L’infarctus du myocarde représente un problème de santé publique dont le traitement de choix consiste à restaurer le flux sanguin (reperfusion) à travers le tissu ischémié dans les plus brefs délais, cependant cette procédure s’accompagne de lésions supplémentaires dont les mécanismes ne sont pas totalement connus. Notre laboratoire a observé que la reperfusion du myocarde s’accompagne d’une accumulation de cholestérol et d’oxystérols dans les mitochondries qui sont impliquées dans l’apparition de ces lésions. L’objectif de ce projet de thèse a donc été d’identifier les mécanismes responsables de cette accumulation. L’utilisation de stratégies cardioprotectrices (statines, exercice physique, ligand de la protéine translocatrice (TSPO)), visant à réduire la concentration cellulaire ou mitochondriale de cholestérol ou le stress oxydant, a tout d’abord permis de mettre en évidence une relation entre l’effet cardioprotecteur et l’inhibition de l’accumulation des stérols mitochondriaux. Cette relation persiste en présence d’une hypercholestérolémie. Par ailleurs, nous avons montré que l’accumulation mitochondriale de cholestérol et d’oxystérols est due à la translocation de la protéine StAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein) du cytosol à la mitochondrie dans les premières minutes de la reperfusion et que ce phénomène est modulé par le TSPO. L’inhibition de l’expression mitochondriale de la protéine StAR pourrait représenter une stratégie intéressante afin de protéger le myocarde ischémié de la reperfusion et ce notamment en cas d’hypercholestérolémie. / Myocardial infarction represents a serious public health issue which requires the restoration of the blood flow (reperfusion) in the ischemic tissue as soon as possible; however cardiac reperfusion also induces additional injuries whose mechanisms are not completely established. Our laboratory showed that myocardial infarction induces the accumulation of cholesterol and oxysterols in the mitochondria which are involved in the induction of reperfusion injury. The objective of this thesis project was to identify the mechanisms responsible for this accumulation. The use of cardioprotective strategies (statin, physical exercise, translocator protein (TSPO) ligand), aiming at reducing the cellular and mitochondrial cholesterol concentrations or the oxidative stress, showed the relation between the cardioprotective effect and the inhibition of the mitochondrial sterol accumulation. This relation persists in hypercholesterolemic animals. Furthermore, we showed that the mitochondrial cholesterol and oxysterol accumulation is caused by the translocation of StAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein) from cytosol to mitochondria during the first minutes of the reperfusion and this phenomenon is regulated by the TSPO. The inhibition of the mitochondrial expression of StAR could be an interesting approach in order to protect the ischemic myocardium from reperfusion injury, especially in a hypercholesterolemic context.

La modélisation de maladies métaboliques hépatiques et les approches de thérapie cellulaire nécessitent de disposer d’une source fiable et illimitée d’hépatocytes. Grâce à leurs propriétés spécifiques, les cellules souches pluripotentes peuvent représenter une telle source. Nous avons tout d’abord mis au point une approche originale pour différencier une lignée de cellules souches embryonnaires humaines européenne, générée en conditions GMP-compatibles, en hépatocytes fonctionnels in vitro et in vivo après transplantation dans un modèle murin d'insuffisance hépatique aiguë. Nous avons ensuite utilisé les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques d’un patient homozygote pour une mutation entrainant une absence de récepteur des lipoprotéines de basse densité (RLDL) afin de modéliser l'hypercholestérolémie familiale (HF) in vitro. Nous avons amélioré notre approche pour différencier ces iPSC en hépatocytes plus matures et polarisés car les hépatocytes sont les seules cellules capables de dégrader le cholestérol via la bile. Nous avons montré que ce modèle reproduit la physiopathologie de l'HF et établit la preuve de concept de la correction génétique ciblée par la technologie CRISPR/Cas au locus AAVS1 par la restauration de l’expression, inductible par les statines, et de la fonctionnalité du récepteur. Nous avons également mis en évidence que le RLDL ne semble pas impliqué dans l'entrée du virus de l'hépatite C (VHC) mais plutôt dans les étapes tardives de la morphogénèse virale. Ce modèle pourra désormais servir à l’étude physiopathologique de différents patients HF, au criblage de nouvelles drogues hypocholestérolémiantes et antivirales ainsi qu'à de nouvelles approches thérapeutiques. / Liver metabolic diseases modeling and cell therapy approaches require a a reliable and well-characterized cell source. Due to their specific properties, pluripotent stem cells represent a credible alternative to primary human hepatocytes. Thus, we have defined a new approach to differentiate a European human embryonic stem cell line, generated in GMP-compatible conditions, into hepatocytes that are functional in vitro and in vivo after transplantation into a murine model of acute liver failure. We have then used induced pluripotent stem cells from a homozygous patient with a mutation leading to an absence of the low-density lipoproteins receptor (LDLR) to model familial hypercholesterolemia type IIA (FH) in vitro. As hepatocytes are the only cells able to metabolize cholesterol into bile acids, we have improved our approach to differentiate these iPSC into hepatocytes displaying cell functional organization and polarization. We have shown that our model reproduced FH physiopathology and have also restored, by the genetic targeted correction at the AAVS1 locus using CRISPR/Cas technology and subsequent hepatocyte differentiation, the LDLR expression – inducible by statins - and functionality. Moreover, we have demonstrated that the LDLR does not seem to be involved in hepatitis C virus entry or replication but rather in viral morphogenesis steps. This model will be useful to develop new cholesterol-lowering and antiviral drugs as well as new cell therapy options. Furthermore, it can be applied to similar studies for other liver metabolic disorders.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) constituent la première cause de mortalité dans le monde. Des efforts significatifs ont été menés pour améliorer la prévention des MCV et ont abouti à une réduction du taux de mortalité. Cependant, un ralentissement considérable du taux de réduction des MCV a été observé à partir de 2011 malgré les nouvelles avancées thérapeutiques. Ces taux alarmants justifient le besoin de découvrir de nouvelles thérapies afin d’améliorer la prévention des MCV dans la population générale. Des taux élevés de cholestérol total et transporté par les lipoprotéines de basse densité (LDL) sont fortement liés aux MCV athérosclérotiques. Ainsi, les thérapies hypolipémiantes sont les thérapies les plus utilisées pour prévenir les MCV. Nos résultats antérieurs ont identifié Golgi glycoprotein 1 (GLG1) comme étant une nouvelle protéine impliquée dans le métabolisme lipidique. Par conséquent, notre étude actuelle vise à démontrer l'effet de GLG1 sur le développement de l'athérosclérose. Pour étudier cet effet, nous avons réduit l'expression de GLG1 (silençage génique ou knockdown) dans le foie de souris hypercholestérolémiques Apoe-/- en utilisant un virus adéno-associé de type 8 (AAV8) véhiculant un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) ciblant GLG1. Deux semaines post-injection, les souris ont été nourries par un régime occidental pendant 12 semaines. L'étude a révélé que le knockdown de GLG1 réduit significativement les taux plasmatiques de cholestérol total, de lipoprotéines de très basse densité (VLDL), de LDL et diminue les lésions athérosclérotiques au niveau du sinus aortique. Cependant, nos résultats ont démontré que le knockdown de GLG1 à l’aide du système AAV8 n'était pas stable pendant toute l'étude, le rendant inefficace au-delà de 2 mois. En résumé, nos résultats montrent que le knockdown de GLG1 réduit les taux de cholestérol plasmatique ainsi que la progression de l'athérosclérose chez les souris Apoe-/-. Cette réduction s'est produite en dépit de la perte progressive du knockdown de GLG1 et est probablement liée à la réduction de la sécrétion d'apolipoprotéines B100. Ces résultats montrent que GLG1 est une cible thérapeutique prometteuse pour abaisser les taux de cholestérol plasmatique, en particulier les VLDL et LDL, et prévenir le développement de l'athérosclérose. / Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death worldwide. Significant efforts have been made to prevent CVD and have resulted in a reduced mortality rate. However, a considerable slowdown in the reduction rate of CVD has been observed starting in 2011 despite new therapeutic advances. These alarming rates justify the need to discover new therapies to improve the prevention of CVD in the general population. High levels of total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) are strongly linked to atherosclerotic cardiovascular diseases. Thus, lipid-lowering therapies are the most used therapies to prevent CVDs. Our previous study identified Golgi glycoprotein 1 (GLG1) as a new protein involved in lipid metabolism. Therefore, our current study aims to demonstrate the effect of GLG1 on the development of atherosclerosis. To study the effect of GLG1 on atherosclerosis, we reduced GLG1 expression in hypercholesterolemic Apoe-/- mice livers using an adeno-associated virus coding for a short hairpin RNA (shRNA) targeting GLG1 then 2 weeks post-injection mice were fed a Western diet for 12 weeks. The study revealed that GLG1 knockdown significantly reduced plasma total cholesterol levels, especially very low-density lipoprotein (VLDL)- and LDL-C, and atherosclerotic lesions in the aortic root. However, our results showed that AAV-mediated GLG1 knockdown was not stable during the entire study, making it ineffective in lowering plasma cholesterol levels beyond 2 months. In summary, our results show that lowering GLG1 expression reduces plasma cholesterol levels as well as atherosclerosis progression in Apoe-/- mice. Remarkably, the reduction in atherosclerosis occurred in spite of the gradual loss of GLG1 AAV-mediated knockdown and is likely related to the reduced apolipoptotein B100 secretion. These findings demonstrate that GLG1 is a promising therapeutic target for lowering plasma cholesterol levels, particularly VLDL- and LDL-C, and preventing atherosclerosis development.

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Cette maitrise a été fait en co-direction : Jean-Marc Lavoie (UdeM) et David St-Pierre (UQAM). / Mise en contexte : La présente étude a pour but de tester l’hypothèse selon laquelle l’accumulation excessive de lipides au foie perturbe le métabolisme du cholestérol. La stéatose hépatique perturberait ainsi principalement les voies métaboliques qui impliquent les récepteurs de LDL au foie. Méthodologie: Des rats Wistar (n/groupe = 10) ont été soumis soit à une diète standard (SD), une diète enrichie en lipides (HFD : High Fat Diet) ou à une diète occidentale (WD : Western Diet) pour une durée de 2 ou 6 semaines. Au niveau de la composition des diètes, 60% de l’apport calorique de la diète enrichie en lipides provient des lipides tandis que la diète occidentale est composée à 40% de lipides et 35% de sucrose dont 17,5% de fructose. Résultats: Comparativement aux animaux traités pendant 2 semaines, le poids des tissus adipeux était environ trois fois plus élevé (~ 20 vs 7 g) chez les animaux soumis à 6 semaines de diètes obésogènes. Une augmentation significative du gain de poids (~ 40g) a été observée uniquement après 6 semaines chez les groupes soumis à la HFD ou la WD (P < 0.01). Comparativement aux animaux soumis à la diète conventionnelle, les niveaux de triglycérides (TG) hépatiques étaient significativement supérieurs chez les rats nourris avec la HFD et WD (P < 0.01) et ce, indépendamment de la durée du traitement. Après deux semaines, des concentrations de TG hépatiques significativement plus élevées (P < 0.05) ont été observés chez les animaux avec la WD comparativement à celles des rats avec la HFD. Des niveaux de cholestérol plasmatiques significativement plus élevés (P < 0.05) ont été mesurés chez les animaux avec la WD par rapport à la SD et la HFD et ce indépendamment de la durée. Après 2 et 6 semaines de diètes, l’expression génique au foie de LDL-R, PCSK9 et SREBP2, qui sont impliqués dans la captation des LDL-cholestérol, a significativement diminué chez les animaux soumis à la WD comparativement à ceux nourris avec la diète SD ou HFD (P < 0.01). De la même manière, des niveaux d’ARNm de LRP1 et ACAT2 significativement diminués (P < 0.01) ont été mesurés chez les animaux nourris avec WD comparativement ceux du groupe SD. L’expression de l’HMGCoAR, l’enzyme limitante impliquée dans la régulation de la synthèse endogène de cholestérol, a été significativement 6 diminuée chez les animaux soumis à la WD comparativement à ceux traités avec la SD ou la HFD après 2 (P < 0.001) et 6 semaines (P < 0.05). Dû au fait que la diète soit enrichie en sucrose et conséquemment en fructose, la WD a fortement favorisé l’expression de ChREBP et ACC, deux régulateurs majeurs dans la voie de la lipogenèse de novo. Conclusion: Ces résultats suggèrent que la diète de type occidentale augmenterait les niveaux de TG en favorisant simultanément la captation exogène de lipides ainsi que leur production endogène par l’activation de la lipogenèse de novo. L’altération de la voie de la captation du cholestérol par les LDL-R favoriserait une augmentation rapide des taux plasmatiques de cholestérol. / Background: The present study was designed to test the hypothesis that excessive fat accumulations impair cholesterol metabolism mainly through alterations in the LDL-receptor (LDL-R) pathway in liver. Method: Rats were either submitted to standard (SD), high fat (HFD; 60% kcal) or western (WD; 40% fat + 35% sucrose (17.5% fructose)) diets for 2 or 6 weeks. Results: Weight gain (~ 40g) was observed only following 6 weeks of the obesogenic diets (P < 0.01). Compared to the 2-week treatment, obesogenic diets tripled fat pad weight (~ 20 vs 7 g) after 6 weeks. Hepatic triglyceride (TG) levels were greater in response to both the WD and HFD compared to the SD (P < 0.01) at 2 and 6 weeks and their concentrations were greater (P < 0.05) in WD than HFD at 2 weeks. Plasma cholesterol levels were higher (P < 0.05) in animals submitted to WD compare to SD and HFD. After 2 and 6 weeks, liver expression of LDL-R, PCSK9 and SREBP2, involved in LDL-cholesterol uptake, was lower in animals submitted to WD than in others treated with HFD or SD (P < 0.01). Similarly, LRP1 and ACAT2 mRNA levels were lower (P < 0.01) among WD compared to SD-fed rats. Expression of the gene coding the main regulator of endogenous cholesterol synthesis, HMGCoAR was reduced in response to WD compared to SD and HFD at 2 (P < 0.001) and 6 (P < 0.05) weeks. Being enriched in fructose, the WD strongly promoted the expression of ChREBP and ACC, two key regulators of de novo lipogenesis. Conclusion: These results show that the WD promptly increased TG levels in the liver by potentiating dietary fat storage and de novo lipogenesis. This effect impaired hepatic cholesterol uptake via the LDL-R axis and promoted a rapid increase in plasma cholesterol levels.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'objectif de notre travail est de vérifier l'effet de la réduction du cholestérol sérique sur la mortalité totale dans les études impliquant des diètes ou des inhibiteurs de la HMG-CoA réductase (statines) comme moyens de traitement hypocholestérolémiants, et de traduire cet effet en termes actuariels afin de comparer la mortalité dans ces études avec la mortalité attendue dans la population générale donnée par les tables de mortalité. La méthodologie employée sera décrite avant la revue de la littérature. J Nous avons utilisé les données de trois études de population connues, impliquant des inhibiteurs de la HMG-CoA réductase (4S ou Scandinavian Simvastatin Survival Study, CARE ou Cholesterol And Reçurent Events , WOSCOPS ou West Of Scotland Coronary Prevention Study) et de quatre études impliquant la diète (LRC-CPPT ou Lipid Research Clinic Coronary Primary Prevention Trial, MRFIT ou Multiple Risk Factor Intervention Trial, ODHS ou Oslo Diet Heart Study et LDHS ouLyon Diet Heart Study) pour déterminer l'impact des interventions par la diète ou par prescription des inhibiteurs de la HMG-CoA réductase sur la survie. La méthode actuarielle employée permettra de comparer la mortalité observée dans le groupe placebo et dans le groupe sous intervention à la mortalité prévue (attendue) donnée par les tables de mortalité. Cette méthodologie permettra d'une part de comparer l'espérance de vie du groupe placebo dans tes grandes études de population, avec les données actuarielles. D'autre part, ces données, présentées sur une base actuarielle, permettront de mieux préciser le risque associé à l'hyperlipémie, basé sur des études récentes de population. En prévention primaire: les inhibiteurs de la HMG-CoA réductase réduisent les niveaux de cholestérol élevés et suppriment la mortalité excessive qui leur est reliée (étude WOSCOPS). En cas de multiples facteurs de risque, ta mortalité est comparable à celle des coronariens, mais l'impact des mesures de correction des facteurs de risque sur l'espérance de vie reste modeste (MRFIT). En prévention secondaire, les statines réduisent de presque de moitié le risque de mortalité en cas de cholestérol sérique élevé (étude 4S), cependant cet impact est plus modeste en cas de cholestérolémie normale (étude CARE). Parmi les mesures diététiques, seule la diète méditerranéenne a un effet très marqué en rendant le risque de mortalité chez le coronarien comparable à la population normale (Lyon diet heart study). Notre travail est présenté sous forme de deux articles devant être soumis à la publication dans la revue American Journal Of Insurance Medicine et dans Canadian Dietetic Association Journal. Les deux articles sont précédés d'une revue des principales études épidémiologiques et cliniques sur la relation entre le niveau de cholestérol sérique et la mortalité par maladie coronarienne. Le premier article concerne l'analyse de mortalité dans les études utilisant les diètes, en prévention primaire (MRFIT, LRC-CPPT) et en prévention secondaire (ODHS, LDHS), le second concerne des études impliquant les statines, en prévention primaire (WOSCOPS) et en prévention secondaire (CARE, 4S). Chacun des deux articles comprend une introduction, une analyse des données, les résultats, leur discussion, une conclusion et les références bibliographiques relatives soit à l'intervention par la diète soit par les statines. Une conclusion commune aux deux volets est faite à la fin de cette étude.

Il existe un nombre grandissant de preuves au cours des dernières années que la diminution de la sécrétion des œstrogènes chez les animaux ovariectomisés (Ovx) et chez les femmes ménopausées conduit à une accumulation importante de triglycérides (TG) dans le foie. Cependant, les évidences de perturbations dans le métabolisme du cholestérol, en lien avec la diminution des œstrogènes, sont limitées à des observations de niveaux élevés de cholestérol total dans le plasma trouvés chez la femme ainsi que chez les animaux. En fait, l'impact de la suppression des œstrogènes sur le métabolisme du cholestérol dans le foie a reçu peu d'attention et montre quelques controverses. Par conséquent, les trois études présentées dans cette thèse ont été réalisées chez des rats Ovx, comme modèle animal de femmes post-ménopausées, afin de documenter les effets du retrait des œstrogènes sur les marqueurs moléculaires clés du métabolisme du cholestérol et des acides biliaires dans le foie et dans l'intestin et des effets potentiels de l’entraînement physique. Il a été en effet démontré que l'entraînement physique peut réduire le niveau plasmatique de cholestérol. Une amélioration du transport du cholestérol en périphérie vers le foie pour sa sécrétion subséquente dans la bile et pour son l'excrétion de l'organisme a été suggérée, bien que les mécanismes sous-jacents ne soient pas entièrement compris. Dans la première étude, nous avons démontré que les rattes Ovx nourris avec une diète standard et une diète standard + cholestérol avait un taux de cholestérol total dans le foie plus élevé (P <0,05) que les rattes avec une ovariectomie simulée (Sham) nourris avec ces deux derniers types de diète, tandis que la teneur en triglycérides du foie était plus élevée chez les rattes Ovx que chez les rattes Sham nourris avec une diète standard, une diète standard + cholestérol et aussi une diète riche en grasses + cholestérol. Étonnement, la diète standard + cholestérol a été associée à un niveau plasmatique plus faible (P <0,001) de cholestérol total et de triglycérides chez les rats Ovx que les rats Sham, ce qui suggère une diminution de la sécrétion de lipoprotéines à très basses densités (VLDL). Par conséquent, la transcription de plusieurs marqueurs clés de la synthèse des VLDL, y compris la microsomal triglyceride transfer Protein (MTP) et apoB-100, ont été réduites (P <0,05) chez les rattes Ovx par rapport aux rattes Sham nourris avec tous les trois types diètes et cette diminution de MTP et apoB-100 était plus prononcée chez les rats nourris avec la diète standard + cholestérol. Pour aller un peu plus loin, dans la deuxième étude, nous avons déterminé les effets de l'entraînement physique sur les marqueurs clés hépatiques de la voie farnesoid X receptor (FXR) - small heterodimer partner (SHP) - de cholestérol 7 alpha-hydroxylase (CYP7A1) (FXR-SHP-CYP7A1) impliquée dans la conversion de cholestérol en acides biliaires et de leur excrétion chez les rat Ovx nourris avec une diète standard + cholestérol. Notre groupe expérimental principal comprenait des rats Ovx nourris avec une diète riche en cholestérol (Ovx-Chol). Ce groupe a été comparé à un groupe de rats Ovx nourris avec une diète standard (Ovx-SD) et un groupe de rats Sham nourris avec une diète riche en cholestérol (Sham-Chol) pour observer, respectivement, l'effet de l'alimentation et l’effet du retrait de l'œstrogène. Les résultats de cette étude ont démontré que les niveaux de cholestérol total dans le plasma et dans le foie ne sont pas affectés par l'entraînement physique dans aucune des conditions expérimentales. L'alimentation en cholestérol a induit une accumulation plus importante chez les rats Sham et Ovx a mené à une accumulation du cholestérol dans le foie significativement plus élevée (P <0,001) que chez les rats Ovx-SD. Un effet principal d'entraînement physique (P <0,05) a été trouvée dans l’expression génique du SHP et de CYP7A1. Ce dernier gène est reconnu pour son implication majeure sur le contrôle de la biosynthèse des acides biliaires à partir du cholestérol. De plus, cette étude a montré que le récepteurs des LDL (LDL-R) et proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PSCK9) au foie, qui sont impliqués dans l'absorption du cholestérol de la circulation, ne sont pas influencés par l’entraînement physique. Ces résultats suggèrent que l'entraînement physique module le métabolisme du cholestérol chez les animaux Ovx par un réglage positif de la formation des acides biliaires. Un nombre croissant de preuves récentes suggèrent que le transport inverse du cholestérol (RCT) peut également passer par une voie non-biliaire connue sous le nom « transintestinal cholesterol excretion » (TICE). En effet, le foie et l'intestin sont impliqués dans l'excrétion du cholestérol excédentaire du corps. Dans cette optique, dans la troisième étude, nous avons élargi nos recherches afin de déterminer si l'entraînement physique module l’expression des récepteurs de cholestérol de la membrane intestinale qui sont impliqués dans TICE chez les rats intacts et Ovx nourris avec une diète standard et une diète riche en cholestérol. Les résultats de cette étude ont montré que l'entraînement physique a augmenté (P <0,01) l’expression génique intestinale de LDL-R et de PCSK9 impliquées dans la captation du cholestérol intestinal de la circulation et de leur récepteur nucléaire, « sterol regulatory element-binding protein 2 » (SREBP2) (P <0,05) chez les rats Sham et Ovx par rapport aux rats sédentaires (Sed). D'autre part, l’expression des gènes hépatiques de LDL-R et de PCSK9 ont été supprimées (P <0,01) par l’alimentation riche en cholestérol, mais pas affectée par l'entraînement physique. L'expression du gène « flavin monooxygénase 3 » (FMO3), en tant que régulateur de l'équilibre du cholestérol dans le foie, a été diminuée de façon significative (P <0,01) par le cholestérol alimentaire chez les rats Sham et Ovx par rapport aux rats nourris avec la diète standard, mais demeure inchangée suite à l'entraînement physique et le retrait des œstrogènes. Un réglage positif de l'expression de gènes du LDL-R et PCSK9 intestinale par l'entraînement physique chez les rats intacts et Ovx suggère que l'entraînement physique peut contribuer à l’accroissement de l'élimination de cholestérol par la voie TICE. Dans l'ensemble, nos résultats indiquent qu'une combinaison d’une diète riche en cholestérol et un retrait des œstrogènes a mené à une diminution de l'expression des gènes des marqueurs essentiels de la synthèse de VLDL, ce qui implique une réduction de l'excrétion du cholestérol du foie. Il semble que la réduction de LDL-R hépatique pourrait être due à l'accumulation du cholestérol dans le foie. De plus, nos résultats ont présenté l’entraînement physique comme une intervention non pharmacologique appropriée pour stimuler l'excrétion du cholestérol excédentaire de l'organisme par le réglage positif des gènes impliqués dans la biosynthèse des acides biliaires dans le foie et les récepteurs intestinaux de cholestérol dans la voie TICE. / There has been accumulating evidence in recent years that the estrogen deficient state in ovariectomized (Ovx) animals and in postmenopausal women results in substantial liver triglyceride (TG) accumulation. However, evidence of disturbances in cholesterol metabolism in link with estrogen deficiency is limited to observations of higher plasma total cholesterol levels found in human as well as in animals. In fact, the impact of estrogen withdrawal on liver cholesterol metabolism has received little attention and shows some controversies. Therefore, the three studies presented in this thesis have been conducted in Ovx rats, as an animal model of post-menopausal women, to investigate the effects of estrogen withdrawal on key molecular markers of cholesterol and bile acid metabolism in liver and in transintestinal cholesterol excretion (TICE), and also to determine the potential role of exercise training as a positive alternative intervention. It has been shown that exercise training can improve plasma cholesterol levels. An enhanced transport of peripheral cholesterol toward the liver for subsequent secretion into bile and excretion from the body has been suggested; however, the underlying mechanism for this action is not fully understood. In the first study, we showed that estrogen withdrawal was associated with higher (P < 0.05) liver total cholesterol under the standard diet and the standard diet + cholesterol diet, while liver triglyceride (TG) content was higher in Ovx than in Sham rats in all three dietary conditions which are the standard diet, the standard diet + cholesterol and the high fat diet + cholesterol. Surprisingly, the standard diet + cholesterol was associated with lower (P < 0.001) plasma total cholesterol and TG levels in Ovx than in Sham rats, suggesting a decrease in very low-density lipoprotein (VLDL) secretion. Accordingly, several transcripts of key markers of VLDL synthesis including microsomal triglyceride transfer protein (MTP) and apoB-100 were decreased (P < 0.05) in Ovx compared to Sham rats under the three dietary conditions and even more so for MTP and apoB-100 when rats were fed the standard diet + cholesterol. To go one step further, in the second study we determined the effects of exercise training on hepatic key markers of farnesoid X receptor (FXR)-small heterodimer partner (SHP)-cholesterol 7 alpha-hydroxylase (CYP7A1) (FXR-SHP-CYP7A1) pathway, involved in cholesterol conversion into bile acid and excretion from the body, in Ovx cholesterol fed rats. Our main experimental group was Ovx rats fed a high cholesterol diet (Ovx-Chol) that was compared, on one hand, to a group of Ovx rats fed a standard diet (Ovx-SD) to observe the effects of the diet and, on the other hand, compared to a group of Sham operated rats fed the cholesterol diet (Sham-Chol) to observe the effect of estrogen withdrawal. Results of this study showed that plasma and liver total cholesterol levels were not affected by exercise training in any of the experimental conditions. Cholesterol feeding in both Sham and Ovx rats resulted in significantly (P<0.001) higher hepatic cholesterol accumulation than in Ovx-SD rats. A main effect of training (P< 0.05) was, however, found for transcripts of SHP and CYP7A1. The SHP and CYP7A1 transcripts were increased by training. These results suggest that exercise training through up-regulation of genes involved in bile acid formation may modulate cholesterol metabolism in Ovx animals. Finally, a recent growing body of evidence suggests that reverse cholesterol transport (RCT) can also proceed through a non-biliary pathway known as transintestinal cholesterol excretion (TICE). Indeed, both liver and intestine are involved in excretion of the excess cholesterol from the body. Based on this concept, we expanded our research to determine whether exercise training has an effect on intestinal membrane cholesterol receptors involved in TICE pathway in intact and Ovx rats fed a normal and a high cholesterol diet. Results of the third study showed that exercise training increased (P< 0.01) transcripts of intestinal LDL-R and PCSK9, which are involved in intestinal cholesterol uptake from circulation, and their nuclear transcription factor, intestinal sterol regulatory element-binding protein 2 (SREBP2) (P< 0.05) in both Sham and Ovx rats compared to rats remaining sedentary (Sed). On the other hand, hepatic LDL-R and PCSK9 gene expression was suppressed (P< 0.01) by cholesterol feeding but not affected by exercise training. Flavin monooxygenase 3 (FMO3) gene expression, as a cholesterol balance regulator in liver, was significantly decreased (P<0.01) by cholesterol feeding in both Sham and Ovx rats compared to rats were fed the SD diet but unchanged following exercise training and estrogen withdrawal. An up-regulation of intestinal gene expression of LDL-R and PCSK9 following voluntary wheel running in intact and Ovx rats suggests that exercise training may contribute to increased cholesterol elimination through the TICE pathway. Overall, our results indicate that a high cholesterol diet and ovariectomy combine to decrease the gene expression of key markers of VLDL synthesis suggesting a reduction in cholesterol excretion from the liver. Alternatively, it seems that reduced hepatic LDL-R transcript found in Ovx animals might be due to hepatic cholesterol accumulation. Moreover, our findings introduced exercise training as an appropriate non-pharmacological intervention to stimulate the excretion of the excess cholesterol from the body through upregulation of genes involved in bile acid biosynthesis in liver and intestinal basolateral cholesterol transporters in TICE.

Récemment, des études menées chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA) suggèrent un rôle important de la clairance cérébrale des peptides bêta-amyloïde (Abeta) dans la physiopathologie de la MA. Les échanges de peptide Abeta entre le cerveau et le sang peuvent se faire à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE). De nombreux transporteurs sont exprimés au niveau de la BHE, telles les protéines ABC (ATP-Binding Casette) et SLC (Solute Carriers). Il a été montré que l’influx du peptide Abeta à travers la BHE était partiellement médié par le récepteur RAGE (Receptor for Advanced Glycation End products) et son efflux par le récepteur LRP-1 (Low density lipoprotein receptor-related protein 1). De plus, l’implication de transporteurs ABC/SLC dans le passage cérébral du peptide Abeta a été suggérée. Il paraît donc important de caractériser les transporteurs ABC et/ou SLC impliqués dans le transport du peptide Abeta à travers la BHE. D’autre part, l’on peut se demander si, dans le cadre de la MA, la BHE subit des modifications, en termes d’étanchéité, d’expression de transporteurs, de mécanismes de transport, et si, dans ce cas, il y a une modification du transport du peptide Abeta à travers la BHE altérée. Nous avons d’abord montré que des transporteurs ABC et SLC étaient respectivement impliqués dans l’efflux et l’influx des peptides Abeta à travers la BHE. Concernant l’efflux, outre l’Abcb1, nous avons montré qu’Abcg2 et Abcg4 étaient impliquées dans la clairance cérébrale des peptides Abeta. Concernant l’influx, nous avons montré qu’Oatp1a4 pourrait jouer un rôle important dans la pénétration cérébrale des peptides Abeta. De plus, Abca1, principal transporteur ABC impliqué dans le transport du cholestérol, régule indirectement les taux cérébraux d’Abeta. En particulier, nous avons identifié la L-thyroxine et la rosuvastatine comme de puissants inhibiteurs respectifs de l’efflux et de l’influx cérébral d’Abeta. L’ensemble de ces transporteurs d’influx et d’efflux fixe ainsi la clairance cérébrale des peptides Abeta à travers la BHE. Or ces transporteurs sont régulés chez les souris 3xTg-AD (modèle de souris triple transgénique pour la MA exprimant à la fois les pathologies amyloïde et tau), dans des phases précoces et/ou tardives de la MA. Précocement, l’expression de Rage et d’Abca1 sont fortement augmentées au niveau de la BHE chez les souris 3xTg-AD. L’augmentation de Rage dès l’âge de 3 mois laisse supposer une augmentation très précoce de l’influx du peptide Abeta à travers la BHE. Mais cet influx semble être contre-balancé par l’augmentation concomitante d’Abcg4. Quant à Abca1, ne transportant pas directement le peptide Abeta, le rôle de son augmentation graduelle au cours du développement de la MA reste à déterminer. L’ensemble de ces régulations n’étant pas suffisantes pour empêcher l’accumulation cérébrale d’Abeta, des régulations plus tardives semblent se mettre en place, avec notamment l’augmentation de l’expression d’Abcb1 et d’Abcg2, et la diminution d’Oatp1a4. Ces mécanismes semblent donc correspondre à des phénomènes compensatoires ayant pour objectif d’augmenter la clairance cérébrale d’Abeta. Enfin, nous avons montré que l’intégrité physique de la BHE n’était pas altérée chez ces souris 3xTg-AD âgées de 3 à 18 mois. De plus, nos résultats ont montré que le volume vasculaire était diminué de manière précoce, notamment au niveau de l’hippocampe, chez les souris 3xTg-AD par rapport à leurs contrôles. Ce phénomène n’a pas été retrouvé chez les souris APP/PS1 n’exprimant que la pathologie amyloïde. Ces résultats suggèrent un rôle causal et précoce de la protéine tau hyperphosphorylée dans la pathologie de la MA. En conclusion, nos résultats soulignent l’importance de la BHE dans la physiopathologie de la MA. Ce travail de thèse ouvre des perspectives thérapeutiques, mais aussi des pistes pour la compréhension des mécanismes conduisant à une régulation de ces systèmes de transport dans la MA. / Recent studies in Alzheimer's disease (AD) patients have suggested an important role of cerebral clearance of Abeta peptide in the pathogenesis of AD. The blood-brain barrier (BBB) represents a major pathway for exchanges of Abeta between the brain and the peripheral circulation. Many transporters are expressed at the BBB, such as the ABC (ATP-Binding Casette) and SLC (Solute Carriers) proteins. It has been shown that the influx of Abeta peptide across the BBB was partially mediated by the receptor RAGE (Receptor for Advanced Glycation End products) and its efflux by the LRP-1 receptor (low density lipoprotein receptor-related protein 1). On the other hand, the involvement of ABC/SLC transporters in the brain efflux/influx of Abeta peptide has been suggested. It was therefore important to characterize the ABC/SLC transporters involved in the transport of Abeta peptide across the BBB. In addition, the disorders of the BBB have always been suggested in neurodegenerative diseases. The question is whether, in the context of AD, the BBB undergoes changes in terms of integrity, expression of transporters, transport mechanisms, and if, in this case, there is a change in the transport of Abeta peptide across the impaired BBB. We first showed that the BBB regulated the exchange of blood-brain Abeta peptides. Thus, the involvement of efflux (ABCG2 and ABCG4) and influx (Oatp1a4) transporters allows this equilibrium of Abeta peptides between the blood and the brain parenchyma. In addition, ABCA1, the main ABC transporter involved in cholesterol transport, regulates indirectly the brain levels of Abeta. We also identified the L-thyroxine and rosuvastatin as potent inhibitors of the efflux and influx transport of brain Abeta, respectively. All these influx and efflux transporters could control the transport of Abeta peptide across the BBB. However, these transporters are regulated in 3xTg-AD mice (triple transgenic mouse model for AD expressing both amyloid and tau pathologies) in the early and/or late stages of AD. Early, the expression of Abca1 and Rage are strongly increased at the BBB in 3xTg-AD mice. The high expression levels of Rage at the age of 3 months suggest an early increase in the influx transport of Abeta peptide across the BBB. But this increase seems to be compensated by the concomitant increase of Abcg4. As Abca1 does not directly mediate the transport of Abeta peptide, the role of its gradual increase in the development of AD remains to be determined. As all these regulations are not sufficient to prevent the accumulation of cerebral Abeta, the late regulations seem to develop, including increased expression of Abcb1 and Abcg2, and decreased expression of Oatp1a4. These mechanisms seem to correspond to compensatory phenomena with the objective to increase the cerebral clearance of Abeta. Finally, we have shown that the physical integrity of the BBB was not altered in 3xTg-AD mice aging from 3 to18 months. In addition, our results showed that the cerebral vascular volume was reduced early, especially in the hippocampus of 3xTg-AD mice compared to their age-matched controls. This phenomenon was not found in APP/PS1 mice expressing only the amyloid pathology. These results suggest a causal and early role of hyperphosphorylated tau in AD pathology.In conclusion, our results show the importance of the BBB and particularly of Abcg2, Abcg4 and Oatp1a4 transporters in the pathophysiology of AD. Knowledge of these transporters not only opens up therapeutic or prophylactic purposes, but also leads to the further understanding of the regulation mechanisms of these transport systems in AD.

Le cholestérol est le principal stérol présent dans la rétine. Dans sa forme libre, le cholestérol est distribué dans toutes les couches cellulaires de la rétine, alors que le cholestérol estérifié s'accumule essentiellement à la base de l'épithélium pigmentaire rétinien. La capacité intrinsèque de la rétine à synthétiser le cholestérol paraît limitée, ce qui implique nécessairement que des voies extra-rétiniennes participent activement à suppléer la rétine en cholestérol. Les cellules gliales de Müller contribueraient à l'apport de cholestérol aux neurones de la rétine, en particulier pour la formation des synapses. Les conséquences délétères d'une accumulation ou à l'inverse d'un déficit en cholestérol dans les neurones sur leur survie souligne l'importance de maintenir l'équilibre entre l'apport et la néosynthèse du cholestérol d'une part et son élimination d'autre part. Pour cela, la rétine neurale a en particulier la capacité de convertir, pour l'éliminer, le cholestérol en 24S-hydroxycholestérol. En effet, le transport du 24S-hydroxycholestérol au travers des membranes est facilité par la présence d'un groupe hydroxyle supplémentaire, lui conférant une polarité plus importante par rapport au cholestérol. L'enzyme qui catalyse cette réaction est la cholestérol-24S-hydroxylase (CYP46A1). Des liens ont été établis entre CYP46A1, 24S-hydroxycholestérol et processus neurodégénératifs dans le cerveau, suggérant un rôle potentiel dans certaines pathologies comme la maladie d'Alzheimer. CYP46A1 est exprimée dans la rétine neurale, et plus particulièrement dans les cellules ganglionnaires de la rétine. Le rôle de CYP46A1 dans la rétine reste pour l'instant inconnu. Cependant, par analogie avec le cerveau, nous pouvons supposer une fonction dans le contrôle de l'homéostasie du cholestérol dans les neurones et envisager une association avec des pathologies dégénératives de la rétine comme la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Âge (DMLA) ou le glaucome. Dans ce contexte, l'objectif de nos travaux a consisté à évaluer le rôle de la cholestérol-24S-hydroxylase dans la rétine en conditions physiologiques et pathologiques. Par une approche clinique, nous avons trouvé qu'un polymorphisme génétique dans CYP46A1 était un facteur de risque de glaucome (Risque relatif=1,26, intervalle de confiance à 95%=1,006-1,574, p<0,05) (Fourgeux et al. 2009, Invest Ophthalmol Vis Sci 50:5712-7). Par contre, ce polymorphisme génétique n'a pas été retrouvé, en tant que tel, comme facteur de risque chez des patients DMLA, mais pourrait l'être chez les patients non porteurs d'allèles à risque dans les gènes CFH et LOC388715 (Fourgeux et al. 2012, Invest Ophthalmol Vis Sci 53:7026-33). Deux approches expérimentales nous ont permis de suggérer qu'il existe un lien entre le stress des cellules de la rétine et le 24S-hydroxycholestérol. En effet, dans une étude in vivo faite chez le rat, après avoir reproduit une caractéristique principale du glaucome par l'augmentation de la pression intraoculaire, nous avons suggéré le rôle crucial de la glie dans le maintien de l'expression de CYP46A1 au cours de la neurodégénérescence de la rétine (Fourgeux et al. 2012, Acta Ophthalmol, Sep 23 ; doi: 10.1111/j.1755-3768.2012.02490.x.). Enfin, l'inhibition pharmacologique de l'activité CYP46A1 dans la rétine par le voriconazole injecté in vivo chez le rat nous a permis de mettre en évidence que la diminution du contenu en 24S-hydroxycholestérol de la rétine était associée à une dysfonction des cellules ganglionnaires, évaluée par électrorétinographie. En parallèle, nous avons observé une activation gliale, dont l'amplitude était amplifiée par l'inhibition de l'activation microgliale induite par la minocycline [...]

Le cholestérol est le principal stérol présent dans la rétine. Dans sa forme libre, le cholestérol est distribué dans toutes les couches cellulaires de la rétine, alors que le cholestérol estérifié s’accumule essentiellement à la base de l’épithélium pigmentaire rétinien. La capacité intrinsèque de la rétine à synthétiser le cholestérol paraît limitée, ce qui implique nécessairement que des voies extra-rétiniennes participent activement à suppléer la rétine en cholestérol. Les cellules gliales de Müller contribueraient à l’apport de cholestérol aux neurones de la rétine, en particulier pour la formation des synapses. Les conséquences délétères d’une accumulation ou à l’inverse d’un déficit en cholestérol dans les neurones sur leur survie souligne l’importance de maintenir l’équilibre entre l’apport et la néosynthèse du cholestérol d’une part et son élimination d’autre part. Pour cela, la rétine neurale a en particulier la capacité de convertir, pour l’éliminer, le cholestérol en 24S-hydroxycholestérol. En effet, le transport du 24S-hydroxycholestérol au travers des membranes est facilité par la présence d’un groupe hydroxyle supplémentaire, lui conférant une polarité plus importante par rapport au cholestérol. L’enzyme qui catalyse cette réaction est la cholestérol-24S-hydroxylase (CYP46A1). Des liens ont été établis entre CYP46A1, 24S-hydroxycholestérol et processus neurodégénératifs dans le cerveau, suggérant un rôle potentiel dans certaines pathologies comme la maladie d’Alzheimer. CYP46A1 est exprimée dans la rétine neurale, et plus particulièrement dans les cellules ganglionnaires de la rétine. Le rôle de CYP46A1 dans la rétine reste pour l’instant inconnu. Cependant, par analogie avec le cerveau, nous pouvons supposer une fonction dans le contrôle de l’homéostasie du cholestérol dans les neurones et envisager une association avec des pathologies dégénératives de la rétine comme la Dégénérescence Maculaire Liée à l’Âge (DMLA) ou le glaucome. Dans ce contexte, l’objectif de nos travaux a consisté à évaluer le rôle de la cholestérol-24S-hydroxylase dans la rétine en conditions physiologiques et pathologiques. Par une approche clinique, nous avons trouvé qu’un polymorphisme génétique dans CYP46A1 était un facteur de risque de glaucome (Risque relatif=1,26, intervalle de confiance à 95%=1,006-1,574, p<0,05) (Fourgeux et al. 2009, Invest Ophthalmol Vis Sci 50:5712-7). Par contre, ce polymorphisme génétique n’a pas été retrouvé, en tant que tel, comme facteur de risque chez des patients DMLA, mais pourrait l’être chez les patients non porteurs d’allèles à risque dans les gènes CFH et LOC388715 (Fourgeux et al. 2012, Invest Ophthalmol Vis Sci 53:7026-33). Deux approches expérimentales nous ont permis de suggérer qu’il existe un lien entre le stress des cellules de la rétine et le 24S-hydroxycholestérol. En effet, dans une étude in vivo faite chez le rat, après avoir reproduit une caractéristique principale du glaucome par l’augmentation de la pression intraoculaire, nous avons suggéré le rôle crucial de la glie dans le maintien de l’expression de CYP46A1 au cours de la neurodégénérescence de la rétine (Fourgeux et al. 2012, Acta Ophthalmol, Sep 23 ; doi: 10.1111/j.1755-3768.2012.02490.x.). Enfin, l’inhibition pharmacologique de l’activité CYP46A1 dans la rétine par le voriconazole injecté in vivo chez le rat nous a permis de mettre en évidence que la diminution du contenu en 24S-hydroxycholestérol de la rétine était associée à une dysfonction des cellules ganglionnaires, évaluée par électrorétinographie. En parallèle, nous avons observé une activation gliale, dont l’amplitude était amplifiée par l’inhibition de l’activation microgliale induite par la minocycline [...] / Cholesterol is the major sterol found in the retina. In its free form, cholesterol is present in all cell layers of the retina, whereas cholesteryl esters mainly accumulate at the basement of the retinal pigment epithelium. The intrinsic capacity of the retina to synthetize cholesterol appears limited. Some extra-retinal pathways actively participate to cholesterol uptake to the retina. Müller glial cells may contribute to cholesterol supply to retinal neurons, especially for synaptic formation. Cholesterol accumulation or conversely deficiency have deleterious consequences on neuron survival. Maintaining the equilibrium between cholesterol supply and neosynthesis in the one hand and cholesterol elimination in the other hand is crucial. For that purpose, the inner retina converts cholesterol into 24S-hydroxycholesterol. The transport of 24S-hydroxycholesterol across membranes is facilitated by the addition of the hydroxyle group to cholesterol at position 24 of carbon chain since it renders cholesterol more hydrophilic. CYP46A1 (cholesterol 24S-hydroxylase) is the enzyme which catalyzes this reaction. Some links between CYP46A1, 24S-hydroxycholesterol and neurodegenerative processes have been reported in the brain, suggesting a potential role in several pathologies such as Alzheimer’s disease. CYP46A1 is expressed in the neural retina and specifically in retinal ganglion cells. The contribution of CYP46A1 in the retina remains unknown. Moreover by analogy with the brain, we can suggest a function for CYP46A1 in the regulation of cholesterol homeostasis in retinal neurons. Possible associations between CYP46A1 and Age-related Macular Degeneration (AMD) and glaucoma were suspected. In this context, we aimed to evaluate the role of CYP46A1 in the retina in physiological and pathological conditions. Through a clinical approach, we found that a genetic polymorphism in CYP46A1 was a risk factor for glaucoma (Odd Ratio = 1.26 ; 95% CI=1.006-1.574, p<0.05) (Fourgeux et al. 2009, Invest Ophthalmol Vis Sci 50:5712-7). By contrast, this genetic polymorphism was not found as a risk factor in AMD patients, but may become an additional risk factor in patients who do not carry risk allele in CFH and LOC387715 genes (Fourgeux et al. 2012, Invest Ophthalmol Vis Sci 53:7026-33). Two experimental approaches suggested that a link between retinal stress and 24S-hydroxycholesterol does exist. Indeed, in a rat model of glaucoma of elevated intraocular pressure, we suggested the crucial role of CYP46A1 in maintaining CYP46A1 expression in the course of retinal neurodegeneration (Fourgeux et al. 2012, Acta Ophthalmol, Sep 23; doi: 10.1111/j.1755-3768.2012.02490.x.). Pharmacological inhibition of CYP46A1 activity in the retina by voriconazole administered in vivo in the rat highlighted that the decrease in retinal 24S-hydroxycholesterol levels was associated with RGC dysfunction evaluated by electroretinography. In parallel, we observed glial activation in which magnitude was exacerbated when microglia activation was inhibited by minocycline at the same time.In conclusion, by a dual clinical and experimental approach, our works suggest a crucial role for CYP46A1 in maintaining cholesterol homeostasis in the retina in physiological and pathological conditions. Müller glial cell intervention in this process may be suspected especially in pathological conditions of glaucoma