CANUTO, J. A. Efeitos da Violaceína sobre as formas evolutivas de Trypanosoma cruzi. 2016. 78 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-13T12:12:37Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_jacanuto.pdf: 1383413 bytes, checksum: 294fb79f391911aa314db8d5184e0e10 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-13T12:12:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_jacanuto.pdf: 1383413 bytes, checksum: 294fb79f391911aa314db8d5184e0e10 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-13T12:12:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_jacanuto.pdf: 1383413 bytes, checksum: 294fb79f391911aa314db8d5184e0e10 (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / The World Health Organization estimates that about 7 to 8 million people are infected with Trypanosoma cruzi in the world. Treatment of Chagas disease has limited efficacy and side effects that limit tolerability and patient compliance. The search for new therapeutic alternatives from bioactive substances has grown significantly in recent years. Violacein (VIO), a bacterial pigment produced by Chromobacterium violaceum has shown several biological actions, among them, antiulcer action, antitumor, antiviral, and antiparasitic. In this paper, we studied the effects of VIO on the evolutionary forms of Trypanosoma cruzi. Epimastigotes were cultured in LIT at 28 ° C in the presence of VIO (0.97; 1.9; 3.9; 7.8; 15.62; 31.25; 62.5; 125; 250 ; 500; 1000μM) for 24, 48 and 72 hours. The trypomastigotes were obtained after infection in LLC-MK2 cells resuspended in DMEM 2% FBS and incubated with VIO (0.97; 1.9; 3.9; 7.8; 15.62; 31,25μM ) for 24h. amastigotes were cultivated on circular coverslips within culture plates containing LLC-MK2 cells and treated with violacein (4.97 and 9.94 mM). Cytotoxicity on LLC-MK2 mammalian cells was assessed using the MTT reduction assay, after incubation with VIO (3.9; 7.8; 15.62; 31.25; 62.5; 125; 250; 500μM ) for 24h. The evaluation of the process of cell death was made from the marking epimastigotes with 7AAD and Annexin V-PE after treatment with VIO (51.39 and 102,78μM). To determine the production of reactive oxygen species, epimastigotes were incubated with VIO (51.39 and 102,78μM). In determining the effect on the mitochondrial membrane potential, it was used Rhodamine 123 marker in epimastigotes treated with VIO (102,78μM). In epimastigotes, the substance showed trypanocidal action, with IC50 value of 51.39; 104.7 67,78μM and 24, 48 and 72h of treatment, respectively. In trypomastigotes, the IC 50 was 4,97μM in 24 hours. The analysis of amastigotes reduced the percentage of infected cells and the survival rate of these, at 24 and 48 hours at concentrations of 4.97 and 9.94 uM. In determining the cytotoxic effect on LLC-MK2, there was obtained an IC50 of 47,91μM. The analysis of the mechanisms of cell death allowed to infer that the VIO cause death in parasites predominantly by apoptosis. It was observed the production of reactive oxygen species (ROS), which can contribute to the aforementioned type of death. It was also observed a reduction in the mitochondrial membrane potential in the treated groups. All experiments were performed in triplicate (n = 3). For comparison of the experimental groups, the ANOVA was used, with post-test Dunnett, using p <0.05 as significance criterion. Thus, VIO presented trypanocidal effects on all of the evolutionary cycle of the parasite forms, suggesting involvement of reactive oxygen species and changes in mitochondrial membrane potential in the process of cell death by apoptosis. / A Organização Mundial de Saúde estima que aproximadamente 7 a 8 milhões de pessoas encontram-se infectadas pelo Trypanosoma cruzi no mundo. O tratamento da doença de Chagas apresenta eficácia limitada e efeitos colaterais que limitam a tolerabilidade e a adesão dos pacientes. A busca de novas alternativas terapêuticas a partir de substâncias bioativas cresceu bastante nos últimos anos. A violaceína (VIO), um pigmento bacteriano produzido por Chromobacterium violaceum tem mostrado diversas ações biológicas, dentre elas, ações antiulcerogênica, antitumoral, antiviral e antiparasitária. No presente trabalho, estudamos os efeitos da VIO sobre as formas evolutivas do Trypanosoma cruzi. As formas epimastigotas foram cultivadas em meio LIT, a 28°C, na presença de VIO (0,97; 1,9; 3,9; 7,8; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000μM) por 24, 48 e 72h. As formas tripomastigotas, foram obtidas após infecção em células LLC-MK2, ressuspensas em meio DMEM 2% de SBF e incubadas com VIO (0,97; 1,9; 3,9; 7,8; 15,62; 31,25μM) por 24h. Formas amastigotas foram cultivadas em lamínulas circulares no interior de placas de cultura contendo células LLC-MK2 e tratadas com violaceína (4,97 e 9,94 μM). A citotoxicidade sobre células de mamíferos LLC-MK2 foi avaliada por meio do ensaio de redução do MTT, após incubação com VIO (3,9; 7,8; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250; 500μM) por 24h. A avaliação do processo de morte celular foi feita a partir da marcação de formas epimastigotas com 7AAD e Anexina V-PE após tratamento com VIO (51,39 e 102,78μM). Para a determinação da produção de espécies reativas de oxigênio, formas epimastigotas foram incubadas com VIO (51,39 e 102,78μM). Na determinação do efeito sobre o potencial de membrana mitocondrial, foi utilizado o marcador Rodamina 123 em formas epimastigotas tratadas com VIO (102,78μM). Em formas epimastigotas, a substância demonstrou ação tripanocida, com valor de CI50 igual a 51,39; 104,7 e 67,78μM em 24, 48 e 72h de tratamento, respectivamente. Em formas tripomastigotas, a CI50 foi de 4,97μM em 24h. A análise sobre formas amastigotas reduziu o percentual de células infectadas e o índice de sobrevivência destes, nos tempos de 24 e 48h, nas concentrações de 4,97 e 9,94 μM. Na determinação do efeito citotóxico sobre LLC-MK2, obteve-se uma CI50 de 47,91μM. A análise dos mecanismos de morte celular permitiu inferir que a VIO causa morte nos parasitos predominantemente por apoptose. Foi observado a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), que podem contribuir para o tipo de morte supracitado. Foi ainda observada a redução do potencial de membrana mitocondrial nos grupos tratados. Todos os experimentos foram realizados em triplicata (n=3). Para comparação dos grupos experimentais, foi utilizado o teste estatístico ANOVA, com pós-teste de Dunnet, utilizando p<0,05 como critério de significância. Dessa forma, a VIO apresentou efeitos tripanocida em todas as formas do ciclo evolutivo do parasito, sugerindo envolvimento de espécies reativas de oxigênio e alterações no potencial de membrana mitocondrial no processo de morte celular por apoptose.

Orientador: Nelson Eduardo Duran Caballero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-21T11:03:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rettori_Daniel_M.pdf: 1599329 bytes, checksum: aed98aebab06459e3c12b58b794e9dae (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6277_1.pdf: 1258637 bytes, checksum: 3bd6fe754154b1007ead8a3fb3326544 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / desvio no uso dos códons podem ocorrer devido a vários fatores. Entre provariotos, o uso de códons sinônimos é atribuido ao equilíbrio existente mutação e seleção natural. Um determinado subconjunto de códons pode frequentemente ser observado nas regiões do genoma onde uma alta eficiência traducional é requerida. O uso de códons de uma beta-proteobactéria, Chromobacterium violaceum, é deswcrito aqui pela primeira vez. O presente estudo teve como objetivo a identificação das principais causas da variação do uso de códons no genoma da C. violaceum ATCC 12472. Uma análise de correspondência (CoA) da utilização relativa de códons sinônimos (RSCU) foi empregada para investigar a variação do uso de códons sinônimos entre os genes. Os resultados mostraram que um dos maiores determinantes desta variação é o conteúdo de GC que mostrou correlação direta com o primeiro eixo principal da CoA. Observou-se também uma forte correlação inversa entre o número relativo de códons (ENc) e o conteúdo Guanina/Citosina na terceira posição (GC3), mostrando que o uso de códons também sofre influência da composição em nucleotídeos. Ao contrário do que observado em alfa-proteobactérias, a assimetria das fitas não pareceu influenciar a composição de aminoácidos ou o número de genes, por outro lado o uso de códosn teve alguma influência. A distribuição semelhante dos genes nas fitas contínua e descontínua apontou para aus~encia de conflito entre transcrição e replicação, provavelmente devido a uma tradução otimizada e a uma replicação muito lenta. A generealidade destas observações entre beta-proteobactérias dependerá de novos estudos com este grupo de microrganismos

Orientador: Nora Marcela Haun Quiros / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T15:49:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio_ReginaVasconcellos_D.pdf: 4164743 bytes, checksum: 1165bdb91953c41821709ee656da6cb9 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Neste trabalho foram estudadas algumas condições de cultivo da Chromobacterium violaceum (cepa BB-78) com o objetivo de aumentar a produção da violaceína, um pigmento produzido pela bactéria, que apresenta atividades tripanocida e antibiótica. Verificou-se que glicose e frutose são fontes de carbono que inibem a produção de violaceína embora favoreçam a produção de massa celular. Baixas concentrações de glicose e a utilização de fontes de carbono de difícil metabolismo, tais como amido, lactose, manitol e sacarose, favoreceram a produção de violaceína, porém o crescimento celular foi bastante reduzido sob tais condições. Observou-se que a produção de violaceína chega a ser até 36 vezes maior na presença de meios sólidos, quando comparada aos meios líquidos correspondentes, sendo marcadamente maior na presença de grãos de arroz cozido. Metabólitos indólicos, tais como: triptofano, ácido 3-indol acético e 5-hidroxitriptamina, produzidos pela bactéria, aumentaram a eficiência da produção de violaceína., expressa como a razão entre a concentração de violaceína e o peso seco da massa celular, em até 40%, como foi o caso do triptofano. A isatina, também produzida pela bactéria, não teve efeito estimulatório sobre a eficiência da biossíntese de violaceína embora tenha apresentado um efeito indutor sobre esta via na ausência de outros compostos indólicos no meio de cultura, aumentando a eficiência de produção de violaceína 20 vezes em relação ao controle. Ensaios de incorporação do ácido 3-indol acético (IAA) à molécula de violaceína., mostraram que este é integralmente incorporada ao pigmento. Foram sintetizadas duas carboxiamidas, CBX-l e CBX-2, sendo a primeira a partir da condensação do IAA à 5-hidroxitriptamina e a segunda a partir da condensação do IAA à triptamina. Enquanto a primeira foi capaz de aumentar a eficiência da biossíntese de violaceína em 42%, indicando que esta seja um importante intermediário desta via, a CBX-2 não teve efeito algum sobre a biossíntese de violaceína. Devido às semelhança estruturais das carboxiamidas com a violaceína., ambas foram testadas quanto à atividade tripanocida. A CBX-2, além de se apresentar bastante efetiva contra formas amastigotas e tripomastigotas de Trypanosoma cruzi (cepa Y), foi também menos tóxica sobre células V79 de hamster chinês que nifurtimox e metilol violaceína., se constituindo num composto promissor a ser melhor testado como quimioterápico. Por outro lado, a CBX-1 foi pouco efetiva contra T. cruzi / Abstract: Violacein is a pigment produced by Chromobacterium violaceum that has shown trypanocide and antibiotic activity. To improve the violacein biosynthesis, the bacteria growth conditions were studied. Glucose and fructose were shown to inhibit the pigment production although they have stimulated the cellular mass production. Low concentrations of these sugars and other carbon sources slowly metabolized by this bacterium have shown to increase violacein production although cellular mass was reduced in such conditions. Violacein production increased until thirty six fold when C. violaceum was grown in solid medium, being much higher in cooked rice grains. Violacein production efficiency (expressed as the ratio of violacein production and cellular mass, dry weight) was increased by indolic compounds such as tryptophan, indole acetic acid and 5-hydroxytriptamine until forty percent, as did tryptophan. Isatin had no stimuli on violacein biosynthesis, but it increased twenty fold its efficiency when no other indole sources were present in the medium. From experiments with labelled 2_14C and 1_14C-indole acetic acid (14C-IAA), it was concluded that these compounds were incorporated into violacein molecule. Two carboxamides were synthesized, N-ethyl-(5hydroxy-indol-3-yl)-2-indolylethyl amide (CBX1) and N-ethyl-(indol-3-yl)-2-indoliethylamide (CBX-2). CBX-1 increased the violacein efficiency production in forty two percent, this is indicative that this is an important intermediate in violacein biosynthesis. CBX-2 had no effect on violacein efficiency production. Due the structural's similarities between the CBX-1, CBX-2 and violacein, the carboxiamides were assayed to trypanocide activities. Only CBX-2 has shown significant activity on amastigotes and trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi (Y strain). It exhibited lower toxicity than nifurtimox and metilol violacein, on V79 chinese hamster cells being a promissory compound to Chagas desease chemotherapy / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. / Made available in DSpace on 2013-07-15T22:45:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 223237.pdf: 2071979 bytes, checksum: dba22a02825ff94d9450282e6acca62a (MD5) / Microrganismos, cujo genoma já foram completamente seqüenciados, como é o caso da Chromobacterium violaceum, possuem dados de anotação genômica em geral produzidos por uma equipe que analisa a fisiologia do organismo e os correlaciona com os dados produzidos pelo projeto de seqüenciamento. Esses dados são geralmente armazenados em bases de dados públicas, e precisam muitas vezes ser verificados, ou seja, validados por via experimental. Todavia, os recentes avanços na área de bioinformática e biologia computacional permitem que certas condições fisiológicas sejam verificadas computacionalmente como, por exemplo, a existência ou não de uma dada via metabólica. Vários grupos têm desenvolvido técnicas para predição de vias metabólicas de organismos a partir da anotação do genoma, produzindo bases de dados integradas via/genoma (pathway/genome database). Este trabalho teve como objetivo construir uma base de dados para a C. violaceum (CvioCyc), uma bactéria Gram-negativa, seqüenciada pelo Brazilian National Genome Project Consortium, de grande potencial biotecnológico e biomédico. A C. violaceum produz um pigmento violeta conhecido como violaceína, ao qual são atribuídas propriedades anti-tumorais, anti-chagazíticas, entre outras; além disso, essa bactéria é capaz de produzir biopolímeros de grande interesse comercial. A base de dados via/genoma - CvioCyc (cviocy.intelab.ufsc.br), criada a partir do conjunto de softwares Pathway Tools, mostrou-se uma importante ferramenta de análise do genoma da C. violaceum. Através da análise de 61 vias metabólicas, de um total de 233 geradas automaticamente pelo software, 17 vias foram removidas (27,86%) e 44 mantidas (72,13%). Além da inclusão da via de biossíntese da violaceína a partir do aminoácido triptofano, essas 61 vias foram diretamente curadas a partir dos resultados do Pathway Tools, da análise de dados da literatura, e pelo uso de várias outras ferramentas de bioinformática disponíveis na web, tais como ferramentas BLAST e bases de dados de enzimas (KEGG, ENZYME e BRENDA). Trinta e nove ORFs (quadros abertos de leitura), relacionadas às vias analisadas, foram alteradas na base CvioCyc. Isto representa aproximadamente 24,3% de erro numa amostra de 160 ORFs analisadas. Este resultado está dentro da faixa de erros comumente encontrada na literatura, que varia de 8% a 25%. Vários erros se encaixam nos erros de anotação mais comumente encontrados na literatura, como ORFs falso-positivas, falso-negativas, erros de digitação, e falta de padronização nos nomes de enzimas e de genes. A análise dos genes envolvidos na biossíntese da violaceína nos permite sugerir que a ORF CV3270 pode fazer parte do operon vio, de acordo a predição do Pathway Tools. É, portanto, provável a existência de mais um gene no operon vioABCD. Entre essa ORF e o gene vioD, há uma distância de apenas 12 pares de bases, e observa-se uma estrutura em grampo, à jusante desta ORF, o que indica o término da transcrição após a ORF CV3270. Microorganisms that have already had their genomes completely sequenced, as in the case of Chromobacterium violaceum, have their genome annotation generally produced by a team that analyze the organism's physiology and its correlation to data produced by the sequencing project. These data are generally stored in public domain databases and most of the time they need to be verified, i.e., experimentally validated. However, recent advances in bioinformatics and computational biology allow us to computationally verify some physiological conditions, such as, for instance, the presence or lack of a particular metabolic pathway. Several research groups have developed techniques to predict metabolic pathways from genomic annotation, thus producing integrated pathway/genome database. The main objective of this work was to build a database for C. violaceum (CvioCyc), a Gram-negative bacterium sequenced by the Brazilian National Genome Project Consortium. C. violaceum is a microorganism of great biotechnological and biomedical potential. C. violaceum produces a violet pigment known as violacein, to which it is attributed anti-tumoral and anti-Trypanosoma cruzi properties, among others; moreover, this bacterium is able to synthesize biopolymer of great commercial interest. The pathway/genome database - CvioCyc (cviocyc.intelab.ufsc.br), was built from a suite of programs in the Pathway Tools package, and was shown to be an important tool to analyze the C. violaceum genome. It allowed us re-annotating 61 out of 233 automatically generated metabolic pathways, 17 were removed (27.86%) and 44 were remained (72.13%). Besides the violacein biosynthesis pathway included in the database, from its precursors (tryptophan), those 61 metabolic pathways were directly curated from the results generated by Pathway Tools, and from literature research, and the use of bioinformatics tools available on the web, such as BLAST and enzyme databases (KEGG, ENZYME and BRENDA). Thirty-nine ORFs (open reading frames) were modified in CvioCyc. That represents approximately 24.3% error in the 160 examined ORFs. This result is in agreement with what we have found for other genome annotations (8 to 25%). Most of those errors are among the frequently found in the literature, such as false-positive and false-negative ORFs, typo errors, and lack of standardization in enzyme and gene names. The analysis done on violacein biosynthesis suggests that ORF CV3270 may be part of the vio operon, according to Pathway Tools predictions. Thus, it is likely that it might exist another gene in the vioABCD operon. We have found that there is only a 12 bp distance between the ORF3270 and the vioD gene; besides that, there is a stem-loop (hairpin) structure downstream that ORF, what suggests a transcription termination moiety after CV3270.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2012-10-23T10:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 245430.pdf: 2343086 bytes, checksum: 9276cd2a14ba823e91f55d55056bcccf (MD5) / A violaceína é um pigmento formado pela união de duas moléculas modificadas do aminoácido L-triptofano. Este pigmento apresenta propriedades interessantes como tripanocida e antitumoral. Dentre os microrganismos produtores de violaceína encontra-se a bactéria Chromobacterium violaceum. Os genes necessários à síntese de violaceína em C. violaceum estão organizados em um operon conhecido como vioABCDE. A clonagem e expressão dos genes vioABCDE de C. violaceum sob controle do promotor araBAD foi realizada em Escherichia coli visando avaliar a estabilidade, rendimento e produtividade da produção heteróloga de violaceína neste microrganismo. Os resultados indicam que um dos fatores responsáveis pela instabilidade da produção de violaceína em E. coli está relacionado às alterações que podem ser causadas aos genes vioABCDE devido à produção desta molécula. Apesar da instabilidade observada, foi possível a obtenção de um rendimento e produtividade de violaceína bruta de 22,06 mg/gMS e 10,71 µmol/gMS·h, respectivamente.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-23T12:49:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 240338.pdf: 5928151 bytes, checksum: 3ec335edd174d0f75509099b78fc544c (MD5) / Visando ao desenvolvimento de um sistema heterólogo para produção de polihidroxialcanoatos (PHA) em Escherichia coli, clonou-se o gene da enzima PHA sintase de Chromobacterium violaceum (phaCCv) no plasmídeo pBHR69, o qual continha previamente os genes para as enzimas ß-cetotiolase (phbA) e acetoacetil-CoA redutase (phbB) do operon de Cupriavidus necator, ambas necessárias, juntamente com a PHA sintase, para a biossíntese de PHA em E. coli. Para verificação da produção de polímero em E. coli foram transformadas com o plasmídeo obtido (pRLC2) as linhagens JM101 e DH5a. Em cultivos não otimizados utilizando glicose como substrato obteve-se 1,15 e 1,52 g l-1 de biomassa com rendimento de 29,6 e 42,6 % de PHA do tipo poli(3-hidroxibutirato) nas linhagens JM101 e DH5a, respectivamente. Estes resultados evidenciaram que a PHA sintase de C. violaceum apresenta atividade aparentemente normal em E. coli, diferentemente do que sugeriram estudos anteriores, permitindo, portanto, a sua utilização para produção heteróloga de PHA nesta bactéria. O modelo estrutural teórico obtido para a enzima PhaCCv apresentou uma tríade catalítica similar à observada em lipases e outras enzimas da família a/ß-hidrolase, sugerindo que o resíduo de aspartato pertencente à tríade possa também estar associado à estabilização da ligação enzima-substrato. Assim como nas lipases, observou-se também no modelo a ocorrência de uma região possivelmente relacionada à ativação interfacial da enzima junto à superfície hidrofóbica do grânulo de PHA. As estruturas terciárias obtidas na modelagem estrutural sugerem a necessidade de reavaliação dos modelos mecanísticos de síntese atualmente propostos, uma vez que os mesmos pressupõem que o resíduo de aspartato não participaria da estabilização da ligação enzima-substrato, possuindo unicamente a função de ativação do radical hidroxila durante a biossíntese do polímero.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia Química. / Made available in DSpace on 2012-10-24T01:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 255653.pdf: 1907221 bytes, checksum: 0c93fe1f48bf9620cbb617616e9fee05 (MD5) / Biofilmes são comunidades de microrganismos ligados a uma superfície inerte ou viva. Na complexa constituição do material extracelular de biofilmes, os polissacarídeos possuem um importante papel. Dentro da família de exopolissacarídeos sintetizados pelas bactérias com intuito de se proteger do sistema de defesa hospedeiro, encontra-se um com o monômero N-Acetil-D-Glicosamina ligado por conformação ß-1,6. Grupos de genes que produzem tal polímero encontram-se no genoma de diversas bactérias. A associação deste polissacarídeo com fatores de virulência, aliado à síntese em bactérias causadoras de infecção, torna-o um potencial alvo no desenvolvimento de novos antibióticos. A Chromobacterium violaceum, um patógeno oportunístico, e na maioria das vezes fatal, possui o operon hmsHFR-CV2940 cujas proteínas podem sintetizar tal polissacarídeo. Neste trabalho foram utilizados alinhamentos múltiplos entre proteínas de bactérias que sintetizam polissacarídeos com o intuito de verificar a existência de aminoácidos críticos para a atividade patogênica conferida por biofilmes. Foram gerados modelos tridimensionais para visualização da distribuição espacial destes aminoácidos. A análise efetuada mostra que a proteína HmsR conserva os aminoácidos D135, D228, Q264 e R267, considerados críticos para a formação de biofilmes, e estes se encontram próximos. A proteína HmsF de C. violaceum conserva os resíduos D86, D87, H156 e W115. No modelo estrutural gerado observa-se que estes resíduos também encontram-se favoravelmente localizados. Para a proteína HmsH houve comprovação de conservação para o resíduo R104, e na proteína CV2940 conservou-se o resíduo W94. A conservação de aminoácidos considerados importantes para a formação de biofilmes entre as proteínas deste operon em C. violaceum indica que eles desempenham a mesma função enzimática na síntese de biofilmes. Também como no caso de operons de outros organismos patogênicos, pode-se sugerir que o operon hmsHFR-CV2940 esteja ligado à sua patogenicidade.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 221663.pdf: 3298544 bytes, checksum: d7078a9b7ba3ea540646c7eaea3921b0 (MD5) / A Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, violeta-pigmentada, aeróbica facultativa, que vive em regiões de climas tropicais e subtropicais, encontrada principalmente em solos e rios. Este microrganismo tem capacidade de produzir metabólitos de interesse biotecnológico, como por exemplo, a produção de antibióticos, agentes anti-tumorais e biopolímeros. Estas foram algumas das razões que levaram esta bactéria a ter o seu genoma seqüenciado por uma rede nacional de seqüenciamento de DNA, composta por 25 grupos de pesquisa de todo o país (http://www.brgene.lncc.br/cviolaceum/). Com o seqüenciamento do genoma da C. violaceum (linhagem ATCC 12472), o Brasil se incluiu entre os países com grande interesse na fisiologia e potencial biotecnólogico desta bactéria. Uma das características mais notáveis da C. violaceum é a produção de um pigmento de cor violeta, chamado violaceína, quando cultivada sob condições de aerobiose. Este metabólito e derivados da mesma via têm sido alvo de estudos por apresentarem potencial farmacológico. Neste trabalho são investigados os genes envolvidos na regulação da biossíntese de violaceína, bem como o mecanismo de regulação quorum sensing em C. violaceum (linhagem ATCC 12472; mesma linhagem seqüenciada). Além dos genes cviI e cviR (homólogos aos genes que caracterizam o sistema quorum sensing em bactérias Gram-negativas), outros genes foram encontrados serem reguladores da produção de violaceína. Através da análise de homologia entre seqüências e estruturas de proteínas, gerou-se um modelo da estrutura tridimensional do domínio C-terminal da proteína regulatória CviR, que tem uma ação importante no controle transcricional da expressão do operon vioABCD em C. violaceum. Os genes de regulação da biossíntese de violaceína foram investigados através da construção de mutantes por inserção de transposon (mini-Tn5 luxCDABE). Tais mutantes apresentam pouca produção de pigmento em relação à linhagem selvagem ATCC 12472. Moléculas de sinalização quorum sensing, N-acil-homoserinas lactonas (AHL), também foram investigadas na linhagem selvagem e nas mutantes. Três tipos de moléculas AHL foram identificadas na linhagem selvagem ATCC 12472, sendo que duas são de cadeia curta (N-hexahoil-L-homoserina lactona (HHL); N-(3-oxohexanoil)-L-homoserina lactona (OHHL)) e uma de cadeia longa (N-oxododecanoil)-L-homoserina lactona (OdDHL)), o que demonstra maior complexidade no circuito de regulação quorum sensing nesta linhagem de C.violaceum. Outra forma de regulação da produção de violaceína também foi explorada neste trabalho, assim como a atuação do complexo cAMP-CAP na transcrição do gene cviR, que resulta no estímulo da produção de violaceína quando há baixos níveis de glicose. Um modelo da arquitetura da rede de regulação do operon vioABCD foi desenvolvido com base no mecanismo quorum sensing utilizando-se a técnica matemático-computacional de redes de Petri híbrida. O modelo gerou resultados semi-quantitativos para diferentes condições de simulação, prevendo diferentes níveis de produção de violaceína frente ao nocauteamento de genes regulatórios e a presença de glicose ou glicerol no meio de cultura.

NEPOMUCENO, D. R. Expressão em Escherichia coli e Pichia pastoris de uma quitinase antifúngica da família 19 das glicosídeo hidrolases de Chromobacterium violaceum. 2012. 171 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-27T19:39:14Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_drnepomuceno.pdf: 4357475 bytes, checksum: 975d138d8ff4d3744499261b825e0ff2 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T20:00:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_drnepomuceno.pdf: 4357475 bytes, checksum: 975d138d8ff4d3744499261b825e0ff2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T20:00:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_drnepomuceno.pdf: 4357475 bytes, checksum: 975d138d8ff4d3744499261b825e0ff2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The annotation of the genome of this species revealed many genes encoding products with potential applications in many areas. Among these products are several chitinases, which are enzymes capable of degrading chitin, a polysaccharide of N-acetyl-β-D-glucosamine. Chitin is found in the cell wall of many fungi and in the exoskeleton of insects and crustaceans. Chitinases are of great biotechnological interest because these enzymes can be used to produce useful derivatives from chitin, and also to be exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase (CV1897) belonging to family GH19 from C. violaceum ATCC 12472. The complete sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP+, with the native signal peptide) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET302/NT-His and pPICZαA, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. The partial sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP-, without the native signal peptide) was expressed only in P. pastoris. In E. coli the rCV1897SP+ was mainly produced as insoluble inclusion bodies. In P. pastoris, the two versions of the protein (rCV1897PS+ and rCV1897PS-) were secreted into the culture medium, in their soluble and functional form. The enzymes were purified by affinity chromatography on immobilized nickel ions, with yields of 1.8 mg/L (rCV1897PS+) and 2.1 mg/L (rCV1897PS-), being detected by electrophoresis as two isoforms with different molecular weights. The recombinant chitinase (rCV1897PS+) showed optimal hydrolytic activity at pH 5.0 and was active after treatement at temperatures up to 40 °C for 30 min. The rCV1897 showed chitinolytic activity against colloidal chitin and glycol-chitin on SDS-PAGE. Circular dichroism spectra showed that the protein has predominantly α-helical arrangements (37%), also having 26% of β-strands and 38% disordered structure. The fluorescence spectra revealed that the protein was produced in their folded conformation. The rCV1897PS+ inhibited the conidial germination and mycelial growth of the phytopathogenic fungi Penicillium herquei and Colletotrichum lindemuthianum. Both rCV1897PS+ and rCV1897PS- in combination with fluconazole acted synergistically against different strains of the human pathogenic yeast Candida tropicalis. The biochemical, structural and biological studies of rCV1897 may be useful for biotechnological application of this enzyme. / Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, saprófita, não patogênica e de vida livre. A anotação do genoma dessa espécie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicações em diversas áreas. Dentre esses produtos estão várias quitinases, enzimas capazes de degradar quitina, um polissacarídeo de N-acetil-β-D-glucosamina presente na parede celular de muitos fungos e no exoesqueleto de insetos e crustáceos. As quitinases são de grande interesse biotecnológico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados úteis, e também para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrícolas. O presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterização bioquímica, estrutural e biológica de uma quitinase recombinante (CV1897), da família 19 das glicosil hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A sequência completa da ORF CV1897 (codificando CV1897PS+, com o peptídeo sinal nativo) foi amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET302/NT-His e pPICZαA para expressão em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A sequência parcial da ORF (rCV1897PS-, sem o peptídeo sinal nativo) foi expressa apenas em P. pastoris. Em E. coli, a rCV1897PS+ foi produzida principalmente em corpos de inclusão, de forma insolúvel e inativa. Em P. pastoris, as proteínas (rCV1897PS+ e rCV1897PS-) foram secretadas para o meio de cultura de forma solúvel e funcional. As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade em níquel imobilizado, com rendimentos de 1,8 mg/L (rCV1897PS+) e 2,1 mg/L (rCV1897PS-), sendo detectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE) como duas isoformas com massas moleculares diferentes (43,2 kDa e 51,4 kDa; 44 e 50 kDa, respectivamente). A quitinase recombinante (CV1897PS+) mostrou atividade ótima em Ph 5,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de até 40 °C por 30 min. A Rcv1897 apresentou atividade quitinásica frente a quitina coloidal e glicol-quitina (em gel SDS-PAGE). Os espectros de dicroísmo circular revelaram que a estrutura da proteína possui predominantemente estrutura secundária do tipo α-hélice (37%), com 26% de fitas-β e 38% de estrutura desordenada. Os espectros de fluorescência revelaram que a proteína foi produzida na sua conformação enovelada. A rCV1897PS+ inibiu a germinação de conídios e o crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos Penicillium herquei e Colletotrichum lindemuthianum. As quitinases rCV1897PS+ e rCV1897PS- em associação com o fluconazol atuaram de forma sinérgica contra diferentes cepas da levedura patogênica Candida tropicalis. Os estudos bioquímicos, estruturais e biológicos da rCV1897 poderão ser úteis para aplicação biotecnológica dessa enzima.