Einige biologische Prozesse sind dosisabhängig, wobei nicht nur die Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter Genprodukte, sondern auch deren spezifische Mengen wichtig sind. Ein Beispiel ist die Dosis-Kompensation für Geschlechtschromosomen bei Säugetieren, die durch X-Chromosomen-Inaktivierung erreicht wird. Dieser Mechanismus ist auf Frauen beschränkt, da sie zwei X-Chromosomen besitzen, im Gegensatz zu Männern mit nur einem X-Chromosom. Dosisabhängigkeit spielt auch bei der Differenzierung pluripotenter Stammzellen eine Rolle. Geringe Schwankungen in der Menge des Pluripotenzfaktors OCT4 (POU5F1) können bestimmen, ob Maus-Embryonale Stammzellen (mESCs) sich in das Trophektoderm oder in meso-endodermale Linien differenzieren. Ebenso ist die Menge des Pluripotenzfaktors NANOG entscheidend für die Steuerung der naiven und vorbereiteten pluripotenten Zustände. Das Verständnis der dosisabhängigen Regulation biologischer Prozesse ist entscheidend, jedoch technisch anspruchsvoll, da es erfordert, die Proteinmenge quantitativ zu modulieren. Hier wurde ein auf Degron- und CRISPR/Cas-basiertes Toolkit, CasTuner, entwickelt, um die endogene Genexpression analog zu steuern. CasTuner basiert auf Cas-abgeleiteten Repressoren, die an eine Degron-Domäne fusioniert sind und durch die Titration der Konzentration eines Liganden gesteuert werden können. CasTuner ermöglicht eine homogene (analoge) Steuerung der Genexpression, im Gegensatz zum KRAB-basierten CRISPRi-System, das eine bimodale (digitale) Repression zeigt. Mit CasTuner wurden die Dosis-Wirkungs-Beziehungen von NANOG und OCT4 mit ihren Zielgenen und dem zellulären Phänotyp gemessen. Schließlich wurde CasTuner eingesetzt, um die dosisabhängige Rolle des X-gebundenen Xist-Aktivators RNF12 und des neu entdeckten Faktors ZIC3 zu untersuchen. Dabei wurde ein modifiziertes Modell für die zufällige X-Chromosomen-Inaktivierung vorgeschlagen. / Certain biological processes are dose-dependent, depending not only on the presence or absence of given gene products but also on their specific. The importance of quantitative regulation of gene expression is illustrated by the need for dosage compensation for sex chromosomes and by the presence of genes whose decreased expression is linked to diseases. The mechanism by which mammals achieve X-dosage compensation, X-chromosome inactivation, is itself dose-dependent, being restricted to females through sensing the two-fold higher dose for X-linked genes in females compared to males. Dose-dependency has been described in the differentiation of pluripotent stem cells into different lineages: small variations in the quantity of the pluripotency factor OCT4 (POU5F1) can determine the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) into the trophectoderm or meso-endoderm lineages. Similarly, the amount of the pluripotency factor NANOG is critical for the control of naïve and primed pluripotent states. Understanding the principles underlying the dose-dependent regulation of biological processes is crucial, but also technically challenging, since it requires the ability to quantitatively modulate protein abundance. Here, I developed a degron- and CRISPR/Cas-based toolkit, CasTuner, for analogue tuning of endogenous gene expression. CasTuner relies on Cas-derived repressors fused to a degron domain, which can be tuned by titrating the concentration of a ligand. I demonstrate homogenous (analogue) tuning of gene expression across cells, as opposed to the KRAB-based CRISPRi system, which exhibits bimodal (digital) repression. I employ CasTuner to measure the dose-response relationships of NANOG and OCT4 with their target genes and the cellular phenotype. Finally, I apply CasTuner to study the dose-dependent role of the X-linked Xist activator RNF12 and the newly discovered factor ZIC3, and propose a modified model for random X-chromosome inactivation.

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Zusammenfassung Die Asteraceae Brachycome dichromosomatica ist eine besonders geeignete Spezies, um B-Chromosomen zu analysieren. Die auf den B-Chromosomen-lokalisierte 45S rDNA wurde auf Ursprung und Funktion untersucht. Die Mikrodissektion von B-Chromosomen und PCR-Amplifikation ermöglichte es, B-Chromosomen-spezifische ITS2-Sequenzen der 45S rDNA zu erhalten. Auffallend bei dieser Analyse waren zwei beständige Differenzen zwischen den Sequenzen von A- und B-Chromosomen. Phylogenetische Untersuchungen identifizierten keine Spezies, die eine ITS2-Sequenz hatte, die ähnlicher zu der B-Chromosomen-ITS2-Sequenz war als die A-Chromosomen-ITS2-Sequenz von B. dichromosomatica. Es wurde ein Ursprung der B-Chromosomen in der Zeit vor der Ausbildung der vier Cytodeme von B. dichromosomatica postuliert. Die Analyse der Assoziationen von Mikro-B-Chromosomen mit dem Nukleolus ergab, dass 70% der Mikro-B-Chromosomen nicht mit dem Nukleolus assoziierten. Die hohe Frequenz von nichtassoziierten Mikro-B-Chromosomen weist auf eine Inaktivität der Mikro-B-Chromosomen-lokalisierten 45S rDNA hin. Die Immunfluoreszenzmarkierung zeigte, dass sich das Chromatin der A- und B-Chromosomen deutlich in der euchromatischen Histon-H3-Methylierung unterscheidet. Während die A-Chromosomen deutliche Immunfluoreszenzsignale aufwiesen, zeigten die Mikro-B- und Standard-B-Chromosomen nur eine schwache Markierung mit Antikörpern gegen Histon H3K4me1,2,3, H3K9me3 und H3K27me2,3. Die heteropygnotischen, mit Tandem-Repeats angereicherten Mikro-B-Chromosomen waren dabei noch weniger mit diesen euchromatischen Markierungen gekennzeichnet als die Standard-B-Chromosomen. Keine Unterschiede zwischen den A- und B-Chromosomen wurden für die heterochromatischen Markierungen Histon H3K9me1,2 und H3K27me1 gefunden, was darauf hinweist, dass die B-Chromosomen nicht spezifisch durch zusätzliche heterochromatische Histonmarkierungen gekennzeichnet sind. / Summary The Asteraceae Brachycome dichromosomatica is a suitable species for the analysis of B chromosomes (Bs). The origin and activity of micro B-located 45S rDNA of was analysed. Microisolation of Bs and PCR with internal transcribed spacer 2 (ITS2)-specific primers succeeded in the isolation of B-specific ITS2-sequences. ITS2 was sequenced for micro B, large B and A chromosomes, and conserved differences were identified between sequences originating from A and both types of Bs. Phylogenetic analysis did not identify a species that contained an ITS2 sequence that was more similar to either of the B’s sequences than that of the B. dichromosomatica A chromosomes (As). Thus, an origin of the Bs from As at a time prior to the divergence of the four cytodemes of B. dichromosomatica is suggested. Because 70% of micro Bs did not co-localize with the nucleolus I conclude that micro B-located 45S rDNA is not constitutively transcribed. Immunofluorescence demonstrates that the chromatin in A and both types of Bs differs markedly in euchromatic histone H3 methylation marks. While A chromosomes are labelled brightly, the micro B and large Bs are faintly labelled with antibodies against H3K4me2/3, H3K9me3 and H3K27me2/3. The heteropycnotic, tandem-repeat enriched micro Bs were even less labelled with euchromatic histone H3 methylation marks than large Bs. No differences between A and Bs were found as to the heterochromatic marks H3K9me1/2 and H3K27me1, indicating that Bs are not additionally labelled by heterochromatin typical histone H3 modifications. 1

Meiosis is a specialized cell cycle, which generates haploid gametes from diploid parental cells. During meiosis one round of cohesion establishment during premeiotic DNA replication mediates two rounds of chromosome segregation. During meiosis I homologous chromosomes separate, whereas sister chromatids segregate during the second meiotic division without an intervening round of DNA replication. Both rounds of chromosome segregation are triggered by an ubiquitin ligase called the Anaphase-Promoting Complex or Cyclosome (APC/C). APC/C-dependent destruction of securin/Pds1 is required to activate separase, a thiol protease that mediates chromosome segregation by cleavage of the cohesin complex. The first meiotic division is preceded by an extended prophase I, during which maternal and paternal chromatids undergo recombination. The persistence of cohesion during premeiotic S- and prophase I is essential for recombination and both meiotic nuclear divisions. In order to prevent premature loss of cohesion, the APC/C has to be inactivated during early meiosis. How the APC/C is kept inactive during premeiotic S- and prophase I was unknown. This question has been addressed by studying the APC/C subunit Mnd2 from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. This work demonstrates that Mnd2 is required for the persistence of cohesion during premeiotic S- and prophase I. Mnd2 prevents premature activation of the APC/C by the meiosis-specific substrate recognition factor Ama1. In cells lacking Mnd2, the APC/C-Ama1 enzyme triggers premature ubiquitin-dependent degradation of Pds1, which leads to premature separation of sister chromatids due to an unrestrained activity of separase. Thus, chromosome segregation during meiosis depends on both inhibition of a meiosis-specific APC/C and timely activation of APC/C- dependent proteolysis. / Die Meiose ist ein spezialisierter Zellzyklus, der zum Ziel hat haploide Gameten aus diploiden Vorläuferzellen zu produzieren. Dafür erfolgen nach der prä-meiotischen DNA Replikation zwei aufeinanderfolgende Kernteilungen. In der ersten meiotischen Teilung erfolgt die Trennung der homologen Chromosomen. In einer zweiten meiotischen Teilung werden dann die Schwesterchromatiden getrennt. Die Trennung der Chromosomen wird durch den Anaphase-Promoting Complex oder Cyclosome (APC/C), einer Ubiquitin Ligase, reguliert. Der APC/C initiiert den Abbau von Securin/Pds1, einem Inhibitor der Thiol-Protease Separase, welche für die Trennung der Chromosomen zum Beginn der Anaphase verantwortlich ist. In einer im Vergleich zur Mitose extrem langen meiotischen Prophase I findet Rekombination zwischen maternalen und paternalen Chromosomen statt. Für diesen Vorgang, sowie für die beiden folgenden meiotischen Teilungen, wird Kohäsion zwischen den Schwesterchromatiden benötigt. Ein frühzeitiger Verlust der Kohäsion führt zur frühzeitigen Trennnung der Schwesterchromatiden, wodurch aneuploide Gameten produziert werden können. Daher muss die Aktivität des APC/C während der meiotischen Prophase I inhibiert werden. Wie der APC/C während der Prophase I inaktiviert wird, war bisher unbekannt. Einsicht in dieses Problem ergab sich aus der Untersuchung der APC/C Untereinheit Mnd2 aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Es wird gezeigt, dass Mnd2 für den Verbleib der Kohäsion zwischen den Schwesterchromatiden während der meiotischen S- und Prophase I benötigt wird. Während dieser Phase verhindert Mnd2 die frühzeitige Aktivierung der Meiose-spezifischen Form des APC/C-Ama1. In meiotischen Zellen, die kein Mnd2 besitzen, löst das APC/C-Ama1 Enzym die Ubiquitin-abhängige Zerstörung von Pds1 aus. Dies führt zu einer frühzeitigen Aktivierung von Separase, welches die Trennung der Schwesterchromatiden schon während der meiotischen S- und Prophase I zur Folge hat. Die korrekte Verteilung der Chromosomen hängt daher sowohl von der Inhibierung als auch der Aktivierung des APC/C ab.

Meiosis is a specialized cell cycle, which generates haploid gametes from diploid parental cells. During meiosis one round of cohesion establishment during premeiotic DNA replication mediates two rounds of chromosome segregation. During meiosis I homologous chromosomes separate, whereas sister chromatids segregate during the second meiotic division without an intervening round of DNA replication. Both rounds of chromosome segregation are triggered by an ubiquitin ligase called the Anaphase-Promoting Complex or Cyclosome (APC/C). APC/C-dependent destruction of securin/Pds1 is required to activate separase, a thiol protease that mediates chromosome segregation by cleavage of the cohesin complex. The first meiotic division is preceded by an extended prophase I, during which maternal and paternal chromatids undergo recombination. The persistence of cohesion during premeiotic S- and prophase I is essential for recombination and both meiotic nuclear divisions. In order to prevent premature loss of cohesion, the APC/C has to be inactivated during early meiosis. How the APC/C is kept inactive during premeiotic S- and prophase I was unknown. This question has been addressed by studying the APC/C subunit Mnd2 from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. This work demonstrates that Mnd2 is required for the persistence of cohesion during premeiotic S- and prophase I. Mnd2 prevents premature activation of the APC/C by the meiosis-specific substrate recognition factor Ama1. In cells lacking Mnd2, the APC/C-Ama1 enzyme triggers premature ubiquitin-dependent degradation of Pds1, which leads to premature separation of sister chromatids due to an unrestrained activity of separase. Thus, chromosome segregation during meiosis depends on both inhibition of a meiosis-specific APC/C and timely activation of APC/C- dependent proteolysis. / Die Meiose ist ein spezialisierter Zellzyklus, der zum Ziel hat haploide Gameten aus diploiden Vorläuferzellen zu produzieren. Dafür erfolgen nach der prä-meiotischen DNA Replikation zwei aufeinanderfolgende Kernteilungen. In der ersten meiotischen Teilung erfolgt die Trennung der homologen Chromosomen. In einer zweiten meiotischen Teilung werden dann die Schwesterchromatiden getrennt. Die Trennung der Chromosomen wird durch den Anaphase-Promoting Complex oder Cyclosome (APC/C), einer Ubiquitin Ligase, reguliert. Der APC/C initiiert den Abbau von Securin/Pds1, einem Inhibitor der Thiol-Protease Separase, welche für die Trennung der Chromosomen zum Beginn der Anaphase verantwortlich ist. In einer im Vergleich zur Mitose extrem langen meiotischen Prophase I findet Rekombination zwischen maternalen und paternalen Chromosomen statt. Für diesen Vorgang, sowie für die beiden folgenden meiotischen Teilungen, wird Kohäsion zwischen den Schwesterchromatiden benötigt. Ein frühzeitiger Verlust der Kohäsion führt zur frühzeitigen Trennnung der Schwesterchromatiden, wodurch aneuploide Gameten produziert werden können. Daher muss die Aktivität des APC/C während der meiotischen Prophase I inhibiert werden. Wie der APC/C während der Prophase I inaktiviert wird, war bisher unbekannt. Einsicht in dieses Problem ergab sich aus der Untersuchung der APC/C Untereinheit Mnd2 aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Es wird gezeigt, dass Mnd2 für den Verbleib der Kohäsion zwischen den Schwesterchromatiden während der meiotischen S- und Prophase I benötigt wird. Während dieser Phase verhindert Mnd2 die frühzeitige Aktivierung der Meiose-spezifischen Form des APC/C-Ama1. In meiotischen Zellen, die kein Mnd2 besitzen, löst das APC/C-Ama1 Enzym die Ubiquitin-abhängige Zerstörung von Pds1 aus. Dies führt zu einer frühzeitigen Aktivierung von Separase, welches die Trennung der Schwesterchromatiden schon während der meiotischen S- und Prophase I zur Folge hat. Die korrekte Verteilung der Chromosomen hängt daher sowohl von der Inhibierung als auch der Aktivierung des APC/C ab.

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