La malaria y la anemia se encuentran entre los principales problemas de la salud pública mundial. Los recién nacidos y los niños pequeños son uno de los grupos de la población más afectados por ambas patologías. En áreas endémicas de malaria, la frecuente coexistencia de ferropenia, procesos inflamatorios y malaria dificulta la interpretación de las magnitudes bioquímicas utilizadas para valorar el metabolismo del hierro. Otra dificultad añadida en la interpretación de los resultados es la falta de valores normales en estas poblaciones. En los últimos años se ha desarrollado otro test indicador del contenido corporal de hierro, el receptor soluble de transferrina, que aumenta en aquellos pacientes con anemia por deficiencia de hierro mientras que no se altera en la anemia asociada a procesos infecciosos o inflamatorios. Se han realizado pocos estudios sobre la utilidad de este marcador en niños que viven en áreas endémicas de malaria y con resultados contradictorios.Los objetivos de esta investigación son: estudiar el metabolismo del hierro en un grupo de lactantes que viven en un área endémica de malaria, determinando el efecto de la inflamación y de la malaria, así como valorar la utilidad del receptor soluble de transferrina en el diagnóstico diferencial de la anemia en esta población. Se analizan, durante el primer año de vida, las magnitudes bioquímicas y hematológicas utilizadas habitualmente para valorar el metabolismo del hierro. Se ha observado que la edad influye sobre la prevalencia de las principales patologías que en esta zona afectan a este metabolismo y sobre las magnitudes bioquímicas y hematológicas estudiadas. Asimismo estas magnitudes se alteran en los niños con malaria y/o procesos inflamatorios. El receptor soluble de transferrina no contribuye al diagnóstico del tipo de anemia en los lactantes que viven en estas áreas, puesto que su concentración se eleva con la hemólisis asociada a la malaria además de con la ferropenia. Se recomienda continuar las búsqueda de nuevos test no invasivos que permitan detectar la deficiencia de hierro en estas zonas.

INTRODUCCIÓN. La familia HERC humana está formada por seis proteínas en cuyas secuencias se hallan invariablemente un dominio HECT (Homólogo al extremo C-terminal de E6AP) y uno o varios dominios RLD (Homólogos al regulador de la condensación cromosómica RCC1). La presencia del HECT sugiere que estas proteínas poseen actividad ubiquitina ligasa, mientras que la presencia de RLDs plantea la posibilidad de que posean además actividad intercambiadora de nucleótidos de guanina sobre GTPasas monoméricas. La proteína HERC1 es una proteína gigante (532 kDa) que ha sido implicada en el tráfico intracelular de membranas en virtud de su interacción con la cadena pesada de la clatrina (CHC) y con GTPasas de las familias ARF y Rab.OBJETIVOS. Con el fin de ampliar nuestros conocimientos acerca de la proteína HERC1 establecimos los siguientes objetivos: (1) identificación de moléculas que interaccionen con HERC1; (2) análisis de la localización subcelular de HERC1; (3) estudio de los efectos de la silenciación de HERC1 por RNAi; (4) análisis de formas truncadas y mutadas de HERC1.MÉTODOS. Para hallar móleculas capaces de unirse a HERC1 usamos técnicas tales como ensayos de doble híbrido en levadura, pull-downs, coinmunoprecipitaciones o ensayos de unión lípido-proteína. Las interacciones halladas fueron caracterizadas usando ensayos de ubiquitinación y de intercambio de nucleótidos, cromatografía de filtración en gel o medición de actividades enzimáticas. La distribución subcelular de HERC1 se estudió por microscopía confocal usando marcadores de varios compartimentos intracelulares. La silenciación de HERC1 se logró mediante transfección de un siRNA específico de ésta en células HeLa, en las que se estudió a continuación el funcionamiento de las vías de tráfico endocítico y secretor. Finalmente, el estudio de formas truncadas y mutadas de HERC1 se basó en el análisis microscópico de varias proteínas de fusión entre la proteína fluorescente verde (GFP) y las mencionadas formas de HERC1. RESULTADOS. La isoforma M2 del enzima glucolítico piruvato quinasa (M2PK) se identificó como una nueva proteína de unión a HERC1. No obstante, M2PK no es sustrato de ubiquitinación de HERC1, y ésta tampoco afecta la actividad enzimática ni la estructura cuaternaria de M2PK. También se demostró la presencia de la cadena ligera de la clatrina en un complejo citosólico en el que se hallan además HERC1, CHC y la chaperona Hsp70. HERC1 interacciona asimismo con la GTPasa ARF6, sobre la cual estimula la disociación de GDP. Dicha actividad se probó que depende de la unión a HERC1 de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2). Éste no es el único fosfolípido capaz de unirse a HERC1, ya que también lo hacen otros fosfoinosítidos. En cuanto a su distribución subcelular, HERC1 se halla en vesículas asociadas al Golgi pero no en endosomas. HERC1 es además reclutada a protrusiones de membrana ricas en actina por activación de ARF6. En relación a la silenciación de HERC1 por RNAi, ésta no afecta el tráfico endocítico ni secretor. Por último, ciertas formas delecionadas o mutadas de HERC1 forman agregados intracelulares ricos en ubiquitina, mientras que otras provocan cambios en el citoesqueleto de actina o inhiben la endocitosis del factor de crecimiento epidérmico (EGF).CONCLUSIONES. M2PK, CLC, ARF6 y varios fosfolípidos, tales como PIP2, han sido identificados como nuevas moléculas capaces de interactuar con HERC1. Esta proteína se halla asociada al aparato de Golgi y se transloca a protrusiones de actina. HERC1 no es, sin embargo, esencial para el adecuado funcionamiento de las vías celulares de endocitosis y secreción proteica, aunque la sobreexpresión de ciertos dominios de HERC1 causa alteraciones en el citoesqueleto de actina y la endocitosis de EGF. / INTRODUCTION. The human HERC family consists of six proteins whose sequences contain both HECT (Homologous to E6AP C-terminus) and RCC1-like domains (RLDs). While HECT domains are known to act as E3 ubiquitin ligases, RLDs behave, in at least some cases, as guanine nucleotide exchange factors for small GTPases. HERC1 is a giant (532 kDa) protein which has been implicated in membrane trafficking pathways through its ability to interact with clathrin heavy chain (CHC) as well as ARF- and Rab-family GTPases. OBJECTIVES. In this study, we sought to (i) identify new HERC1-binding molecules, (ii) pinpoint HERC1's subcellular localization, (iii) analyze the effects of siRNA-mediated HERC1 knockdown and (iv) characterize the behavior of truncated and mutant versions of HERC1.METHODS. HERC1-interacting molecules were found using yeast two-hybrid screens, pull-down, coimmunoprecipitation and lipid-protein overlay assays. The interactions were further characterized using ubiquitination and nucleotide exchange assays, gel filtration chromatography and enzyme activity measurements. The subcellular distribution of HERC1 was studied by confocal epifluorescence microscopy in several cell lines, which were also used to determine the effects upon intracellular trafficking pathways of a HERC1-specific siRNA and of a number of chimeric proteins between the green fluorescent protein (GFP) and various truncated and mutant forms of HERC1. RESULTS. M2-type pyruvate kinase (M2PK) was shown to interact with HERC1. However, HERC1 does not influence M2PK enzyme activity, oligomeric structure or ubiquitination. Clathrin light chain (CLC) and ARF6 also bind HERC1. Moreover, HERC1 stimulates GDP dissociation from ARF6, which, in turn, requires the presence of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) bound to HERC1. Other phospholipids apart from PIP2 also display affinity for HERC1. Regarding its subcellular localization, HERC1 appeared partly in Golgi-associated vesicles and was seen to translocate to actin-rich membrane protrusions in an ARF6-dependent manner. On the other hand, HERC1 siRNA was shown not to affect endocytic or secretory pathways whereas, by contrast, some GFP-HERC1 chimeras cause alterations in endocytosis and the actin cytoskeleton. CONCLUSIONS. M2PK, CLC, ARF6 and several phosphoinositides have been identified as HERC1-binding molecules. HERC1 is Golgi-associated and probably has a regulatory function in membrane trafficking and/or in cytoskeletal rearrangements.

Els mecanismes d'adhesió plaquetària i formació de trombes arterials venen determinats en gran mesura per l'entorn biomecànic, concretament per la velocitat i l'esforç de cisalla local. El present treball pretén aprofundir en el coneixement de diferents mecanismes inflamatoris implicats en el desencadenament de la trombosi arterial, concretament en els processos d'adhesió i activació plaquetàries.La creixent importància de la proteïna C-reactiva (CRP), un reactant de fase aguda, no només com a marcador sino com a modulador de la malaltia cardiovascular, així com la controvèrsia que ha sorgit dels seus estudis ens va plantejar estudiar l'efecte de les diferents isoformes de la CRP sobre el creixement del trombe en condicions de flux arterial. Així, vam conloure que les diferents isoformes de la CRP difereixen en els seus efectes sobre el creixement del trombe. Concretament, la isoforma monomèrica de CRP (mCRP) té un fenotip protrombòtic que indueix activació i adhesió plaquetària i el creixement del trombe en condicions de flux arterial, tant quan es troba en forma circulant com immobilitzada, mitjançant l'increment de P-selectina a la superfície plaquetària. En canvi, la isoforma nativa (natCRP) no té cap efecte en l'adhesió plaquetària ni en el creixement del trombe. Tanmateix, la CRP interacciona amb les plaquetes i s'incorpora a l'estructura tridimensional del trombe.D'altra banda, es desconeix si l'oclusió coronària per se, en absència de malaltia ateroscleròtica subjacent i altres factors de risc, pot produir una resposta inflamatòria aguda tant local com sistèmica que indueixi l'activació i adhesió de les plaquetes. Així, vam demostrar en un model porcí d'infart de miocardi que la isquèmia miocàrdica, en absència d'aterosclerosi, indueix expressió de mCRP cardíaca i provoca una resposta inflamatòria local i sistèmica i una major adhesió i activació plaquetària.Finalment, degut a que els efectes beneficiosos de les estatines en la prevenció de la malaltia aterotrombòtica van més enllà dels seus efectes hipolipemiants, es va estudiar l'efecte de la rosuvastatina sobre la formació del trombe amb l'objectiu d'identificar nous potencials mecanismes protectors de la rosuvastatina. Mitjançant un sistema de perfusió in vitro vam demostrar que la rosuvastatina inhibeix l'adhesió plaquetària en condicions de flux arterial i venós. Mitjançant un abordatge proteòmic vam demostrar que la rosuvastatina produeix un augment de GRP78 a la membrana de les plaquetes perfundides, que interacciona amb el factor tissular (TF), reduint la seva activitat procoagulant. / Mechanisms of thrombus formation and platelet adhesion are regulated by flow-mediated interactions where shear rate and shear stress play a key role. The present work aimed to study the role of inflammation in thrombus formation and platelet adhesion. The growing interest of C-reactive protein (CRP), an acute phase reactant, not only as a marker but also as a maker of cardiovascular disease, lead us to study the effect of the different CRP isoforms on thrombus formation under arterial flow conditions. We found that CRP isoforms differ in their effects on thrombus growth. Indeed, the monomeric isoform (mCRP) shows a prothrombotic phenotype and enhances platelet activation and adhesion under flow, both in a circulating form and immobilized with the activating substrate increasing platelet surface P-selectin expression. In contrast, native CRP (natCRP) has no effect on thrombus growth. Additionally, we observed that CRP isoforms interact with adhered platelets and incorporate on the structure of the growing thrombi.On the other hand, we studied whether coronary occlusion per se, in the absence of atherosclerotic disease and other risk factors, induces an inflammatory response triggering platelet adhesion and activation. We found in a porcine model of myocardial infarction that ischemia, in the absence of atherosclerosis, induces cardiac mCRP expression and produces a local and systemic inflammatory response triggering platelet adhesion and activation.Finnally, since beneficial effects of statins (lipid lowering drugs) go beyond its lipid-lowering effects, we studied the effect of rosuvastatin, a new available statin, on thrombus formation under flow with the aim to identify novel potential beneficial effects of rosuvastatin. Indeed, we found that rosuvastatin inhibits platelet adhesion under venous and arterial flow conditions. By means of a proteomic approach, we showed that rosuvastatin increases GRP78 (Glucose-regulated protein 78) on the platelet surface, which interacts with tissue factor reducing its procoagulant activity.

La vida neonatal se caracteriza por una sensibilidad elevada frente a agentes infecciosos, posiblemente debida a la ausencia de memoria inmunológica preexistente en recién nacidos. Otro factor importante que puede contribuir a esta sensibilidad es el reducido número de células inmunocompetentes presentes en los tejidos linfoides periféricos en las primeras etapas de vida. El proceso de maduración inmunológica se halla influenciado por factores exógenos procedentes fundamentalmente de la dieta y de la microbiota presente en las mucosas.La lactancia materna es el vehículo utilizado por la madre para la transferencia de inmunidad pasiva al neonato, principalmente IgA, leucocitos, citocinas, ácidos grasos y otros agentes bioactivos. Estos componentes no solo ofrecen protección frente a infecciones sino que modulan el sistema inmunitario del neonato, inmaduro en el momento del nacimiento.El Ácido Linoleico Conjugado, mejor conocido por su acrónimo en inglés CLA, es un ácido graso poliinsaturado de cadena larga que comprende isómeros de posición y esteroisómeros, es decir formas "cis" y "trans", siendo los isómeros cis-9, trans-11 y trans-10, cis-12, los predominantes del CLA presente en alimentos de consumo diario. La leche es uno de los alimentos en los que el CLA se encuentra en mayores proporciones. El CLA interfiere en una gran variedad de procesos fisiológicos entre los que se encuentran la reducción de la grasa corporal, un efecto anti-aterosclerótico y anti-cancerígeno. Actualmente, aunque existen diversos estudios del efecto de CLA sobre el sistema inmunitario, ninguno de ellos ha sido estudiado en las primeras etapas de vida.Se parte de la premisa que la maduración del sistema inmunitario intestinal y sistémico tiene lugar en la etapa postnatal y depende entre otros, de factores exógenos procedentes de la dieta. Partiendo de la actividad inmunomoduladora sugerida para el ácido linoleico conjugado (CLA), presente en la leche materna, se plantea que el suplemento dietético con la mezcla isomérica de CLA -cis9,trans11:trans10,cis12 (80:20)- durante las primeras etapas de vida podría contribuir a la maduración del sistema inmunitario. Este planteamiento se concreta en los tres objetivos específicos de la tesis. Los dos primeros van dirigidos a determinar la influencia del suplemento con CLA durante los períodos de gestación, lactancia y primera infancia sobre el desarrollo del sistema inmunitario en ratas Wistar, y un tercer objetivo que pretende establecer el efecto inmunomodulador del suplemento con CLA -de forma continuada desde la gestación y durante 17 semanas- en ratas adultas inmunizadas con ovoalbúmina.Una de las principales aportaciones de la tesis es la demostración que el suplemento dietético con CLA (mezcla 80:20 de los isómeros cis9,trans11:trans10,cis12) durante los períodos de gestación, lactancia y primera infancia- ejerce un efecto inmunopotenciador sobre la respuesta inmunitaria humoral sistémica e intestinal durante las primeras etapas de vida en ratas Wistar.Concretamente, a nivel sistémico, este efecto inmunopotenciador se refleja en un incremento tanto de la concentración sérica de inmunoglobulinas como la producción esplénica de IgM. A nivel intestinal, el aporte de CLA induce un aumento de la expresión génica de IgA y su secreción hacia la luz intestinal. Por otra parte, cabe destacar que cuando el suplemento con CLA se inicia en el período de gestación y se prolonga durante 17 semanas, se evidencia también la capacidad inmunopotenciadora en rata adulta. En este caso, CLA incrementa la respuesta inmunitaria celular específica y promueve, a nivel intestinal, la producción de anticuerpos de isotipo IgA dirigidos contra un antígeno determinado. Por tanto, las propiedades inmunomoduladoras de CLA confieren a este ácido graso un gran potencial como posible ingrediente funcional. / THESIS SUMMARY:The maduration of the intestinal and systemic immune system takes place during the postnatal period and depends among others, of external factors coming from diet. It has been suggested that conjugated linoleic acid (CLA), present in breast milk, has immunomodulatory properties.Thus, it has been hypothesized that the CLA isomers mixture -cis9,trans11:trans10,cis12 (80:20)- during the first stages of life could help immune system maduration.This approach has been developed in three main objectives. The first two objectives are focused on determining the influence of CLA supplementation during gestation, suckling and early infancy on the development of the immune system of Wistar rats. The third aim tries to establish the immunomodulatory effect of CLA supplementation since gestation and during 17 weeks, in adult rats challenged with ovoalbumin.The main contribution of this thesis is the demonstration that CLA supplementation (isomer mixture 80:20 cis9,trans11:trans10,cis12) during gestation, suckling and early infancy enhances the systemic and intestinal immune response during the first stages of life in Wistar rats.Specifically, CLA supplementation shows an immune enhancing effect by increasing the concentration of sera immunoglobulins as wells as the splenic production of IgM. At the intestinal level, CLA induces an increment of IgA gene expression and its secretion to the intestinal lumen. Moreover, when CLA supplementation begins during gestation and lasts for 17 weeks, it is also seen an immune enhancing effect on adult rats. In this case, CLA increases the specific cellular immune response and promotes, at the intestinal level, the production of IgA antibodies for a particular antigen. Therefore, the immunomodulatory properties of CLA provide this fatty acid a great potential as possible functional ingredient.

EN CASTELLANO:Se presenta un estudio basado en la caracterización morfológica, fisiológica, quimiotaxonómica y análisis filogenético de 16 aislamientos obtenidos a partir de muestras procedentes de la Isla del Rey Jorge y la Isla de Livingston. Ambas son las islas de mayor superficie de las Shetland del Sur en la Antártida. Las muestras fueron proporcionadas por científicos españoles en el transcurso de las campañas científicas llevadas a cabo durante los veranos australes de los años 1987-88, 1988-1989 y 1990-91.El contenido de este trabajo se inicia con un recorrido histórico de la taxonomía bacteriana desde sus orígenes, los grandes hitos que han marcado su avance así como las perspectivas actuales de esta disciplina. Se señalan las aportaciones de Müller, Ehrenberg, Cohn, Migula, Orla-Jensen, Lehmann y Neumann, Buchanan, Bergey, Prévot, Krassilnikov, Murria, Kimura, Woese y Stackebrandt, entre otros.Como resultado de este estudio polifásico se ha logrado establecer la posición taxonómica de estos 16 aislamientos. Tres de las cepas aisladas (NF12, NF22 y NF24) corresponden a bacilos Gram negativos, psicrotrofos, móviles mediante flagelación polar monotrica y anaerobios facultativos. La composición de bases del DNA presenta un valor entre 41-42 mol % (G+C). En cuanto al perfil de ácidos grasos es similar al perfil que presentan otras especies del género Shewanella. Todas las cepas contienen ubiquinonas, menaquinonas y pequeñas cantidades de metilmenaquinonas al igual que otras shewanellas. Los estudios filogenéticos basados en la secuenciación del rRNA 16S y los experimentos de hibridación DNA-DNA confirman que estos aislamientos pertenecen al género Shewanella. Dos de ellos (NF12 y NF24) se ubican a nivel de la especie Shewanella firigidimarina mientras que NF22T ocupa una posición separada de las especies conocidas en el género Shewanella, corresponde por tanto a una nueva especie a la que se ha designado como Shewanella livingstonensis.El segundo grupo caracterizado comprende 11 biotipos que corresponden a cocobacilos Gram negativos, halotolerantes, inmóviles y con un metabolismo estrictamente oxidativo. El contenido en G+C presenta un rango entre 44-47 mol %. El perfil de ácidos grasos predominantes que se ha detectado concuerda con el presentado por el género Psychrobacter. Los estudios filogenéticos basados en la composición del rRNA 16S confirman que estas cepas pertenecen al género Psychrobacter. En cuanto a los experimentos basados en las hibridaciones DNA-DNA entre estos 11 biotipos y las especies de Psychrobacter filogenéticamente más próximas, nos han permitido establecer grupos de homología y concluir que 5 de los aislamientos (NF18, NF19, NF20, EN1 y EN2) se sitúan a nivel de Psychrobacter immobilis, 3 aislamientos (NF1, NF7 y NF8) corresponden a representantes de Psychrobacter glacincola y los otros 3 aislamientos corresponden a nuevas especies del género Psychrobactera las que se ha denominado Psychrobacter luti (NF11T) y Psychrobacter fozii(NF23T y EN4). El último grupo estudiado está constituido por los biotipos 20CM y 20CO, aislados a partir de sedimentos e identificados como miembros del género Paenibacillus. Estos microorganismos psicrotolerantes, aerobios o facultativos, presentan un Gram variable y forman endosporas ovales, terminales o subterminales, deformantes del esporangio. El perfil de ácidos grasos coincide con el descrito para el género Paenibacillus, siendo el ácido graso saturado C15:0 el mayoritario. La composición de bases del DNA es de 40.7 mol % (G+C). Los estudios basados en la secuencia del rRNA 16S sitúan la cepa 20CMT en el género Paenibacillus, con un índice de similitud del 99.5 % respecto a la especie Paenibacillus macquariensis DSM 2T. Sin embargo, los estudios de hibridación DNA-DNA entre ambas cepas dan unos niveles de reasociación muy bajos (47 %), lo que nos permite confirmar que el biotipo 20CMT corresponde a una nueva especie del género Paenibacillus para la que hemos propuesto el nombre de Paenibacillus antarcticus. / This Doctoral Memory presents a study based on evaluation of morphological, physiological, chemotaxonomic and phylogenetic analyses of 16 isolates from samples collected in the South Shetland Islands (Antarctica) by a Spanish scientific expeditions during the Antarctic summers of 1987-88, 1988-89 y 1990-91. The content of this work begins with an historical overview and taxonomic bacteriology perspectives also. Pointing out the contribution of Müller, Ehrenberg, Cohn, Migula, Orla-Jensen, Lehmann and Neumann, Buchanan, Bergey, Prévot, Krassilnikov, Murray, Kimura, Woese, Stackebrandt and others.As a result from this study we establish the taxonomic position of these bacteria. Three strains (NF12, NF22 and NF24) of psychrophilic bacteria isolated from Antarctic coastal marine environments were Gram-negative rods, facultatively anaerobic and motile by means of a single polar flagellum. The DNA base content of these bacteria was 41-42 mol % (G+C). The fatty acid profiles of the bacterial isolates were similar to the profiles of other "Shewanella" species. All the strains contained both ubiquinones and menaquinones, like "Shewanella" species. 16S rRNA gene analysis and DNA-DNA hibridization experiments confirmed that isolated strains belonged to the genus "Shewanella" and two of them specifically to "Shewanella frigidimarina" (NF12 and NF24), the other strain (NF22T) occupies a separate position in the genus "Shewanella" and is proposed as a new species, designated "Shewanella livingstonensis sp. nov".Another group of eleven psychrophilic bacteria isolated correspond to Gram-negative coccobacilli, halotolerant, non-motile with a strictly oxidative metabolism. The DNA (G+C) content ranged from 44 to 47 mol %. The predominant cellular fatty acids detected were typical of the genus Psychrobacter. 16S rRNA gene sequence analysis confirmed that the strains isolated belonged to the genus "Psychrobacter". DNA-DNA hybridization experiments showed six homology groups. The results of the study assigned five isolates (NF18, NF19, NF20, EN1 and EN2) to "Psychrobacter immobilis" LMG 7203T, three isolates (NF1, NF7 and NF8) to "Psychrobacter glacincola" LMG 21282T and three isolates to novel "Psychrobacter" species designated as a Psychrobacter luti sp. nov. (NF11T) and "Psychrobacter fozii sp. nov." (NF23T and EN4).The last group, constituted by 20CO and 20CM strains, was isolated from sediment and identified as a members of the genus "Paenibacillus". These organisms stained Gram-variable, produced ellipsoidal spores and were facultatively anaerobic. These isolates were psychrotolerant and the fatty acid profile was in accordance with that given in the description of the genus "Paenibacillus", anteiso-branched saturated C15:0 is the predominant fatty acid found. The DNA (G+C) content was 40.7 mol %. Studies based on 16S rRNA gene sequence analysis placed strain 20CMT within the Panibacillus cluster, with a similarity value of 99.5 % to "Paenibacillus macquariensis" DSM 2T. The low DNA-DNA reassociation value of 47 % between these two strains confirmed the distinct position of strain 20CMT within the genus "Paenibacillus". The name "Paenibacillus antarcticus sp. nov". is proposed to the type strain 20CMT.

Se ha estudiado la variabilidad genética de poblaciones de V. cholerae procedentes de distintas fuentes y orígenes geográficos, que agrupan diferentes serogrupos y biotipos de esta especie. Se ha analizado la variabilidad genética a dos niveles: a un nivel proteico, aplicando la técnica de electroforesis de aloenzimas multilocus (MLEE), y a un nivel génico, realizando el análisis de secuencias multilocus (MLST). Con ello, se ha intentado determinar la relación genética existente entre las distintas cepas estudiadas, considerando los datos obtenidos globalmente y por subgrupos de poblaciones, para establecer la estructura poblacional y la diversidad génica que presenta V. cholerae.Un total de 107 cepas de V. cholerae, incluyendo 29 cepas pertenecientes al serogrupo O139, fueron estudiadas aplicando la técnica de electroforesis de aloenzimas multilocus (MLEE) para determinar la variación alélica de 15 enzimas "housekeeping". Todos los loci fueron polimórficos y se identificaron 99 ETs para el total de la muestra. No se detectó una asociación significativa de las cepas en función de su serogrupo u origen geográfico. Se obtuvo el valor de diversidad génica media (H=0,50) más alto descrito para esta especie. El análisis del desequilibrio de ligamiento mostró una estructura clonal para el conjunto de la población, pero cuando se estudiaron subgrupos de esta población hubo excepciones, que hacen pensar en la existencia de un cierto grado de recombinación. Estos resultados sugieren que la población estudiada presenta una estructura poblacional epidémica.Para una colección de 29 cepas del serogrupo O139 se ha realizado el análisis comparativo de fragmentos internos de 6 genes "housekeeping", aplicando la metodología de análisis de secuencias multilocus (MLST). Los resultados obtenidos muestran la existencia de al menos 3 clones distintos entre las cepas analizadas, contradiciendo la actual hipótesis monoclonal de este serogrupo. También se detectaron dos grupos muy distintos de cepas del serogrupo O139, ST1 y ST4, que exhibieron diferencias en el perfil alélico para los 6 loci analizados.

En aquest estudi es van aïllar un total de 199 soques mesòfiles del gènere Aeromonas a partir de mostres de mol·luscs bivalves i d'aigües dolces. El medi agar dextrina ampicil·lina (ADA) fou el medi de cultiu més eficient en l'aïllament d'Aeromonas. La selecció de 16 proves fenotípiques clau va permetre la identificació a nivell d'espècie del 91 % de les soques estudiades. Es va realitzar un estudi de taxonomia numèrica amb 64 proves fenotípiques i 220 soques que, al 89 % de S[sub SM], va definir huit phena (I-VIII). Totes les soques d'una mateixa espècie o de diverses espècies d'un mateix complex fenotípic o fenoespècie es van agrupar en un únic phenon, excepte les soques tipus d'A. salmonicida i d'A. media que no s'agruparen en cap dels phena definits. Els phena V, VI i VII agruparen soques aïllades de mol·luscs bivalves no identificades a nivell d'espècie, la qual cosa suggereix l'existència de noves espècies del gènere Aeromonas. Per una altra banda, mentre la majoria de les espècies mostraren activitat beta-hemolítica, únicamente les espècies A. hydrophila, A. bestiarum i A. salmonicida van presentar activitat elastolítica. La presència d'espècies d'Aeromonas patògenes oportunistes i d'altres espècies amb factors de virulència fa recomanable la monitorització d'Aeromonas en aigües (potables, recreatives i de piscifactories) i en aliments que, com les ostres, es consumeixen crus o poc cuits.Es va aplicar la tècnica d'electroforesi d'enzims multilocus (MLEE) a 122 soques de les espècies A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, A. popoffii i A. trota. Mitjançant l'anàlisi de 15 enzims, s'obtingueren 79 perfils al·lèlics o tipus electroforètics (ETs). La diversitat genètica mitjana (H) de la mostra completa fou 0,64. Les subpoblacions A. hydrophila i A. salmonicida van presentar major diversitat genètica que les subpoblacions A. popoffii i A. bestiarum. Per una altra banda, l'anàlisi del desequilibri de lligament suggereix que l'estructura poblacional d'Aeromonas és clonal, ja què l'índex d'associació (I-subA) fou significativament diferent de 0 (I-subA=2,38, P menor que 0,0001). A una distància genètica menor que o igual a 0,7 el dendrograma de la relació genètica entre ETs va separar clarament les espècies A. salmonicida (grup II), A. trota (grup III) i A. hydrophila (grup IV), en canvi, les espècies A. bestiarum (subgrup Ib) i A. popoffii (subgrup Ic) es van separar a una distància genètica memor que o igual a 0,6. Les soques mesòfiles i psicròfiles de l'espècie A. salmonicida s'agruparen conjuntament. El dendrograma de la relació genètica entre ETs també va mostrar una bona correlació amb l'origen de les soques. Finalment, la comparació entre la identificació fenotípica de les soques i les freqüències al·lèliques obtingudes en la técnica MLEE va mostrar que cinc loci, EST1 (esterasa 1), HEX (hexoquinasa), IDH (isocitrat deshidrogenasa), LDH1 (lactat deshidrogenasa 1) i MDH (malat deshidrogenasa), identifiquen correctament el 94 % de les soques estudiades.

ANTECEDENTES: El cambio global conduce a la emergencia o reemergencia de las enfermedades transmitidas por vectores en algunas partes del mundo, incluyendo la leishmaniosis, una de las más olvidadas. La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria transmitida principalmente a través de la picada de un flebotomo vector. En nuestro entorno, la leishmaniosis está causada por Leishmania infantum y los vectores probados de la misma son Phlebotomus ariasi y P. perniciosus. Los perros domésticos constituyen el principal reservorio del parásito, representando un riesgo para los humanos. En la Península Ibérica, la distribución de la leishmaniosis humana y canina es heterogénea e incompleta. En Andorra y Lleida existen algunos estudios sobre la presencia de flebotomos y hay algunos casos de leishmaniosis humana recogidos de forma oficial en la provincia de Lleida pero, por otra parte, no existen datos oficiales sobre la presencia de casos de leishmaniosis canina. La posibilidad de que la enfermedad esté extendiéndose y estableciéndose en los Pirineos debe ser tomada en consideración, conociendo la presencia de la misma en las áreas fronterizas de Francia y España. OBJETIVOS: El principal objetivo del presente estudio es la obtención de datos epidemiológicos sobre la leishmaniosis que puedan ser utilizados como base para el monitoreo de la evolución de la enfermedad en estudios posteriores, a través del estudio de los vectores y de la leishmaniosis canina así como de los factores que influyen en su densidad y seroprevalencia. MÉTODOS: Se han realizado tres tipos de estudios: un estudio entomológico en Andorra y Lleida mediante la captura de flebotomos con trampas adhesivas colocadas en los lugares de reposo de los adultos, un estudio basado en un cuestionario sobre la percepción de la leishmaniosis canina enviado a todos los veterinarios dedicados a pequeños animales de la provincia de Lleida y un estudio serológico transversal realizado en perros de la comarca del Pallars Sobirà. Se realizaron análisis bivariantes y multivariantes para estudiar la correlación estadística entre las distintas variables recogidas y las variables respuesta obtenidas (densidad de los vectores y seroprevalencia de leishmaniosis canina). RESULTADOS: En el estudio entomológico, las dos especies vectoras fueron capturadas en Andorra donde P. ariasi mostraba una distribución más amplia, encontrándose ejemplares entre los 800 y los 2200 m s.n.m., mientras que P. perniciosus, identificado por primera vez en la zona, estaba presente por debajo de los 1000 m s.n.m. En la provincia de Lleida también se capturaron los dos vectores entre los 94 y los 1630 m s.n.m. El análisis bivariante reveló que factores como la altitud, el piso bioclimático, la temperatura, la precipitación, el lugar de captura, la presencia de vegetación en el muro, el hecho de estar en un parque natural, el ambiente general, la vegetación adyacente y la cobertura del suelo se asociaban de forma significativa a la densidad de las especies, a menudo con resultados opuestos, en función de la especie. El modelo multivariante para P. perniciosus reveló que su densidad se encontraba afectada principalmente por la situación de la trampa de captura (caminos asfaltados IRR: 0,41) y la cobertura del suelo (cultivo IRR: 4,59). En el caso de P. ariasi, se observó una correlación significativa con la altitud, incrementando su densidad por encima de los 800 m s.n.m. (IRR: 3,40), y con el piso bioclimático, disminuyendo su densidad en el piso Mesomediterráneo con respecto a los pisos presentes en las zonas pirenaicas (IRR: 0,08). El estudio serológico mostró una seropositividad del 33,1%. Los resultados del modelo de regresión logística mostraron que el riesgo de seropositividad aumentaba con la edad (OR=1,35 p-valor=0,002), en aquellos perros que vivían en la zona sur del Pallars Sobirà (OR=6,20 p-valor=0,025), en aquellos cuyos dueños consideraban que sus animales estaban en riesgo de padecer la enfermedad a lo largo de su vida (OR=1,26 p-valor=0,024) y en aquellos que no estaban informados de la utilización de medidas preventivas (OR=11,6 p-valor=0,009). El riesgo decrecía cuando los perros vivían en hábitats urbanos o periurbanos (OR=0,17 p-valor=0,002). DISCUSIÓN: Se considera a Andorra como un área en riesgo para la emergencia de la leishmaniosis humana y canina debido a la presencia de los vectores durante el periodo de transmisión de la enfermedad en regiones templadas. Dada la influencia de factores bióticos y abióticos en la distribución y densidad de las especies vectoras, queda claro que el cambio global puede afectar a la distribución y expansión de la leishmaniosis en la provincia de Lleida. La utilidad de los cuestionarios veterinarios para definir la percepción de la leishmaniosis canina en una región virgen, queda puesta de manifiesto. La elevada seroprevalencia de la leishmaniosis canina detectada y el elevado porcentaje de perros asintomáticos seropositivos sugieren que el foco autóctono detectado por primera vez en la provincia de Lleida no es reciente. La transmisión de Leishmania infantum puede verse favorecida por la presencia de una elevada densidad de perros viviendo en condiciones idóneas para que tenga lugar la transmisión de la enfermedad, incluso en presencia de una baja densidad de especies vectoras capturadas con trampas adhesivas. CONCLUSIONES: Un monitoreo constante del área estudiada es necesario para el control de la expansión así como del posible establecimiento de la enfermedad. / Changes in global climate, human activities and migration have resulted in the emergence or re-emergence of vector-borne diseases in some parts of the world, including leishmaniasis, one of the most neglected diseases. Leishmaniasis is a parasitic disease transmitted mainly by the bite of permissive sand flies. In the Iberian Peninsula, leishmaniasis is caused by Leishmania infantum and the two proven vectors are Phlebotomus ariasi and P. perniciosus. The domestic dogs constitute the main reservoir hosts of the parasite, representing a risk for humans. The distribution of canine and human leishmaniasis in the Iberian Peninsula is heterogeneous and incomplete. In Andorra and Lleida there are few studies on the presence of sand flies but non official data on canine leishmaniasis is recorded. In spite of that, there are some official records on human leishmaniasis cases noticed in Lleida province. The possibility of the disease becoming wide-spread and established in the Pyrenees has to be under consideration, knowing the presence of the disease in the bordering areas of France and Spain. The general aim of the present work is to obtain epidemiological data on leishmaniasis that could be used as a base to monitor the evolution of the disease in later studies through the study of sand fly vectors and canine leishmaniasis and also identify the factors influencing them in Andorra and Lleida province. Three kinds of studies were carried out in the studied area. An entomological survey in Andorra and Lleida province through sand fly captures using sticky traps set in adults resting places, a questionnaire-based survey on canine leishmaniasis send to all the clinical veterinarians of small animals in Lleida province and a serological cross-sectional study in the dogs of Pallars Sobirà county. Bivariate and multivariate statistical analyses were applied to study the correlation between all the variables recorded and the outcomes obtained. The density of the vectors was used as a first outcome and the seroprevalence of canine leishmaniasis were used as a secondary outcome. Andorra is an area at risk of human and canine leishmaniasis emergence, given the presence of vectors during the disease transmission period in temperate countries. Given the influence of biotic and abiotic factors in the distribution and density of vector species, it is clear that global change would affect the distribution and expansion of leishmaniasis in Lleida province. The usefulness of veterinary questionnaires in defining awareness of canine leishmaniasis in a naïve region has been confirmed. The high seroprevalence of canine leishmaniasis detected and the high percentage of asymptomatic seropositive animals suggest that the focus detected for the first time in Lleida province has not emerged recently. Leishmania infantum transmission could be favoured by the presence of a high density of dogs living under conditions suitable for the transmission of the disease, even in the presence of a low density of sand flies vectors captured with sticky traps. A constant monitoring of the area studied is necessary to control the possible establishment and also the wide-spread of the disease.

El trabajo de investigación que aquí presentamos tiene sus orígenes a finales de los años 80, momento en que se gestó en el Departamento de Psicología Evolutiva y de la Educación, el grupo de investigación EIDA (Equipo de Investigación de Deficiencias Auditivas), dirigido por la Dra. Carme Triado, que se proponía como objetivo principal conocer el desarrollo comunicativo y lingüístico de los niños sordos. El pertenecer a este grupo nos permitió iniciarnos en el mundo del sordo y progresivamente nos fuimos interesando por el acceso a la alfabetización de estas personas. Nos vinculamos a varios grupos de investigación, dirigidos por la Dra. M. Pilar Fernández Viader, con el propósito de acercarnos a la realidad de estas personas. Por un lado participamos en el Seminario Permanente CHILDES, colaborando en la investigación que lleva por título "Estudio, revisión y adaptación del sistema CHILDES para el análisis de la interacción comunicativa niño-adulto en poblaciones infantiles de desarrollo psicológico normal y con necesidades educativas especiales", y por otro lado, participamos en los proyectos de investigación del grupo DACINE (Desarrollo, Aprendizaje, Comunicación y Necesidades Educativas). El acercamiento a las personas sordas nos desveló algunas lagunas que presentan en la construcción del código escrito. Entre los humanos es universal la creación y uso del lenguaje. Entre las diferentes modalidades que el hombre ha creado, la escritura ha adoptado un papel fundamental para la revolución cultural como instrumento de transmisión de valores e información. En nuestra sociedad el dominio de la lengua escrita permite el acceso al conocimiento y a la información. Reconocida la importancia que nuestra sociedad le concede al mundo gráfico, a la necesidad de tener acceso al mundo de las letras nos propusimos conocer cuál era la realidad de las personas sordas cuando se proponían aprender a escribir. Los sordos, aparentemente, no deberían presentar dificultades para acceder a este sistema de comunicación visual, pues su limitación es auditiva, pero no es esta la realidad. Las personas sordas, pese a cursar la escolaridad obligatoria, ya sea en centros ordinarios o especiales, deben superar un considerable número de obstáculos para alcanzar un nivel funcional de la escritura. Realizamos varios estudios con el propósito de conocer la realidad en torno a la competencia en escritura que poseían las personas sordas; cuál era su nivel de escritura espontánea y cuáles las dificultades más frecuentes. Nuestros resultados (Fernández Viader y Pertusa,1995) fueron coincidentes con anteriores estudios (Mogford,1981 ;Marchesi,1987) que mostraban niveles inferiores al de sus iguales oyentes y un mayor registro de errores, tanto fonéticos como morfológicos y sintácticos. A partir de estas evidencias nos planteamos aproximarnos al proceso de construcción de la escritura de las personas sordas. Partimos de algunas ideas previas, que nos permitirán entender con mayor claridad el trabajo realizado y la organización de los diferentes capítulos. Por un lado, el hecho de que el código escrito resulta fundamental como medio de comunicación y conocimiento en nuestro contexto socio-cultural, pues muchas de las informaciones y de conocimientos son transmitidos a través de la escritura. La lengua escrita la consideramos como segunda lengua para estos sujetos, pues precisan adquirir primeramente una lengua sobre la que edificarla. Representa la modalidad escrita de la lengua oral, de la lengua del oyente. Es bien conocida la esencial importancia del acceso a la comunicación y al lenguaje para los seres humanos y, en particular, el interés de que el niño se desarrolle inmerso en un entorno lingüístico donde la comunicación sea accesible, desde el principio, de manera que se le facilite la apropiación de una primera lengua. Esta resulta ser una primera dificultad que encontramos con los alumnos sordos, la gran mayoría inmersos en contextos orales, por lo que no comparten con los otros un canal o sistema de comunicación. Nuestra propuesta con los niños sordos es propiciar una inmersión en entornos lingüísticos signados, en los que la Lengua de Signos sea utilizada normalmente por usuarios habituales, competentes, que inunden el entorno infantil de un sistema de comunicación eficaz; entendemos la lengua de signos como la lengua natural de estos niños y por tanto debe ser la lengua vehicular en las situaciones enseñanza-aprendizaje. Una segunda premisa surge de postulados socioculturales. Creemos fundamental que el alumno sienta interés y motivación para acceder a esta forma de lenguaje que la cultura pone a su alcance. Para ello, resulta imprescindible que los alumnos perciban la funcionalidad social y personal que aporta la escritura en nuestro contexto sociocultural. Por último, como tercera premisa sostenemos que la construcción de la escritura es un proceso en el que el profesor adopta un papel central, pues el uso de determinadas estrategias y recursos puede beneficiar esta motivación y construcción personal hacia el escrito. El profesor adquiere el rol de andamiador en el proceso de construcción del conocimiento, acompañando al alumno en el proceso de enseñanza-aprendizaje. Por tanto, nos interesa avanzar en el estudio de los procesos de ajuste que tienen lugar entre profesor y alumno durante el aprendizaje de la lengua escrita, para, de este modo, poder obtener más datos para el asesoramiento y la intervención educativa en este ámbito (Pertusa, 1995). Estas ideas generales orientan la concepción de nuestro trabajo. Recogemos en una primera parte, el marco teórico más amplio en que se enmarca nuestra investigación, desde la perspectiva constructivista de enseñanza-aprendizaje hasta la conceptualización de la escritura en las personas sordas. De esta forma, la primera parte del trabajo está organizada en tres capítulos. El primero de ellos presenta las premisas generales que definen la concepción constructivista de la enseñanza y el aprendizaje, marco teórico que adoptamos en este trabajo. El segundo capítulo, recorre diferentes perspectivas que se aproximan al tema de la escritura; desde aproximaciones psicogenéticas, cognitivas hasta la concepción de escritura que adopta la perspectiva constructivista de la escritura. El capítulo tercero, se centra en el proceso de apropiación de la lengua escrita por parte de las personas sordas. La segunda parte de la tesis desarrolla nuestro estudio empírico, y ocupa los restantes tres capítulos. El capítulo cuarto ofrece el contexto social en el que se recogen los datos, y presentamos a los sujetos de la investigación. Se definen además los objetivos e hipótesis directrices de este trabajo. El capítulo quinto recoge el proceso de construcción y la sucesión de sistemas de categorías hasta la elaboración de la taxonomía definitiva elaborada para el posterior análisis de los datos. Hemos valorado el interés de mostrar la trayectoria que han sufrido estas categorías, por considerarlas importantes para futuros estudios en tomo al tema de la escritura con alumnos sordos. En el capítulo sexto, se presentan los resultados obtenidos, tanto desde una perspectiva cualitativa como cuantitativa. Ofrecemos un análisis de las frecuencias y un análisis secuencial que nos ha permitido obtener patrones de conducta de la maestra cuando se propone el acercamiento de la escritura a los alumnos sordos. Finalizamos este segundo bloque, con el capítulo séptimo, en el que ofrecemos las conclusiones más interesantes que se desprenden de nuestros datos. De especial importancia constituye el reconocimiento de nuestro trabajo pionero en este ámbito de estudios, y por tanto, precursor de ideas y de nuevas cuestiones que restan sin contestar. La tesis contiene un considerable número de referencias bibliográficas, y un anexo con información adiente y complementaria al propio texto. Este trabajo pretende ser un primer paso en el tema del acceso a la lengua escrita por parte de las personas sordas, pero aún son numerosos los interrogantes que restan sin respuesta. Dejamos abiertas muchas cuestiones para que sigan realizándose distintas investigaciones en relación a este tema, para nosotros tan apasionante.

El software libre está cada vez más presente en lo cotidiano y actualmente ha dejado de ser sólo un asunto de interés para técnicos o profesionales de informática para volverse de interés general, provocando así discusiones alrededor de su uso en diversos sectores de la sociedad, sobre todo en la administración pública de las diversas esferas gubernamentales y en el área de educación. Pero hay una diversidad de puntos de vista, algunos incluso conflictivos, con respecto a su uso en este espacio. Se habla reiteradamente de las muchas ventajas y oportunidades que aporta a este entorno, pero poco se sabe en la práctica. Hacen falta evidencias empíricas que permitan corroborar o refutar determinadas ideas propagadas sobre su uso en esta área. De este modo, el principal objetivo de la investigación ha sido conocer y comprender el uso del software libre en contextos de la enseñanza obligatoria en la comunidad autónoma de Cataluña, a través de dos experiencias: una en una escuela primaria y otra en una de secundaria, ambas públicas y urbanas, que prácticamente sólo utilizan este software. Se trata de una experiencia educativa innovadora en Cataluña, considerando que pocos centros han llevado a la práctica el uso exclusivo, o casi, del software libre . Específicamente, el estudio se enmarca dentro de una metodología cualitativa de estudio de casos. Sobre las conclusiones, podemos decir que, en los casos y situaciones específicas de esta investigación, la utilización del software libre en los centros educativos participantes es una realidad sostenida e imparable. Han dado el primer paso y ha traído contribuciones substanciales a los centros educativos. Pese a la inercia, las naturales resistencias al cambio y desconfianzas respecto aquello que es menos conocido, los argumentos a favor de su uso en la educación van mucho más allá del ahorro económico y la tendencia en este sentido es clara. Por otro lado, aún falta mucho por hacer en cuanto a la promoción y difusión de programas libres. Esto es reflejo, también, de la inexistencia de políticas concretas por parte de los organismos gubernamentales. / Free software is every time more present in daily work and at the moment it stopped being only a subject of interest of technicians or professionals of computer science to become a general interest topic, thus causing discussions around of its use in diverse sectors of the society, especially in the public administration of the diverse governmental spheres and in the area of education. But there are many different points of view about it's use in this environment, even some conflictive. Many benefits and opportunities brought to this ambit are pointed repeatedly, but, in practice, little is known. Empirical evidence is needed to corroborate or refute certain ideas about it's use in this area. Thus, the main objective of this research was to find and understand the use of free software in the context of compulsory education in the autonomous community of Catalonia, through two experiences: one in a primary school and one in a secudary one, both public and urban, that use almost exclusively this software. It is an innovative educational experience in Catalonia, seing that few centers have implemented the exclusive, or nearly, use of free software. Specifically, the study follows a case study qualitative methodology. About the conclusions, we can say that, in the specific cases and situations of this research, the use of free software in participating schools is a sustained and unstoppable reality. They have taken the first step and it brought substantial contributions to schools. Despite the inertia, the natural resistance to change and distrust of what is less known, the arguments for its use in education go far beyond the cost savings, and the trend this way is clear. On the other hand, much remains to be done on the promotion and dissemination of free software. This reflects also the lack of specific policies by government agencies.