En la presente tesis doctoral está dividida en dos partes, una dedicada a la óptica no lineal y en concreto a la generación de segundo armónico (GSA) donde un compuesto se irradia con luz de longitud de onda  y éste es capaz de devolver al medio luz de longitud de onda /2. La otra parte está dedicada al estudio de los complejos de Meisenheimer, que son los intermedios que surgen de la reacción de Substitución Nucleófila Aromática. El nexo de unión de ambas partes son los aluminosilicatos porosos, utilizados en el caso de la óptica no lineal como soportes de procesos porosos y en el caso de los complejos de Meisenheimer como estabilizadores de este tipo de intermedios.En la parte dedicada a la óptica no lineal se realizan tres tipos de estudió de GSA: i) homólogos del verde de Malaquita, ii) p-nitroanilina incorporada en zeolitas y iii) C60. Para el primer estudio se llevó a cabo la síntesis de los homólogos del verde de malaquita y posteriormente se les realizaron los ensayos de GSA en forma de film y sólido microcristalino. En el segundo se estudió la influencia de los canales de la zeolita, con p-nitroanilina incorporada, en la obtención de GSA. En último lugar se realizó el estudió de GSA del C60 incorporado en aluminosilicatos y polímeros.En la segunda parte se llevaron a cabo tres tipos de estudio: i) Estudio del mecanismo de descomposición de un complejo de Meisenheimer activado mediante irradiación y/o O2, ii) Estabilización de un complejo de Meisenheiemer en zeolitas e hidrotalcitas y iii) Estudio del mecanismo de transferencia de hidruro entre un complejo de Meisenheimer y agentes oxidantes aceptores de hidruro. / The present thesis is divided into two different parts. The first part is devoted to non-linear optics and, specifically, to second harmonic generation (SHG). SHG consists in doubling the frequency of light by irradiation of an active medium. The second part of the thesis is dedicated to the study of Meisenheimer complexes, which are the intermediates of the Nucleophylic Aromatic Substitution reaction. The link between both parts is the use of porous aluminosilicates. They were used as matrices for the optical active species in the first part of thesis, and as stabilizers of the Meisenheimer complexes in the second part.The SHG efficiency of three different types of systems were investigated in the first part of the work: i) homologues of malachite green, ii) p-nitroaniline embedded in zeolites, and iii) C60. In the first case, new derivatives of the malachite green dye were synthesized and their SHG properties were investigated in thin films and as a microcristalline solid. Second, the influence of the ordering of p-nitroaniline within zeolites with different degrees of directionality on the SHG efficiencies was studied. Finally, the SHG behavior of C60 embedded in aluminosilicates and linked to polymers was probed.In the second part of thesis devoted to Meisenheimer complexes, the attention was focused on the following points: i) the decomposition mechanism of the complexes induced by light and/or oxygen, ii) the incorporation and stabilization of these species within zeolites and hidrotalcites, and iii) the mechanism of hydride transfer between the Meisenheimer complexes and oxidizing, hydride-acceptor agents.

El treball que es recull en la present tesi ha consistit, en primer lloc, en l'estudi de la reactivitat fotoquímica d'una sèrie de lactones i lactames quirals α,β-insaturades en front d'altres substrats insaturats com ara etilè, acetilè o dietil acetal de cetena així com alquins mono i disubstituits. La finalitat d'aquest estudi era construir derivats ciclobutànics i ciclobutènics enantiomèricament purs altament funcionalitzats mitjançant reaccions de fotocicloaddició [2+2]. Per aquest motiu s'han establert les millors condicions per a dur a terme les reaccions fotoquímiques (temperatura, temps, dissolvent, filtre de llum) i s'ha estudiat la diastereoselectivitat i la regioselectivitat amb la que tenen lloc aquests processos. Un cop optimitzades, les reaccions de fotocicloaddició [2+2] de cloro i fluoro lactones, així com de lactames, a etilè han sigut aplicades en la síntesi diastereoselectiva d'anàlegs ciclobutànics de cloro, fluoro i azanucleòsids amb interès biològic. La metodologia seguida ha permès preparar una amplia família de nous derivats de bases nitrogenades púriques (adenina, hipoxantina i 6-cloropurina) i pirimidíniques (timina). El pas sintètic clau en totes les síntesis ha consistit en una reacció de nucleosidació de Vorbrüggen entre un derivat acetilat i les corresponents bases nitrogenades. Finalment, l'activitat antiviral en front del VIH-1 ha sigut avaluada per a tots els anàlegs ciclobutànics de nucleòsids preparats, obtenint-se una activitat moderada per a un d'ells. / El trabajo recogido en la presente tesis doctoral ha consistido, en primer lugar, en el estudio de la reactividad fotoquímica de una serie de lactonas y lactamas quirales α,β-insaturadas frente a otros sustratos insaturados tales como etileno, acetileno, dietil acetal de cetena así como alquinos mono y disustituidos. La finalidad de este estudio era construir derivados ciclobutánicos y ciclobuténicos enantioméricamente puros altamente funcionarizados mediante reacciones de fotocicloadición [2+2]. Para ello se han establecido las mejores condiciones para llevar a cabo las reacciones fotoquímicas (temperatura, tiempo, disolvente, filtro de luz) y se ha estudiado la diastereoselectividad y la regioselectividad con la que estos procesos tienen lugar. Una vez optimizadas, las reacciones de fotocicloadición [2+2] de cloro y fluoro lactonas, así como de lactamas, a etileno fueron aplicadas en la síntesis diastereoselectiva de análogos ciclobutánicos de cloro, fluoro y azanucleósidos con interés biológico. La metodología seguida ha permitido preparar una amplia familia de nuevos derivados de bases nitrogenadas púricas (adenina, hiopoxantina y 6-cloropurina) y pirimidínicas (timina). El paso sintético clave de todas las síntesis ha consistido en una reacción de nucleosidación de Vorbrüggen entre un derivado acetilado y las correspondientes bases nitrogenadas. Finalmente, la actividad antiviral frente al VIH-1 ha sido evaluada para todos los análogos ciclobutánicos de nucleósidos preparados, obteniéndose una actividad moderada para uno de ellos. / This doctoral thesis is based on the study of the photochemical reactivity of a series of chiral α,β-unsaturated lactones and lactames with other unsaturated compounds such as ethylene, acetylene or diethyl ketene ketal as well as mono and disubstituted alkynes. The goal of this study was the preparation of enantiomerically pure cyclobutane and cyclobutene building blocks by means of [2+2] photocycloaddition reactions. The best experimental conditions (temperature, time, solvent, light filter) as well as the diastereoselectivity and regioselectivity of these processes have been determined. Once optimized, the [2+2] photocycloaddition of chloro and fluoro lactones, as well as lactames, to ethylene have been applied to the diastereoselective synthesis of cyclobutane chloro, fluoro and azanucleoside analogues. The methodology carried out has permitted the preparation of a wide family of new derivatives including purine (adenine, hypoxanthine and 6-chloropurine) and pyrimidine (thymine) nucleobases. The main key synthetic step has been in all cases a Vorbrüggen nucleosidation reaction between an acetylated derivative and the corresponding nucleobase. Finally, the anti-HIV activity of all the cyclobutane nucleoside analogues synthesized has been evaluated, showing one of them a moderate activity.

En esta tesis, se ha estudiado el estado de conservación de la roca utilizada en la construcción del acueducto romano de Zaghouan-Cartago (areniscas miocénicas de la unidad superior de la formación Fortuna).Se ha realizado una serie estratigráfica de la zona donde se encuentran parte de las canteras romanas que suministraron el material necesario para la construcción de los monumentos de la zona. De este estudio se desprendió que los diferentes frentes de cantera abiertos en la serie explotan en realidad el mismo nivel estratigráfico (nivel 3 del tramo inferior). También se desprendió que de toda la serie es este nivel el único posible que puede ser explotado como material de construcción, puesto que, es el único que presenta un grado de litificación adecuado y una potencia de estratos que permite extraer con facilidad sillares de las dimensiones deseadas. El estudio petrográfico detallado de esta roca mostró que corresponde a una cuarzoarenita no cementada y litificada por compactación, compuesta esencialmente por cuarzo (69-84 %), porosidad (14- 28 %), matriz arcillosa (0-10 %) y como componentes accesorios (0-1%) feldespato potásico y turmalina. Texturalmente, se trata de areniscas de tamaño fino a medio-grueso con una selección que varía de extremadamente buena a muy buena en el caso de las finas y que es moderada en el caso de las gruesas.La ausencia casi total de fase cementante, genera un sistema poroso único definido tan solo por la disposición de los granos de cuarzo y el grado de compactación de la roca. Esto confiere a la roca un carácter macroporoso y otorga a la porosidad una alta comunicabilidad.El carácter monomíctico cuarzoso de la roca la hace muy resistente a la alteración química o a cualquier mecanismo de alteración que implique la presencia de agua, puesto que, éste es el agente principal que interviene en la mayoría de los procesos de alteración físico-químicos del material pétreo.Estas características petrográficas se reflejan perfectamente en el comportamiento tanto físico como de alterabilidad de esta roca. El carácter macroporoso y la alta comunicabilidad del sistema poroso otorgan a la roca un excelente comportamiento hídrico. La ausencia de una fase cementante junto con la baja litificación de la roca hace que ésta sea muy débil mecánicamente y por tanto, muy vulnerable a cualquier tipo de mecanismo de alteración que implique fuerzas físicas o mecánicas disruptivas como es el caso de las sales solubles y el hielo-deshielo.Si la roca del monumento tiene un estado aceptable de conservación, es que porque ha estado en equilibrio con el medio ambiente en el cual esta ubicada. Por lo tanto, los factores que han ayudado a que la roca del monumento persista intacta durante tantos siglos son:- La indiferencia de la roca a la presencia de agua.- La ausencia de sales.- La ausencia de gelificación del agua.Si las condiciones ambientales cambian y la roca entra en contacto con sus agentes de alteración más agresivos (sales), entonces habrá que protegerla contra los efectos disruptivos que amenazan su integridad textural, intentando mejorar su cohesión interna. Para ello se ha optado a ensayar diferentes tratamientos de conservación para testar su idoneidad en el caso preciso de esta roca.Los consolidantes, no sólo no han perjudicado el comportamiento hídrico de la roca, sino que le han otorgado una mejora de alrededor del 200 % en sus características mecánicas, lo que indica un aumento de la cohesión entre los componentes de la roca. También se ha querido testar la idoneidad de estos consolidantes frente a la acción disruptiva de las sales. Los resultados obtenidos mostraron una mejora importante en la resistencia de la roca tratada con consolidante en relación a la roca sin tratar. Pero esta mejora es insuficiente para que se pueda considerar la consolidación como una solución eficaz y suficiente, para hacer frente a los daños que se pueden producir por la cristalización de sales.En el caso de los tratamientos de hidrofugación, los resultados han sido satisfactorios, puesto que, los productos utilizados impiden la entrada del agua casi en un 100% y sin producir ningún cambio en la red porosa ni en la permeabilidad al vapor de agua. Aunque la eficacia de estos tratamientos ha sido probada, su aplicación no tiene sentido en este caso, ya que, el agua en su estado líquido no perjudica la roca debido a su composición mineralógica prácticamente inalterable. / The state of conservation of the rock used in the construction of the Roman aqueduct of Zaghouan-Carthage is the core of this work. This rocks are Miocene sandstones of the upper unit of the Fortuna formation).A petrologic study, with all the diagnostic techniques required, was the main methodology of this work.Reconstruction of the stratigraphic series was performed in the zone where part of the Roman quarries, used in the construction of the monuments, is found. This study revealed that the different fronts of opened quarry in the series exploit the same stratigraphic level (level 3 of the lower section). It was also evidenced that this level is the only one of the whole section that can be exploited as construction material, since it is the only one that presents the appropiate degree of litification and thickness of strata. This allows the extraction of ashlars with easiness and wanted dimensions. The detailed petrographic study of this rock showed that it is a quartz-arenite that has not been cemented, and is lithified by compaction It is composed essentially of quartz (69-84%), porosity (14 - 28%), matrix (0-10%) and K-feldspar and tourmaline are the accessory components (0-1%). Texturally, sandstones are fine- to medium-coarse size with a selection that varies from extremely good to very good, in the case of the fine ones, and that it is moderated in the case of the coarse ones.The almost total absence of cement phase generates unique porous net that is defined by the disposition of the quartz grains and the compaction degree of the rock. This confers to the rock a macroporosic character and a highly connected porosity.The quartzitic character of the rock makes it very resistant to chemical mechanisms since water is the main agent that intervenes in most of the physico-chemical alteration processes of the rock material and quartz is basically an unreactive mineral.These petrogrphic characteristics are perfectly reflected in the physical behavior (hydric and mechanic) as well as in the alterability of the rock. The character macroporous and the high connectability of the porous system give the rock an excellent hydric behavior The absence of a cement phase together with the low lithification of the rock, makes it to be very weak mechanically. Therefore, it is very vulnerable to any type of alteration mechanism that implies physical or mechanical disruptive forces, like the case of soluble salts and ice-thaw. If the monument rock has an acceptable state of conservation, this is because it has been in equilibrium with the environment where it is located. Therefore, the factors that have helped the monument rock to persists intact during so many centuries are: - The indifference of the rock to the presence of water. - The absence of salts. - The absence of gelification of water. If the environmental conditions change and the rock enters in contact with more aggressive alteration agents (salts), then it will be necessary to protect it against the disruptive effects that threaten its textural integrity, improving its internal cohesion. Therefore, different conservation treatments has been tested in this rock.The consolidants not only did not harmed the hydric behavior the rock, but also improved its mechanical characteristics by 200%, indicating an increase in the cohesion among the components of the rock. This is due to the operatins way of the consolidant among the grains, joining the nearest ones and increasing the number of contacts among grains and in consequently, the cohesion of the rock.The suitability of these consolidants versus the disruptive action of the salts has also been tested. Although the obtained results showed an important improvement in the resistance of the rock treated, this improvement is insufficient to consider the consolidation as an effective and efficient solution in avoiding the damages that can take place by the crystallization of salts inside the porous system of the rock. In the case of the hydrophobing treatments, the results have been satisfactory, since the used products impeded the entrance of water by almost 100% without producing any changes in the porous system or in the permeability to the water vapor. Although the efficiency of these treatments has been proven, their application is not valuable in this case, since, water in its liquid state does not harm the rock because its mineralogical composition is practically unalterable.

Recientes progresos en el conocimiento de la patogénesis de la enfermedad causada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) junto con el desarrollo de potentes agentes antiretrovirales han resultado en una abundancia de opciones de tratamiento para los individuos infectados por este virus, y entre estos progresos, los avances en el conocimiento del proceso por el cual el VIH-1 entra en la célula huésped, han señalado este punto como una diana para el desarrollo de nuevas drogas que añadir al actual armamento terapéutico. Este trabajo esta centrado en el proceso de entrada viral, en su posible inhibición y en las consecuencias del bloqueo de alguno de sus pasos. AR177 (Zintevir) y las albúminas cargadas negativamente son dos clases de compuestos de naturaleza aniónica. Nosotros mostramos evidencias directas de que ambos compuestos interaccionan con la molécula gp120. Esto nos permite sugerir un modo de acción común para ambas clases de compuestos: la unión de dichas moléculas a la glucoproteína gp120, acción que previene una asociación estable entre el VIH-1 y las células CD4+. Los biciclanes y los aminoglicosidos conjugados a L-argininas son dos clases de agentes antivirales catiónicos. La fuerte interacción con CXCR4 aquí mostrada, indica que el mecanismo de acción de ambas clases de compuestos es el bloqueo del correceptor CXCR4. La naturaleza catiónica de estos compuestos podría conducir a interacciones electrostáticas con los residuos cargados negativamente de CXCR4, impidiendo de este modo la interacción de la glucoproteína de la envuelta de VIH con el correceptor CXCR4. Frente al bloqueo del receptor de quimiocinas CXCR4, en un modelo experimental que trataría de reflejar lo que ocurriría in vivo, el VIH-1 evoluciona de dos formas muy diferentes. Con concentraciones subóptimas del antagonista, y sin la posibilidad de utilizar otro correceptor, el virus adquiere un gran número de mutaciones en la glucoproteína de la envuelta que le permite crecer sin cambiar de correceptor Con concentraciones óptimas del antagonista, y en presencia del receptor CCR5, se da un cambio de fenotipo de tipo X4 a fenotipo de tipo R5 y se previene el cambio de fenotipo de tipo R5 a tipo X4, sugiriendo que el tratamiento de pacientes VIH-positivos con un antagonista de CXCR4 podría revertir el fenotipo viral de tipo X4 a un fenotipo menos patogénico de tipo R5 prolongándose así la fase asintomática de la enfermedad. En conjunto, nuestros resultados muestran que el bloqueo del proceso de entrada del virus de la inmunodeficiencia humana nos puede ofrecer una nueva oferta de fármacos antivirales que no sólo mejorarían las terapias anti-VIH actualmente existentes, sino que nos pueden ayudar a aumentar el conocimiento del proceso de infección del VIH, además de ayudarnos a diseñar nuevas drogas quizá capaces de llegar a la erradicación de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana.

Las neurotoxinas clostridiales (CNTs) producen patologías graves como el tétanos y el botulismo. En ambas patologías la muerte se produce en un porcentaje elevado y generalmente por colapso respiratorio y asfixia. Esta capacidad de causar la muerte en organismos superiores es responsabilidad de la actividad metaloproteásica dependiente de zinc que tienen estas toxinas en el dominio catalítico.Sin embargo, además de la actividad metaloproteásica también se han descubierto otras acciones farmacológicas de las neurotoxinas. Las neurotoxinas son estructuras proteicas complejas que han adquirido la capacidad de actuar en distintos sistemas a través de diferentes mecanismos de acción, como son el bloqueo de la captación de algunos neurotransmisores o bien de algunos de sus precursores.Asimismo, La toxina tetánica (TeTx) sintetizada por Cl.tetani, además de producir parálisis espástica, tiene otros efectos sobre diversos enzimas, no explicables por esta acción proteásica.En la presente tesis se describe la activación de vías de señalización en tejido nervioso por toxina tetánica (TeTx) como por su dominio C-terminal de 50 kDa de la cadena pesada (Hc). Estas vías de señalización incluyen la fosforilación del receptor TrkA y de la fosfolipasa C-1 (PLC-1), la translocación de las isoformas clásicas y nuevas de la proteína cinasa C (PKC) y la fosforilación de cinasas reguladas por señales extracelulares (ERK-1/2) en sinaptosomas de encéfalo de rata (Trabajo, 1). Experimentos similares en cultivos primarios de neuronas corticales demuestran la activación de las vías Akt y ERK1/2 (Trabajo, 2). Se presentan también trabajos que apuntan hacia una neuroprotección ejercida por el fragmento NO TÓXICO Hc frente a la muerte apoptótica de las neuronas granulares de cerebelo (CGN) en concetraciones bajas de potasio. Creemos que esta neuroprotección puede ser debida a la interacción del fragmento Hc con el receptor TrkB, receptor del factor de crecimiento BDNF, produciendo la activación de al menos tres vía de señalización: fosfatidilinositol-3-quinasa (PI-3K)/proteína quinasa B, Ras/ERK and PLC/PKC, tal como lo hace el BDNF. También caracterizamos la acción de bloqueo de la caspasa-3 en los mecanismos de protección celular (Trabajo, 3). Por último, y en el mismo modelo anteriormente mencionado, CGN, demostramos también el efecto neuroprotector del fragmento Hc-TeTx frente a la muerte apoptótica inducida por el MPP+, disminuyendo la muerte celular y la condensación de cromatina. En el proceso apoptótico inducido por el MPP+ se produce la translocación de Bax de la fracción citosólica a la fracción mitocondrial, la liberación de citocromo c en el citoplasma así como la activación de la pro-caspasa-3. Este proceso apoptótico es inhibido por el fragmento Hc-TeTx (Trabajo, 4). El conjunto de estos trabajos apunta a que el fragmento Hc-TeTx podría utilizarse como una neurotrofina (NGF, BDNF, NT/3,..) y producir acciones anti-apoptóticas terapéuticamente dirigidas. / The clostridial neurotoxins (CNTs) produce serious pathologies like the tetanus and the botulism. In both pathologies the death takes place in a high percentage and generally by respiratory collapse and asphyxia. This capacity to cause the death in superior organisms is responsibility of the dependent zinc metaloproteásica activity that has these toxins in the catalytic domain. Nevertheless, in addition to the metaloproteásica activity also other pharmacological actions of the neurotoxins have been described. The neurotoxins are complex protein structures that have acquired the ability to act in different systems through different mechanisms from action, as they are the inhibition of release of some neurotransmitters or of some of his precursors. Also, the tetanus toxin (TeTx) synthesized by Cl.tetani, besides to produce spastic paralysis, has other effects on diverse enzymes, no explicable by this protease action.In the present thesis, we described the activation of several signalling pathways in nervous system by both tetanus toxin (TeTx) and its atoxic 50-kDa C-terminal domain of the heavy chain (Hc). These pathways include phosphorylation of TrkA receptor and phospholipase C 1 (PLC 1), translocation of classical and novel protein kinase C (PKC) isoforms and phosphorylation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK 1/2) in rat brain synaptosomes (Work, 1). Similar experiments in primary cultures of cortical neurons demonstrate the activation of Akt and ERK1/2 pathways (Work, 2). Works also appear that aim towards the neuroprotection due to the NON-TOXIC Hc fragment against the apoptotic death of the cerebellar granule neurons (CGN) in low potassium concentration. We propose that this neuroprotection could be, in part, due to the interaction of Hc with the TrkB receptor, receptor of the endogenous neurotrophic factor BDNF, leading to the activation of at least three major signalling pathways: phosphatidylinositol 3 kinase (PI 3K)/protein kinase B, Ras/ERK and PLC/PKC, as BDNF does. We also characterized the blocking action of Hc on caspases in the mechanims of cell protection (Work, 3). Finally, and in the same model previously mentioned, CGN, we also demonstrated the neuroprotective effect of the Hc-TeTx fragment against the apoptotic death induced by the MPP+, diminishing the cellular death and the chromatin condensation. In the apoptotic process induced by the MPP+ the translocation of Bax of the citosolic to the mitochondrial fraction; the cytochrome c release in the cytoplasm takes place as well as the activation of the pro-caspasa-3. This apoptotic process is inhibited by the Hc-TeTx fragment (Work, 4). These results aims at that the Hc-TeTx fragment could be used like a neurotrophin (NGF, BDNF, NT/3..) and produce anti-apoptotic actions therapeutically directed.

El peròxid d'hidrogen és una espècie reactiva de l'oxigen que està involucrada en el dany oxidatiu i en la transducció intracelular de senyals. Per tant, és molt important regular la concentració de H2O2 per tal de mantenir la senyalització sense danyar les biomolècules. Les catalases són el principal sistema regulador dels nivells de peròxid d'hidrogen i per això participen en processos imflamatoris, mutagènesi, prevenció de l'apoptosi i estimulació d'un ampli espectre de tumors. Les hemo catalases són enzims que dismuten el peròxid d'hidrogen en aigua i oxigen (2 H2O2 →2 H2O + O2). Estan presents en pràcticament tots els organismes aeròbics i són uns dels enzims més eficients coneguts, amb 106 molècules de H2O2 degradades per segond. Degut a aquest augment excepcional de la velocitat de dismutació del H2O2 respecte als catalitzadors que no són proteïnes, la catalasa va ser un factor clau per reconèixer que els enzims són proteïnes i que tenen especificitat de substrat. S'ha observat que algunes catalases contenen un hemo modificat (hemo d), en comptes del més abundant hemo b (protoporfirina IX de ferro). Malgrat que el cicle catalític d'aquests dos tipus de catalases és el mateix, no es coneix l'efecte de la modificació de l'hemo en l'estructura i configuració electrònica dels intermedis de reacció o en les seves propietats redox i àcid-base. El principal intermedi del cicle catalític és una espècie de ferro de valència alta (Por·+-FeIV=O) anomenada Compost I (Cpd I). El Cpd I reacciona amb una mol·lècula de peròxid d'hidrogen produint aigua i oxigen molecular. Aquesta reacció també és duta a terme per altres hemoproteïnes, però a una velocitat molt méss baixa. La causa d'aquesta disparitat s'ha estudiat durant molts anys, i, tot i que aquesta reacció es coneix des del 1940, el seu mecanisme molecular detallat encara no s'ha clarificat. Aquesta tesi té com a objectiu respondre aquestes preguntes, considerant dues catalases com a prototip: la catalasa de Helicobacter pylori (HPC, que conté hemo b) i la catalasa de Penicillium vitale (PVC, basada en hemo d). Aquest estudi s'ha realitzat utilitzant dinàmica molecular (clàssica i ab initio). La tesi s'ha organitzat de la següent manera. El Capítol I introdueix els enzims a estudiar, les hemo catalases, i presenta els objectius generals d'aquest treball. Els fonaments metodològics s'expliquen al Capítol II. Els Capítols III-VII contenen una breu introducció al problema investigat, seguida d'una descripció i discussió de les simulacions realitzades. En primer lloc (Capítol III), s'ha estudiat l'efecte de la modificació de l'hemo en els intermedis de la catalasa utilitzant models en fase gas. Al Capítol IV, s'ha analitzat l'estructura dels intermedis formats per HPC and PVC i s'ha confirmat l'estat de protonació del Compost II (Cpd II) de catalasa. Al Capítol V s'han investigat els factors que determinen que HPC and PVC formin diferents intermedis (Compost I i Compost I, respectivament). Al Capítol VI, s'ha avaluat la validesa dels arguments utilitzats normalment per predir l'estat de espín de l'oxigen molecular produït per la catalasa. El mecanisme molecular de la reacció de la catalasa s'ha estudiat al Capítol VII. Finalment, el Capítol VIII llista les principals conclusions d'aquesta tesi. Informació addicional sobre les simulations realitzades als Capítols IV-VII es pot trobar als Apèndixs A-D. / Hydrogen peroxide is a reactive oxygen species that is involved in oxidative damage as well as in intracellular redox-sensitive signal transduction. Therefore, a fine balance of the H2O2 concentration is essential for mantaining signaling without damaging biomolecules. Catalases are the primary enzymes regulating these hydrogen peroxide levels and thus they have been implicated as an important factor in inflammation, mutagenesis, prevention of apoptosis and stimulation of a wide spectrum of tumors. Heme catalases are enzymes that decompose hydrogen peroxide into water and oxygen (2 H2O2 →2 H2O + O2). They are present in almost all aerobic organisms and are one of the most efficient enzymes known, with 106 molecules of H2O2 degraded per second. Indeed, because of the exceptional rate enhancement of H2O2 dismutation compared to catalysts that are not proteins, catalase was a key factor in the early recognition that enzymes are proteins and have substrate specificity. It has been shown that some catalases contain a modified heme (heme d) instead of the most abundant heme b (i.e. iron-protoporphyrin IX). Although the reaction cycle performed by the two types of catalases is the same, the effect of the heme modification on the structure and electronic configuration of the reaction intermediates, as well as on their redox and acid-base properties is not known. The principal active species of the catalase reaction cycle is a high valent iron species (Por·+-FeIV=O) named Compound I (Cpd I). Cpd I reacts with a molecule of hydrogen peroxide releasing water and molecular oxygen. This reaction is also performed by other hemeproteins, although at much slower pace. The origin of this disparity has long been sought, and even though the catalase reaction has been known since 1940s, its detailed molecular mechanism has yet to be clarified. The present thesis is aimed at answering these questions, considering two catalases as a test case: Helicobacter pylori catalase (HPC, a heme b-containing catalase) and Penicillium vitale catalase (PVC, based on heme d). This investigation will be performed by means of molecular dynamics (classical and ab initio). The thesis is organized as follows. Chapter I introduces the enzymes under study, heme catalases, and presents the general objectives of this work. The basics of the methodologies used are given in Chapter II. Chapters III-VII contain a brief introduction to the problem investigated, followed by a description and discussion of the simulations performed. First, the effect of the heme modification on catalase intermediates is investigated in Chapter III by using gas phase models. In Chapter IV, we analyze the structure of the intermediates formed by HPC and PVC and ascertain the protonation state of catalase Compound II (Cpd II). The factors determining that HPC and PVC show different oxidized intermediates (i.e. Compound I* and Compound I, respectively) are investigated in Chapter V. In Chapter VI, we assess the validity of the arguments commonly used to predict the spin state of the molecular oxygen released by catalase. The molecular mechanism of the catalase reaction is studied in Chapter VII. Finally, Chapter VIII lists the main conclusions of this work. Additional information on the simulations performed in Chapters IV-VII can be found in Appendixes A-D.

El conocimiento de los factores de virulencia de Mycobacterium tuberculosis es primordial para el desarrollo de nuevos fármacos y vacunas, esenciales para combatir esta enfermedad infecciosa que causa anualmente 1,7 millones de muertes. Una característica distintiva de las cepas virulentas de M. tuberculosis es la capacidad de fijar el colorante rojo neutro en su forma ácida. En trabajos anteriores se refutó la relación, ampliamente aceptada hasta el momento, entre este comportamiento y el sulfolípido (un componente de la envuelta celular); y se determinó que el gen Rv0577, cotranscrito con el posible regulador transcripcional Rv0576, confería a M. smegmatis (una micobacteria saprófita) el fenotipo rojo neutro positivo de las cepas virulentas de M. tuberculosis.En el presente trabajo, mediante fusiones transcripcionales y el análisis con microchips, se ha demostrado que el gen Rv0576 es, efectivamente, un regulador transcripcional que reprime la expresión del operón Rv0576-Rv0577. Sin embargo, el estudio de cepas mutantes y complementadas en estos genes ha mostrado que ninguno de estos dos genes es necesario para la tinción con rojo neutro de M. tuberculosis, ni para la virulencia en el modelo de infección murino.Asimismo se ha comprobado que M. tuberculosis, in vitro, forma poblaciones celulares heterogéneas para el carácter rojo neutro y para la síntesis de dimicocerosatos de ftiocerol, unos lípidos de la envuelta celular relacionados con la virulencia del bacilo. Los mutantes espontáneos rojo neutro negativos revierten, con cierta frecuencia, al fenotipo salvaje; mientras que no se ha detectado reversión en los mutantes en la síntesis de dimicocerosatos de ftiocerol, que se acumulan con las sucesivas resiembras de M. tuberculosis, hasta resultar en la población mayoritaria. Estas observaciones, y la relación de la tinción con rojo neutro y de los dimicocerosatos de ftiocerol con la virulencia de M. tuberculosis, ponen de manifiesto la necesidad de comprobar estos fenotipos antes de realizar el análisis de la virulencia de una determinada cepa o mutante de M. tuberculosis. / The identification of Mycobacterium tuberculosis virulence factors is necessary to develop new drugs and vaccines, urgently needed to fight an infectious disease that causes 1.7 million deaths annually. A unique feature of the virulent strains of M. tuberculosis is their ability to fix the neutral red stain in its acid form. Although sulfolipid (a component of the cell envelope) was first recognized as the molecule responsible for the neutral red uptake, recent studies have refuted this relationship, and have established that the Rv0577 gene, which constitutes a single operon together with the putative transcriptional regulator Rv0576, provides M. smegmatis (a saprophytic mycobacteria) with the neutral red positive phenotype characteristic of M. tuberculosis virulent strains.In the present work, by means of transcriptional fusions and microarray analysis, we have proved that the Rv0576 gene indeed behaves as a transcriptional regulator that represses the expression of the Rv0576-Rv0577 operon. However, studies of mutant and complemented strains in these genes have shown that none of them is necessary either for the neutral red reaction of M. tuberculosis or for virulence in the murine infection-model.We have also proved that, in vitro, M. tuberculosis forms heterogeneous cell populations regarding the neutral red character and the synthesis of phthiocerol dimycocerosates, a cell-wall lipid related to the virulence of the bacillus. Reversion of the spontaneous neutral red mutants to the wild-type phenotype occurs at certain frequency, whereas reversion of the mutants in the synthesis of phthiocerol dimycocerosates has not been detected and they accumulate with successive cultures of M. tuberculosis, becoming the bulk of the population. As both the neutral red character and phthiocerol dimycocerosates are related to M. tuberculosis virulence, it would be prudent to check these phenotypes before analyzing the virulence of a certain strain or mutant of M. tuberculosis.

Les Ribonucleotidil reductases (RNRs) són un grup d'enzims que catalitzen la reducció de ribonucleòtids (NTPs) a desoxiribonucleòtids (dNTPs), proporcionant a tots els organismes vius la quantitat necessària de monòmers per a la síntesis i la reparació del DNA. S'han caracteritzat tres classes diferents de RNRs en funció dels mecanismes de generació del radical, diferències estructurals, regulació al·lostèrica i dependència envers l'oxigen, però totes elles tenen en comú el mecanisme de reacció i la utilització d'un radical orgànic lliure per a iniciar la catàlisi.El genoma de Streptococcus pyogenes (Grup A Streptococcus [GAS]), un patògen humà responsable de diverses malalties, conté els gens per a sintetitzar dues RNRs completes de classe Ib (nrdHEF/nrdI2 i nrdFIE*, respectivament), mentre que la majoria d'estreptococs tan sols conté els gens nrdHEF/nrdI2. Aquest treball intenta determinar si la presencia de una segona reductasa de classe Ib en aquest microorganisme és conseqüència d'una necessitat biològica o si senzillament és el resultat del procés evolutiu. S. pyogenes és el primer organisme procariota on s'han estudiat dues riboucleotidil reductases de la mateixa classe.L'estudi per RT-PCR de lligament ha demostrat que tots dos agrupaments es transcriuen de manera simultània i que constitueixen dues unitats policistròniques independents. Les subunitats ? i ? d'aquests dos sistemes s'han purificat i caracteritzat bioquímicament. El primer sistema (nrdHEF) ha resultat ser bioquímicament actiu i presenta una senyal d'EPR que coincideix amb la d'altres radicals tirosil de classe Ib. L'activitat del sistema depèn de l'adició de magnesi i DTT i utilitza NDPs, però no NTPs, com a substrat. Tanmateix, es veu estimulada per el dATP com a efector al·lostèric però no per l'ATP, tal i com correspon a un enzim de classe Ib. No obstant, no s'ha pogut detectar activitat ni un radical tirosil en l'operó nrdFIE*. L'alineament de la subunitat ? d'aquest operó ha mostrat que tres dels sis residus d'unió a ferro no estan conservats. El contingut de ferro de les dues proteïnes NrdF mostra clarament que, a diferència del que succeeix en la proteïna NrdF, la proteïna NrdF* no és capaç de coordinar un centre difèrric in vitro en les condicions de l'assaig, impedint-se així la generació d'un radical tirosil.L'assaig de complementació heteròloga, no obstant, indica que l'operó nrdFIE* és funcional in vivo si tots tres gens estan presents. D'una manera similar, l'operó nrdHEF no presenta complementació si no s'afegeix una proteïna NrdI funcional a l'assaig. En presència de les proteïnes NrdI* i NrdI2 de S. pyogenes, l'operó nrdHEF no és funcional in vivo, però si s'assaja en combinació amb la proteïna NrdI2 de S. pneumoniae. La presencia d'un agrupament nrdFIE quasi idèntic en totes les espècies del gènera Mycoplasma ens permet suggerir que l'operó nrdFIE ha estat adquirit per S. pyogenes mitjançant transferència genètica lateral per a compensar la pèrdua de funcionalitat de la proteïna NrdI*.També hem estudiat el promotor que regula l'expressió transcripcional de la ribonucleotidil reductasa anaeròbica d'Escherichia coli (nrdDG). S'ha demostrat que aquest promotor està activat per el regulador transcripcional FNR (fumarate and nitrate reduction), i s'han identificat dues regions que presenten un nivell de similitud significatiu amb la seqüència consens d'unió a FNR. En aquest treball hem investigat la interacció de FNR a la regió promotora dels gens nrdDG així com l'efecte d'aquesta interacció en la transcripció. Els assaigs de mobilitat electroforètica amb la proteïna FNR* purificada han demostrat la interacció de FNR amb totes dues regions, i els estudis amb les caixes FNR mutagenitzades indiquen que la regió FNR-2 és essencial per a la activació anaeròbica del promotor nrdDG. La regió FNR-1, no obstant, és necessària per a la màxima expressió d'aquest promotor. Els nostres resultats suggereixen que totes dues regions actuen de forma sinèrgica per a coordinar l'expressió en resposta a concentracions canviants d'oxigen. / Ribonucleotide reductases (RNRs) are a group of enzymes that catalyze the reduction of ribonucleotides (NTPs) to deoxyribonucleotides (dNTPs), thus providing all organisms with optimal amounts of the necessary buildings blocks for DNA replication and repair. Three classes of RNRs have been characterized up to date according to their different mechanisms for radical generation, structural differences, allosteric regulation and oxygen dependence, all of them having in common the reaction mechanism and the use of an organic free radical to initiate catalysis.The genome of Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus [GAS]), a human pathogen responsible for many diverse infections, harbours the genes to synthesize two complete class Ib RNRs (nrdHEF/nrdI2 and nrdFIE* respectively), while most streptococci only bear the nrdHEF/nrdI2 genes. This work attempts to determine whether the presence of a second class Ib RNR in S. pyogenes accounts for a biological need or if it is simply the result of a vestigial burden. S. pyogenes is the first prokaryotic organism where two distinct and complete ribonucleotide reductases of the same class are studied.Linkage RT-PCR showed that both clusters are simultaneously transcribed and constitute two independent polycistronic units. The ? and ? subunits for these two systems were purified and biochemically characterized. The first system (nrdHEF) proved active and presented an EPR signal that matched that of other class Ib tyrosyl radicals. Activity was dependent on the addition of magnesium and DTT and required NDPs but not NTPs as a substrate. It was also stimulated by dATP as an allosteric effector but not by ATP, as expected in a class Ib enzyme. However, neither activity nor tyrosyl radical signal were ever detected from the nrdFIE* cluster. When aligned together with other class Ib enzymes, three out of the six iron binding residues within the ? subunit of the nrdFIE* cluster were found not to be conserved. The iron contents of the two NrdF proteins clearly showed that, contrary to the ? subunit from nrdHEF, the ? subunit from nrdFIE* was not capable of coordinating an iron centre in vitro under the conditions tested, which, in turn, impaired the generation of a tyrosyl radical.Heterologous complementation assays, however, showed that the nrdFIE* operon is fully functional in vivo when all three genes are present. In a similar manner, the nrdHEF system showed no complementation unless a functional NrdI protein was provided. Neither NrdI* nor NrdI2 from S. pyogenes rendered nrdHEF active, but it did addition of the NrdI2 protein form S. pneumoniae. The presence of an almost identical nrdFIE cluster in all Mycoplasma species leads us to suggest that the nrdFIE* operon was acquired by S. pyogenes through a lateral gene transfer event to compensate for the loss of a functional NrdI*.We have also studied the promoter regulating the transcriptional expression of the anaerobic ribonucleotide reductase of Escherichia coli (nrdDG). This promoter has been shown to be up-regulated by the pleiotropic transcriptional regulator FNR (fumarate and nitrate reduction), and two regions with significant similarity to the FNR consensus sequence were also found. In this work we have investigated the binding of FNR to the nrdDG promoter region and the effects of such binding on transcription. Gel retardation analysis with purified FNR* demonstrated FNR interaction at both sites, and studies with altered FNR boxes indicated that the upstream FNR-2 site is essential for the anaerobic activation of the nrdDG promoter. The FNR-1 site, however, is needed for the maximal expression of this promoter. Our results suggest that both sites act synergistically to coordinate expression in response to shifting oxygen concentrations.

Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) és un patògen intracel·lular gram negatiu que provoca gastroenteritis en humans però que en ratolins provoca una infecció sistèmica similar a la febre tifoidea humana (provocada en aquest cas per S. Typhi). Una de les característiques principals de la infecció per S. enterica és la capacitat que presenta per envair activament cèl·lules epitelials i sobreviure i proliferar a l'interior dels macròfags.S. Typhimurium presenta codificades en el seu genoma tres tipus de ribonucleotidil reductases (RNRs): classe Ia, Ib i III. Les RNRs són enzims essencials ja que són els responsables de la síntesi de novo dels desoxirribonucleòtids (dNTPs), necessaris per a la síntesi i reparació del DNA, a partir de la reducció dels ribonucleòtids (NTPs). Fins ara s'han descrit tres classes de RNRs que es diferencien pel mecanisme de generació del radical que utilitzen, l'estructura que presenten, la seva regulació al·lostèrica i la seva dependència de l'oxigen. Tot i així, totes tenen en comú el mecanisme de reacció i la utilització d'un radical lliure orgànic per a iniciar la catàlisi.En aquest treball s'ha estudiat la regulació transcripcional de les tres classes de RNRs presents en S. Typhimurium, centrant-nos en dos reguladors: NrdR i Fur. S'ha estudiat l'efecte de la deleció de NrdR sobre l'expressió gènica de les tres classes de RNRs. NrdR és un repressor de les tres classes de RNRs i presenta un major efecte sobre l'expressió de l'operó nrdHIEF. També s'han descrit les seves caixes d'unió i s'han obtingut proteïnes mutants en determinats residus que afecten la funcionalitat de NrdR in vivo, possiblement degut a la participació d'aquests residus en la unió de dATP/ATP. La mutació de Fur provoca un agument de l'expressió de l'operó nrdHIEF de fins a cinc vegades respecte la soca salvatge. A la regió promotora de l'operó nrdHIEF hi hem detectat una possible caixa d'unió de Fur, la mutació de la qual provoca un augment en l'expressió similar a l'observat en la soca amb Fur delecionat. Mitjançant assajos de retardament electroforètic hem confirmat la unió de Fur a la regió promotora de l'operó nrdHIEF.En condicions normals, S. Typhimurium utilitza la RNR de la classe Ia per a la síntesi de novo de desoxirribonucleòtids en presència d'oxígen. La classe Ia és essencial per al seu creixement i la classe Ib no és capaç de complementar-ne la seva mutació a no ser que se li introdueixi una còpia extra. La presència de dues RNRs amb activitats redundants en un mateix microorganisme, el fet que en altres espècies bacterianes la síntesi de desoxirribonucleòtids en presència d'oxigen la dugui a terme la classe Ib, i que tant en E. coli com S. Typhimurium la classe Ib s'hagi conservat al llarg de l'evolució fa pensar que aquesta classe de RNR ha d'expressar-se en algunes condicions molt concretes de creixement.En aquest treball s'ha estudiat la participació de les RNRs en la virulència de S. Typhimurium SL1344 mitjançant la construcció de mutants de cada una de les tres classes així com de dobles mutants i mutants en els seus reguladors (Fur, NrdR). Mitjançant assajos d'infecció de línies cel·lulars de macròfags i també de cèl·lules epitelials hem intentat desvetllar quina de les RNRs és la responsable del creixement de S. Typhimurium durant el procés d'infecció. Els resultats obtinguts indiquen que la RNR responsable de la invasió i de la proliferació a l'interior de macròfags és la classe Ia, mentre que les classes Ib i III no semblen ser essencials. No obstant, observant el comportament de la soca mutant en la classe Ia que presenta la classe Ib sobreexpressada, durant les primeres hores d'infecció (2-6 h) sí que és capaç de sobreviure. Creiem que en aquesta etapa inicial de la infecció, quan es produeix l'explosió respiratoria, es generen unes condicions que activen l'expressió de l'operó nrdHIEF, possiblement la concentració de peròxid d'hidrogen és capaç d'inhibir l'activitat repressora de Fur. La gran demanda de dNTPs a causa del dany al DNA que s'està produint fa necessari un subministrament extra de dNTPs que aportarà la reductasa NrdEF. / Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) is a gram negative intracellular human pathogen causing gastroenteritis in humans as well as a systemic infection in mice similar to human typhoid fever (which is caused by S. Typhi). One of the main features of S. enterica infection is its capacity to actively invade epithelial cells and proliferate inside macrophages.S. Typhimurium presents three classes of ribonucleotide reductases (RNRs) in its genome: class Ia, class Ib and class III. RNRs are essential enzymes because they carry out the de novo synthesis of deoxyribonucleotides (dNTPs), needed for DNA synthesis and repair, by reducing ribonucleotides (NTPs). Up to date, three different classes of RNRs have been described, differing in their mechanism of radical generation, their three-dimensional structure, allosteric regulation and their oxygen dependence. Nevertheless, they all have in common the mechanism of reaction and the use of an organic free radical to initiate catalysis.This work has studied the transcriptional regulation of the three RNR classes present in S. Typhimurium, giving importance to two main regulators: NrdR and Fur. We have studied the effects of NrdR deletion in each class of RNR gene expression. Our results indicate that NrdR is a repressor of all three classes, but it shows a stronger repression when regulating nrdHIEF expression. We have also described NrdR recognition sites (NrdR boxes) and we have obtained mutant proteins in some residues that affect NrdR functionality in vivo, possibly due to their participation in dATP/ATP union.Mutation of Fur causes an upregulation of nrdHIEF expression up to five fold compared to the wild type strain. We have detected a putative Fur recognition sequence within the nrdHIEF promoter region. Mutation of this recognition sequence causes an upshift in nrdHIEF expression similar to the level observed in the fur mutant. Using electrophoretic mobility shift assays (EMSA) we have confirmed that Fur interacts with the nrdHIEF promoter region.Under normal conditions, S. Typhimurium uses class Ia RNR to de novo synthesize dNTPs in the presence of oxygen. Class Ia is essential for normal growth and class Ib is not able to complement its mutation unless an extra copy of nrdHIEF is introduced. The presence of two RNRs with redundant activities in the same organism, the fact that other bacterial species use class Ib for dNTP synthesis in then presence of oxygen, and that both E. coli and S. Typhimurium have retained class Ib enzymes during evolution, suggest that this class might be expressed under specific growth conditions.We have studied the role of RNRs in the virulence of S. Typhimurium SL1344 by means of different mutants and double mutants in each RNR class as well as mutants in their transcriptional regulators (Fur, NrdR). Infection assays performed in macrophage cell lines and epithelial cell lines have allowed to elucidate which RNR is responsible for S. Typhimurium growth during infection. Our results indicate that class Ia is the RNR responsible for invasion and proliferation inside macrophages, while class Ib and class III do not seem to be essential. However, class Ia mutants overexpressing class Ib are capable of surviving the first hours of infection (2-6 h). We think that is in this first stage of the infection process (when the oxidative burst takes place), specific conditions generate and activate nrdHIEF expression. It is possible that hydrogen peroxide concentrations are responsible for the inhibition of the Fur repressor activity. The highest demand of dNTPs due to DNA lesions makes it necessary for an extra dNTP supply that will be provided by the NrdEF enzyme.

Introducción: La gelatinasa B o MMP-9 es una metaloproteasa de matriz que ha sido relacionada con la disrupción de la barrera hematoencefálica en diversas enfermedades del SNC. Diversos trabajos han demostrado que el desarrollo de edema perihematoma (EPH) en la fase aguda de la hemorragia cerebral (HIC) se relaciona con el deterioro clínico de estos pacientes. El papel de MMP-9 en la HIC en humanos nunca ha sido investigado. Los objetivos de esta tesis han sido: investigar si las concentraciones de MMP-9 aumentan después de una HIC y si tal aumento se relaciona con la formación de EPH.Método: Se estudian HIC supratentoriales espontáneas, lobares y profundas, diagnosticadas en las primeras 24 horas del proceso. Se excluyen las HIC secundarias a malformaciones vasculares, coagulopatías congénitas o adquiridas, tratamiento anticoagulante y HIC tumorales. Tras el diagnóstico mediante TC craneal se extrajeron muestras sanguíneas (<24 h) para la posterior determinación de MMP-9 mediante una técnica ELISA. Nuestro laboratorio disponía de valores de referencia de MMP-9 en población sana. En la visita basal (<24 h) se recogieron los antecedentes personales, datos clínicos del episodio (escala de Glasgow y Canadiense: GCS, CSS) y radiológicos (volumen inicial HIC: VHIC1). Entre el tercero y sexto día se realizó una TC craneal de control en la que se midió el volumen del EPH (VE) y se recogieron de nuevo datos sobre la evolución clínica.Resultados: Se estudiaron 57 HIC de las que 38 (66.7%) eran profundas y 19 (33.3%) eran lobares. La edad media de la muestra fue 69.8 años y el 56.1% eran hombres. La hipertensión (64.9%) y la presencia de ictus previo (29.8%) fueron los factores de riesgo vascular más prevalentes. El VHIC1 y VE medios fueron 36.65 cc y 30.72 cc, respectivamente. La concentración plasmática media de MMP-9 fue 151.32±111.43 ng/ml, significativamente superior a los valores de referencia (<97 ng/ml). La concentración basal de MMP-9 no se relacionó con la edad, sexo, VHIC1, ni con el estado neurológico (puntuación en la GCS y CSS). En el subgrupo de HIC profundas, MMP-9 se correlacionó de forma significativa con el VE (p<0.01). Otras variables relacionadas con el VE en el análisis univariante fueron los antecedentes de enolismo (p<0.05), tabaquismo (p=0.057), el VHIC1 (p<0.001) y la CSS basal (p<0.05). El análisis multivariante mostró que el VHIC1 era la variable relacionada independientemente con el VE (OR:3.37;IC 95%:1.1-10.3;p<0.05). Se realizó un segundo análisis para estudiar el VE relativo (VEr=VE/VHIC1). De nuevo, MMP-9 se correlacionó de forma significativa con el VEr en las HIC profundas (p<0.01). En este subgrupo, las variables que se asociaron con un VEr mayor en el análisis univariante fueron: el no realizar tratamiento antiagregante (p<0.05) y la ausencia de ictus previo (p<0.1). Tras el análisis multivariante, una concentración de MMP-9 superior a 133.91 ng/ml predecía el desarrollo de un EPH 1.8 veces mayor que el volumen inicial de la HIC (OR:11.66;IC 95%:1.52-89.1;p<0.05).Conclusiones: La concentración de MMP-9 está incrementada tras la HIC espontánea. Este incremento se relaciona con el desarrollo de edema perihematoma en las HIC profundas. En esta localización, donde el tratamiento quirúrgico no ha demostrado ser más eficaz que el médico podría plantearse, en un futuro, el tratamiento con inhibidores de MMP-9 con el fin de evitar la formación de edema y el deterioro neurológico en estos enfermos.