerar a obtenção de plantas resistentes a doenças seria a obtenção de plantas transgênicas. A seleção de genes candidatos em citros seria uma excelente estratégia, não fossem dificuldades para transformação genética como escapes, enraizamento, enxertia e longo ciclo da cultura. A solução para acelerar o conhecimento do potencial do gene em conferir resistência ao patógeno seria então o uso de hospedeiros alternativos como Nicotiana tabacum e Arabidopsis thaliana, pois possuem grande informação genética, protocolos simples de transformação e ciclo de vida curto. Devido à identificação prévia por transcritoma de genes possivelmente associados à resistência de Citrus reticulata a X. fastidiosa, torna-se necessário o estudo da função desses genes para aplicação por transgenia visando resistência em C. sinensis. Assim, o objetivo do trabalho foi utilizar plantas modelo (tabaco e Arabidopsis) para estudo funcional desses genes potenciais. Nossos resultados indicaram que Arabidopsis é moderadamente resistente à infecção por X. fastidiosa, uma vez que a bactéria não consegue colonizá-la eficientemente. Utilizando plantas mutantes de Arabidopsis para os genes candidatos RPS5, RAP2.2, MOA2.2, PseudoNBS, ERF73, RD22 e ATJ2 (homólogos aos diferencialmente expressos em C. reticulata sob infecção) verificou-se que dois deles, RPS5 e RAP2.2, estão envolvidos na resistência à bactéria, pois na ausência deles a bactéria colonizou mais eficientemente o hospedeiro, e portanto, são bons candidatos para superexpressão em C. sinensis visando resistência à CVC. RPS5 codifica uma proteína do tipo CC-NBS-LRR, comumente responsável pelo reconhecimento de moléculas dos patógenos e desencadeando vias de sinalização, enquanto o gene RAP2.2 codifica um fator de transcrição relacionado à uma via de sinalização mediada por etileno, de forma a desencadear respostas contra a infecção. Em relação a tabaco foi estudado a colonização da bactéria visando estabelecer um bioensaio quantitativo. Nesse sentido, foi elaborada e validada uma escala diagramática para correta aferição da severidade da doença nas folhas. Também foi estabelecida uma correlação entre níveis de severidade e população bacteriana, permitindo estimar a população bacteriana na folha a partir da análise de severidade. Um bioensaio mais rápido foi estabelecido para avaliação do gene soyBiPD, candidato à conferir resistência a X. fastidiosa. Entretanto, nossos resultados demonstram que esse gene não confere resistência à esse patógeno na planta modelo, não sendo, portanto, candidato para transformar C. sinensis visando resistência a CVC. Num curto período de tempo, oito genes candidatos foram avaliados e dois apresentaram resultados promissores (RPS5 e RAP2.2), sendo selecionados para transformação em C. sinensis visando tolerância a CVC. Isso comprova a importância de plantas modelo no estudo e seleção de genes promissores e a consequente redução de custos, trabalho e tempo para obter respostas acerca da potencialidade dos genes / Abstract: The Brazilian citrus agribusiness is a very important commodity; nevertheless Brazilian citrus productivity is low, mainly due to pests and diseases that affect the culture. The Citrus Variegated Chlorosis (CVC), caused by the bacterium Xylella fastidiosa is one of the most important diseases, since it affects all varieties of sweet oranges. Citrus breeding programs could be used to solve this problem however the breeding is a challenging due to the very low genetic variability and the breakthrough of pests and diseases. An alternative to accelerate the obtaining of resistant plants to diseases could be through of transgenic plants. The selection of candidate genes in citrus would be an excellent strategy, if there were not difficulties in genetic transformation. The solution to accelerate the knowledge of gene to confer pathogen resistance is the use of alternative hosts such as the Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana. Both hosts have great genetic information, simple protocol of transformation and short life cycle. Due to the prior identification by transcriptome of genes possibly associated with resistance of C. reticulata to X. fastidiosa become necessary to study the function of these genes. Thus, the goal of this study was to use model plants (Arabidopsis and tobacco) for functional study of potential genes to confer X. fastidiosa resistance and use them in C. sinensis in a transgenic approach. Our results indicated that Arabidopsis is moderately resistant to infection by X. fastidiosa, since bacteria cannot colonize it efficiently. Using mutant plants to the candidate genes RPS5, RAP2.2, MOA2.2, PseudoNBS, ERF73, RD22 and ATJ2 (homologous to the differentially expressed in C. reticulata under infection) it was found that RPS5 and RAP2.2 are probably involved in resistance to this bacterium, since the mutants were more susceptible to X. fastidiosa, therefore they are good candidates for overexpression in C. sinensis aiming CVC resistance. The RPS5 gene encodes a protein of the CC-NBS-LRR type commonly responsible for the recognition of molecules of pathogens and triggering signaling pathways, while RAP2.2 gene encodes a transcription factor related to the signaling pathway mediated by ethylene, triggering responses against infection. Regarding tobacco we study the colonization of bacteria to establish a quantitative bioassay. In this sense, was developed and validated a diagrammatic scale for accurate measurement of disease severity in the leaves. A correlation between levels of severity and bacterial population, allowing estimation of the bacterial population in plant from the analysis of severity, was also established. A faster bioassay was established for evaluation of soyBiPD gene, candidate to confer resistance to X. fastidiosa. However, our results demonstrate that this gene does not confer resistance in the plant model, and therefore would not be used to transform C. sinensis. In a short time, eight candidate genes were evaluated and two of them showed promising results (RPS5 and RAP2.2). These results demonstrate the importance of model plants in accelerate the knowledge of candidate genes and consequent the reduction of costs, labor and time to obtain responses about the potentiality of genes to confer pathogen resistance / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T17:07:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Niza_Barbara_M.pdf: 2368175 bytes, checksum: 2c97ffad74e7a3e1c33ae99c78818b99 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A citricultura brasileira é um importante setor para a economia do país, contribuindo com superávits comerciais e geração de empregos, entretanto, o setor passa por uma grave crise econômica em decorrência do alto custo de produção e do baixo valor pago pela caixa de laranja no Brasil. O principal motivo do alto custo de produção é a alta incidência de pragas e doenças que atingem essa cultura. Dentre as doenças, a Clorose Variegada do Citros (CVC) causada pela bactéria Xylella fastidiosa e transmitida a seus hospedeiros por cigarrinhas vetoras, é a que até hoje causou mais danos à citricultura brasileira. O mecanismo de patogenicidade da X. fastidiosa permanece não conclusivo porém a hipótese mais aceita está relacionada à facilidade da bactéria em colonizar o hospedeiro, ou seja, em se movimentar e multiplicar dentro dos vasos do xilema da planta infectada, seguido da formação do biofilme. O conhecimento da doença bem como das interações planta-patógeno e vetor-patógeno estão muito avançados para a doença de Pierce (PD), doença causada pela X. fastidiosa em videiras nos Estados Unidos. Esse avanço no conhecimento para PD ocorreu principalmente devido à obtenção de estirpes geneticamente modificadas da bactéria, permitindo a execução de estudos funcionais e de colonização. A implementação da aquisição de X. fastidiosa em sistema de dieta artificial para estudos com o vetor também foi de grande contribuição para esse avanço, uma vez que esse sistema elimina a utilização de plantas fonte para aquisição da bactéria. Em citros, sabe-se que existem fontes de resistência natural à CVC como tangerinas, tangors, limas e limões, entretanto, todas as variedades de laranja doce plantadas no Brasil são suscetíveis a essa doença. Sabe-se também que há uma resposta genética diferente entre um genótipo resistente e o suscetível quando inoculados com X. fastidiosa, porém, não se conhece como se dá a colonização in planta, e se existe uma correlação entre a resposta genética da planta e o comportamento da bactéria. Buscando melhorar o entendimento dos fatores envolvidos no patossistema CVC este trabalho teve como objetivo a obtenção de uma estirpe patogênica de X. fastidiosa de citros transformada com a proteína verde fluorescente (GFP) afim de avaliar sua colonização in planta em genótipos parentais e híbridos de citros, resistentes e suscetíveis, além da implementação da aquisição de X. fastidiosa por cigarrinhas vetores por meio do sistema de dieta artificial. A obtenção do transformante de X. fastidiosa expressando GFP permitiu o acompanhamento da colonização da bactéria nos vasos do xilema de plantas suscetíveis e resistentes e a avaliação mostrou uma colonização diferenciada entre caule e pecíolo. Também foi verificado um padrão diferencial de colonização dos caules de genótipos suscetíveis em relação aos resistentes, no qual a bactéria parece não capaz de se mover em genótipos resistentes, permanecendo aprisionada no xilema primário dessas plantas, sugerindo um possível mecanismo de resistência. A implementação da aquisição de células bacterianas em sistema de dieta artificial foi estabelecida com sucesso para vetor e estirpe de X. fastidiosa em citros, abrindo perspectivas para vários estudos na área de interação vetor-patógeno e transmissão da CVC / Abstract: The citrus agribusiness is an important segment for the country economy, contributing to employment and trade surpluses, however, it is passing through an economic crisis on behalf of the high cost of production and the low price paid by the orange box in Brazil. The main reason for the high cost of production is the high incidence of pests and diseases affecting this crop. Among the diseases, the Citrus Variegated Chlorosis (CVC) is caused by the bacterium Xylella fastidiosa and transmitted to its hosts by sharpshooters, and it is the disease that more damage have been causing to the citrus agribusiness in Brazil. The X. fastidiosa pathogenicity mechanism still not clear but the currently accept hypothesis is related to its facility to colonize the host, in other words, on move and multiply within the xylem vessels of an infected host, followed by the biofilm formation. The knowledge about the disease and the interactions between plant-pathogen and vector-pathogen are advanced for the Pierce disease, which is caused by X. fastidiosa on grapes in the United States. This occurs mainly on behalf of bacterial mutant¿s obtainment, allowing functional and colonization studies, besides the artificial diet system establishment for insect vectors studies, once this system eliminates the use of source plant acquisition, a limiting factor for X. fastidiosa acquisition since its colonization in host plants is random. In citrus, is known that natural resistant sources against CVC exists like tangerine, tangors, limes and lemons, while all the sweet orange varieties grown in Brazil are susceptible. Also, was verified a different genetic response between a resistant and a susceptible genotype when inoculated with X. fastidiosa, although, the colonization process in planta still unkown as well as if there is a correlation between the plant genetic response and the bacterial behavior. In order to better understand the factors involved in the CVC pathosystem, this work had the goal of obtain a pathogenic X. fastidiosa strain from citrus transformed with the green fluorescent protein (GFP) to evaluate its colonization in planta on parent and hybrid citrus genotypes, resistant and susceptible, besides de X. fastidiosa artificial acquisition by the insect vector using the artificial diet system. Was obtained a X. fastidiosa strain transformed with the GFP which allowed the bacterial colonization monitoring within the xylem vessels of resistant and susceptible plants and this evaluation showed a differential colonization of stems and petioles. Was also verified a different stem colonization pattern between resistant and susceptible genotypes on which the bacteria seems to be not able to move in resistant ones, staying contained into the primary xylem of these plants, suggesting a possible mechanism of resistance. The bacterial cells acquisition on artificial diet system was successfully established using a citrus insect vector and bacterial strain, opening perspectives for various studies on vector-pathogen interaction and transmission of CVC / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Iron deficiency chlorosis (IDC) is a frequent problem throughout many areas of the United States where soils are high in calcium carbonate (CaCO3), including the Blackland Prairie regions of Mississippi. The main objectives of this study were to 1) determine the effects of seven different cropping systems on IDC visual symptomology and grain yield in rainfed soybeans grown in calcareous soils, and 2) evaluate the effects of soil water tension (SWT) on IDC. Rotating soybeans with corn produced significantly higher yields for both tolerant and susceptible soybean varieties. IDC symptomology was worse, and yields were lower in cropping systems with lower average SWT, or wetter soils, throughout the growing season. Last, this study evaluated the use of multispectral imagery and apparent soil electrical conductivity (ECa) to identify IDC-prone areas of a field for the site-specific implementation of management strategies that produced higher yields in the plot-scale study.

X. fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica limitada ao xilema, que tem afetado um grande número de plantas no Brasil e no mundo. Muitos trabalhos já foram realizados sobre esta bactéria, mas pouco se conhece a respeito da adesão, colonização e expressão dos sintomas. Os objetivos deste trabalho foram: a) através do uso da microscopia eletrônica e de luz, determinar e relacionar o número de vasos colonizados de citros, cafeeiro e ameixeira com a sintomatologia em folhas; b) estudar a adesão, migração radial e colonização dos vasos do xilema do pecíolo de folhas de citros pela bactéria; c) estudar algumas variáveis experimentais que afetam a expressão dos sintomas em fumo; d) verificar os sítios de ligação da bactéria em cigarrinhas vetores; e) estudar a adesão e a formação do biofilme por X. fastidiosa em superfície de poliestireno, como uma nova metodologia. Os resultados mostraram em ameixeira e cafeeiro uma relação entre o número de vasos colonizados e a expressão de sintomas necróticos, relação esta que não pode ser observada para citros, o qual apresentava um número de vasos colonizados do pecíolo bem menor que o das outras duas espécies. No estudo da bactéria nos vaso do xilema de citros foi possível verificar as diversas fases do processo de colonização do xilema, bem como a capacidade da bactéria em degradar a parede celular primária da pontuação e migrar para os vasos adjacentes. Neste estudo foi também possível verificar respostas da planta à bactérias caracterizadas pela produção de cristais no lúmen dos vasos do xilema e o acúmulo de goma e hiperplasia de células nas folhas. No estudo com variedades de fumo verificou-se que a cultivar Havana apresentou expressão de sintomas mais intensa que as variedades TNN e RP1 e que o aparecimento dos mesmos não foi influenciado pelo volume de inóculo e pelo local de inoculação, mas sim pela adubação com sulfato de amônio, a qual retardou o aparecimento dos sintomas e reverteu os sintomas inicias em folhas após a aplicação. Em cigarrinhas, células bacterianas com morfologia similar as de X. fastidiosa, foram visualizadas aderidas pela parte lateral na câmara do cibário (sulco longitudinal, parede lateral e membrana do diafragma) de Acrogonia citrina, e Oncometopia facialis, no canal do apodeme de Dilobopterus costalimai e pela parte polar no precibário de O. facialis. Finalmente, no estudo da adesão de X. fastidiosa a película de poliestireno, os resultados revelaram as várias fases da formação do biofilme, aspectos da sua arquitetura, e indicaram que a técnica é uma ferramenta adequada para o estudo da formação do biofilme e também da morfologia das bactérias. Os resultados são discutidos em termos de modelos de adesão e colonização, da bactéria e importância para o conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da bactéria em plantas e transmissão pelos vetores. / X. fastidiosa is a xylem-limited bacterium that has been affecting a high number of plants in Brazil and in the world. A lot of researches were already accomplished on this bacterium, but little is known regarding the adhesion, colonization and expression of the symptoms in plants. The objectives of this work were: a) through the use of electron microscopy and of light microscopy determine and to correlate the number of xylem colonized vessels of petiole of sweet orange, coffee and plum with chlorosis and leaf scorching in leaves; b) study the adhesion, radial migration and colonization of the vessels of the petiole xylem of sweet orange by the bacterium; c) study some experimental variables that affect the expression of symptoms in tobacco; d) verify the retention sites of the bacterium in sharpshooters; d) study the adhesion and biofilm formation by X. fastidiosa on polystyrene surface. The results showed a relationship between the number of colonized vessels in plum and coffee and the expression of necrotic symptoms. However, that relationship was not observed for sweet orange, which presented a number of colonized vessels smaller than the other two species. In the study of the bacterium in the xylem vessels of sweet orange it was possible to verify the several phases of the colonization process of the xylem as well as the ability of the bacterium to degrade the primary cell wall of the pit and migrate to adjacent vessels. It was also possible to verify responses of the plant to the bacterium characterized by the production of crystals in the lumen of the xylem vessels and gum accumulation and hyperplasia in the leaf cells. Regarding the tobacco varieties it was verified that the expression of symptoms is more intense in the cultivar Havana than in the cultivars TNN and RP1. It was also seen that symptoms expression was not influenced by the inoculum volume or the inoculation place, but it was altered by fertilization with ammonium sulfate, which delayed the beginning of the symptoms and reverted the symptoms in leaves after the application. In sharpshooters, bacterial cells exhibiting morphology similar to X. fastidiosa were visualized attached to the lateral side in the cibarium camera (longitudinal, lateral wall and membrane of the diaphragm) of Acrogonia citrina, and Oncometopia facialis, in the apodemal channel of Dilobopterus costalimai, and in the polar part in the pre-cibarium of O. facialis. Finally, in the study of the adhesion of X. fastidiosa on polystyrene surface, the results revealed the several phases of biofilm formation; aspects of its architecture, and it also indicated that the technique is an appropriate tool to study of the formation of biofilms and also of the bacterial morphology. The results are discussed regarding adhesion models, colonization, and distribution of the bacterium in the plant and the importance of knowing the pathogenicity mechanisms of X. fastidiosa and its transmission by the insect vectors.

X. fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica limitada ao xilema, que tem afetado um grande número de plantas no Brasil e no mundo. Muitos trabalhos já foram realizados sobre esta bactéria, mas pouco se conhece a respeito da adesão, colonização e expressão dos sintomas. Os objetivos deste trabalho foram: a) através do uso da microscopia eletrônica e de luz, determinar e relacionar o número de vasos colonizados de citros, cafeeiro e ameixeira com a sintomatologia em folhas; b) estudar a adesão, migração radial e colonização dos vasos do xilema do pecíolo de folhas de citros pela bactéria; c) estudar algumas variáveis experimentais que afetam a expressão dos sintomas em fumo; d) verificar os sítios de ligação da bactéria em cigarrinhas vetores; e) estudar a adesão e a formação do biofilme por X. fastidiosa em superfície de poliestireno, como uma nova metodologia. Os resultados mostraram em ameixeira e cafeeiro uma relação entre o número de vasos colonizados e a expressão de sintomas necróticos, relação esta que não pode ser observada para citros, o qual apresentava um número de vasos colonizados do pecíolo bem menor que o das outras duas espécies. No estudo da bactéria nos vaso do xilema de citros foi possível verificar as diversas fases do processo de colonização do xilema, bem como a capacidade da bactéria em degradar a parede celular primária da pontuação e migrar para os vasos adjacentes. Neste estudo foi também possível verificar respostas da planta à bactérias caracterizadas pela produção de cristais no lúmen dos vasos do xilema e o acúmulo de goma e hiperplasia de células nas folhas. No estudo com variedades de fumo verificou-se que a cultivar Havana apresentou expressão de sintomas mais intensa que as variedades TNN e RP1 e que o aparecimento dos mesmos não foi influenciado pelo volume de inóculo e pelo local de inoculação, mas sim pela adubação com sulfato de amônio, a qual retardou o aparecimento dos sintomas e reverteu os sintomas inicias em folhas após a aplicação. Em cigarrinhas, células bacterianas com morfologia similar as de X. fastidiosa, foram visualizadas aderidas pela parte lateral na câmara do cibário (sulco longitudinal, parede lateral e membrana do diafragma) de Acrogonia citrina, e Oncometopia facialis, no canal do apodeme de Dilobopterus costalimai e pela parte polar no precibário de O. facialis. Finalmente, no estudo da adesão de X. fastidiosa a película de poliestireno, os resultados revelaram as várias fases da formação do biofilme, aspectos da sua arquitetura, e indicaram que a técnica é uma ferramenta adequada para o estudo da formação do biofilme e também da morfologia das bactérias. Os resultados são discutidos em termos de modelos de adesão e colonização, da bactéria e importância para o conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da bactéria em plantas e transmissão pelos vetores. / X. fastidiosa is a xylem-limited bacterium that has been affecting a high number of plants in Brazil and in the world. A lot of researches were already accomplished on this bacterium, but little is known regarding the adhesion, colonization and expression of the symptoms in plants. The objectives of this work were: a) through the use of electron microscopy and of light microscopy determine and to correlate the number of xylem colonized vessels of petiole of sweet orange, coffee and plum with chlorosis and leaf scorching in leaves; b) study the adhesion, radial migration and colonization of the vessels of the petiole xylem of sweet orange by the bacterium; c) study some experimental variables that affect the expression of symptoms in tobacco; d) verify the retention sites of the bacterium in sharpshooters; d) study the adhesion and biofilm formation by X. fastidiosa on polystyrene surface. The results showed a relationship between the number of colonized vessels in plum and coffee and the expression of necrotic symptoms. However, that relationship was not observed for sweet orange, which presented a number of colonized vessels smaller than the other two species. In the study of the bacterium in the xylem vessels of sweet orange it was possible to verify the several phases of the colonization process of the xylem as well as the ability of the bacterium to degrade the primary cell wall of the pit and migrate to adjacent vessels. It was also possible to verify responses of the plant to the bacterium characterized by the production of crystals in the lumen of the xylem vessels and gum accumulation and hyperplasia in the leaf cells. Regarding the tobacco varieties it was verified that the expression of symptoms is more intense in the cultivar Havana than in the cultivars TNN and RP1. It was also seen that symptoms expression was not influenced by the inoculum volume or the inoculation place, but it was altered by fertilization with ammonium sulfate, which delayed the beginning of the symptoms and reverted the symptoms in leaves after the application. In sharpshooters, bacterial cells exhibiting morphology similar to X. fastidiosa were visualized attached to the lateral side in the cibarium camera (longitudinal, lateral wall and membrane of the diaphragm) of Acrogonia citrina, and Oncometopia facialis, in the apodemal channel of Dilobopterus costalimai, and in the polar part in the pre-cibarium of O. facialis. Finally, in the study of the adhesion of X. fastidiosa on polystyrene surface, the results revealed the several phases of biofilm formation; aspects of its architecture, and it also indicated that the technique is an appropriate tool to study of the formation of biofilms and also of the bacterial morphology. The results are discussed regarding adhesion models, colonization, and distribution of the bacterium in the plant and the importance of knowing the pathogenicity mechanisms of X. fastidiosa and its transmission by the insect vectors.

This study presents mountain forest Norway spruce (Picea abies) injured by surface ozone and oxidative stress. Norway spruce is not a sensitive species but it is the most representative tree in our country and this is the reason to pay attention on its injury. Study was connected to the ozone measurement by CHMI in Jizerske mountains. Aim of our study was to find influence of surface ozone on the forest and show correlation between ozone concentrations, altitude and Norway spruce injury. Ozone concentrations are growing with the altitude. Increasing percentage of injury with growing concentrations and altitude was expected. Needles were collected at the altitude 750-1100 meters. Collected needle years were 2006, 2007 and 2009. The 2009 year was not evaluated because no symptoms were found. Injury was observed on the maroscopical, microscopical and biochemical level. Visual injury was assessed by percentage of injured needle surface by chlorosis and necrosis. Microscopical analysis studied injury on cross and longitudinal sections of needles. On the longitudinal sections were visible typically bone-cells. These cells have lost its shape by ozone stress and were narrowed in its width. Bone-cells were best visible near the stomata. Four symptoms were observed on the cross sections: tannin...