Les maladies cardiovasculaires représentent la principale cause de décès dans le monde et elles sont souvent causées par l’athérosclérose coronarienne caractérisée par l’accumulation de plaques dans la paroi des artères menant à leur rétrécissement et à la réduction ou l’abolition de l’apport sanguin régional au muscle cardiaque. Les anomalies du métabolisme des lipides, incluant l’élévation du cholestérol dans les lipoprotéines de basse densité (LDL-cholestérol) contribuent au processus d’athérosclérose. Plusieurs traitements existent pour réduire les taux de lipides plasmatiques chez les sujets à risque, dont le principal est les statines. Cependant, les statines ne permettent pas toujours d’atteindre les cibles thérapeutiques, ce qui justifie la recherche de nouveaux traitements pouvant modifier les lipides plasmatiques. Une avenue potentielle de traitement à explorer est le beta-glucane, une fibre soluble contenue dans l’avoine pour laquelle certaines données suggèrent un effet hypolipidémiant. L’objectif de ce mémoire était d’évaluer l’efficacité d’un supplément de beta-glucane dans la réduction des taux plasmatiques de LDL-C chez les patients atteints de dyslipidémie à travers le Canada. Pour ce faire, nous avons effectué un essai clinique randomisé en double aveugle contrôlé par placebo dans une population de 264 sujets atteints d’hyperlipidémie qui ont reçus aléatoirement des traitements de beta-glucane à doses de 1.5 g, 3 g et 6 g ou un placebo durant 12 semaines. Tout au long du traitement, des mesures du taux plasmatique de LDL-C ont été effectuées et des analyses statistiques de covariance (ANCOVA) ont été faites pour comparer ces taux entre les groupes actifs et placebos afin d’observer s’il y avait des changements significatifs. La mesure d’efficacité établie était une réduction du taux de LDL-C d’au moins 0.30 mmol/L. Nos résultats suggèrent que le supplément de beta-glucane à doses de 1.5 g, 3 g et 6 g n’est pas efficace pour réduire les taux de lipides sériques. Il n’y a pas eu de variation significative dans les taux de LDL-C lorsque les groupes actifs ont été comparé au groupe placebo. / Cardiovascular diseases are the principal cause of death in the world, and they are often caused by coronary atherosclerosis characterized by the accumulation of plaques in the wall of arteries leading to their narrowing and reduction or disappearance of regional blood supply to the cardiac muscle. Abnormalities of lipid metabolism, including elevated cholesterol in low-density lipoproteins (LDL-C), contribute to the atherosclerotic process. Several treatments exist to reduce levels of plasma lipids in patients at risk, the main one being statins. However, a substantial number of patients do not reach recommended therapeutic targets while treated with statins which creates the impetus for the search of new lipid-modifying treatments. One potential avenue of treatment worthy of investigation is beta-glucan, a soluble fiber found in oats, for which some data have suggested a lipid-lowering effect. The objective of this thesis was to evaluate the efficacy of a beta-glucan supplement in reducing plasma LDL-C levels in patients with dyslipidemia across Canada. To do this, we conducted a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial in a population of 264 subjects with hyperlipidemia who randomly received beta-glucan treatments at doses of 1.5 g, 3 g and 6 g or a placebo for 12 weeks. Throughout the treatment, LDL-C plasma measurements were taken and statistical analyzes of covariance (ANCOVA) were done to compare these levels between the active and placebo groups to observe if there were any significant changes. The established measure of efficacy was a reduction in LDL-C of at least 0.30 mmol/L. Briefly, our results have shown that beta-glucan in doses of 1.5 g, 3 g and 6 g is not efficacious in reducing plasma lipid levels. There was no significant change in LDL-C levels when the active groups were compared to the placebo group.

La maladie coronarienne est la première cause de mortalité dans le monde ayant emporté 7.6 millions d'individus en 2005. Plusieurs facteurs de risque pour cette maladie ont été identifiés dont l'un des plus importants est la présence d'une dyslipidémie. L'hyperréactivité plaquettaire a récemment été ajoutée à cette liste. Bien que le cholestérol soit naturellement présent et que les plaquettes soient réactives chez tous les individus, ces paramètres varient d'une personne à l'autre. Plusieurs études ont été réalisées afin de déterminer les causes de cette variation. L'une des hypothèses les plus étudiées à l'heure actuelle est celle de polymorphismes localisés sur les gènes codant pour des protéines clées dans le métabolisme du cholestérol et des plaquettes. De nombreuses investigations ont été réalisées dans cette optique, mais l'impact de plusieurs polymorphismes reste à être déterminé et les conclusions de précédentes études doivent être validées. La réalisation de ces travaux est importante puisque la découverte de gènes permettant de prédire certains facteurs de risque permettrait de détecter précocement les sujets à risque et ainsi potentiellement sauver des vies. Nous avons donc réalisé cette étude afin de déterminer l'impact du polymorphisme -18 C>A du récepteur NPC1L1 sur les niveaux d'apo B100 et de valider l'effet rapporté du polymorphisme TaqEB de la protéine de transfert des esters du cholestérol sur les niveaux de HDL-cholestérol que nous avons évalués par la mesure de l'apo Al. Finalement, nous avons tenté de déterminer si l'effet du polymorphisme i-T744C du récepteur P2Y12 des plaquettes sur la survenue d'un second événement coronarien peut s'expliquer par l'impact de ce polymorphisme sur la concentration de protéine C-réactive. Pour ce faire, nous avons recruté 176 sujets ayant présenté un infarctus aigu du myocarde pour lesquels nous avons déterminé le génotype pour les polymorphismes mentionnés précédemment ainsi que mesuré les concentrations d'apo B100, d'apo Al et de protéine C-réactive. Les résultats de la présente étude ne permettent pas de conclure définitivement si les polymorphismes étudiés ont ou n'ont pas d'impact sur ces paramètres. Ce qui apparaît toutefois à l'analyse des résultats, c'est que si ces mutations ont un effet sur les paramètres étudiés, cet effet est probablement mineur.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Une étude a été entreprise dans le but de déterminer les interactions pouvant survenir entre certains lipides impliqués dans les fonctions de barrière de perméabilité et de desquamation du stratum corneum. Cette étude a consisté à étudier le thermotropisme de diverses dispersions composées de sphingomyéline, céramide 3, acide palmitique perdeutéré, cholestérol et sulfate de cholestérol en proportions variées, par spectroscopie infrarouge par transformée de Fourier. Cette étude a été également effectuée aux pH 5.2 et 7.4 afin d'estimer l'influence de l'environnement ionique sur 1'interaction de ces lipides. Le thermotropisme des dispersions de céramide 3 et de sphingomyéline a indiqué que le céramide 3 adopte un empilement plus serré que la sphingomyéline aux deux pH. Les résultats ont également indiqué que l'acide palmitique rigidifie la bicouche de sphingomyéline et fluidifie la dispersion de céramide 3, et que la miscibilité de cet acide gras est plus élevée avec la sphingomyéline qu'avec le céramide 3. Toutefois, la miscibilité de l'acide palmitique et du céramide 3 est augmentée par le cholestérol et le sulfate de cholestérol à pH 5.2, ce qui semble affecter leur thermotropisme en induisant la formation d'une phase très ordonnée à 37 °C. Par contre, le cholestérol et le sulfate de cholestérol semblent accentuer la déprotonation de l'acide palmitique en présence du céramide 3 à pH 7.4, ce qui semble provoquer une séparation de phase de l'acide gras et du céramide 3. Le cholestérol induit également la formation de la phase liquide ordonnée au sein de la bicouche de sphingomyéline en présence de l' acide palmitique aux pH 5.2 et 7.4. Toutefois, le sulfate de cholestérol semble être moins efficace que le cholestérol à abolir la transition de phase de la sphingomyéline et de l 'acide palmitique. L'analyse des résultats nous a permis de déterminer que l'acide palmitique, le cholestérol et le sulfate de cholestérol interagissent avec la sphingomyéline et le céramide 3 par l'intermédiaire d' interactions hydrophobes et de van der Waals impliquant leurs portions hydrophobes, et de liaisons hydrogène qui impliquent leurs groupements d'interface et de tête iv polaire. Il ressort également que les implications de ces lipides et du pH dans les fonctions de barrière de perméabilité et de desquamation pourraient être purement structurales. En fait, la structure de la tête polaire du céramide 3 permet l'empilement serré des lipides ainsi que l'imperméabilité des membranes, le cholestérol et le sulfate de cholestérol augmentent la miscibilité de l'acide palmitique et du céramide 3 à pH 5.2, et l'environnement à pH 5.2 semble être nécessaire au maintien de l'intégrité du stratum corneum.

Introduction: L'homéostasie du cholestérol est indispensable à la synthèse de la testostérone dans le tissu interstitiel et la production de gamètes mâles fertiles dans les tubules séminifères. Les facteurs enzymatiques contribuent au maintien de cet équilibre intracellulaire du cholestérol. L'absence d'un ou de plusieurs enzymes telles que la HMG-CoA réductase, la HSL et l'ACAT-1 a été associée à l'infertilité masculine. Toutefois, les facteurs enzymatiques qui contribuent au maintien de l'équilibre intra-tissulaire du cholestérol n'ont pas été étudiés. Cette étude a pour but de tester l'hypothèse que le maintien des taux de cholestérol compatibles avec la spermatogenèse nécessite une coordination de la fonction intracellulaire des enzymes HMG-CoA réductase, ACAT1 et ACAT2 et la HSL. Méthodes: Nous avons analysé l'expression de l’ARNm et de la protéine de ces enzymes dans les fractions enrichies en tubules séminifères (STf) de vison durant le développement postnatal et le cycle reproductif annuel et dans les fractions enrichies en tissu interstitiel (ITf) et de STf durant le développement postnatal chez la souris. Nous avons développé deux nouvelles techniques pour la mesure de l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de celle de l'ACAT1 et ACAT2. En outre, l'immunohistochimie a été utilisée pour localiser les enzymes dans le testicule. Enfin, les souris génétiquement déficientes en HSL, en SR-BI et en CD36 ont été utilisées pour élucider la contribution de la HMG-CoA réductase, l'ACAT1 et l'ACAT2 et la HSL à l'homéostasie du cholestérol. Résultats: 1) HMG-CoA réductase: (Vison) La variation du taux d’expression de l’ARNm de la HMG-CoA réductase était corrélée à celle de l'isoforme de 90 kDa de la protéine HMG-CoA réductase durant le développement postnatal et chez l'adulte durant le cycle reproductif saisonnier. L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase augmentait de façon concomitante avec le taux protéinique pour atteindre son niveau le plus élevé à 240 jours (3.6411e-7 mol/min/μg de protéines) au cours du développement et en Février (1.2132e-6 mol/min/μg de protéines) durant le cycle reproductif chez l’adulte. (Souris), Les niveaux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase étaient maximales à 42 jours. A l'opposé, le taux protéinique diminuait au cours du développement. 2) HSL: (Vison), l'expression de la protéine de 90 kDa de la HSL était élevée à 180- et 240 jours après la naissance, ainsi qu'en Janvier durant le cycle saisonnier chez l'adulte. L'activité enzymatique de la HSL augmentait durant le développement pour atteindre un pic à 270 jours (36,45 nM/min/μg). Chez l'adulte, l'activité enzymatique de la HSL était maximale en Février. (Souris) Le niveau d’expression de l'ARNm de la HSL augmentait significativement à 21-, 28- et 35 jours après la naissance concomitamment avec le taux d'expression protéinique. L'activité enzymatique de la HSL était maximale à 42 jours suivie d'une baisse significative chez l'adulte. 3) ACAT-1 et ACAT-2: Le présent rapport est le premier à identifier l’expression de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 dans les STf de visons et de souris. (Vison) L'activité enzymatique de l'ACAT-2 était maximale à la complétion du développement à 270 jour (1190.00 CPMB/200 μg de protéines) et en janvier (2643 CPMB/200 μg de protéines) chez l'adulte. En revanche, l'activité enzymatique de l'ACAT-1 piquait à 90 jours et en août respectivement durant le développement et chez l'adulte. (Souris) Les niveaux d'expression de l'ARNm et la protéine de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement. Le taux de l'ARNm de l'ACAT-2, à l’opposé du taux protéinique, augmentait au cours du développement. L'activité enzymatique de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement tandis que celle de l'ACAT-2 augmentait pour atteindre son niveau maximal à 42 jours. 4) Souris HSL-/ -: Le taux d’expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase diminuaient significativement dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+. Par contre, les taux de l'ARNm et les niveaux des activités enzymatiques de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 étaient significativement plus élevés dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+ 5) Souris SR-BI-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-1 étaient plus basses dans les STf de souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. A l'opposé, le taux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HSL étaient augmentées chez les souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. 6) Souris CD36-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-2 étaient significativement plus faibles tandis que celles de la HSL et de l'ACAT-1 étaient inchangées dans les STf de souris CD36-/- comparées aux souris CD36+/+. Conclusion: Nos résultats suggèrent que: 1) L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de la HSL sont associées à l'activité spermatogénétique et que ces activités ne seraient pas régulées au niveau transcriptionnel. 2) L'ACAT-1 et de l'ACAT-2 sont exprimées dans des cellules différentes au sein des tubules séminifères, suggérant des fonctions distinctes pour ces deux isoformes: l'estérification du cholestérol libre dans les cellules germinales pour l'ACAT-1 et l'efflux du cholestérol en excès dans les cellules de Sertoli au cours de la spermatogenèse pour l'ACAT-2. 3) La suppression génétique de la HSL diminuait la HMG-CoA réductase et augmentait les deux isoformes de l'ACAT, suggérant que ces enzymes jouent un rôle critique dans le métabolisme du cholestérol intratubulaire. 4) La suppression génétique des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI et CD36 affecte l'expression (ARNm et protéine) et l'activité des enzymes HMG-CoA réductase, HSL, ACAT-1 et ACAT-2, suggérant l'existence d’un effet compensatoire entre facteurs enzymatiques et non-enzymatiques du métabolisme du cholestérol dans les fractions tubulaires. Ensemble, les résultats de notre étude suggèrent que les enzymes impliquées dans la régulation du cholestérol intratubulaire agissent de concert avec les transporteurs sélectifs de cholestérol dans le but de maintenir l'homéostasie du cholestérol intra-tissulaire du testicule. / Introduction: Cholesterol homeostasis is essential for the synthesis of testosterone in interstitial tissue and the production of fertile gametes in the seminiferous tubules of the testis. Intracelluar cholesterol equilibrium in the testis is delicately maintained and regulated by enzymatic factors. The absence of one or more enzymes (HMG-CoA reductase, HSL and ACAT) has been implicated in the development of male infertility. However, the enzymatic factors that contribute to the maintenance of cholesterol equilibrium have not been investigated. This study is to test the hypothesis that the coordinated function of intracellular enzymes, HMG-CoA reductase, HSL and ACAT isoforms, are the basis of a system that helps to maintain cholesterol equilibrium during spermatogenesis. Methods: We characterized mRNA and protein expression levels of these enzymes in mink seminiferous tubules-enriched fraction (STf) during development and the annual reproductive cycle; or in mouse interstitial tissue-enriched fraction (ITf) and STf during postnatal development. Two novel techniques were developed to measure the HMG-CoA reductase, HSL and ACAT activities in mink and mouse STf. Additionally, immunohistochemistry was used to localize the enzymes in the testis. Finally, HSL knockout (KO) infertile male mice and selective cholesterol transporter (SR-BI, CD36) KO mice were used to elucidate the contribution of HMG-CoA reductase, HSL and ACAT isoforms in testicular cholesterol homeostasis when the enzyme or cholesterol transport system was genetically impeded. Results: 1) HMG-CoA reductase: (In mink STf), HMG-CoA reductase mRNA levels were relatively independent of 90kDa protein expression during development and the seasonal cycle. HMG-CoA reductase activity increased independently of its protein expression and reached maximal values by day 240 (3.6411e-7 mol/min/μg protein) during development and peaked in February (1.2132e-6 mol/min/μg protein) during the seasonal cycle. (In mouse STf), HMG-CoA reductase mRNA levels and enzymatic activity peaked by 42 days before decreasing while the protein levels tended to decrease steadily. 2) HSL: (In mink STf), an increase of 90kDa HSL protein expression by day 180- and 240 after birth as well as in January in seasonal cycle, was not related to the enzyme mRNA expression. HSL activity increased progressively through development and peaked by 270 days (36.45 nM/min/μg); another high HSL activity was shown in February. (In mouse STf), three significant elevations in HSL mRNA levels by day 21, 28, and 35 corresponded to a steady elevation of HSL protein expression throughout development. HSL activity peaked by day 42 but decreased remarkably in the adult. 3) ACAT-1 and ACAT-2: This is the first report to establish the presence of both ACAT-1 and ACAT-2 in the mink and mouse testis. (In mink STf), ACAT-2 activity reached its maximal value at 1190.00 CPMB/200μg protein by day 270 and 2643 CPMB/200μg protein in January. In contrast, ACAT-1 activity peaked by day 90 or in August during the seasonal cycle. (In mouse STf), ACAT-1 mRNA and protein levels were both decreased throughout development; ACAT-2 mRNA levels changes in the opposite direction of the protein levels, increasing throughout development. ACAT-1 activity in STf decreased throughout the development; while ACAT-2 activity increased significantly during development and peaked by day 42. 4) HSL-/- mice: KO HSL gene caused a decrease of HMG-CoA redutase mRNA expression and enzymatic activity in STf. However, ACAT-1 and ACAT-2 mRNA levels and enzymatic activities significantly increased in STf. 5) SR-BI-/- mice: The mRNA expression and activity of HMG-CoA reductase as well as ACAT-1 were statistically decreased in STf; whereas HSL mRNA level and activity were increased. 6) CD36-/- mice: The mRNA expression and activity of HMG-CoA reductase as well as ACAT-2 were significantly decreased in STf; while HSL and ACAT-1 mRNA levels and activities remained constant. Conclusion: These results suggest that 1) Activation of HMG-CoA reductase and HSL is associated with spermatogenetic activity, while the enzymatic activities may not only be regulated transcriptionally. 2) ACAT-1 and ACAT-2 are expressed in different cells of the tubules, suggesting distinct functions for these two closely related enzyme isoforms, with ACAT-1 being related to cholesterol esterification in germ cells and with ACAT-2 being associated with the removal of excessive cholesterol by Sertoli cells during spermatogenesis. 3) Genetically blocking HSL reduced the activity of HMG-CoA reductase while increasing activity of ACAT isoforms, suggesting the turn-off the enzyme in the cholesterol ester cycle may be essential for the accumulation of cholesterol esters in the tubules. 4) The dysfunction of intracellular cholesterol transporters affects regulation of the enzymes (HMG-CoA reductase, HSL and ACAT-1 and ACAT-2), which is presumably in response to compensatory extracellular cholesterol uptake. This study suggests that the enzymes implicated in the regulation of intracellular cholesterol may act cooperatively to maintain cholesterol homeostasis in testis.

La proprotéine convertase subtilisine/kexine-9 (PCSK9) a été identifiée comme le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie autosome dominante (ADH). Les deux autres gènes impliqués dans l’ADH encodent le récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR) et l’apolipoprotéine B. La PCSK9 est une convertase qui favorise la dégradation du LDLR dans les hépatocytes et augmente le niveau plasmatique de cholestérol des LDL (LDL-C). Les mutations « gain de fonction » de la PCSK9 sont associées à un phénotype d’hypercholestérolémie familiale, tandis que les variantes « perte de fonction » sont associées à un LDL-C réduit et à un risque coronarien plus faible. Pour élucider le rôle physiologique de la PCSK9, nous avons étudié sa régulation génique. En utilisant le RT-PCR quantitatif dans des hépatocytes humains, nous avons analysé la régulation de PCSK9 sous différentes conditions modulant l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol. Nous avons démontré que l’expression de la PCSK9 était induite par les statines de manière dose-dépendante et que cette induction était abolie par le mévalonate. De plus, le promoteur de PCSK9 contenait deux motifs conservés pour la régulation par le cholestérol : le sterol regulatory element (SRE) et un site Sp1. La PCSK9 circule dans le plasma sous des formes mature et clivée par la furine. Grâce à notre anticorps polyclonal, nous avons mis au point un test ELISA mesurant la PCSK9 plasmatique totale. Une étude transversale a évalué les concentrations plasmatiques de PCSK9 chez des sujets sains et hypercholestérolémiques, traités ou non par des statines ou une combinaison statine/ezetimibe. Chez 254 sujets sains, la valeur moyenne de PCSK9 (écart-type) était de 89,5 (31,9) µg/L. La concentration plasmatique de la PCSK9 corrélait avec celle de cholestérol total, du LDL-C, des triglycérides (TG), de la glycémie à jeun, l’âge et l’indice de masse corporelle. Le séquençage de PCSK9 chez des sujets aux extrêmes de la distribution des concentrations de PCSK9 de notre cohorte a révélé la présence d’une nouvelle variation « perte de fonction » : R434W. Chez 200 patients hypercholestérolémiques, la concentration de PCSK9 était plus élevée que chez les sujets sains (P<0,04). Elle a augmenté avec une dose croissante de statine (P<0,001), et a augmenté encore plus suite à l’ajout d’ezetimibe (P<0,001). Chez les patients traités, ceux présentant une hypercholestérolémie familiale (HF; due à une mutation du LDLR) avaient des concentrations plus élevées de PCSK9 que les non-HF (P<0,005), et la réduction de LDL-C corrélait positivement avec la concentration de PCSK9 atteinte de la même manière dans les deux sous-catégories (P<0,02 et P<0,005, respectivement). Par ailleurs, une incubation des cellules HepG2 (hépatocytes) et Caco-2 (entérocytes) avec de l’ezetimibe a provoqué une augmentation de l’ARNm de PCSK9 et de NPC1L1 de 1,5 à 2 fois (P<0,05), mais aucune variation significative de PCSK9 sécrétée n’a été observée, suggérant que ces lignées cellulaires ne sont pas un modèle idéal. Nous avons également mesuré le niveau de PCSK9 chez 1 739 Canadiens-français âgés de 9, 13 et 16 ans. La valeur moyenne (écart-type) de PCSK9 dans cette cohorte était de 84,7 (24,7) µg/L, légèrement plus basse que dans la cohorte d’adultes (89,5 (31,9) µg/L). Chez les garçons, la PCSK9 circulante diminuait avec l’âge, tandis que c’était l’inverse chez les filles. Il y avait des associations positives et significatives entre la PCSK9 et la glycémie à jeun, l’insulinémie, le HOMA-IR, et les paramètres lipidiques (TC, LDL-C, TG, HDL-C, apoAI et apoB). Dans l’analyse multivariée, une hausse de 10% de l’insulinémie à jeun était associée à une augmentation de 1 à 2% de PCSK9. La régulation de PCSK9 est typique de celle d’un gène impliqué dans le métabolisme des lipoprotéines et est probablement la cible du facteur de transcription «sterol regulatory element-binding protein » (SREBP-2). La concentration plasmatique de la PCSK9 est associée avec l’âge, le sexe, et de multiples marqueurs métaboliques chez les enfants et les adultes. La détection de la PCSK9 circulante chez les sujets HF et non-HF signifie que ce test ELISA spécifique à PCSK9 pourrait servir à suivre la réponse à la thérapie chez un grand éventail de sujets. PCSK9 semble être une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de l’hypercholestérolémie et de la maladie cardiovasculaire. / Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) has been identified as the third locus implicated in autosomal dominant hypercholesterolemia (ADH). The two other known genes implicated in ADH encode the low-density lipoprotein receptor (LDLR) and apolipoprotein B. PCSK9 is a protein convertase that post-translationally promotes the degradation of the LDLR in hepatocytes and increases plasma LDL cholesterol concentration (LDL-C). Heterozygote “gain-of-function” mutations of PCSK9 are associated with the familial hypercholesterolemia phenotype, whereas “loss-of-function” variants are associated with reduced LDL-C concentrations and lower coronary risk. As an approach toward the elucidation of the physiological role(s) of PCSK9, we studied its transcriptional regulation. Using quantitative RT-PCR, we assessed PCSK9 regulation under conditions known to regulate genes involved in cholesterol metabolism in HepG2 cells and in human primary hepatocytes. We found that PCSK9 expression was strongly induced by statins in a dose-dependent manner and that this induction was efficiently reversed by mevalonate. The PCSK9 promoter contains two typical conserved motifs for cholesterol regulation: a sterol regulatory element (SRE) and an Sp1 site. PCSK9 circulates in plasma as mature and furin-cleaved forms. A polyclonal antibody against human PCSK9 was used to develop an ELISA that measures total plasma PCSK9 rather than only the mature form. A cross-sectional study evaluated plasma levels in normal and hypercholesterolemic subjects treated or untreated with statins or statin plus ezetimibe. In 254 healthy subjects, the mean plasma PCSK9 (SD) concentration was 89 (32) µg/L. PCSK9 levels correlated positively with plasma cholesterol, LDL-C, triglycerides, fasting glucose, age and body mass index. Sequencing PCSK9 from subjects at the extremes of PCSK9 plasma distribution revealed a new loss-of-function R434W variant. In 200 hypercholesterolemic patients, circulating PCSK9 was higher than in controls (P<0.04), increased with increasing statin dose (P<0.001), and further increased when ezetimibe was added (P<0.001). In treated patients (n = 139), those with familial hypercholesterolemia (FH; due to LDLR gene mutations) had higher PCSK9 values than non-FH (P<0,005), and LDL-C reduction correlated positively with achieved plasma PCSK9 levels to a similar extent in both subsets (P<0.02 and P<0.005, respectively). However, incubation with ezetimibe of HepG2 (hepatocytes) and Caco-2 (enterocytes) cells caused an increase in PCSK9 and NPC1L1 mRNA of 1.5 to 2-fold (P<0.05), but no significant rise in PCSK9 protein secretion, suggesting that these transformed cells are not an ideal model. We also studied PCSK9 levels in 1,739 French Canadian youth ages 9, 13, and 16 years old. The mean (SD) plasma PCSK9 concentration, measured by ELISA, was 84.7 (24.7) µg/L in the cohort, slightly lower than in the adult cohort (89.5 (31.9) µg/L. In boys, plasma PCSK9 decreased with age, whereas the inverse was true for girls. There were significant positive associations between PCSK9 and fasting glucose, insulin, and HOMA-IR (homeostasis model assessment of insulin resistance). In multivariable analysis, a 10% higher fasting insulin was associated with a 1%-2% higher PCSK9 in both sexes. There were also positive associations between PCSK9 and total cholesterol, LDL-C, and triglycerides, as well as with HDL-C and apolipoproteins A1 and B. PCSK9 regulation is typical of that of the genes implicated in lipoprotein metabolism. In vivo, PCSK9 is probably a target of the transcription factor “sterol response element-binding protein” (SREBP)-2. The PCSK9 plasmatic concentration is associated with age, sex, and multiple metabolic markers in youth and adult samples. The detection of circulating PCSK9 in both FH and non-FH subjects means that this PCSK9 ELISA test could be used to monitor response to therapy in a wide range of patients. PCSK9 seems to be a promising drug target in the treatment of hypercholesterolemia and coronary heart disease.

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés. Le récepteur CD36, exprimé à la surface des macrophages, joue un rôle déterminant dans l’internalisation des lipoprotéines oxydées menant à la formation des cellules spumeuses dans l’espace sous endothélial, première étape du développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons montré précédemment que les sécrétines de l’hormone de croissance sont des ligands du récepteur CD36 qui possèdent un site de liaison qui chevauche celui des lipoprotéines oxydées. Cependant, aucune étude n’avait rapporté les effets potentiels des ligands sélectifs du CD36 sur la progression des lésions athérosclérotiques et le métabolisme lipidique au niveau des macrophages. Ainsi, ce projet de doctorat visait à évaluer le potentiel anti-athérosclérotique du EP 80317, un ligand sélectif du CD36, et élucider les mécanismes à l’origine de ses effets sur le métabolisme et le transport des lipides au niveau des macrophages. À cette fin, des souris déficientes en apolipoprotéine E (apoE-/-), nourries avec une diète riche en lipides et en cholestérol, ont été traitées quotidiennement pendant 12 semaines avec le EP 80317, montrant un puissant effet anti-athérosclérotique associé à une réduction de 51% des lésions aortiques et de 30% du taux plasmatique de cholestérol total. Cette même étude a permis de montrer une réduction de l’internalisation des lipoprotéines oxydées ainsi qu’une augmentation de l’expression des gènes/protéines impliqués dans l’efflux du cholestérol au niveau des macrophages, comme le peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), liver x receptor α (LXRα) et les transporteurs ABCA1 et ABCG1, entraînant une réduction de la formation des cellules spumeuses. Ces observations nous ont conduits à élucider les mécanismes moléculaires engendrés par la liaison d’un ligand sélectif au récepteur CD36 dans les macrophages. Les études ont permis de montrer que les ligands du CD36 entraînent une augmentation de l’efflux du cholestérol vers les transporteurs ABCA1 et ABCG1 en augmentant l’expression protéique de la cyclooxygénase 2 (COX-2) consécutive à la phosphorylation de la MAP kinase ERK1/2. L’activation de COX-2 stimule la production intracellulaire de la prostaglandine 15d-PGJ2, cette dernière conduisant à l’activation du PPARγ. Finalement, une troisième étude nous a permis de mettre en évidence les effets du EP 80317 sur le transport inverse du cholestérol in vivo. L’injection de macrophages J774 radiomarqués avec du cholestérol tritié dans la cavité péritonéale de souris avec le EP 80317 nous a permis de montrer que le EP 80317 entraîne une réduction de la radioactivité retrouvée dans le foie tandis qu’il augmente celle retrouvée dans les fèces par comparaison aux souris contrôles, sans néanmoins modifier le profil plasmatique du radiotraceur entre les deux groupes. De plus, l’expression des gènes impliqués dans le transport du cholestérol au niveau intestinal comme le LXRα, ABCA1, ABCG5 ainsi que ABCG8 ont été régulés à la hausse par le EP 80317 tandis que l’expression de NPC1L1, un transporteur impliqué dans l’absorption du cholestérol, a été régulé à la baisse. Toutefois, les gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol au niveau du foie ne sont pas modulés par le EP 80317. En conclusion, les travaux effectués dans le cadre de cette thèse nous ont permis de montrer que l’activation du récepteur CD36 par le EP 80317 pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l’athérosclérose. Les effets anti-athérosclérotiques et hypocholestérolémiants des ligands synthétiques du récepteur CD36 sont en partie engendrés par 1) la régulation du métabolisme des lipides au niveau des macrophages en réponse à l’activation du PPARγ par son ligand endogène, le 15d-PGJ2 et 2) par une augmentation du transport inverse du cholestérol, particulièrement par une augmentation de l’efflux transintestinal. / Cardiovascular diseases are the major cause of mortality and morbidity in industrialized countries. CD36, a type B scavenger receptor expressed on macrophages, appears to play a major role in foam cell formation through scavenging oxidatively modified lipoproteins, thus leading to fatty streak lesion formation in the arterial wall. We have previously reported that growth hormone-releasing peptides (GHRP) are synthetic ligands that share the same binding site as oxidized low density lipoprotein (oxLDL) on the CD36 receptor. However, no study has reported the anti-atherosclerotic effects of CD36 ligands and their role in macrophage lipid metabolism. Thus, this project aimed to evaluate the anti-atherosclerotic effects of EP 80317, a CD36 selective ligand, and to elucidate the role of GHRP on macrophage lipid metabolism and transport. Apolipoprotein E deficient mice (apoE-/-) fed a high fat high cholesterol diet were treated for 12 weeks with EP 80317. Our study showed that EP 80317 exerted potent anti-atherosclerotic effects as shown by reduced lesion areas (up to 51%) and hypocholesterolemia. We further showed that a chronic treatment with EP 80317 reduced oxLDL uptake and increased the expression of genes/proteins involved in macrophage cholesterol efflux, such as peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), liver x receptor α (LXRα) and ATP-binding cassette A1 (ABCA1) and ABCG1, thus reducing foam cell formation. Our second study aimed to elucidate the molecular mechanisms by which CD36 ligands lead to an increase in macrophage cholesterol efflux following PPARγ activation. [3H]-cholesterol-labeled murine macrophages incubated in the presence of EP 80317 showed a significant increase in cholesterol efflux to both ABCA1 and ABCG1 transporters of cholesterol. EP 80317-mediated macrophage cholesterol efflux through PPARγ involved an increase in intracellular 15d-PGJ2 levels that were elicited by extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) stimulation, itself dependent on COX-2 activation. The third and last study of this thesis aimed to investigate the effect of CD36 selective ligand on reverse cholesterol transport in vivo. ApoE-/- mice treated or not with EP 80317 were injected intraperitoneally with [3H]-cholesterol-labeled murine J774 macrophage-like cells. The radioactivity recovered in the livers of EP 80317-treated mice was significantly lower than that found in vehicle-treated mice whereas feces radioactivity was higher. Yet, the radioactivity in plasma did not achieve statistical differences between the two groups. Furthermore, the expression of genes involved in intestinal cholesterol transport such as LXRα, ABCA1, ABCG5 and ABCG8 was upregulated in EP 80317-treated mice while the expression of NPC1L1, a transporter involved in cholesterol absorption, was downregulated compared to vehicle-treated mice. In contrast, genes involved in hepatic cholesterol metabolism were not modulated by EP 80317. In conclusion, the work conducted in this thesis supported that activation of CD36 signaling pathways by EP 80317 may constitute a novel therapeutic approach for the treatment of atherosclerosis. The anti-atherosclerotic and hypocholesterolemic effects of synthetic CD36 selective ligands might be explained, at least in part, by 1) the regulation of macrophage cholesterol metabolism as a result of an increase in PPARγ activation by its endogenous ligand, 15d-PGJ2 and 2) the stimulation of reverse cholesterol transport, in particular that of transintestinal cholesterol efflux.

AIDA-I (adhesin involved in diffuse adherence) est une importante adhésine autotransporteur exprimée par certaines souches de Escherichia. coli impliquée dans la colonisation des porcelets sevrés causant la diarrhée post-sevrage et la maladie de l’œdème. Une précédente étude de notre laboratoire a identifié l’apolipoprotéine AI (ApoAI) du sérum porcin, la protéine structurale des lipoprotéines à haute densité, comme récepteur cellulaire putatif de AIDA-I. L’interaction entre ces deux protéines doit être caractérisée. Ici, nous montrons par ELISA que AIDA-I purifiée est capable d’interagir avec l’ApoAI humaine, mais également avec les apolipoprotéines B et E2. L’ApoAI est rencontrée sous deux formes, soit libre ou associée aux lipides. Nous montrons que la forme libre n’interagit pas avec les bactéries AIDA-I+ mais s’associe spécifiquement à l’ApoAI membranaire de cellules épithéliales HEp-2. Afin d’étudier le rôle de l’ApoAI dans l’adhésion des bactéries, nous avons infecté des cellules HEp-2 en présence d’anticorps dirigés contre l’ApoAI, mais l’adhésion des bactéries AIDA I+ n’a jamais été réduite. De plus, l’induction de l’expression de l’ApoAI par fénofibrate et GW7647 chez les cellules Caco 2 polarisée et Hep G2, n’a pas permis l’augmentation de l’adhésion cellulaire des E. coli exprimant AIDA-I. Notre étude suggère davantage que l’interaction entre AIDA-I et ApoAI n’intervient pas dans les mécanismes d’adhésion cellulaire. / The adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) is an important autotransporter adhesin expressed by some strains of Escherichia coli and is involved in the intestinal colonisation of weaned piglets, causing the postweaning diarrhea and the edema disease. A previous study from our laboratory identified the apolipoprotein AI (ApoAI) from porcine serum, the structural protein of high density lipoproteins, as a putative receptor of AIDA-I. The interaction between these two proteins must be characterized. Here, we show that purified AIDA-I, using an ELISA assay, is able to bind the human ApoAI and the apolipoprotein B and E2. The ApoAI is found under two forms, either free or bound to lipid. We show that the free form of ApoAI does not interact with AIDA-I+ bacteria but specifically interact with membrane bound ApoAI on Hep-2 epithelial cells. To study the role of ApoAI in the adhesion of bacteria, we infected Hep-2 cells preincubated with antibodies to ApoAI. The adhesion of AIDA-I+ bacteria to the cells couldn’t be reduced. Additionally, the induction of ApoAI synthesis using fenofibrate and GW7647 on polarized Caco-2 or Hep G2 cells did not increase the adhesion of AIDA-I+ bacteria. Our study suggests that the interaction between AIDA-I and ApoAI is not involved in the cellular adhesion of the bacteria.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'aquaculture a connu un développement considérable au cours des dernières décennies. De par leurs disponibilités limitées, la farine de poisson et l'huile de poisson, considérées comme des ingrédients traditionnels de l'alimentation des poissons d’élevage, ont été largement remplacées par des matières premières végétales afin de soutenir le développement durable de l'aquaculture. Cette évolution de la composition des aliments aquacoles a entraîné une réduction importante de la teneur en cholestérol des aliments aquacoles. Dans ce contexte, l'objectif de la thèse était d’analyser les modifications du métabolisme du cholestérol chez la truite arc-en-ciel en réponse à une alimentation strictement végétale. Nous avons porté une attention particulière aux mécanismes sous-jacents à la régulation du métabolisme du cholestérol, en nous concentrant sur les facteurs de transcription et les microARNs. Enfin, nous avons évalué la possibilité d'utiliser les microARNs comme biomarqueurs non invasifs. Nos études ont montré qu’une alimentation végétale induit chez la truite une hypocholestérolémie associée à une modification de l’expression des gènes impliqués dans la synthèse et dans l'efflux du cholestérol mais aussi des facteurs de transcription SREBP-2 et LXRα. Nous avons également observé une diminution de l’expression du miR-223 dans le foie des truites nourries avec un régime à base de plantes ce qui suggère l'implication de mécanismes post-transcriptionnels dans la régulation de la synthèse du cholestérol chez la truite arc-en-ciel. Nous avons ensuite effectué une étude de la régulation du métabolisme du cholestérol chez une lignée de truite arc-en-ciel sélectionnée pour sa meilleure capacité de croissance sur aliment végétal. Nous avons observé une augmentation de l'expression du miR-33a chez les truites nourries avec un régime à base de plantes et une expression plus importante des miR-122 et 128 chez les truites de la lignée sélectionnée, quel que soit le régime. En analysant l’expression de gènes cibles potentiels des miR-33a, 122 et 128, nous avons pu mettre en évidence une régulation cohérente entre les miR-33a et 128 et leurs cibles potentielles que sont respectivement la caspase 6 apoptosis-related cysteine peptidase like 2 (casp6l2) et la phosphodiesterase 4B cAMP-specific a (pde4ba). Ces résultats mettent en évidence deux nouvelles voies moléculaires affectées par l’alimentation végétale chez la truite. Grâce à la combinaison d’approches in vivo et in vitro, nous avons constaté que l'expression des gènes impliqués dans la synthèse de cholestérol et celle du facteur de transcription SREBP-2 et du miR-33a augmentent chez les truites nourris avec l’aliment végétal et inversement diminuent en culture primaire d’hépatocytes de truite stimulés par du 25-hydroxycholestérol. Il semble donc SREBP-2 et miR-33a agissent en synergie pour réguler la synthèse du cholestérol. Enfin, nous avons détecté avec succès miR-1, miR-33a, miR-122, miR-128 et miR-223 dans le plasma de truite. Nous avons observé que les taux plasmatiques de miR-128 et de miR-223 sont soumis à des variations postprandiales similaires à celles observées pour leurs homologues hépatiques. Des corrélations significatives ont été observées entre les taux hépatiques et plasmatiques des miR-128 et miR-223. D’autres corrélations apparaissent entre les miR-122, 128 et 223 et l'expression de gènes liés à la synthèse et à l'efflux du cholestérol. Ces résultats indiquent que les micrARNs plasmatiques 122, 128 et 223 constituent de potentiels biomarqueurs non invasifs du métabolisme du cholestérol chez la truite arc-en-ciel. / Aquaculture has been subjected to a huge development during the last decades. Due to limiting availabilities, fishmeal and fish oil, the traditional ingredients of fish feed, have been widely replaced with vegetable ingredients in order to support the sustainable development of aquaculture. This evolution of aquafeeds has resulted in a reduction of the cholesterol content of the diets. In this context, the major objective of the thesis was to decipher the physiological changes related to cholesterol metabolism occurring in fish fed the plant-based diet. We furthermore analyzed the mechanisms underlying the regulation of cholesterol metabolism, focusing on transcription factors and microRNAs. Additionally, the possibility of utilizing miRNA as potential noninvasive biomarker was also investigated in the thesis. Our studies have shown that utilization of plant-based diet resulted in hypocholesterolemia and modified the expression of genes involved in cholesterol synthesis and efflux as well as that of their corresponding transcriptional factors SREBP-2 and LXRα. We also observed a lower expression of miR-223 in the liver of trout fed the plant-based diet suggesting the involvement of posttranscriptional mechanisms in the regulation of cholesterol synthesis. We then carried out another experiment using a line of rainbow trout selected for better growth performance on plant-based diet. We found that the hepatic expression of miR-33a increased in trout fed the plant-based diet, while the expression of miR-122 and miR-128 was much higher in the selected line regardless of the diet. By analyzing the expression of putative target genes of miR-33a, 122 and 128, we noticed consistent regulations between miR-33a and 128 and their respective putative targets, which were caspase 6 apoptosis-related cysteine peptidase like 2 (casp612) and cAMP-specific phosphodiesterase 4B a (pde4ba). These results highlighted two new molecular pathways affected by the plant-based diet. Through the combination in vivo and in vitro approaches, we demonstrated that the expression of the genes involved in cholesterol synthesis and that of the transcription factor SREBP-2 and the miR-33a increased in trout fed plant-based diet devoid of cholesterol while conversely decreased in rainbow trout primary cell culture of hepatocytes stimulated by 25-hydroxycholesterol. These data indicate that SREBP-2 and miR-33a act synergistically to control cholesterol synthesis. Finally, we successfully detected miR-1, miR-33a, miR-122, miR-128 and miR-223 in trout plasma. We observed similar postprandial changes between plasma levels of miR-128 and miR-223 and their hepatic counterparts. Significant correlations were observed between hepatic and plasma levels of miR-128 and miR-223. Other correlations appeared between miR-122, 128 and 223 and the expression of genes related to synthesis and efflux of cholesterol. Altogether, these results indicate that plasma microRNAs 122, 128 and 223 are potential non-invasive biomarkers of cholesterol metabolism in rainbow trout.

Le cancer papillaire de la thyroïde (PTC) représente 70-80% des cas de cancers de la thyroïde. Il est principalement caractérisé par des réarrangements chromosomiques affectant le gène RET. Le réarrangement RET/PTC1, dans lequel RET est réarrangé avec un gène proapoptotique H4, représente 30% des cas sporadiques et jusqu’à 60% des cas survenus après irradiation. Afin d’inhiber l’oncogène de fusion RET/PTC1, nous avons utilisé un siRNA ciblant la zone de jonction RET/PTC1 (siRNA RET/PTC1) au niveau de l’ARN messager des cellules tumorales et montré sa spécificité et son efficacité. Néanmoins, le développement des siRNAs comme molécule d’intérêt thérapeutique se heurte in vivo à des difficultés liées à leur administration. Sous forme libre, ces molécules sont, en effet, très vite dégradées par les nucléases extracellulaires et leur pénétration intracellulaire est limitée. C’est la raison pour laquelle il est nécessaire de les vectoriser. Nous avons choisi de le faire par la méthode de « squalénisation » et avons couplé d’une manière covalente le squalène, un lipide naturel précurseur de la biosynthèse du cholestérol, au siRNA RET/PTC1. Le bioconjugué formé s’autoassemble spontanément en milieu aqueux sous forme de nanoparticules stables de 170 nm de diamètre. L’efficacité et la toxicité des nanoparticules siRNA RET/PTC1-squalène ont été étudiées in vitro dans deux lignées de PTC exprimant RET/PTC1 (BHP10-3 et TPC-1) et l’activité antitumorale a été évaluée in vivo sur des souris athymiques xénogreffées par BHP10-3 puis traitées en i.v. par ces nanoparticules. Les nanoparticules siRNA RET/PTC1-squalène ont montré une bonne efficacité antitumorale. En revanche, aucune activité inhibitrice n’a été retrouvée in vitro. En conclusion, nous avons réussi à vectoriser le siRNA RET/PTC1 par la méthode de squalénisation. Cette étude ouvre des perspectives thérapeutiques pour certains patients atteints de PTC et réfractaires au traitement conventionnel. / The papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most common type of thyroid malignancy. This tumour is associated with somatic mutations of the RET proto-oncogene, due to gene rearrangements of the proto-RET. RET/PTC1 rearrangement is the most common genetic alteration identified to date, it is formed by an intra chromosomic rearrangement which leads to the juxtaposition of the RET Tyrosine Kinase domain of the proto-RET with the gene H4. The fusion RET/PTC1 oncogene represents an interesting target for small interfering RNA (siRNA) strategies since it is present only in the tumour cells and not in the surrounding normal cells. However, the biological efficacy of the siRNAs is hampered by their short plasma half-life due to poor stability in biological fluids and low intracellular penetration. In order to protect siRNA from degradation, and to improve their intracellular capture, we applied the concept of “squalenoylation”, ie. The bioconjugation of a drug substance to squalene, for the delivery of siRNA targeted toward the RET/PTC1 fusion oncogene. The acyclic isoprenoid chain of squalene was covalently coupled with RET/PTC1 siRNA at the 3’-terminus of the sense strand via a stable thioether linkage. The linkage of RET/PTC1 siRNA to squalene leads to an amphiphilic molecule that self-organise in water as RET/PTC1 siRNA-SQ nanoassemblies of 170 nm and Zeta potential of -26.4 mV. These RET/PTC1 siRNA-SQ NPs did not showed any cytotoxicity in vitro. Interestingly, in vivo, in a mouse xenografted RET/PTC1 experimental model, RET/PTC1 siRNA-SQ nanoparticles inhibited tumour growth, RET/PTC1 oncogene and oncoprotein expression, after intravenous injections of 2.5 mg/kg cumulative dose. In the last of this work, GALA-cholesterol combination with siRNA-SQ NPs further enhanced nucleic acid internalization, promoted their escape into the cytosol and consequently their gene silencing efficiency in vitro. In conclusion, these results showed that the “squalenoylation” offers a new non cationic plate-form for the siRNA delivery.