A abobrinha de moita (Cucurbita pepo L.), espécie pertencente à família Cucurbitaceae, apresenta significativa participação na produção mundial e brasileira desta família de plantas. Porém, como em toda cultura de importância econômica, as cucurbitáceas apresentam problemas fitossanitários causados por diferentes agentes etiológicos. Na produção brasileira de abóboras, já foi constatada a presença de 8 vírus, dentre eles os potyvirus PRSV-W (Papaya ringspot virus-type W) e ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) e o tospovirus ZLCV (Zucchini lethal chlorosis virus) têm sido considerados os mais importantes pela predominância em diversas regiões produtoras de cucurbitáceas no país e pelos consideráveis prejuízos que geralmente causam à produção. Considerando que a maioria dos estudos epidemiológicos existentes sobre estas três viroses são poucos e fragmentados, percebe-se que não há estudos que abordam em conjunto todos os parâmetros epidemiológicos de tais vírus. Assim, os objetivos deste trabalho foram estudar o progresso temporal e espacial destas três viroses e verificar a relação entre a epidemiologia das mesmas em campo de abobrinha de moita, além de melhor entender o patossistema em que a clorose letal (causada pelo ZLCV) está inserida Para isso, foram conduzidos experimentos com abobrinha de moita Caserta nos campos experimentais dos Departamentos de Fitopatologia e Nematologia (DFN) e Departamento de Genética (DGN) da Esalq/USP. Primeiramente foram conduzidos em 2009 dois experimentos simultâneos nas áreas do DFN e DGN para estudar a epidemiologia isolada da clorose letal acompanhada da dinâmica populacional do tripes Frankliniella zucchini, vetor deste vírus. Em seguida, em épocas diferentes 3 experimentos foram conduzidos em 2010 com o intuito de comparar as epidemiologias da clorose letal e dos mosaicos comum e amarelo, estes últimos causados por PRSV-W e ZYMV, respectivamente. Nos experimentos apenas com a clorose letal no ano de 2009, o modelo monomolecular foi o que melhor se ajustou aos dados de incidência e através das análises espaciais detectou-se agregação da doença ao final dos dois experimentos. Nos 3 experimentos realizados em 2010, variações na incidência, no ajuste do modelo e no comportamento espacial de cada virose foram freqüentes. Para a clorose letal, o modelo monomolecular ofereceu melhor ajuste apenas na 3ª época de plantio. Nas duas primeiras o modelo gompertz apresentou maior coeficiente de determinação. No comportamento espacial, novamente agregação da doença foi detectada ao final do ciclo da cultura. Para o mosaico amarelo, os modelos que melhores se ajustaram na 1ª, 2ª e 3ª épocas de plantio, foram o logístico e o monomolecular (este nas duas últimas), respectivamente. O padrão espacial desta doença foi ao acaso quando da baixa incidência da doença e agregado nos casos em que elevada incidência ocorreu. Já o mosaico comum apresentou a menor incidência nas 3 épocas. O modelo logístico foi o que melhor se ajustou em todas as épocas e a doença apresentou comportamento espacial ao acaso nos três experimentos. Nos levantamentos do tripes vetor do ZLCV, verificou-se preferência do mesmo por plantas sintomáticas e consideráveis correlações do número de insetos coletados com a incidência da clorose letal. / The zucchini squash (Cucurbita pepo L.) belonging to the Cucurbitaceae family, has a good share of world and brazilian output. However, as in every plants of economically important, cucurbits have problems caused by different etiological agents. In the Brazilian production of zucchini squash, already confirmed the presence of 8 viruses, including the potyviruses PRSV-W (Papaya ringspot virus-type W) and ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) and the tospovirus ZLCV (Zucchini lethal chlorosis virus) have been considered the most important viruses by the predominance in several cucurbits producing regions in the Brazil and the considerable damage on production. Whereas the most of the existing epidemiological studies about these three viruses are few and fragmented, it is clear that there are no studies that deal together all the epidemiological parameters of such viruses. The objectives of this work were to study the temporal and spatial progress of these three viruses and the relation between the epidemiology of these viruses in the same field of zucchini squash in addition to better understand the lethal chlorosis pathosystem (caused by ZLCV). Trials were carried out with zucchini squash \'Caserta in the experimental fields of the Departments of Plant Pathology and Nematology (DPP) and Department of Genetics (DGN) at Esalq/USP. The firsts were conducted in 2009 simultaneously in DPP and DGN to study the epidemiology of lethal chlorosis only and to study the population dynamic of thrips Frankliniella zucchini, the vector of this virus. In 2010 three experiments were carried out in different growing seasons in order to compare the epidemiology of the lethal chlorosis, yellow mosaic and common mosaic caused by ZLCV, PRSV-W and ZYMV, respectively. In the experiments with the lethal chlorosis in 2009, the monomolecular model was the best fit to the incidence data and spatial analysis indicated aggregation of the disease at the end of both experiments. In three experiments carried out in 2010, variations in incidence, in the fit of the model and in the spatial distribution of each virus were frequents. For lethal chlorosis, the monomolecular model provided a better fit only in the 3rd growing season. In the first and second growing seasons Gompertz model had the best coefficient of determination. In the spatial distribution, aggregation of disease was detected at the end of the crop cycle again. For yellow mosaic, the models that best fit in the 1st, 2nd and 3rd planting dates were the logistic and monomolecular (this in the last two) respectively. The spatial pattern of this disease were randomly when the disease incidence was low and aggregated when the disease incidence was high. The common mosaic had the lowest incidence in all three seasons. The logistic model was the best fit in all growing seasons and the disease showed a spatial random distribuctions in all experiments. The thrips vector of ZLCV prefer symptomatic plants and good correlations between the number of insects collected with the incidence of lethal chlorosis was found.

O gênero Xylella é composto de uma única espécie, Xylella fastidiosa, bactéria Gram-negativa, não flagelada, que coloniza o xilema de uma diversidade de plantas cultivadas e silvestres em várias partes do mundo. Em algumas dessas plantas, a bactéria é considerada agente causal de doenças, como a Clorose Variegada do Citros em laranjeiras, a Doença de Pierce das videiras e escaldadura da folha de cafeeiro. Onze diferentes cepas de X. fastidiosa, isoladas de distintos hospedeiros, já tiveram seus genomas sequenciados, entre essas, as cepas 9a5c, isolada de laranjeira, e Temecula 1, isolada de videira. Análises desses genomas indicam uma razoável variabilidade entre suas respectivas sequências e evidenciam vários genes associados a mecanismos de virulência e patogenicidade desta bactéria. No presente trabalho descrevemos o sequenciamento, a montagem e a anotação dos genomas das cepas U24d e Fb7, isoladas de laranjeiras, e da cepa 3124 isolada de cafeeiro, os quais apresentam, respectivamente 2.681.334 pb, 2.733.974 pb e 2.748.594 pb. Destas, apenas a cepa U24d apresenta um plasmídeo, o qual é idêntico ao pXF51 previamente identificado na cepa 9a5c. O genoma da cepa U24d é praticamente colinear ao genoma da cepa 9a5c enquanto que os genomas das cepas Fb7 e 3124 apresentaram maior colinearidade com a cepa Temecula1. Entre as diversas alterações encontradas nas análises comparativas destes genomas, destacamos a inserção no gene pilQ verificada no genoma da cepa U24d. Essa mutação causa ausência do pilus do tipo IV com consequente deficiência na motilidade twitching, sendo que plantas infectadas com a cepa U24d apresentam sintomas localizados restritos ao ponto de inoculação. Na cepa Fb7, detectamos a ausência de formação de biofilme no cultivo in vitro possivelmente devido ausência da expressão dos transcritos de mrkD e pspA, que codificam respectivamente adesina do pilus curto e adesina similar à hemaglutinina. Postulamos que estes genes não são expressos em decorrência de um defeito na via de sinalização de DSF (Fator de Sinalização Difusível) reflexo de uma mutação em rpfC no genoma de Fb7. Assim como as demais cepas de X. fastidiosa, também os genomas de U24d, Fb7 e 3124 apresentaram elevado conteúdo de Elementos Genéticos Móveis (EGM), que aparecem em maior número nas cepas sul-americanas. Os estudos do pangenoma de X. fastidiosa mostraram que essa espécie tem um genoma aberto e grande parte dos genes de EGMs correspondem a genes acessórios. A grande quantidade de EGMs em X. fastidiosa pode estar relacionada a falta do sistema CRISPR/cas completo, um provável resultado de eventos de erosão do genoma desta espécie. A inferência filogenética por MSLA mostrou uma clara distinção dos grupos de cepas da América do Norte em relação às do Sul, sugerindo a ocorrência de mais eventos de recombinações genéticas nas cepas sul-americanas, provavelmente pela falta de isolamento geográfico. Assim, é possível que as cepas norte e sul-americanas sofreram divergência alopátrica e simpátrica, respectivamente. / The genus Xylella consists of a single species, Xylella fastidiosa, a Gram-negative and non-flagellated bacterium that colonizes the xylem of a diversity of cultivated and wild plants in several parts of the world. In some of these plants, this bacterium is considered causal agent of diseases such as the Citrus Variegated Cholorosis in orange trees, Pierce\'s Disease of grapevines and coffee leaf scald. Eleven different strains of X. fastidiosa isolated from different hosts had their genomes sequenced, including 9a5c and Temecula1 strains, respectively isolated from orange tree and grapevine. Analyses of these genomes indicate a reasonable variability in their sequences and showed several genes associated with pathogenicity and virulence mechanisms of this bacterium. In this work we describe the genome sequencing, assembly and annotation of the strains U24d and Fb7, isolated from orange trees, and 3124 isolated from coffee, which have, respectively, 2,681,334 bp, 2,733,974 bp and 2,748,594 bp. Of these, only strain U24d has a plasmid, identical to pXF51 from strain 9a5c. The genome of U24d strain is almost collinear to the genome of strain 9a5c while the genomes of strains Fb7 and 3124 had higher collinearity to Temecula1 strain. Among many changes found in the comparative analysis of these genomes, we highlight an on insertion in pilQ gene that was found in U24d strain genome. This mutation causes lack of type IV pilus with a consequent deficiency in twitching motility. Moreover orange trees infected with U24d strain showed localized symptoms near to the inoculation point. We verified that Fb7 strain does not form biofilm in vitro possibly due to the absence of expression of mrkD and pspA transcripts, which encode, respectively, a short pilus adhesin and a hemagglutinin-like adhesin. We postulate that these genes are not expressed due to a defect in the signaling pathway of DSF (Diffusible Signal Factor) reflecting a mutation on rpfC in the Fb7 genome. Similarly to other X. fastidiosa strains, the genomes of U24d, Fb7 and 3124 also showed high content of mobile genetic elements (MGE), which appear in larger numbers in South American strains. Pan genome studies of X. fastidiosa showed that this species has a open genome and that most of MGE genes correspond to accessory genes. The large number of MGE in X. fastidiosa may be related to the lack of a complete system CRISPR/cas, likely a result of erosion events of the genome of this species. The phylogenetic reconstruction by MLSA showed a clear distinction between groups of strains from North and South America, suggesting the occurrence of more recombination events in South American strains, probably due to lack of geographical isolation. Thus it is possible that North and South American strains underwent allopatric and sympatric divergence, respectively.

Este trabalho foi realizado com o objetivo de identificar cigarrinhas vetoras ou potenciais vetoras de Xylella fastidiosa Wells et al. em pomares cítricos do litoral norte da Bahia, determinando-se as espécies predominantes com ênfase na subfamília Cicadellinae. Os levantamentos foram conduzidos no período de março/2002 a fevereiro/2003, em cinco propriedades do litoral norte do Estado da Bahia, nos municípios de Alagoinhas, Inhambupe e Rio Real, em pomares de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] cv. Pêra, enxertada sobre limão cravo (Citrus limonia Osbeck) com idade de 7 a 9 anos. Em cada pomar, foram instalados 15 cartões adesivos amarelos de 8,5 X 11,5 cm, dispostos em um espaçamento de 40x40 m. Os cartões foram amarrados a 1,5 m de altura em ramos da face norte, na periferia da copa, sendo substituídos periodicamente. Também foram realizadas avaliações periódicas na vegetação rasteira presente nas entrelinhas dos pomares através de rede de varredura, amostrando-se, em cada avaliação, cinco pontos escolhidos aleatoriamente e efetuando-se 30 redadas por ponto. Os dados de coleta foram submetidos a uma análise faunística, calculando-se os índices de constância, freqüência, abundância, dominância, diversidade, eqüitabilidade e similaridade. Coletaram-se 1860 espécimes pertencentes a 54 espécies de sete famílias da subordem Auchenorrhyncha, sendo a maioria deles das famílias Cicadellidae (84,3%) e Membracidae (14,2%). Um maior número de espécies de Auchenorrhynca foi observado em pomar vizinho a mata nativa pouco degradada. A subfamília Cicadellinae, que inclui os vetores de X. fastidiosa, foi a mais representativa em número de espécies (15) e de indivíduos coletados (63,92%). Observou-se variação na composição de espécies de Cicadellinae dependendo do método e local de amostragem, evidenciando-se a existência de dois grupos de potenciais vetores habitando a copa das laranjeiras e a vegetação rasteira. Acrogonia flagellata Young, A. citrina Marucci & Cavichioli, Homalodica sp. e Cicadellini sp.1 predominaram nos cartões adesivos amarelos (árvores cítricas), enquanto que Hortensia similis (Walker) e Erythrogonia dubia (Medler) foram dominantes na rede de varredura (vegetação rasteira). Entre as espécies de Cicadellinae já conhecidas como vetoras de X. fastidiosa em citros, apenas A. citrina, Bucephalogonia xanthophis (Berg) e Ferrariana trivittata (Signoret) foram observadas, sendo que as duas últimas foram de ocorrência acidental na vegetação rasteira. Entre os novos potenciais vetores, A. flagellata, Homalodisca sp. e Cicadellini sp.1 são espécies predominantes nos pomares cítricos do litoral norte da Bahia, devendo ser investigadas quanto à capacidade de transmissão de X. fastidiosa para citros. / This study was carried out to identify vectors or potential vectors of Xylella fastidiosa Wells et al. in citrus groves of the north coast of Bahia State, Brazil, based on a faunistic survey and determination of predominant sharpshooter leafhoppers (subfamily Cicadellinae). The survey was carried out from March/2002 to February/2003 in five old sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck, cv. Pêra, grafted on rangpur lime (Citrus limonia Osbeck); 7-9 years old] groves of northeastern Bahia State, located in Alagoinhas, Inhambupe and Rio Real. Fifteen yellow sticky cards (8,5 X 11,5 cm) were installed 40x40 m apart in each grove, hanged at the height of 1.5 m on the upper north side of citrus canopies. Cards were replaced monthly or fortnightly. A sweep net was periodically used to sample leafhoppers in the herbaceous weeds inside the groves, by selecting five points at random and performing 30 sweeps in each point (sample unit). Data was uses to calculate indices of constancy, frequency, abundance, dominance, diversity, equitability and similarity. A total of 1860 specimens of 54 species belonging to 7 families of suborder Auchenorrhyncha were collected, most of them in the families Cicadellidae (84,3%) and Membracidae (14,2%). A larger number of species was observed in a grove located nearby a non-degraded native wood. The subfamily Cicadellinae, which includes the sharphooter vectors of X. fastidiosa, showed the largest number of species (15) and specimens (63,92%). There was a variation in Cicadellinae species composition depending upon the sampling method, which indicates that two distinct groups of potential sharpshooter vectors are inhabiting the citrus canopy and the weedy vegetation. Acrogonia flagellata Young, A. citrina Marucci & Cavichioli, Homalodica sp. e Cicadellini sp.1 predominate in the yellow sticky cards hanged on the citrus canopy, whereas Hortensia similis (Walker) e Erythrogonia dubia (Medler) were dominant species on weeds. Among the Cicadellinae species already known as vectors of X. fastidiosa in citrus, only A. citrina, Bucephalogonia xanthophis (Berg) e Ferrariana trivittata (Signoret) were found; the two latter species were accidentally trapped by sweep net in the weedy vegetation. Among the new potential vectors, A. flagellata, Homalodisca sp. e Cicadellini sp.1 are predominant species in citrus groves of the north coast of Bahia and should be tested with respect to their ability to transmit X. fastidiosa to citrus.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram.negativa, fastidiosa, que vive limitada ao xilema de plantas causando várias doenças de importância econômica como a doença de Pierce em videiras nos Estados Unidos e a Clorose Variegada dos Citros (CVC) no Brasil. A CVC tem afetado severamente a citricultura do estado de São Paulo pondo em risco milhares de empregos e milhões de dólares em geração de divisas. O sequenciamento do genoma de X. fastidiosa revelou genes envolvidos em possíveis mecanismos de patogenicidade dessa bactéria, entre eles um operon possivelmente envolvido na produção de um exopolissacarídeo extracelular denominado goma fastidiana. Supõe.se que esse exopolissacarídeo seja o responsável pela manutenção dos biofilmes bacterianos que causam a oclusão dos vasos xilemáticos levando ao surgimento dos sintomas da CVC. Para estudar esse operon, denominado operon gum, foram construídos vetores para a inativação dos genes gumB, gumD e gumF por duas estratégias: mutagênese por inserção.deleção e mutagênese por troca alélica. A mutagênese por inserção.deleção envolve a integração via recombinação homóloga com uma permuta.de um plasmídeo contendo uma cópia truncada do gene alvo. A mutagênese por troca alélica, por sua vez, envolve duas permutas e se caracteriza pela troca do gene alvo selvagem por uma cópia interrompida por um marcador de seleção. Nenhum mutante gum foi obtido usando.se a estratégia de troca alélica, todavia, mutantes para os genes gumB e gumF foram obtidos com sucesso pela estratégia de mutagênese por inserção.deleção. Nenhum mutante para o gene gumD foi obtido, sugerindo que essa mutação possa ser letal para a célula. A análise de células e colônias desses mutantes crescidos em meio sólido ou em suspensão não mostrou diferenças morfológicas em relação a linhagem selvagem. A inativação dos genes gumB e gumF não influenciou a capacidade de X. fastidiosa se aderir a vidro. Com o uso do gene repórter CAT, que codifica para a enzima clorafenicol acetil transferase a qual confere à bactéria resistência ao antibiótico clorafenicol foi possível verificar que a glicose não influencia na expressão desse operon ao nível de transcrição. Com o uso desse gene reporter, também foi possível identificar uma região transcrita a partir de um promotor não caracterizado, localizada na fita antisenso do operon gum. A comparação do perfil cromatográfico de proteínas solúveis totais dos mutantes e da linhagem selvagem mostrou diferenças significativas nesses pefis, indicando um efeito pleiotrópico dessas mutações. O estudo da função dos genes gumB e gumF na patogenicidade de X. fastidiosa foi impossibilitado por se ter verificado recentemente que a linhagem usada na construção dos mutantes não coloniza a planta eficientemente para a indução de sintomas em citros e tabaco em condições experimentais após inoculação mecânica. / Xylella fastidiosa is a fastidious, xylem restricted, gram.negative bacteria, that causes several economically important diseases as Pierce's disease of grapevine in USA and the Citrus Variegated Chlorosis (CVC) in Brasil. CVC affects severely the São Paulo State citriculture jeopardizing thousands of jobs and millions of dollars of incomes. The genome sequence of X. fastidiosa has revealed several genes possibly involved in the pathogenicity mechanisms of this bacterium, among them, an operon containing nine genes possibly involved in the synthesis of an exopolisaccharide named fastidian gum. This gum is possibly involved in the bacterial biofilm maintenance that causes the xylem occlusion leading to CVC symptoms development. To study this operon, named gum operon, vectors were constructed to inactivate the gumB, gumD and gumF genes by two strategies, insertion.duplication mutagenesis and allelic exchange mutagenesis. The insertion.duplication mutagenesis involves the integration a whole plasmid containing a truncated copy of the target gene by homologous recombination with one crossing over. The allelic exchange mutagenesis involves homologous recombination with two crossing overs that substitutes the wild.type copy of the target gene by a truncated copy interrupted by a selectable marker gene. No gum mutant was obtained using the allelic exchange strategy; however gumB and gumF mutants were obtained by insertion-duplication mutagenesis strategy. GumD mutant was not obtained, suggesting that the mutation in this gene is lethal to the cell. Analysis of cells and colonies of these mutants growing in solid media and in suspension hasn't reveal any morphological difference to the wild.type strain. The disruption of the gumB and gumF genes does not influenced the adhesion capacity of X. fastidiosa to the glass, used as a substrate. Using the reporter gene CAT, wich codes for cloramphenicol acetil transferase enzime confering resistance to cloramphenicol, we verified that glucose has no influence in the expression of this operon at the transcription level. Using this reporter gene, we also identified a transcribed region directed by a non characterized promoter, localized in the antisense strand of the gum operon. A comparison between the soluble protein profile of the mutants and the wild.type strain, obtained by liquid chromatography, showed significative differences, indicating a pleiotropic effect of these mutations. The study of the function of the gumB and gumF genes in the pathogenicity of X. fastidiosa was not concluded because we verified recently that the strainm, used to generate the mutants, do not colonize the plants efficiently to induce symptoms in citrus and tobacco plants after mechanical inoculation.

A clorose variegada dos citros (CVC) é uma das principais doenças que afeta a citricultura brasileira, causada pela bactéria Xylella fastidiosa (Wells), que coloniza o xilema de culturas de interesse econômico, além de plantas ornamentais e daninhas, sendo transmitida por cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). A compreensão do patossistema CVC é fundamental para planejar táticas eficazes de controle da doença. Entretanto, as pesquisas sobre interações patógeno-planta-vetores são escassas, devido à falta de plantas hospedeiras adequadas para ensaios de transmissão da bactéria, visto que citros não é um bom hospedeiro experimental. Assim, nesta pesquisa objetivou-se identificar espécies herbáceas que permitam a colonização sistêmica da estirpe de X. fastidiosa de citros, e avaliar seu uso como plantas-fonte e plantas-teste (indicadoras) em testes de transmissão por Bucephalogonia xanthophis (Berg). Para tal foram escolhidas as plantas Bidens pilosa L., Catharanthus roseus L., Citrus sinensis (L.) Osbeck, Medicago sativa L., Nicotiana tabacum L., Ocimum basilicum L., Parthenium hysterophorus L., Phaseolus vulgaris L., Sida rhombifolia L. e Solanum americanum Mill, que foram inoculadas mecanicamente com isolados de X. fastidiosa de citros e posteriormente avaliadas quanto à infecção por isolamento primário e reação de cadeia da polimerase (PCR). As espécies que permitiram colonização bacteriana foram posteriormente avaliadas em experimentos de transmissão por B. xanthophis, sendo divididos em duas etapas. Na primeira delas, variaram-se as espécies de plantas-fonte para aquisição da bactéria e fixou-se C. roseus como planta-teste para inoculação. Na segunda etapa, fixou-se C. roseus como planta-fonte e variaram-se as espécies de planta-teste. Durante os experimentos de transmissão, foram avaliados dois parâmetros biológicos de B. xanthophis: mortalidade (%) e volume de honeydew excretado (medida indireta de ingestão). Entre 30 a 90 dias após a inoculação, as plantas-testes foram analisadas quanto à infecção bacteriana por meio de PCR e isolamento. As inoculações mecânicas mostraram colonização sistêmica e multiplicação de X. fastidiosa em sete espécies vegetais (B. pilosa, C. roseus, C. sinensis, M. sativa, N. tabacum, O. basilicum e S. americanum), com maiores taxas de infecção e populações bacterianas em C. roseus e N. tabacum. As espécies C. roseus, M. sativa e O. basilicum, quando usadas como plantas-fonte de X. fastidiosa, propiciaram maiores volumes de excreção e menores taxas de mortalidade (15, 20 e 20%) da cigarrinha após 48 h de acesso à aquisição da bactéria. No experimento de transmissão com variação de espécies de plantas-teste, detectou-se a inoculação pelo vetor em C. roseus, M. sativa, O. basilicum e S. americanum, com maior proporção de plantas positivas (cerca de 20%) para as duas primeiras. Dentre essas espécies, C. roseus e M. sativa são as indicadoras mais adequadas para ensaios de transmissão de X. fastidiosa por B. xanthophis, sendo a primeira também adequada como planta-fonte. / Citrus variegated chlorosis (CVC) is a major disease that affects the Brazilian citrus industry, caused by the xylem-limited bacterium Xylella fastidiosa (Wells), which colonizes several crop plants, ornamentals and weeds, and is transmitted by sharpshooter leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). A better understanding of the CVC pathossystem is critical for developing effective tactics to control the disease. However, research on the relationships among pathogen strains, host plants and insect vectors associated with CVC is scarce, partly because of the lack of adequate host plants for transmission assays, since citrus is not a suitable experimental host for this purpose. Thus, the present study aimed to identify herbaceous plants that allow systemic colonization of citrus strains of X. fastidiosa, and evaluate them as source and test (indicator) plants in transmission assays by the sharpshooter Bucephalogonia xanthophis (Berg). Ten plant species, Bidens pilosa L., Catharanthus roseus L., Citrus sinensis (L.) Osbeck, Medicago sativa L., Nicotiana tabacum L., Ocimum basilicum L., Parthenium hysterophorus L., Phaseolus vulgaris L., Sida rhombifolia L. and Solanum americanum Mill were mechanically inoculated with citrus isolates of X. fastidiosa and then evaluated for bacterial infection by primary isolation in culture medium and polymerase chain reaction (PCR). Those plant species that allowed bacterial colonization were later evaluated in two transmission experiments by B. xanthophis, In the first experiment, different plant species were tested as source plants for bacterial acquisition and transmission to C. roseus (test plant). In the second one, C. roseus was used as a source plant and different plant species were evaluated as test (indicator) plants for bacterial inoculation. During the transmission experiments, two biological parameters of B. xanthophis were evaluated: mortality rate (%) and honeydew excretion (as an indirect measure of ingestion). Between 30 and 90 days after inoculation, the test plants were analyzed for X. fastidiosa infection by PCR and culturing. The mechanical inoculation experiments showed systemic colonization and multiplication of X. fastidiosa in seven plant species (B. pilosa, C. roseus, C. sinensis, M. sativa, N. tabacum, O. basilicum and S. americanum), with higher rates of infection and bacterial populations of C. roseus and N. tabacum. The species C. roseus, M. sativa and O. basilicum, when used as source plants of X. fastidiosa, allowed higher ingestion (honeydew excretion) rates and lower mortality (15, 20 and 20%) of B. xanthophis during the 48-h acquisition access period. In the transmission experiment with different species of test plants, X. fastidiosa inoculation by the vector was detected in C. roseus, M. sativa, O. basilicum and S. americanum, with a higher rate of infected plants (about 20%) in the former two species. Among the herbaceous plant species evaluated in this research, C. roseus and M. sativa are the most appropriate indicator hosts of X. fastidiosa infection for transmission assays by B. xanthophis, whereas the former species is also suitable as a source plant.

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Bacteriocinas são proteínas antimicrobianas produzidas por bactérias com importante papel na ecologia microbiana. Neste trabalho foram avaliados a produção e os efeitos destas proteínas numa fração da comunidade bacteriana de citros, pertencente aos gêneros Methylobacterium e Curtobacterium, isolada de Citrus sinensis (laranjeiras - plantas saudáveis, sintomáticas para CVC, assintomáticas para CVC) e Citrus reticulata (tangerina). Foi observada, para ambos os gêneros, uma alta freqüência de isolados produtores de bacteriocinas na comunidade endofíticas avaliada. Foi observado que esta freqüência foi maior em populações provenientes de plantas assintomáticas para CVC e em plantas de tangerina. Em Methylobacterium, as populações obtidas de plantas de tangerina e de plantas sintomáticas para CVC apresentaram uma maior freqüência de isolados produtores de bacteriocinas. Por outro lado, a população de Curtobacterium provenientes de plantas sintomáticas para CVC, apresentou a menor freqüência de isolados produtores bacteriocina. Proteínas de 3 isolados de C. flaccumfaciens foram parcialmente caracterizadas bioquimicamente, permitindo a sua classificação como bacteriocinas que foram denominadas de endoficinas. Uma destas bacteriocinas, a endoficina L foi escolhida para ser melhor caracterizada. A endoficina L parcialmente purificada apresentou um peso molecular estimado de 14 kDa e atividade in gel, e atingiu seu nível máximo de produção na fase estacionária e foi ativa contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo patógenos humanos e de plantas. Para a caracterização do gene envolvido na produção desta bacteriocina uma biblioteca, em cosmídeo, de fragmentos de DNA com 40 kb foi construída e um clone exibindo atividade bacteriocinogênica foi subclonado e parcialmente seqüenciado. Esta análise revelou um operon de 2,0 kb consistindo de pelo menos três genes preditos envolvidos na produção desta bacteriocina. Análises in silico sugeriram que a endoficina L deva ser uma bacteriocina do tipo toxina que pode ser uma candidata em potencial como agente no controle biológico de X. fastidiosa e outros fitopatógenos. Os resultados obtidos sugerem que, quando C. flaccumfaciens produtores de bacteriocinas estão presentes em plantas de citros podem inibir X. fastidiosa. Por outro lado, o crescimento de X. fastidiosa parece ser favorecido pela presença de Methylobacterium a qual produz bacteriocinas contra Curtobacterium. A primeira interação poderia ser mediada por bacteriocinas como a endoficina L. Sugere-se uma interação cíclica entre tais microrganismos. O conhecimento da interação entre tais bactérias endofíticas representa um avanço no entendimento dos aspectos ecológicos da interação planta-microrganismo. / Bacteriocins are antimicrobial proteins produced by bacteria, which play a role in microbial ecology. In this work we examined the bacteriocin production and it effects under a citrus bacterial communities belonged to Curtobacterium and Methylobacterium genera isolated from Citrus sinensis (sweet orangeuninfected, symptomatic, CVC-asymptomatic) and Citrus reticulata (tangerine) . We found a high levels of bacteriocin production for both genera, these frequencies were higher in asymptomatic and tangerine plants. The highest production frequencies for Methylobacterium strains were from tangerine and symptomatic plants. C. flaccumfaciens strains from symptomatic plants presented the lowest bacteriocin frequency. Proteins from three strains of C. flaccumfaciens were partially biochemically characterized and further classified as bacteriocins termed endophycins. One of them the endophycin L, was picked for deep investigation. The endophycin L partially purified had a molecular weight estimated of 14 kDa and exhibited in gel activity. Endophycin L production started at the exponential phase and reached its highest point during the stationary phase. It was capable of inhibiting the growth of Gram-positive and Gram-negative bacteria, incluiding several human and plant pathogens. In order to characterize the related to this bacteriocin production. One cosmid clone containing a 40-Kb fragment from a genomic library of C. flaccumfaciens was selected for its bacteriocinogenic ability The fragment was subcloned and DNA sequencing revealed a 2-kb operon consisting of at least three putative genes related to endophycin production. In silico analyses suggested that endophycin L is a toxin-like bacteriocin, this bacteriocin could be a potential candidate as biological control agent against X. fastidiosa and other plant pathogens. The data indicated that when C. flaccumfaciens producers are present it inhibits X. fastidiosa, conversely X. fastidiosa growth seems to be favored by Methylobacterium species and the first interaction could be mediated by endophycins, such as endophycin L. Thus, we suggest a cyclic interaction among these microorganisms. We demonstrated that knowledge of the interaction among those endophytic bacteria represent an advance about plantmicroorganism ecological aspects.

Em concentrações subletais, agentes antimicrobianos modulam a expressão gênica bacteriana, sendo que o conjunto de genes que é modulado depende tanto da cepa bacteriana, como da natureza do agente antimicrobiano. Neste trabalho, avaliamos o perfil de expressão gênica de Xylella fastidiosa cepa 9a5c em resposta ao tratamento por até 60 minutos com dose subletal do antibiótico estreptomicina. Esta é uma cepa virulenta, originalmente isolada de laranjeiras com sintomas de clorose variegada dos citros. A hibridização de microarranjos de DNA representando 2608 das 2848 sequências codificadoras (CDS) previamente anotadas no genoma desta cepa, revelou que 136 CDS apresentaram expressão gênica diferencial em resposta à exposição à estreptomicina, sendo que destas 109 foram negativamente moduladas e 27 positivamente moduladas. Realizamos, também, ensaios de PCR quantitativo precedido de transcrição reversa (RTqPCR) de 21 CDS para confirmar a modulação observada na análise global da expressão gênica. O perfil de expressão gênica de X. fastidiosa em resposta à estreptomicina foi analisado de forma integrada com outros perfis de expressão gênica desta bactéria. Entre as CDS positivamente moduladas, destacamos aquelas codificadoras das chaperoninas GroEL e GroES, que estão associadas a resposta de choque térmico, e CDS associadas à tradução, tais como proteínas ribossomais e fatores de tradução. Interessantemente, a exposição à estreptomicina induz a expressão da CDS que codifica poligalacturonase, que é um fator de virulência em algumas cepas de X. fastidiosa. Por outro lado, o tratamento com estreptomicina promoveu a modulação negativa de CDS relacionadas à formação e manutenção de biofilme ao contrário do observado quando estas bactérias foram submetidas ao tratamento com gomesina, um peptídeo antimicrobiano. O conjunto destas observações sugere que a exposição à dose subletal de estreptomicina possa promover um fenótipo de maior virulência, contrariamente ao efeito previamente observado com a gomesina. Neste trabalho, também descrevemos o pirosequenciamento do genoma da cepa J1a12 de Xylella fastidiosa, que exibe fenótipo menos virulento em citros e tabaco em relação à cepa 9a5c. A comparação da sequência genômica destas duas cepas confirma diferenças anteriormente observadas utilizando-se microarranjos de DNA e destaca genes potencialmente importantes para virulência de Xylella fastidiosa. / At sublethal concentrations, antimicrobials compounds modulate bacterial gene expression and the gene set that is modulated depends not only on the bacterial strain but also on the nature of antimicrobial agent. In this study, we evaluated changes in gene expression profile of Xylella fastidiosa strain 9a5c exposed up to 60 min to sublethal concentration of streptomycin. This a virulent strain originally isolated from orange trees with symptoms of citrus variegated chlorosis. Hybridization of DNA microarrays representing 2,608 out of 2848 coding sequences (CDS) previously annotated in strain 9a5c genome revealed 136 CDS differentially expressed upon streptomycin treatment. Of which 109 were down-regulated and 27 up-regulated. Differential expression for a subset of 21 CDS was further evaluated by reverse transcriptionquantitative PCR (RT-qPCR). In addition, we performed an integrated analysis of the gene expression profile of X. fastidiosa in response to streptomycin along with other gene expression profiles available for this bacterium. Among the up-regulated CDS, we highlight those encoding chaperonins GroEL and GroES, which are associated with heat shock response, and those CDS related to translation, such as ribosomal proteins and translation factors. Interestingly, exposure to streptomycin induces the expression of a CDS encoding polygalacturonase, which is a virulence factor for some X. fastidiosa strains. Furthermore, treatment with streptomycin down-regulates some CDS related to biofilm formation oppositely to treatment with gomesin, an antimicrobial peptide. Together, these observations suggest that exposure to sublethal dose of streptomycin might promote a higher virulent phenotype, in contrast to the effect previously observed with gomesin. In the present work, we also describe the pyrosequencing of J1a12 genome, a X. fastidiosa strain that exhibits a less virulent phenotype in citrus and tobacco if compared to strain 9a5c. A comparison of genome sequences of these two strains confirms differences previously observed using DNA microarrays and highlights important genes for virulence of X. fastidiosa.

A cultura dos citros é extremamente dependente de uma nutrição mineral adequada para atingir maiores patamares de produção a menores custos, especialmente sob condições adversas, como no caso da ocorrência da clorose variegada dos citros (CVC). Neste contexto, o boro influencia diretamente a produção por proporcionar maior desenvolvimento radicular, aumentando o volume de solo explorado pelas raízes, maximizando o aproveitamento da água e dos fertilizantes, bem como por estar diretamente envolvido na formação da parede celular, contribuindo para aumento da resistência geral da planta. O presente trabalho foi desenvolvido a partir de um experimento de campo, conduzido no período de setembro de 2001 a agosto de 2002, em área de campo comercial localizada no município de Comendador Gomes (MG). Utilizou-se a variedade Pêra Rio enxertada sobre Limão Cravo no oitavo ano de produção, cultivada em LATOSSOLO VERMELHO-AMARELO Distrófico psamítico. O objetivo do estudo foi avaliar o uso de fontes de boro aplicadas ao solo em diferentes dosagens e sua influência na produção e qualidade do citros afetado pela CVC. Foram avaliados o estado nutricional das plantas, atributos químicos do solo, produtividade, bem como os atributos tecnológicos e físicos dos frutos. As fontes utilizadas foram: ulexita-pó, ulexita-granulada, colemanita-pó, ácido bórico e termofosfato com boro, nas dosagens de 1, 2, 3 e 4 kg ha-1 . O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com fatorial 5X4, além de dois tratamentos adicionais (testemunha e termofosfato magnesiano), em quatro repetições. A avaliação do estado nutricional foi feita pela análise química dos teores de nutrientes nas folhas amostradas seis meses após a aplicação dos tratamentos. Os atributos químicos do solo foram avaliados por meio de análises das amostras coletadas onze meses após a aplicação dos tratamentos, na profundidade de 0-20 cm. A produção foi avaliada por ocasião da colheita, bem como os atributos tecnológicos e físicos dos frutos. Os resultados mostraram que todas as fontes de boro proporcionaram aumentos significativos nos teores foliares de boro, sendo o ácido bórico e a ulexita-pó as que promoveram os maiores aumentos, não havendo influência das fontes e doses nos teores foliares de P, Ca e Mg. Os teores de boro no solo permaneceram acima do nível considerado adequado, sendo observados maiores valores onde utilizou-se fontes menos solúveis como a colemanita e o termofosfato com boro. A produtividade e os atributos físicos dos frutos não tiveram influência da utilização de fontes e doses de boro no pomar com elevada CVC, sendo observado que o aumento da doses de boro aplicado no solo diminuiu a porcentagem de suco no fruto. / Citrus crop is extremely dependent on an adequate mineral nutrition to reach bigger levels of production to fewer costs, especially under adverse conditions, as in the case of occurrence of citrus variegated chlorosis (CVC). In this context, boron directly influences the production because it provides a bigger root growth, what increases the volume of the explored soil by the roots, maximizes the use of water and fertilizers, as well as because it is directly involved in the cell wall biosynthesis, what contributes to the increase of the general resistance of the plant. The current study was developed from a field experiment and conducted in the period of September/2001 to August/2002, in a commercial field area located in the city of Comendador Gomes (state of MG). Pêra Rio variety grafted on Limão Cravo was used in the eighth year of production, cultivated in Typic Haplustox. The aim of the study was to evaluate the use of boron sources applied to soil in different dosages and its influence in the production and quality of the citrus affected by CVC. Plant nutritional condition, soil chemical attribute evaluations, productivity, and technical and physical attributes of the fruits were evaluated. The sources used were: ulexite fine, ulexite granular, colemanite fine, boric acid and fused boron phosphate, in 1, 2, 3 and 4 kg ha-1 rates. The experimental design used was completely randomized, with 5X4 factorial, besides two additional treatments (control and fused magnesium phosphate), in four replications. The evaluation of the nutritional state was done by leaf chemical analysis sampled six months after the application of the treatments. The chemical attributes of the soil were evaluated through analysis of samples collected eleven months after the application of the treatments, at a depth of 0- 20cm. The production was evaluated on the occasion of the harvest, as well as the technological and physical attributes of the fruits. The results showed that all boron sources promoted significative increases on the leaf boron contents. The higher increase was promoted by boric acid and ulexite fine sources. However didn´t happen source and dose influences on leaf contents of P, Ca e Mg. The boron soil contents remained higher than the level considerate suitable. The higher soil boron content was observed when sources with low solubility like colemanite and fused boron phosphate were applied. Productivity and fruit physical attributes didn´t were influenced by boron sources and dosages in plants with higher incidence of CVC. With the boron doses increase diminish the fruit juice contents.

A utilização de técnicas biotecnológicas como a transformação genética, tem auxiliado os programas de melhoramento de plantas perenes. Essa técnica já é utilizada em citros com sucesso, principalmente para obtenção de plantas tolerantes a doenças. O presente trabalho teve três objetivos: 1.transformação genética do porta-enxerto limão ‘Cravo’ com o gene bacteriopsina (bO), relacionado com ativação de mecanismos de defesa da planta como morte programada de células e produção de ácido salicílico, com o intuito de aumentar a resistência a gomose de Phytophthora; 2. transformação genética das principais variedades copas de laranja doce (‘Hamlin’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’) com o gene da cecropina. Esse gene possui atividade antibacteriana, tornando-se possível fonte de resistência a cancro cítrico e clorose variegada dos citros e; 3. avaliar a viabilidade da utilização de um promotor específico de xilema em citros. As transformações foram efetuadas pelo sistema indireto via Agrobacterium tumefaciens, utilizando segmentos juvenis de epicótilo. Testes moleculares foram realizados e confirmaram a inserção dos genes descritos acima. No caso do limão ‘Cravo’ duas plantas foram regeneradas. Na transformação das variedades copa com o gene da cecropina, diferentes taxas de eficiência foram observadas, sendo que melhores resultados foram obtidos para laranja ‘Valência (3,3-4,5 %) e laranja ‘Hamlin’ (2,5-3,0 %) em comparação com laranja ‘Natal’ (1,6-2,0 %) e laranja ‘Pêra’ (0,5 %). Plantas de laranja ‘Valência’ também foram transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase. Além das transformações, dois bioensaios foram instalados: um com as plantas de limão ‘Cravo’, visando avaliar resistência a gomose de Phytophthora e outro, com laranja ‘Valência’ transformada com o gene da cecropina. No primeiro caso, propagaram-se por enxertia plantas transgênicas de limão ‘Cravo’ e, após seis meses fez-se a inoculação com Phytophtora nicotianae, que consistiu na introdução de agulha contaminada com propágulos do patógeno, numa altura de 10 cm acima da região da enxertia. Vinte e cinco dias após aferiu-se o comprimento e área das lesões, bem como observou-se a presença de goma. Comparando-se o desempenho das duas linhagens transgênicas com o limão ‘Cravo’ não transformado, uma delas apresentou menor área a lesão. Já para as plantas com o gene cecropina um ensaio com folha destacada foi realizado, em que as mesmas foram perfuradas com auxílio de uma agulha e, posteriormente, pulverizadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e, mantidas em tubo de centrífuga (50 mL), onde os pecíolos permaneciam em contato com água estérial (2 mL). Avaliou-se o período necessário para o aparecimento das primeiras lesões e o tamanho das lesões após quinze dias. Uma planta transgênica apresentou maior resistência perante a testemunha. Nas plantas transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase, testes para observar a expressão do gene GUS foram realizados e comprovaram a capacidade desse promotor em direcionar os genes para a região dos vasos condutores. Os resultados obtidos nesse trabalho são pioneiros em citros, utilizando os genes bO, cecropina e o promotor PAL. / Application of modern biotechnology techniques, as genetic transformation, has helped breeding programs of perennial plant species. This technique is already successfully used in citrus in several countries, mostly to the production of more disease-tolerant plants. Present work had three objectives as it follows: 1. genetic transformation of Rangpur lime rootstock with the bacterio-opsin(bO) gene, related to the activation of plant defense mechanisms such as programmed cell death and salicylic acid production, towards the increase of the tolerance to Phytophthora gummosis; 2. genetic transformation of main sweet orange scion varieties (Hamlin, Valência, Natal and Pêra) with cecropin gene. This gene products present antibacterial activity, becoming a possible source for citrus canker and variegated chlorosis tolerance and. 3. to test the viability of the use of a xylem-specific promoter (phenylalanine ammonia lyase) in citrus. Transformations were performed by direct system via Agrobacterium tumefaciens, using juvenile citrus epicotyl segments, which showed to be feasible in citrus, once transgenic plants were obtained for all proposed genes. Molecular tests were conduced and confirmed the insertion of the genes described above. In the case of Rangpur lime two plants were regenerated; in the transformation of canopy varieties with cecropin gene, different efficiency rates were observed, and the best results were obtained for Valencia sweet orange (3.3-4.5 %) and Hamlin sweet orange (2.5-3.0 %), compared to Natal sweet orange (1.6-2.0 %) and Pêra sweet orange (0.5 %). Plants of Valência variety were also transformed with the phenylalanine ammonia lyase promoter, resulting in 15 diverse transformation events. Beyond transformations, two bioessays were installed: one with Rangpur lime plants, aiming to evaluate tolerance to gummosis caused by Phytophthora, and another with Valência sweet orange transformed with cecropin gene. In the first case Rangpur lime transgenic plants were propagated through grafting and, after six months, were inoculated with Phytophtora, by introducing a contaminated needle containing the pathogen propagules, at 10 cm above the grafting region; 25 days later the experiment evaluation was conduced, consisting on measuring the lenght and area of lesions, as well as on the observation of gum. Comparing the performance of Rangpur lime transgenic lines with that of a non-transformed Rangpur lime, one plant presented higher tolerance to gummosis. Although, for the cecropin-gene plants, it was conduced an essay with destached leaves, where these were punched by a needle and then sprayed with a bacterial suspension of Xanthomonas axonopodis pv. citri; they were kept in centrifuge tubes (50 mL), where petioles mantained contact with sterile water (2 mL). After 15 days, the necessary period to the first lesions appearance and their size were evaluated. One transgenic plant showed a higher tolerance in comparison to control. In plants transformed with phenylalanine ammonia lyase promoter, tests to observe gus gene expression were performed and comproved its ability to promote and direct gene activity to conductive vessels. This work results are the first in citrus using bO and cecropin genes, and PAL promoter.