A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis transformadas com os genes atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Pêra\' e \'Valência\', contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão \'Cravo\' para avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja \'Hamlin\' (H), sete de laranja \'Natal\' (N), cinco de laranja \'Pêra\' (P) e nove de laranja \'Valência\' (V). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10 repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30 dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha. / The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker. Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Natal\' and \'Pera\' containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different experiments including, eight \'Hamlin\' sweet orange plants (H), seven \'Natal\' sweet orange plants (N), five \'Pera\' sweet orange plants (P) and nine \'Valencia\' sweet orange plants (V). The experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration, and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants. Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom severity of citrus canker related to control plants.

A bactéria Xylella fastidiosa 9a5c é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC) e responsável por grandes perdas econômicas na citricultura. O genoma de X. fastidiosa 9a5c foi totalmente seqüenciado e a sua análise permitiu identificar vários genes possivelmente envolvidos na patogenicidade/virulência da bactéria. Como os sintomas da CVC desenvolvemse um longo tempo após a infecção da planta pela bactéria e a severidade da doença têm sido associada à altas temperaturas, é possível que a expressão de fatores de patogenicidade/virulência seja dependente de densidade celular e/ou estresses térmicos. Desta forma, o crescimento in vitro da X. fastidiosa foi monitorado através da absorbância de suspensões bacterianas à 600nm (A600), número de unidades formadoras de colônias (UFC) e viabilidade celular, durante 16 dias de cultivo em meio PW modificado líquido, à 28 e 32ºC. Proteínas extracelulares foram extraídas e analisadas através da eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Bioensaios foram utilizados para verificar a produção de moléculas sinais por X. fastidiosa. Os resultados obtidos mostraram que o crescimento de X. fastidiosa à 32ºC, com base na A600, não diferiu do crescimento à 28ºC. No entanto, com base no número de UFCs e viabilidade celular, o crescimento de X. fastidiosa diferiu em função da temperatura, tempos de incubação e a interação entre esses fatores. X. fastidiosa produziu maior número de proteínas extracelulares à 32 do que à 28ºC, mostrando que a secreção de proteínas em X. fastidiosa é regulada pela temperatura de incubação. Várias proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa à 28 e 32ºC são moduladas durante o crescimento da bactéria. A maior parte das proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa são proteínas ácidas e de massa molecular aparente entre 20-60 kDa. X. fastidiosa não sintetizou moléculas de lactonas de homoserina aciladas (LHAs) reconhecidas pelo sistema repórter utilizado, mas sintetizou uma molécula extracelular em meio de cultivo, semelhante ao DSF produzido por X. campestris pv. campestris, capaz de restaurar a atividade da endoglucanase através do sistema repórter utilizado. A concentração desta molécula em meio PW modificado foi dependente da densidade de células de X. fastidiosa no meio. / The bacterium Xylella fastidiosa is the causal agent of the citrus variegated chlorosis (CVC) and is responsible for significant economic losses in citriculture. The genome of X. fastidiosa has been completely sequenced and revealed several genes probably involved in pathogenicity/virulence. Since CVC symptoms are develop a long time after infection of plant by the bacterium and the severity of the disease has been associated with high temperatures, it’s possible that the expression of pathogenicity/virulence factors is dependent on cellular density and/or temperature stresses. Thus, the growth of X. fastidiosa in modified liquid PW medium was measured based on the absorbance of suspensions at (A600), number of colony-forming units (CFU) and cellular viability, during 16 days at 28 and 32ºC. Extracellular proteins were extracted and analysed by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE). Bioassays were used to determine whether X. fastidiosa produces signal molecules involved in quorum perception. The results showed that temperatures of 28 and 32ºC did not affect the growth of the bacterium, based on A600. Temperatures of 28 and 32ºC, incubation times and the interaction of both factors affected bacterial growth based on CFU numbers and the cellular viability. X. fastidiosa produced higher number of extracellular proteins at 32 than at 28ºC, showing that protein secretion is dependent on growth temperature. Several extracellular proteins produced by X. fastidiosa at 28 and 32ºC were modulated the bacterial growth. Most of the extracellular proteins produced by X. fastidiosa were acidic with apparent molecular mass within 20-60 kDa. X. fastidiosa did not synthesize N-acyl homoserine lactone (AHL) recognizes by the reporter system used. However, it synthesized an extracellular molecule in modified PW medium, similar to DSF produced by X. campestris pv. campestris, which is able to restore endoglucanase activity by the reporter system. The concentration of this extracellular molecule produced by X. fastidiosa was dependent on cellular density.

A cultura dos citros é extremamente dependente de uma nutrição mineral adequada para atingir maiores patamares de produção a menores custos, especialmente sob condições adversas, como no caso da ocorrência da clorose variegada dos citros (CVC). Neste contexto, o boro influencia diretamente a produção por proporcionar maior desenvolvimento radicular, aumentando o volume de solo explorado pelas raízes, maximizando o aproveitamento da água e dos fertilizantes, bem como por estar diretamente envolvido na formação da parede celular, contribuindo para aumento da resistência geral da planta. O presente trabalho foi desenvolvido a partir de um experimento de campo, conduzido no período de setembro de 2001 a agosto de 2002, em área de campo comercial localizada no município de Comendador Gomes (MG). Utilizou-se a variedade Pêra Rio enxertada sobre Limão Cravo no oitavo ano de produção, cultivada em LATOSSOLO VERMELHO-AMARELO Distrófico psamítico. O objetivo do estudo foi avaliar o uso de fontes de boro aplicadas ao solo em diferentes dosagens e sua influência na produção e qualidade do citros afetado pela CVC. Foram avaliados o estado nutricional das plantas, atributos químicos do solo, produtividade, bem como os atributos tecnológicos e físicos dos frutos. As fontes utilizadas foram: ulexita-pó, ulexita-granulada, colemanita-pó, ácido bórico e termofosfato com boro, nas dosagens de 1, 2, 3 e 4 kg ha-1 . O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com fatorial 5X4, além de dois tratamentos adicionais (testemunha e termofosfato magnesiano), em quatro repetições. A avaliação do estado nutricional foi feita pela análise química dos teores de nutrientes nas folhas amostradas seis meses após a aplicação dos tratamentos. Os atributos químicos do solo foram avaliados por meio de análises das amostras coletadas onze meses após a aplicação dos tratamentos, na profundidade de 0-20 cm. A produção foi avaliada por ocasião da colheita, bem como os atributos tecnológicos e físicos dos frutos. Os resultados mostraram que todas as fontes de boro proporcionaram aumentos significativos nos teores foliares de boro, sendo o ácido bórico e a ulexita-pó as que promoveram os maiores aumentos, não havendo influência das fontes e doses nos teores foliares de P, Ca e Mg. Os teores de boro no solo permaneceram acima do nível considerado adequado, sendo observados maiores valores onde utilizou-se fontes menos solúveis como a colemanita e o termofosfato com boro. A produtividade e os atributos físicos dos frutos não tiveram influência da utilização de fontes e doses de boro no pomar com elevada CVC, sendo observado que o aumento da doses de boro aplicado no solo diminuiu a porcentagem de suco no fruto. / Citrus crop is extremely dependent on an adequate mineral nutrition to reach bigger levels of production to fewer costs, especially under adverse conditions, as in the case of occurrence of citrus variegated chlorosis (CVC). In this context, boron directly influences the production because it provides a bigger root growth, what increases the volume of the explored soil by the roots, maximizes the use of water and fertilizers, as well as because it is directly involved in the cell wall biosynthesis, what contributes to the increase of the general resistance of the plant. The current study was developed from a field experiment and conducted in the period of September/2001 to August/2002, in a commercial field area located in the city of Comendador Gomes (state of MG). Pêra Rio variety grafted on Limão Cravo was used in the eighth year of production, cultivated in Typic Haplustox. The aim of the study was to evaluate the use of boron sources applied to soil in different dosages and its influence in the production and quality of the citrus affected by CVC. Plant nutritional condition, soil chemical attribute evaluations, productivity, and technical and physical attributes of the fruits were evaluated. The sources used were: ulexite fine, ulexite granular, colemanite fine, boric acid and fused boron phosphate, in 1, 2, 3 and 4 kg ha-1 rates. The experimental design used was completely randomized, with 5X4 factorial, besides two additional treatments (control and fused magnesium phosphate), in four replications. The evaluation of the nutritional state was done by leaf chemical analysis sampled six months after the application of the treatments. The chemical attributes of the soil were evaluated through analysis of samples collected eleven months after the application of the treatments, at a depth of 0- 20cm. The production was evaluated on the occasion of the harvest, as well as the technological and physical attributes of the fruits. The results showed that all boron sources promoted significative increases on the leaf boron contents. The higher increase was promoted by boric acid and ulexite fine sources. However didn´t happen source and dose influences on leaf contents of P, Ca e Mg. The boron soil contents remained higher than the level considerate suitable. The higher soil boron content was observed when sources with low solubility like colemanite and fused boron phosphate were applied. Productivity and fruit physical attributes didn´t were influenced by boron sources and dosages in plants with higher incidence of CVC. With the boron doses increase diminish the fruit juice contents.

Dentre os diversos fatores que afetam a produção e qualidade de frutos em plantas cítricas, os fatores fitossanitários destacam-se pela grande importância. Entre as diversas doenças que afetam a cultura dos citros, a Clorose Variegada dos Citros (CVC) é uma das mais severas e destrutivas, provocando tanto perdas em produção quanto em qualidade. Pelo fato desta doença ser causada por uma bactéria que se aloja no xilema, toda a dinâmica da água e nutrientes é afetada, resultando em uma série de sintomas visuais em diferentes graus. Buscou-se avaliar o estado nutricional de plantas cítricas sem sintomas vis uais de CVC e, com sintomas em diferentes níveis, através do Critério de Faixas de Suficiência, tradicionalmente utilizado na Citricultura Paulista e, através do Sistema Integrado de Diagnose e Recomendação, denominado pela sigla DRIS. O estudo foi realizado em pomares comerciais de laranjeira 'Pera' enxertada em limão 'Cravo', com sete anos de idade, no município de Araraquara – SP. Foram selecionadas em dois talhões, plantas com três níveis de CVC e plantas sem sintomas visuais, determinando-se os teores dos macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg, S) e dos micronutrientes (B, Cu, Fe, Mn e Zn) em folhas de ramos frutíferos, bem como produção de frutos de cada planta. A interpretação através do método DRIS, envolveu a utilização de um "software" aplicado especialmente para a cultura dos citros pelo Instituto Agronômico de Campinas - IAC, onde foi utilizado o método de cálculo proposto por Jones (1981). O DRIS foi eficiente, possibilitando a ordenação dos nutrientes, e, indicando deficiência nutricional para alguns nutrientes considerados adequados ou excessivos pelo Critério de Faixas de Suficiência. Independentemente da presença de sintomas de CVC, todas as plantas apresentaram baixos teores de Ca, resultando em diagnose de deficiência pelos dois critérios de interpretação; de modo geral, houve uma redução nos teores foliares de N e P, em plantas com sintomas mais severos. Com relação aos teores dos demais nutrientes não houve um padrão de decréscimo ou aumento em função da CVC. O "software" DRIS aplicado especialmente para a cultura dos citros pelo IAC, com a população de referência por ele utilizada, deve ainda sofrer ajustes, de acordo com as condições e objetivos do trabalho para melhor correlação com produtividade. / Among all factors which affect the yield and fruit quality from citric plants, pests and diseases are of outstanding importance. There are several pests and diseases wich affect the citrus crop. The citrus variegated chlorosis (CVC) is one of the most severe and destructive diseases affecting both yield and quality. Because this disease is caused by a xylem bacteria, the water and nutrients dinamics is affected resulting in a series of visual simptons of different intensities. There objective of this work was to evaluate the nutritional status os citrus plants without visual simptons of CVC and, with different levels of simptons of this disease. The Sufficiency Range Criteria, traditionally used in the state of São Paulo and the Diagnosis and Recommendation Integrated System (DRIS) were the methods used for leaf analysis interpretation. The study was carried out in commercial orchards of 'Pêra' sweet orange budded on 'Cravo' lemom, seven years old, in the region of Araraquara – SP. Plants with three levels of CVC and plants without visual simptons were selected from two plots. Concentrations of macronutrients (N, P, K, Ca, Mg, S) and micronutrients (B, Cu, Fe, Mn, Zn) were determined on leaves of fruit branches. Fruit production from each plant was measured. The analysis through the DRIS method involved the utilization of a software developed specially for the citrus crop by the Instituto Agronômico de Campinas – IAC, where the method proposed by Jones (1981) was used. The results showed that the DRIS was efficient in ranking the nutrients and indicating the nutritional defficiency for some nutrients considered adequate or excessive by the Sufficiency Range Criteria. Regardless the presence of CVC simptons, all plants show low foliar concentrations of Ca, wich resulted in a diagnose of defficiency by the two criteria of interpretation. There was a foliar concentration reduction of N and P, in plants with more severe simptoms. With respect to the foliar concentration of the other nutrients there was not observed a standard decrease or increase due to CVC. The local DRIS-Citros IAC software norms utilized should be adjusted according to the work conditions and objectives to a improve yield correlation with plant nutrition.

A obtenção de plantas geneticamente modificadas tornou-se uma ferramenta biotecnológica de grande valor, contribuindo nos programas de melhoramento. Plantas transgênicas contendo genes de peptídeos antibacterianos são uma boa alternativa nos programas visando resistência às bactérias. A cecropina é um peptídeo isolado de inseto que apresenta ação antibacteriana contra diversas bactérias, entre elas, a Xylella fastidiosa causadora da clorose variegada dos citros (CVC). Com isso, este trabalho teve dois objetivos: 1) obter plantas transgênicas dos cultivares copa de laranja 'Hamlin' e laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 dirigido pelos promotores do gene da fenilalanina amônia-liase (PAL) clonado de citros (CsPP) e de Arabidopsis thaliana (AtPP), que conferem expressão gênica nos vasos do xilema. Obter plantas transgênicas de laranja 'Hamlin' e laranja 'Valência' com o gene GUS dirigido pelo promotor AtPP. 2) avaliar plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39 inoculadas com Xylella fastidiosa. As transformações genéticas foram realizadas através do co-cultivo de explantes, coletados de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais), com Agrobacterium tumefaciens. Para isso, utilizou-se a estirpe EHA-105 de A. tumefaciens contendo os vetores binários CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 ou AtPP-GUS/2201. A seleção das gemas transformadas foi feita em meio de cultura contendo o antibiótico canamicina, e para confirmação da transformação foram realizados teste histoquímico GUS e análises moleculares de PCR e 'Southern blot'. As gemas regeneradas foram microenxertadas em citrange 'Carrizo' ou laranja 'Hamlin' não transgênicos. Foi possível a obtenção de gemas transformadas para todos os cultivares, porém a regeneração de plantas ocorreu para laranja 'Hamlin' transformada com os vetores CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 e AtPP-GUS/2201. Para a avaliação da resistência de plantas transgênicas a Xylella fastidiosa foram selecionadas nove plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39, sendo que em quatros plantas o gene está sendo dirigido pelo promotor CsPP e nas outras cinco plantas pelo promotor CaMV 35S. Essas plantas foram multiplicadas por borbulhia e inoculadas mecanicamente com Xylella fastidiosa. Foram realizados isolamentos primários e quantificações bacterianas aos quatro e dez meses após a inoculação da bactéria para verificar a eficiência da inoculação e movimentação sistêmica da bactéria. Avaliações sintomáticas foliares também foram feitas aos oito meses após a inoculação. Os resultados dos isolamentos aos quatro meses mostraram que a inoculação da bactéria foi eficiente, já que houve crescimento bacteriano na maioria das placas com meio de cultura. A movimentação sistêmica da bactéria pôde ser detectada no isolamento aos dez meses. Das nove plantas avaliadas, uma planta transgênica apresentou crescimento populacional menor do que a da planta controle, indicando uma resistência ao patógeno. Nas avaliações sintomáticas foliares, as plantas transgênicas não diferiram do controle. / The production of genetically modified plants has become an important biotechnological tool, contributing with breeding programs. Transgenic plants expressing antibacterial peptides genes are a good alternative for breeding programs aiming to obtain bacterial resistance. Cecropin is a peptide isolated from an insect, which presents antibacterial effect against several bacteria including the citrus variegated chlorosis in which the causal agent is Xylella fastidiosa. This work had two objectives: 1) genetically transform 'Hamlin' and 'Pêra' sweet oranges scions with the cecropin MB39 gene under the control of the phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene promoter, cloned from citrus (CsPP) and from Arabidopsis thaliana (AtPP). This promoter confers gene expression within the xylem vessels. Obtain transgenic plants of 'Hamlin' and 'Valência' sweet oranges with the GUS gene under the control of the AtPP promoter. 2) Evaluate the resistance to Xylella fastidiosa of 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene. Co-culture of explants with Agrobacterium tumefaciens was used to genetically transform in vitro plants (epicotyl segments) and greenhouse plants (internodal segments). A. tumefaciens strain EHA-105 containing the CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 or AtPP-GUS/2201 binary vectors were used for transformation. Culture medium containing the antibiotic kanamycin was used for selection of transformed buds. Confirmation of transgenesis was carried out by GUS assays, PCR and Southern blot analysis. Regenerated buds were in vitro grafted on non-transgenic 'Carrizo' citrange or 'Hamlin' sweet orange rootstocks. Transformed buds were obtained for all cultivars, however plant regeneration was only obtained for 'Hamlin' sweet orange transformed with vectors CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 and AtPP-GUS/2201. Nine 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene were selected for the Xylella fastidiosa resistance experiment. Four transgenic lines were controlled by the CsPP promoter and the other five lines were controlled by the CaMV 35S promoter. These transgenic lines were graft propagated and mechanically inoculated with Xylella fastidiosa. Primary isolations and bacterial quantifications were conducted on the fourth and tenth month after inoculation in order to detect inoculation efficiency and bacterial systemic movement. Leaf symptom evaluations were executed eight months after inoculations. The bacterial isolation results from the fourth month indicated that inoculations were successful, since bacterial growth could be detected in the majority of culture mediums. Systemic movement of bacteria within the plants was detected after ten months. From the nine transgenic lines tested, one presented reduced pathogen growth when compared to controls indicating resistance. Transgenic lines did not differ from controls regarding leaf symptoms.

A bactéria Xylella fastidiosa causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Em 2000, foi concluído o seqüenciamento do genoma deste organismo, o primeiro de uma bactéria fitopatogênica, um fato que estimulou o estudo dos possíveis mecanismos de patogenicidade empregados pela bactéria para causar a doença em citros. X. fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Especula-se que a bactéria produza enzimas que degradem a membrana da pontuação, permitindo a colonização de novos vasos do xilema. A identificação de genes com similaridade de seqüência a genes de celulases, xilanases, pectinases e proteases, fomentou o presente estudo visando caracterizar os genes Xf - 810, Xf - 818 e Xf - 2708, similares a endoglicanases. Estes genes foram clonados em vetores de expressão e as respectivas proteínas foram produzidas em Escherichia coli. Através de ensaios enzimáticos as proteínas foram caracterizadas como endoglicanases (EC 3.2.1.4), que são celulases com mecanismo endoglicolítico de ataque às moléculas de celulose. Estas celulases hidrolisam carboximetil celulose, Avicel e xilana, enquanto as enzimas Xf - 810 e Xf - 818 hidrolisam a celulose amolecida com ácido. Estas celulases degradam mais eficientemente a carboximetil celulose em pH ácido (entre 5,2 e 5,6) e na temperatura de 65 °C. Coletivamente, estas celulases são capazes de degradar polímeros solúveis e insolúveis, enquanto a enzima Xf - 818, é capaz de degradar oligossacarídeos derivados da celulose, como celotetraose e celopentaose, apresentando ampla variação catalítica. Esta celulase possui capacidade de ligação à celulose microcristalina, denotando a funcionalidade de seu domínio ligador de celulose. Desenvolvemos um protocolo, empregando cromatografia de troca aniônica, afinidade por metal (níquel) e filtração em gel, eficiente na purificação da proteína Xf - 818 expressa heterologamente em E. coli com fusão hexahistidina à extremidade N-terminal. A caracterização enzimática destas proteínas, com a confirmação da atividade celulásica, fornece subsídios para uma eventual função das celulases durante a colonização do hospedeiro pela bactéria, pois são cataliticamente funcionais. Ademais, corrobora a similaridade destes genes, verificada durante o seqüenciamento do genoma de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as "amarelinho". The recent sequencing of its genome, achieved in 2000, was the first of a plant pathogen, a fact that stimulated the search for putative pathogenicity factors employed by this bacterium while infecting citrus trees. X. fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, being transmitted by sharpshooter vectors. Several authors argue that the bacterium produces enzymes to degrade plant cell, as a way to colonize new xylem vessels through pit membrane degradation. The identification of putative cellulases, xylanases, pectinases and proteases on X. fastidiosa genome, led us to carry out the present work to characterize the putative products of the endoglucanase genes Xf - 810, Xf - 818 and Xf - 2708. These genes were cloned into expression vectors and the proteins were produced in Escherichia coli. Based upon enzymatic assays, those proteins were characterized as endoglucanases (EC 3.2.1.4), which are cellulases able to promote the endo-hydrolysis of cellulose chains. These cellulases degraded carboxymethylcellulose, Avicel and xylan, while only Xf - 810 and Xf - 818 degraded acid swollen cellulose. The hydrolysis of carboxymethylcellulose was higher at acidic pH between 5.2 and 5.6) and at a temperature of 65 °C. As a group, these enzymes were able to degrade soluble and insoluble cellulose derivatives, while only the cellulase Xf - 818 could hydrolyze the cello-oligosaccharides cellotetrose and cellopentose, thus showing a high catalytic diversity. This protein also has the capacity to bind microcristalline cellulose, confirming the presence of a functional cellulose-binding domain. We set a protocol, employing anion exchange, metal affinity and gel filtration chromatography, to purify the Xf - 818 enzyme expressed in E. coli as a N-hexahistine fusion tag. The endoglucanase activity studied gives support for an eventual role of such cellulases during host colonization by the bacterium. Besides that, it agrees with similarities searches observed on the sequencing of X. fastidiosa genome.

A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis transformadas com os genes atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Pêra\' e \'Valência\', contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão \'Cravo\' para avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja \'Hamlin\' (H), sete de laranja \'Natal\' (N), cinco de laranja \'Pêra\' (P) e nove de laranja \'Valência\' (V). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10 repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30 dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha. / The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker. Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Natal\' and \'Pera\' containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different experiments including, eight \'Hamlin\' sweet orange plants (H), seven \'Natal\' sweet orange plants (N), five \'Pera\' sweet orange plants (P) and nine \'Valencia\' sweet orange plants (V). The experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration, and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants. Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom severity of citrus canker related to control plants.

Dentre os diversos fatores que afetam a produção e qualidade de frutos em plantas cítricas, os fatores fitossanitários destacam-se pela grande importância. Entre as diversas doenças que afetam a cultura dos citros, a Clorose Variegada dos Citros (CVC) é uma das mais severas e destrutivas, provocando tanto perdas em produção quanto em qualidade. Pelo fato desta doença ser causada por uma bactéria que se aloja no xilema, toda a dinâmica da água e nutrientes é afetada, resultando em uma série de sintomas visuais em diferentes graus. Buscou-se avaliar o estado nutricional de plantas cítricas sem sintomas vis uais de CVC e, com sintomas em diferentes níveis, através do Critério de Faixas de Suficiência, tradicionalmente utilizado na Citricultura Paulista e, através do Sistema Integrado de Diagnose e Recomendação, denominado pela sigla DRIS. O estudo foi realizado em pomares comerciais de laranjeira 'Pera' enxertada em limão 'Cravo', com sete anos de idade, no município de Araraquara - SP. Foram selecionadas em dois talhões, plantas com três níveis de CVC e plantas sem sintomas visuais, determinando-se os teores dos macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg, S) e dos micronutrientes (B, Cu, Fe, Mn e Zn) em folhas de ramos frutíferos, bem como produção de frutos de cada planta. A interpretação através do método DRIS, envolveu a utilização de um "software" aplicado especialmente para a cultura dos citros pelo Instituto Agronômico de Campinas - IAC, onde foi utilizado o método de cálculo proposto por Jones (1981). O DRIS foi eficiente, possibilitando a ordenação dos nutrientes, e, indicando deficiência nutricional para alguns nutrientes considerados adequados ou excessivos pelo Critério de Faixas de Suficiência. Independentemente da presença de sintomas de CVC, todas as plantas apresentaram baixos teores de Ca, resultando em diagnose de deficiência pelos dois critérios de interpretação; de modo geral, houve uma redução nos teores foliares de N e P, em plantas com sintomas mais severos. Com relação aos teores dos demais nutrientes não houve um padrão de decréscimo ou aumento em função da CVC. O "software" DRIS aplicado especialmente para a cultura dos citros pelo IAC, com a população de referência por ele utilizada, deve ainda sofrer ajustes, de acordo com as condições e objetivos do trabalho para melhor correlação com produtividade. / Among all factors which affect the yield and fruit quality from citric plants, pests and diseases are of outstanding importance. There are several pests and diseases wich affect the citrus crop. The citrus variegated chlorosis (CVC) is one of the most severe and destructive diseases affecting both yield and quality. Because this disease is caused by a xylem bacteria, the water and nutrients dinamics is affected resulting in a series of visual simptons of different intensities. There objective of this work was to evaluate the nutritional status os citrus plants without visual simptons of CVC and, with different levels of simptons of this disease. The Sufficiency Range Criteria, traditionally used in the state of São Paulo and the Diagnosis and Recommendation Integrated System (DRIS) were the methods used for leaf analysis interpretation. The study was carried out in commercial orchards of 'Pêra' sweet orange budded on 'Cravo' lemom, seven years old, in the region of Araraquara - SP. Plants with three levels of CVC and plants without visual simptons were selected from two plots. Concentrations of macronutrients (N, P, K, Ca, Mg, S) and micronutrients (B, Cu, Fe, Mn, Zn) were determined on leaves of fruit branches. Fruit production from each plant was measured. The analysis through the DRIS method involved the utilization of a software developed specially for the citrus crop by the Instituto Agronômico de Campinas - IAC, where the method proposed by Jones (1981) was used. The results showed that the DRIS was efficient in ranking the nutrients and indicating the nutritional defficiency for some nutrients considered adequate or excessive by the Sufficiency Range Criteria. Regardless the presence of CVC simptons, all plants show low foliar concentrations of Ca, wich resulted in a diagnose of defficiency by the two criteria of interpretation. There was a foliar concentration reduction of N and P, in plants with more severe simptoms. With respect to the foliar concentration of the other nutrients there was not observed a standard decrease or increase due to CVC. The local DRIS-Citros IAC software norms utilized should be adjusted according to the work conditions and objectives to a improve yield correlation with plant nutrition.

A bactéria Xylella fastidiosa 9a5c é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC) e responsável por grandes perdas econômicas na citricultura. O genoma de X. fastidiosa 9a5c foi totalmente seqüenciado e a sua análise permitiu identificar vários genes possivelmente envolvidos na patogenicidade/virulência da bactéria. Como os sintomas da CVC desenvolvemse um longo tempo após a infecção da planta pela bactéria e a severidade da doença têm sido associada à altas temperaturas, é possível que a expressão de fatores de patogenicidade/virulência seja dependente de densidade celular e/ou estresses térmicos. Desta forma, o crescimento in vitro da X. fastidiosa foi monitorado através da absorbância de suspensões bacterianas à 600nm (A600), número de unidades formadoras de colônias (UFC) e viabilidade celular, durante 16 dias de cultivo em meio PW modificado líquido, à 28 e 32ºC. Proteínas extracelulares foram extraídas e analisadas através da eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Bioensaios foram utilizados para verificar a produção de moléculas sinais por X. fastidiosa. Os resultados obtidos mostraram que o crescimento de X. fastidiosa à 32ºC, com base na A600, não diferiu do crescimento à 28ºC. No entanto, com base no número de UFCs e viabilidade celular, o crescimento de X. fastidiosa diferiu em função da temperatura, tempos de incubação e a interação entre esses fatores. X. fastidiosa produziu maior número de proteínas extracelulares à 32 do que à 28ºC, mostrando que a secreção de proteínas em X. fastidiosa é regulada pela temperatura de incubação. Várias proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa à 28 e 32ºC são moduladas durante o crescimento da bactéria. A maior parte das proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa são proteínas ácidas e de massa molecular aparente entre 20-60 kDa. X. fastidiosa não sintetizou moléculas de lactonas de homoserina aciladas (LHAs) reconhecidas pelo sistema repórter utilizado, mas sintetizou uma molécula extracelular em meio de cultivo, semelhante ao DSF produzido por X. campestris pv. campestris, capaz de restaurar a atividade da endoglucanase através do sistema repórter utilizado. A concentração desta molécula em meio PW modificado foi dependente da densidade de células de X. fastidiosa no meio. / The bacterium Xylella fastidiosa is the causal agent of the citrus variegated chlorosis (CVC) and is responsible for significant economic losses in citriculture. The genome of X. fastidiosa has been completely sequenced and revealed several genes probably involved in pathogenicity/virulence. Since CVC symptoms are develop a long time after infection of plant by the bacterium and the severity of the disease has been associated with high temperatures, it’s possible that the expression of pathogenicity/virulence factors is dependent on cellular density and/or temperature stresses. Thus, the growth of X. fastidiosa in modified liquid PW medium was measured based on the absorbance of suspensions at (A600), number of colony-forming units (CFU) and cellular viability, during 16 days at 28 and 32ºC. Extracellular proteins were extracted and analysed by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE). Bioassays were used to determine whether X. fastidiosa produces signal molecules involved in quorum perception. The results showed that temperatures of 28 and 32ºC did not affect the growth of the bacterium, based on A600. Temperatures of 28 and 32ºC, incubation times and the interaction of both factors affected bacterial growth based on CFU numbers and the cellular viability. X. fastidiosa produced higher number of extracellular proteins at 32 than at 28ºC, showing that protein secretion is dependent on growth temperature. Several extracellular proteins produced by X. fastidiosa at 28 and 32ºC were modulated the bacterial growth. Most of the extracellular proteins produced by X. fastidiosa were acidic with apparent molecular mass within 20-60 kDa. X. fastidiosa did not synthesize N-acyl homoserine lactone (AHL) recognizes by the reporter system used. However, it synthesized an extracellular molecule in modified PW medium, similar to DSF produced by X. campestris pv. campestris, which is able to restore endoglucanase activity by the reporter system. The concentration of this extracellular molecule produced by X. fastidiosa was dependent on cellular density.

El present treball tracta de nocions fonamentals en la nutrició d’arbres fruiters: (i) estimació de les pèrdues totals de nutrients (ii) diagnòstic nutricional (iii) solucions per desordres nutricionals (iv) estudi de transport de nutrients. Els estudis s’han realitzat a la zona de l’Ebre, Saragossa, al nord d’Espanya on el presseguer s’escull com a exemple d’arbre fruiter i la clorosi fèrrica com exemple de desordre nutricional. En alguns estudis, s’han fet servir plantes model crescudes en condicions controlades. En el primer capítol dels resultats, es fa una anàlisi de l’arbre sencer a mitjançant la quantificació de les pèrdues de nutrients en cada esdeveniment del cicle anual del presseguer, i de les quantitats emmagatzemades a les estructures permanents dels tres cultivars de presseguer: Calanda, Catherina y Babygold 5. Al segon capítol, es considera la clorosi fèrrica com el típic desordre nutricional de la zona, i es presenten avenços al seu diagnòstic a través de l’estudi de materials de l’arbre en èpoques fenològiques avançades (precoces), com gemmes en dormància i flors. Els resultats obtinguts indiquen que és possible predir la clorosi fèrrica utilitzant els materials vegetals indicats. El tercer capítol, tracta sobre la utilització de fertilitzants foliars per la correcció de la clorosi fèrrica, millorant el coneixement científic en l’ús d’aquests fertilitzants foliars. S’avalua la eficàcia d’un tractament foliar d’un compost de ferro estudiant la seva capacitat de penetració i reverdiment. En el quart capítol, es realitzen estudis sobre el transport de ferro en el teixit del xilema, a través d’anàlisis de proteòmica i metabolòmica, aportant avenços en la comprensió d’aquest teixit, responsable del transport de nutrients en plantes. El cinquè capítol tracta sobre consells i aspectes a considerar per part dels investigadors a l’hora de realitzar un seguiment de l’efecte d’un fertilitzant de ferro, i que inclouen: (i) el disseny experimental (ii) el seguiment de l’evolució de la correcció de la clorosi després d’una fertilització amb ferro, controlant la concentració de clorofil•la a la fulla, i (iii) l’anàlisi de la resposta de la planta després d’una fertilització amb ferro. A més, també s’analitzen les fases de la desaparició de la clorosi a la fulla, i l’observació d’altres paràmetres nutricionals a nivell de fulla. / El presente trabajo trata sobre nociones fundamentales en la nutrición de árboles frutales: (i) estimación de las pérdidas totales de nutrientes (ii) diagnostico nutricional (iii) soluciones para desordenes nutricionales (iv) estudio del transporte de nutrientes. Los estudios se han realizado en la zona del Ebro, Zaragoza, en el norte de España dónde el melocotonero se escoge como ejemplo de árbol frutal, y la clorosis férrica como ejemplo de desorden nutricional. En algunos estudios, se han usado plantas modelo crecidas en condiciones controladas. En el primer capítulo de los resultados, se realiza un análisis del árbol entero mediante la cuantificación de las pérdidas de nutrientes en cada evento del ciclo anual del melocotonero, y de las cantidades almacenadas en las estructuras permanentes de tres cultivares de melocotonero: Calanda, Catherina y Babygold 5. En el segundo capítulo, se considera la clorosis férrica como el típico desorden nutricional de la zona, y se presentan avances en su diagnostico mediante el estudio de materiales del árbol en épocas fenológicas avanzadas (precoces), tal como yemas en dormancia y flores. Los resultados adquiridos indican que es posible predecir la clorosis férrica usando los materiales vegetales indicados. El tercer capítulo, trata sobre del uso de fertilizantes foliares para la corrección de la clorosis férrica, mejorando el conocimiento científico sobre el uso de dichos fertilizantes. Se evalúa la eficacia de un tratamiento foliar de un compuesto de hierro estudiando su capacidad de penetración y reverdecimiento. En el cuarto capítulo, se realizan estudios sobre el transporte de hierro en el tejido de xilema a través de análisis de proteomica y metabolómica, aportando avances en la comprensión de dicho tejido, responsable de transporte de nutrientes en plantas. El quinto capítulo trata sobre consejos y aspectos a considerar por parte de los investigadores a la hora de realizar un seguimiento del efecto de un fertilizante de hierro, y que incluyen: i) el diseño del experimento; ii) el seguimiento de la evolución de la corrección de la clorosis después de una fertilización con hierro, controlando la concentración de clorofila en la hoja; y iii) el análisis de la respuesta de la planta después de una fertilización con hierro. Asimismo, también se analizan las fases de la desaparición de la clorosis en la hoja, y la observación de otros parámetros nutricionales a nivel de hoja. / This work deals with fundamental aspects of fruit tree nutrition, including the following: (i) estimation of total nutrient requirements; (ii) nutritional diagnostics; (iii) remediation for nutritional disorders; and (iv) understanding of nutrient transport. Field studies were carried out in the Ebro river basin, Zaragoza, Northern Spain, were peach tree was taken as an example of fruit tree and Fe chlorosis as an example of nutritional disorder. In some studies, model plants grown in controlled environments have also been used. In the first chapter of Results part, whole tree analysis was carried out by quantifying the amounts of nutrients removed at each event of the peach tree annual cycle, as well as the amounts stored in the permanent tree structures, in three different peach tree cultivars. In the second chapter, Fe chlorosis was taken as a typical nutrient disorder in the region, and we show advances in its diagnosis by studying the possibility of using tree materials in early tree phonological stages. Results found indicate that it is possible to carry out the prognosis of Fe chlorosis using early materials such as buds and flowers. The third chapter deals with the correction of iron chlorosis, in an attempt to improve the scientific background for foliar fertilizer practices. We evaluated the success of treatments with a Fe compound by studying the capacity for penetration and re-greening. In the fourth chapter, studies on the transport of Fe into the xylem tissue were carried out by metabolomic and proteomic analysis, opening the way for advancing the understanding of nutrient transport in this fruit tree compartment. The fifth chapter discusses advices and aspects that researchers should take in consideration when assessing the effect of Fe fertilizers, including the following: i) design of Fe-fertilization experiments; ii) assessment of chlorosis recovery upon Fe-fertilization by monitoring leaf chlorophyll; and iii) analysis of the plant responses upon Fe-fertilization. The phases of leaf chlorosis recovery and the control of other leaf nutritional parameters were discussed.