Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 213797.pdf: 598123 bytes, checksum: f46ae31532c19ffd0175779743125ce0 (MD5) / Os produtos de origem natural são utilizados como fonte de medicamentos para tratar enfermidades que acometem o ser humano desde tempos imemoriais. A terapêutica moderna provavelmente não teria se desenvolvido sem o suporte desses produtos. Os organismos vivos, vegetais, microrganismos, animais, são capazes de produzir, transformar e acumular uma série de substâncias não essenciais para o seu crescimento e metabolismo reprodutivo. Estes compostos são denominados de metabólitos secundários, sendo umas das maiores classes de produtos naturais. Com o aparecimento de novas doenças infecciosas e o aumento da resistência bacteriana, surge a necessidade de pesquisas direcionadas ao desenvolvimento de novos antimicrobianos. A Chromobacterium violaceum, é uma bactéria Gram-negativa, de vida livre, que popula solos e águas das regiões tropicais e sub-tropicais. Esta bactéria é responsável pela produção de uma diversidade de metabólitos secundários com grande potencial biotecnológico. Este trabalho teve como objetivo definir estratégias de cultivo, que promovessem o aumento na produção de violaceína e outros metabólitos secundários sintetizados por C. violaceum, bem como avaliar a atividade antibiótica dos principais pigmentos. Sendo assim, estudou a produção de violaceína e pigmentos relacionados, em meios sólidos e líquidos com diferentes fontes de carbono. Foram avaliadas as produções de massa celulares secas, bem como a produção dos pigmentos. Os maiores rendimentos foram em meio LB sólido com glicerol 1%. Os pigmentos foram extraídos em Soxhlet, utilizou-se éter etílico, clorofórmio e metanol como solventes. No extrato etéreo observou-se a predominância de desoxiviolaceína e um pigmento não identificado. Nos extratos metanólicos, violaceína foi o pigmento majoritário. Os pigmentos isolados foram testados para atividade antibiótica contra três espécies bacterianas: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Os resultados mostraram que o extrato metanólico foi mais efetivo sobre P. aeruginosa, na concentração de 125 mg/mL. No entanto, o extrato metanólico nas concentrações analisadas, teve o efeito reduzido sobre as demais bactérias testadas. O extrato etéreo exibiu alta atividade sobre P. aeruginosa. Este extrato mostrou-se o mais efetivo dos extratos sobre as outras linhagens bacterianas testadas. Embora, não obtido o isolamento completo dos pigmentos produzidos por C. violaceum, o extrato etéreo contendo desoxiviolaceína e o pigmento não identificado, sem violaceína, exibiu uma atividade antibiótica promissora.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia Química. / Made available in DSpace on 2012-10-22T01:54:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 212669.pdf: 1833661 bytes, checksum: 70e133626b8e9ea8a2f36eae5af1993f (MD5) / Exopolissacarídeos (EPS) são os principais constituintes de biofilme bacteriano. Esses polímeros, componentes da matriz extracelular bacteriana, têm despertado grande interesse em aplicações industriais e na área médica. Entretanto, têm sido associado com mecanismos de combate bacteriano. A celulose tem sido identificada como um dos EPS da matriz extracelular produzido por várias espécies de bactérias durante a formação de biofilmes. A bactéria Gram-negativa Chromobacterium violaceum, linhagem ATCC 12472, teve seu genoma recentemente seqüenciado pelo Brazilian National Genome Project Consortion. A análise do genoma da C. violaceum mostrou a presença de genes relacionados à biossíntese de celulose, até então desconhecidos. Neste trabalho, analisou-se a estrutura e organização dos genes diretamente envolvidos na biossíntese de celulose, e buscou-se evidências experimentais da presença de celulose na matriz extracelular do biofilme formado por esta bactéria. A metodologia empregada envolveu o uso de ferramentas de bioinformática que exploram informações do seu genoma, como estrutura dos genes, elementos de regulação, domínios e motivos conservados. Ensaios laboratoriais foram utilizados para se obter evidências experimentais das informações genômicas. Estas estratégias permitiram determinar a existência de um operon que compreende cinco genes estruturais codificando as proteínas e enzimas do complexo celulose sintase, como também propor uma via metabólica de biossíntese de celulose a partir de glicose. Identificaram-se ainda 43 ORFs (open reading frames) com domínio GGDEF normalmente associado à atividade de síntese de diguanilmonofosfato cíclico (c-di-GMP) a partir de duas moléculas de guanosina trifosfato (GTP). A molécula c-di-GMP funciona como um componente regulatório de diversas atividades celulares, entre elas a ativação da síntese de celulose. Experimentalmente foi analisado o produto do biofilme formado durante o cultivo de C. violaceum em meio Luria Bertani (LB), culturas estática e agitada. Os resultados obtidos sugerem a presença de celulose como componente do biofilme.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5248_1.pdf: 1569937 bytes, checksum: 3f1b3a3de1d5f859ab866845b409c75b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, pigmentada, aeróbica facultativa, que vive em regiões de climas tropicais e subtropicais, encontrada principalmente, em solos e rios. Seu potencial biotecnológico demonstrado foi através do genoma seqüenciado da C. violaceum ATCC 12472, que apresentou genes desconhecidos relacionados à biossíntese de quitina. Neste trabalho foi avaliada inicialmente a diversidade genética de quatorze linhagens de C. violaceum de diferentes procedências, utilizando métodos bioquímicos e moleculares, das quais duas foram selecionadas para análise do sistema quitinolítico. As linhagens foram crescidas no meio Luria Bertani (LB) e caracterizadas pelo perfil de ácidos graxos e do gene 16S rDNA, e a diversidade genética, pela técnica de rep-PCR. Em seguida, foi realizada a caracterização das linhagens de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 para a biossíntese de quitina, utilizando células crescidas em meio Luria Bertani (LB) com e sem a presença de quitina coloidal 0,2%, sendo quantificada a atividade quitinásica (gel de atividade e ensaios enzimáticos com dímero e trímero) e proteínas totais. As amostras foram analisadas em gel de eletroforese SDSPAGE, corados com Azul de Coomassie G-250 e os géis da atividade quitinásica foram corados com calcofluor. Para a caracterização do gene de quitinase foram utilizadas seqüências codificadoras de quitinase A e endoquitinase (Cv1897 e Cv2736), utilizando-se o DNA genômico de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 como molde na técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), usando oligonucleotídeos específicos. A metodologia empregada envolveu o uso de ferramentas de bioinformática que exploram informações do genoma, como estrutura dos genes, elementos de regulação, domínios e motivos conservados. Os resultados do perfil de ácido graxos e 16S rDNA permitiu a caracterização das linhagens e o rep-PCR demonstrou que as linhagens estudadas apresentam uma diversidade genética. As linhagens de C. violaceum selecionadas apresentaram um perfil diferenciado de atividade quitinolítica em gel desnaturante com a presença de glicol quitina. Nos ensaios com os substratos sintéticos (N,N - diacetilquitobiose e N, N , N -triacetilquitotriose), verificou-se que houve atividade para ambos ossubstratos. Os resultados indicaram que os maiores valores da atividade quitinolítica foram observados usando-se o cromóforo diacetilquitobiose. A seqüência codificadora do gene CV1897 (endoquitinase) apresentou 439 aminoácidos, correspondendo ao domínio quitinase (CDD:29557) da família 19 da glicosil hidrolase (257 aminoácidos), formada por enzimas que catalisam e hidrolisam as unidades β-1,4-N-acetil-D-glucosamina ligadas no polímero de quitina. Além desta região, as bases restantes proporcionaram a formação de dois sítios, um putativo para a construção de açucares e outro constituído por resíduos catalíticos. A seqüência correspondente ao produto do gene Cv2935 sugere uma provável quitinase A no genoma de C. violaceum ATCC 12472 (BrGene), sendo formada por 439 aminoácidos. Observou-se duas regiões: i) a ChtBD3 como um domínio obrigatório para quitina tipo 3 (29..73) e CDD:47799; ii) a quitinase A com um CDD: 33272 responsável pelo transporte e metabolismo de carboidratos (109..419), pertencente a família 18 da glicosil hidrolase. Os resultados obtidos caracterizaram a C. violaceum UCP 1489 com alta identidade com a linhagem ATCC 12472, demonstrando também, ambos aspectos biotecnológico de produção das enzimas quitinase A (exoquitinase) da família 18 e a endoquitinase da família 19

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo70_1.pdf: 2336211 bytes, checksum: 04e8d18d2125932575f4bfe785ae964c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os surfactantes ou tensoativos são moléculas anfifílicas que possuem ação superficial devido à presença de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos numa mesma molécula apresentando a capacidade de atuar na interface de compostos de diferentes naturezas. O interesse em surfactantes de origem microbiana tem aumentado consideravelmente nos últimos anos, especialmente devido ao seu potencial de aplicação industriais e ambientais. Neste trabalho, foi investigado o potencial de cinco linhagens de Chromobacterium violaceum (UCP 1467, UCP 1489, UCP 1552, ATCC 12472 e UCP 1463), isolados de solo e água, na produção de biossurfactantes em meio de produção constituído por resíduos industriais como substratos alternativos de baixo custo. Os efeitos das concentrações dos componentes do meio de produção foram investigados através do planejamento fatorial completo com todas as linhagens de C. violaceum. A linhagem de C. violaceum UCP (1463) demonstrou melhores resultados referente à máxima produção do biossurfactante, evidenciada pelo alcance da redução da tensão superficial da água de 72 mN/m para 26,7 mN/m, em meio formulado com milhocina (0,3%) e glicerina (0,782%), através de um planejamento experimental do tipo Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) após 72 horas de cultivo. O biossurfactante bruto, obtido pelo método de isolamento através da precipitação com sulfato de amônio, com posterior diálise da amostra, mostrouse mais eficiente devido à reduzida quantidade de impurezas no biopolímero, constatadas pela coloração esbranquiçada do biossurfactante. Este biopolímero extracelular, produzido por esta mesma linhagem, foi caracterizado como aniônico, apresentando um valor da concentração micelar crítica (CMC) de 1,5% e capacidade de emulsificação (E24) de 100% utilizando óleo queimado de motor com atividade emulsificante de 6 U.A.E. Verificou-se a presença dos grupamentos éster e ácido carboxílico no biossurfactante selecionado de C. violaceum UCP (1463), sendo caracterizado como polimérico devido a alta composição em carboidratos, lipídeos e proteínas, além de apresentar efetiva estabilidade em todas as faixas de pHs, estabilidade térmica em todas as temperaturas testadas como também, estabilidade nas concentrações de 8 e 10% de NaCl. O potencial do biossurfactante produzido pela linhagem de C. violaceum UCP (1463), em meio constituído por resíduos industriais, foi comprovado pela eficiência deste biopolímero na remoção de óleo queimado de motor adsorvido em solo arenoso, removendo 86% deste óleo adsorvido, indicando desta forma, seu potencial em aplicações biotecnológicas

Orientador: Nelson Duran / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-27T02:13:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rettori_Daniel_D.pdf: 4249874 bytes, checksum: 2531a18d55eecc344fc8b76c6a9683da (MD5) Previous issue date: 2000 / Doutorado

Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T06:37:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_StefanieCostaPinto_M.pdf: 23177514 bytes, checksum: 4171205441f1112d18413fd5eed95ac3 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A violaceína é um pigmento violeta extraído da bactéria Gram-negativa Chromobacterium violaceum. Diversos trabalhos atribuíram à violaceína diferentes atividades biológicas tais como bactericida, antiviral, fungicida e antitumoral. Os efeitos da violaceína também foram observados contra protozoários patogênicos, como Leishmania sp e Trypanossoma sp. Neste trabalho, avaliamos a atividade antimalárica da violaceína in vitro e in vivo contra Plasmodium humano e murino, respectivamente. Neste sentido, a violaceína se mostrou tão eficiente quanto o quinino em eliminar P. falciparum (3D7), mas três vezes menos eficiente que a cloroquina. Além disso, não encontramos diferença na sua atividade contra formas jovens e maduras, mostrando uma atuação similar nos diferentes estágios de desenvolvimento do parasita. Os experimentos in vivo utilizando camundongos infectados com PcchAS tratados por 11 dias consecutivos (0-10) revelaram uma potente atividade desta droga, inibindo o desenvolvimento parasitário em até 86% no pico da parasitemia. Também foi encontrado 60% de inibição quando o tratamento iniciou-se 5 dias após o estabelecimento da infecção. Quando administrada em animais infectados com uma cepa murina letal (PcchAJ), a violaceína protegeu 80% dos animais, em contraste à 100% de mortalidade dos animais não tratados. A comparação do ED50 demonstrou que a violaceína é tão eficiente quanto o artesunato e 2 vezes mais ativa que a cloroquina, sob as mesmas condições de tratamento. Finalmente, animais naive tratados com a violaceína durante 11 dias consecutivos não mostraram alterações na densidade de glóbulos vermelhos e no peso. Também não foi observado nenhum dano morfológico nos cortes histológicos. Coletivamente, estes resultados demonstram claramente o potencial antimalárico da violaceína e abre perspectivas para o entendimento dos mecanismos envolvidos na inibição parasitária por este composto. / Abstract: Violacein is a violet pigment extracted from the bacteria Gram-negative Chromobacterium violaceum. Growing bodies of evidences have implicated violacein as an antimicrobial, antifungal, antitumoral, and a moderate trypanocidal and leishmanial activity has also been observed. Herein, we evaluated the anti-malarial activity of violacein against murine and human-derived Plasmodium. Indeed, violacein showed to be efficient in killing P. falciparum (3D7 strain) as much as quinine, but 3 fold less pronounced than chloroquine. Moreover, this anti-Plasmodial activity detected was direct against both young and mature stages of this human parasite. In vivo experiments in P. c. chabaudi AS (PcchAS) infected mice treated during 10 consecutive days after infection (0-10) revealed a powerful activity of this drug, by inhibiting parasite burden up to 86%. Also, 60% of inhibition was noticed when violacein was administrated 5 days after infection establishment. When administrated in mice infected with a lethal strain of murine-derived Plasmodium (PcchAJ) violacein protected 80% of these mice, in contrast to 100% of mortality reported to the non-treated animals. ED50 comparisons demonstrated that violacein was efficient as much as artesunate and twice more active than chloroquine. Finally, naïve mice inject with violacein during 10 consecutive days did not display alterations on red blood cell density; weight and neither morphological damages were noticed in spleen and liver histological sections. Collectively, these data clearly demonstrated the anti-malarial effect of violacein and open perspectives to understating the mechanisms involved in killing this parasite by this compound. / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Yes / Bacterial quorum sensing has been implicated in a number of pathogenic bacterial processes, such as biofilm formation, making it a crucial target for developing materials with a novel antibiotic mode of action. This paper describes poly(N-isopropyl acrylamide) that has been covalently linked, at multiple chain ends, to homoserine lactone to give a highly branched polymer functionalized with a key messenger molecule implicated in QS. This novel functional material has shown promising anti-QS activity in a Chromobacterium violaceum assay.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Chromobacterium violaceum à uma bactÃria Gram-negativa, saprÃfita, nÃo patogÃnica e de vida livre. A anotaÃÃo do genoma dessa espÃcie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicaÃÃes em diversas Ãreas. Dentre esses produtos estÃo vÃrias quitinases, enzimas capazes de degradar quitina, um polissacarÃdeo de N-acetil-β-D-glucosamina presente na parede celular de muitos fungos e no exoesqueleto de insetos e crustÃceos. As quitinases sÃo de grande interesse biotecnolÃgico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados Ãteis, e tambÃm para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrÃcolas. O presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterizaÃÃo bioquÃmica, estrutural e biolÃgica de uma quitinase recombinante (CV1897), da famÃlia 19 das glicosil hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A sequÃncia completa da ORF CV1897 (codificando CV1897PS+, com o peptÃdeo sinal nativo) foi amplificada por reaÃÃo em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET302/NT-His e pPICZαA para expressÃo em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A sequÃncia parcial da ORF (rCV1897PS-, sem o peptÃdeo sinal nativo) foi expressa apenas em P. pastoris. Em E. coli, a rCV1897PS+ foi produzida principalmente em corpos de inclusÃo, de forma insolÃvel e inativa. Em P. pastoris, as proteÃnas (rCV1897PS+ e rCV1897PS-) foram secretadas para o meio de cultura de forma solÃvel e funcional. As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade em nÃquel imobilizado, com rendimentos de 1,8 mg/L (rCV1897PS+) e 2,1 mg/L (rCV1897PS-), sendo detectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presenÃa de SDS (SDS-PAGE) como duas isoformas com massas moleculares diferentes (43,2 kDa e 51,4 kDa; 44 e 50 kDa, respectivamente). A quitinase recombinante (CV1897PS+) mostrou atividade Ãtima em Ph 5,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de atà 40 ÂC por 30 min. A Rcv1897 apresentou atividade quitinÃsica frente a quitina coloidal e glicol-quitina (em gel SDS-PAGE). Os espectros de dicroÃsmo circular revelaram que a estrutura da proteÃna possui predominantemente estrutura secundÃria do tipo α-hÃlice (37%), com 26% de fitas-β e 38% de estrutura desordenada. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que a proteÃna foi produzida na sua conformaÃÃo enovelada. A rCV1897PS+ inibiu a germinaÃÃo de conÃdios e o crescimento micelial dos fungos fitopatogÃnicos Penicillium herquei e Colletotrichum lindemuthianum. As quitinases rCV1897PS+ e rCV1897PS- em associaÃÃo com o fluconazol atuaram de forma sinÃrgica contra diferentes cepas da levedura patogÃnica Candida tropicalis. Os estudos bioquÃmicos, estruturais e biolÃgicos da rCV1897 poderÃo ser Ãteis para aplicaÃÃo biotecnolÃgica dessa enzima. / Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The annotation of the genome of this species revealed many genes encoding products with potential applications in many areas. Among these products are several chitinases, which are enzymes capable of degrading chitin, a polysaccharide of N-acetyl-β-D-glucosamine. Chitin is found in the cell wall of many fungi and in the exoskeleton of insects and crustaceans. Chitinases are of great biotechnological interest because these enzymes can be used to produce useful derivatives from chitin, and also to be exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase (CV1897) belonging to family GH19 from C. violaceum ATCC 12472. The complete sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP+, with the native signal peptide) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET302/NT-His and pPICZαA, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. The partial sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP-, without the native signal peptide) was expressed only in P. pastoris. In E. coli the rCV1897SP+ was mainly produced as insoluble inclusion bodies. In P. pastoris, the two versions of the protein (rCV1897PS+ and rCV1897PS-) were secreted into the culture medium, in their soluble and functional form. The enzymes were purified by affinity chromatography on immobilized nickel ions, with yields of 1.8 mg/L (rCV1897PS+) and 2.1 mg/L (rCV1897PS-), being detected by electrophoresis as two isoforms with different molecular weights. The recombinant chitinase (rCV1897PS+) showed optimal hydrolytic activity at pH 5.0 and was active after treatement at temperatures up to 40 ÂC for 30 min. The rCV1897 showed chitinolytic activity against colloidal chitin and glycol-chitin on SDS-PAGE. Circular dichroism spectra showed that the protein has predominantly α-helical arrangements (37%), also having 26% of β-strands and 38% disordered structure. The fluorescence spectra revealed that the protein was produced in their folded conformation. The rCV1897PS+ inhibited the conidial germination and mycelial growth of the phytopathogenic fungi Penicillium herquei and Colletotrichum lindemuthianum. Both rCV1897PS+ and rCV1897PS- in combination with fluconazole acted synergistically against different strains of the human pathogenic yeast Candida tropicalis. The biochemical, structural and biological studies of rCV1897 may be useful for biotechnological application of this enzyme.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2008 / Made available in DSpace on 2012-10-24T02:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 275389.pdf: 3136937 bytes, checksum: 8db60fa4cf0a2a81b42e9d06190468e5 (MD5) / Este trabalho teve por objetivo a obtenção de poli-hidroxialcanoatos (PHAs) biossintetizados por Chromobacterium violaceum, em diferentes condições de escala, concentração e variação de substrato, nutrientes limitantes e pH. Embora a produção de PHAs por C. violaceum tenha sido um dos motivos pelos quais este microrganismo tenha tido seu genoma completamente sequenciado por um consórcio envolvendo grupos de pesquisa de todo o país, não se tem conhecimento de nenhum estudo sistemático da produção desses poliésteres em escalas de laboratório e de bancada. As propriedades dos biopolímeros produzidos são consequência da sua composição molecular, que pode ser influenciada pelas condições de operação, assim como do(s) substrato(s) utilizado(s). Em particular, o grau de copolimerização é um parâmetro que pode interferir diretamente no tipo de aplicação do PHA produzido. Como a C. violaceum é capaz de produzir o homopolímero de poli-hidroxivalerato (PHV) e copolímeros PHBV, que incorporam unidades de 3-hidroxibutirato (3HB), isto é, P(3HB-co-3HV), este estudo concentrou seus esforços na obtenção de diferentes graus de incorporação de unidades de valerato no copolímero, visando características desejáveis para novas aplicações comerciais. Foram estudados os copolímeros de 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV) produzidos por C. violaceum em agitador orbital de laboratório e biorreator de 4 litros, a 30°C sob limitação de nitrogênio ou de fósforo, utilizando diferentes pH (6 e 7), concentrações de glicose (10, 20 e 30 g l-1) e concentração de propionato (0 e 10 mM). Os resultados demonstraram que a concentração de substrato, o pH e a adição de propionato afetam a quantidade total dos PHAs produzidos. Um acúmulo de 70% (g.g-1) foi obtido sob limitação de nitrogênio em agitador orbital a pH 7, 10 g l-1 de glicose e sem adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato aumentou a incorporação de unidades de valerato, mas diminuiu a quantidade de biomassa produzida. O controle do pH e da aeração nas condições de cultivo utilizando o biorreator aumentou a quantidade de biomassa formada, alcançando um máximo de 6,54 g l-1 sob limitação de fósforo, em pH 7, 20 g l-1 de glicose, sem a adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato às culturas realizadas em biorreator, contudo, não aumentou a incorporação de 3HV ao copolímero obtido, sugerindo que o controle do pH tem influência sobre a composição do PHBV acumulado. A caracterização dos polímeros extraídos dos cultivos em biorreator demonstrou que a incorporação de unidades de valerato ao polímero diminuiu a temperatura de fusão do material em relação ao PHB puro, ficando entre 174 e 178°C. A temperatura máxima de degradação do polímero também foi influenciada pelo percentual de unidades de valerato, ficando entre 302 e 312°C, cerca de 30°C acima da temperatura de degradação do PHB puro (278°C). A pureza dos copolímeros extraídos foi superior a 95%. As características físico-químicas analisadas destes biopolímeros (temperaturas de fusão, transição vítrea, degradação inicial, degradação total, grupos funcionais, incorporação de violaceína no biopolímero, diâmetro de poros das membranas formadas) sugerem que esses materiais podem ser utilizados para o desenvolvimento de novas aplicações nas áreas biotecnológica e biomédica como, por exemplo, na produção de novos arcabouços de engenharia de tecidos.Este trabalho teve por objetivo a obtenção de poli-hidroxialcanoatos (PHAs) biossintetizados por Chromobacterium violaceum, em diferentes condições de escala, concentração e variação de substrato, nutrientes limitantes e pH. Embora a produção de PHAs por C. violaceum tenha sido um dos motivos pelos quais este microrganismo tenha tido seu genoma completamente sequenciado por um consórcio envolvendo grupos de pesquisa de todo o país, não se tem conhecimento de nenhum estudo sistemático da produção desses poliésteres em escalas de laboratório e de bancada. As propriedades dos biopolímeros produzidos são consequência da sua composição molecular, que pode ser influenciada pelas condições de operação, assim como do(s) substrato(s) utilizado(s). Em particular, o grau de copolimerização é um parâmetro que pode interferir diretamente no tipo de aplicação do PHA produzido. Como a C. violaceum é capaz de produzir o homopolímero de poli-hidroxivalerato (PHV) e copolímeros PHBV, que incorporam unidades de 3-hidroxibutirato (3HB), isto é, P(3HB-co-3HV), este estudo concentrou seus esforços na obtenção de diferentes graus de incorporação de unidades de valerato no copolímero, visando características desejáveis para novas aplicações comerciais. Foram estudados os copolímeros de 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV) produzidos por C. violaceum em agitador orbital de laboratório e biorreator de 4 litros, a 30°C sob limitação de nitrogênio ou de fósforo, utilizando diferentes pH (6 e 7), concentrações de glicose (10, 20 e 30 g l-1) e concentração de propionato (0 e 10 mM). Os resultados demonstraram que a concentração de substrato, o pH e a adição de propionato afetam a quantidade total dos PHAs produzidos. Um acúmulo de 70% (g.g-1) foi obtido sob limitação de nitrogênio em agitador orbital a pH 7, 10 g l-1 de glicose e sem adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato aumentou a incorporação de unidades de valerato, mas diminuiu a quantidade de biomassa produzida. O controle do pH e da aeração nas condições de cultivo utilizando o biorreator aumentou a quantidade de biomassa formada, alcançando um máximo de 6,54 g l-1 sob limitação de fósforo, em pH 7, 20 g l-1 de glicose, sem a adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato às culturas realizadas em biorreator, contudo, não aumentou a incorporação de 3HV ao copolímero obtido, sugerindo que o controle do pH tem influência sobre a composição do PHBV acumulado. A caracterização dos polímeros extraídos dos cultivos em biorreator demonstrou que a incorporação de unidades de valerato ao polímero diminuiu a temperatura de fusão do material em relação ao PHB puro, ficando entre 174 e 178°C. A temperatura máxima de degradação do polímero também foi influenciada pelo percentual de unidades de valerato, ficando entre 302 e 312°C, cerca de 30°C acima da temperatura de degradação do PHB puro (278°C). A pureza dos copolímeros extraídos foi superior a 95%. As características físico-químicas analisadas destes biopolímeros (temperaturas de fusão, transição vítrea, degradação inicial, degradação total, grupos funcionais, incorporação de violaceína no biopolímero, diâmetro de poros das membranas formadas) sugerem que esses materiais podem ser utilizados para o desenvolvimento de novas aplicações nas áreas biotecnológica e biomédica como, por exemplo, na produção de novos arcabouços de engenharia de tecidos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:37:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 303348.pdf: 1152772 bytes, checksum: a3e38c1e81994d268ca4f9b7b93e6cae (MD5) / Os PHAS são um grupo de poliésteres acumulados sob a forma de grânulos intracelulares por inúmeras bactérias, como reserva de carbono e energia. Entre os PHAs mais estudados estão os polímeros de cadeia curta PHB e P(3HB-co-3HV). O conhecimento das vias bioquímicas e enzimas envolvidas na biossíntese e degradação dos PHAs podem auxiliar na implementação de estratégias para sua produção industrial a partir de substratos renováveis e de baixo custo. Isolados de Escherichia coli recombinante contendo os genes de biossíntese de PHAs são capazes de acumular até 90 % (m/m) de biomassa seca de biopolímero. Este trabalho teve como objetivo geral a produção de PHA por Escherichia coli recombinante contendo a PHA sintase de Chromobacterium violaceum e Cupriavdus necator, em presença de soro de queijo. Neste estudo, foi avaliada a capacidade de produção de PHA por três isolados de E. coli (DH5?, JM101 e DH10B), a especificidade da enzima PHA sintase de C. violaceum em E. coli recombinante na produção de P(3HB-co-3HV) em presença de ácido propiônico e a composição do meio de cultivo, através de técnica de planejamento experimental (DCCR), onde as variáveis de estudo foram a quantidade de soro de queijo e concentração de glicose na produção de PHA, concentração de ácido propiônico na incorporação de unidades de valerato e o efeito da adição de IPTG como indutor de expressão gênica. Os resultados mostraram comportamento diferenciado da PHA sintase de C. violaceum para cada um dos isolados de E. coli estudadas sobre a produção de PHB. A PHA sintase de C. violaceum quando inserida em E. coli e em presença de ácido propiônico é capaz de incorporar 8,83 mol % de unidades de 3HV. Uma produção de PHA igual a 0,43 g de MCS.L-1 foi observada, em meio contendo 37 % (v/v) de soro de queijo, 2 g.L-1 de glicose, 4 mmol.L-1 de ácido propiônico na ausência de IPTG. Conclui-se que é possível produzir PHA a partir de isolados JM101 de E. coli contendo os genes da PHA sintase de C. violaceum a partir de soro de queijo, na presença ou ausência de indutor (IPTG). / The PHAS is a group of polyesters accumulated in the form of intracellular granules by many bacteria as carbon and energy reserves. Among the most studied PHAs are the short-chain polymers PHB and P (3HB-co-3HV). The information of biochemical pathways and enzymes involved in biosynthesis and degradation of PHAs can support in the strategies implementation for industrial production across renewable and low cost substrates. Recombinant strains of Escherichia coli containing the genes of the PHAs biosynthesis, are able to accumulate up 90% (w/w) of dry biomass biopolymer. This study aimed at the production of PHA by recombinant E. coli containing the Chromobacterium violaceum and Cupriavidus necator PHA synthase in the presence of cheese whey. This study evaluated the capacity to production of PHA by three strains of E. coli (DH5á, DH10B and JM101), the specificity of the enzyme PHA synthase of C. violaceum in E. coli recombinant in the production of P (3HB-co-3HV) in presence of propionic acid and the composition of the culture media, through experimental planning technique (DCCR), where the variables were the amount of cheese whey and concentration of glucose in the production of PHA, propionic acid concentration on the incorporation of valerate units and the effect of the added IPTG to induce gene expression. The results showed different behavior of the PHA synthase of C. violaceum for each strains of E. coli studied on the production of PHB. The PHA synthase of C. violaceum when inserted into E. coli and in the presence of propionic acid is able to incorporate valerate units. (8.83 mol% of 3HV units). A production of PHA (0.43 gCDW.L-1) was observed in medium containing 37% (v/v of cheese whey, 2 g.L-1 glucose, 4 mmol.L-1 propionic acid and absence of IPTG. Concluded that it is possible to production of PHA across strains of E. coli recombinant containing the PHA synthase of C. violaceum.