INTRODUCCIÓN. La enfermedad de McArdle (Glucogenosis tipo V) es una miopatía metabólica producida por una deficiencia de miofosforilasa, enzima que inicia la degradación del glucógeno con liberación de glucosa-1-fosfato. Los pacientes presentan típicamente intolerancia al ejercicio, mialgias y contracturas. Aproximadamente la mitad de los pacientes presentan mioglobinuria. Se han descrito otras formas de presentación clínica diferentes del fenotipo clásico. Los estudios genéticos moleculares han identificado 32 mutaciones distintas. El defecto molecular más frecuente es la mutación nonsense R49X en el exón 1. Se están describiendo, cada vez con más frecuencia, mutaciones privadas para ciertos grupos étnicos. OBJETIVOS. (1) Identificar el defecto molecular en una serie de 21 familias con individuos afectos de enfermedad de McArdle. (2) Establecer la patogenicidad de esas mutaciones y estudiar la prevalencia de R49X así como de otras mutaciones. (3) Describir los hallazgos clínicos de los afectos. (4) Establecer si existe una correlación genotipo-fenotipo. PACIENTES Y MÉTODOS. Estudiamos 35 pacientes afectos, pertenecientes a 21 familias no relacionadas. Se evaluó los pacientes mediante entrevista, examen físico, análisis bioquímico, estudio neurofisiológico, prueba del ejercicio isquémico del antebrazo, biopsia muscular (en el caso índice de cada una de las familias) y estudios genéticos, incluyendo la secuenciación del gen de la miofosforilasa. Se realizó análisis estadístico de los resultados obtenidos.RESULTADOS. La edad media de los pacientes fue de 42.7 años. La edad media de inicio clínico fue 13.3 años. La edad media del diagnóstico clínico fue 36.2 años. El 43% de los pacientes habían presentado mioglobinuria, nueve habían sufrido más de 5 episodios. La duración media del second wind fue 5.9 minutos. La resistencia durante la prueba del ejercicio isquémico fue 41.6 segundos. La enfermedad fue incapacitante para el trabajo en el 14.2% de los pacientes. El valor medio de CK en reposo fue 1914 UI/L. Nueve pacientes mostraron uricemias superiores a 7.0 mg/dl. La curva de lactato fue plana en todos los pacientes. El fenotipo clásico fue el más frecuente (74.3%). Se observó consanguinidad en 4 familias. Seis familias tenían un patrón pseudodominante. Identificamos 10 mutaciones diferentes. Tres habían sido descritas con anterioridad (R49X, G204S y W797R). Identificamos siete nuevas mutaciones - 5 missense (R93W, L115P, R489W, A669V y N684Y), una nonsense (Y573X) y una splice-junction (K608K). El defecto molecular fue identificado en 62 alelos. Detectamos R49X en 30 alelos (42.85%), W797R en 14, G204S en 7. L115P, R489W, Y573X y K608K en 2 cada uno. N684Y, A669V y R93W en 1 cada uno. Queda aún por identificar el defecto molecular en 8 alelos. Sin embargo, no es ni R49X, ni G204S ni W797R. No encontramos una clara correlación clínica genotipo-fenotipo en la serie.CONCLUSIONES. El test del ejercicio isquémico del antebrazo es la prueba de primera elección al investigar pacientes con probable enfermedad de McArdle. La prevalencia de R49X fue 42.85%, similar a las series francesa y alemana, y ligeramente inferior a la del Reino Unido y Estados Unidos. El concepto de gradiente Norte-Sur propuesto por otros autores debe ser analizado con cautela. Identificamos siete nuevas mutaciones. Estos resultados confirman la heterogeneidad alélica de esta enfermedad en España. La biopsia muscular es una prueba diagnóstica esencial, debido a la alta probabilidad de mutaciones privadas en España. Encontramos una alta prevalencia de heterocigotos sintomáticos en nuestra serie. No observamos una clara correlación genotipo-fenotipo. La mayoría de pacientes con formas de inicio tardío son en realidad formas benignas que empiezan en la infancia y que con la edad se hacen clínicamente más manifiestas. El retraso en el diagnóstico de estos individuos, frecuentemente etiquetados como afectos de alteraciones psicógenas, sugiere la necesidad de programas de divulgación de esta enfermedad entre los profesionales, especialmente aquellos de atención primaria.Palabras Claves: Enfermedad de McArdle. MIM 232600. Glucogenosis tipo V. Miofosforilasa. Miopatía Metabólica. EC 2.4.1.1. Heterogeneidad Alélica. Heterogeneidad Clínica. Correlación Genotipo-Fenotipo. Mutación R49X. / INTRODUCTION. McArdle's Disease (Glycogenosis Type V) is a metabolic myopathy caused by a deficiency of myophosphorylase. This enzyme initiates glycogen breakdown, catalysing glycogen phosphorylitic cleavage to glucose-1-phosphate at a-1,4-glucosydic linkages. McArdle's patients typically present exercise intolerance, premature fatigue, myalgia and cramps. Approximately half present recurrent myoglobinuria. Other clinical presentations have been reported.The myophosphorylase gene has been cloned, sequenced and assigned to chromosome 11q13. Molecular genetic studies have so far identified 32 different mutations. The most common defect is a nonsense mutation (R49X) in exon-1. Private ethnically-related mutations are being increasingly described, especially in Mediterranean countries. OBJECTIVES: (1) identify the molecular defect in a 21-family series with McArdle's patients, according to clinical and histological criteria, (2) establish the pathogenicity of these mutations and study the prevalence of R49X and other mutations, (3) describe the clinical findings concerning those affected, (4) establish whether there is a genotype-phenotype correlation.PATIENTS AND METHODS: we studied 35 McArdle's patients (20 male, 15 female), from 21 non-related families. Patients were evaluated by interviews, physical examination, biochemical analysis, neurophysiological study, ischemic forearm test, muscle biopsy (in one individual from each family) and genetic studies, including myophosphorylase gene sequencing. Data were analysed using standard statistical methods.RESULTS: The mean age was 42.7 years old (range 18-85). Mean clinical onset age was 13.3 years old (range 3-51). Mean age of clinical diagnosis was 36.2 years old (range 16-76). Almost 43% of patients presented with myoglobinuria, and 9 patients (25.7%) had over 5 episodes. Mean "second wind" duration was 5.9 minutes. Mean resistance in the forearm ischemic exercise test was 41.6 seconds. Employment was impossible for 14.2% of patients, who were registered as disabled. Mean CK at rest was 1914 UI/L. Nine patients showed uric concentration of over 7.0 mg/dl. The lactate curve in forearm ischemic exercise tests was flat in all patients. In our patients, the classic phenotype was most frequent (74.3%). Five others (14.2%) presented an adult onset form. Two had thoracic pain, one had acute abdominal pain and another had renal failure. Six families showed a pseudo-dominant inheritance pattern.Consanguinity was present in 4 families. Seven families had common ancestry, as they all originated in small population centres. We identified 10 different mutations in the 35 patients. Three had been described (R49X, G204S and W797R). We found seven novel mutations - 5 missense (R93W, L115P, R489W, A669V, and N684Y), one nonsense (Y573X) and a splice junction (K608K). The molecular defect was identified in 62 alleles. We found R49X in 30 alleles (42.85%), W797R in 14 (20%), G204S in 7 (10%). L115P, R489W, Y573X, and K608K in 2 each (2.85%), and N684Y, A669V and R93W in 1 each (1.42%). The molecular defect in 8 alleles has yet to be identified, but it is neither R49X, G204S nor W797R. No clinical genotype-phenotype correlation was found in the series.CONCLUSIONS: Forearm ischemic exercise test is the first choice test when investigating suspected McArdle's patients. R49X prevalence was 42.85%, similar to the French and German series, and slightly less than those in the UK and the USA. The suggested north-south gradient should be therefore analysed with caution. We identified seven novel mutations. These results confirm this disease's allelic heterogeneity in Spain. Muscle biopsy is an important diagnostic test, especially in Spanish patients, due to the likelihood of private mutations. A clear phenotype-genotype correlation was not found. Most late-onset patients in fact have benign forms starting early in life, which become clinically evident with age. Delay in diagnosing these individuals, who are frequently labelled as psychosomatic, suggests the need for awareness-raising programmes among healthcare professionals, especially those involved in primary care.Key word: McArdle's disease. MIM 232600.Glycogenosis type V. Myophosphorylase. Metabolic Myopathy. EC 2.4.1.1. Allelic Heterogeneity. Clinical heterogeneity. Genotype-Phenotype correlation. R49X mutation.

El cáncer de próstata es el más frecuente en el varón y la tercera causa de muerte por cáncer en España. Su historia natural es incierta. La prostatectomía radical sigue siendo el tratamiento de elección en los estadios localizados. La radioterapia es un tratamiento curativo alternativo a la prostatectomía radical y el tratamiento de elección en los tumores localmente avanzados. El mejor conocimiento de los factores pronóstico permite individualizar y optimizar los tratamientos con radioterapia.Pacientes y Método: Se han revisado 981 paciente con cáncer de próstata localizado tratados con radioterapia externa con intención radical en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau entre 1979-1999. Edad media: 68.5 años. Estadio: 24% T1, 45% T2, 29% T3, 1% T4 y 1% N+. En 12% Gleason desconocido, 13% &#8804; 4, 60% &#8804; 7 y 15% > 7. Un 17% de los pacientes sin PSA inicial, 4% < 4 ng/ml, 32% 4-10 ng/ml, 24% >10-20 ng/ml y 23% > 20 ng/ml. Grupo de riesgo: 20% bajo, 28% intermedio, 27% alto y 25% no clasificables. Un 58% realizó hormonoterapia. 30% de los pacientes se trataron con cobaltoterapia y 70% con fotones de 18 MV. Dosis media próstata: 70 Gy. En 673 pacientes se ha valorado el control bioquímico según la definición propuesta por ASTRO. Para la valoración de la toxicidad se han utilizado las escalas de la RTOG.Resultados: *Respuesta a la radioterapia: 18% no respondieron a la radioterapia. Existe una diferencia estadísticamente significativa entre el valor medio del PSA nadir del grupo de pacientes que presentaron fallo bioquímico y el del grupo sin fallo bioquímico (1.12 vs 0.65 ng/ml; p< 0.001). Un PSA nadir &#8805; 1 ng/ml se asocia con mayor probabilidad de presentar fallo bioquímico (p=0.013), progresión de la enfermedad (p=0.001) y muerte por cáncer de próstata (p=0.001). Los pacientes que alcanzan un PSA nadir más rápidamente durante el primer año después de radioterapia presentaron mayor riesgo de progresión bioquímica y/o clínica que los pacientes con descenso más lento (41% vs 24%; p=0.001). *Fallo bioquímico: 27%; Factores pronóstico: edad (p=0.010); estadio (p=0.001), Gleason (p=0.003), dosis (p<0.001) y PSA nadir < 1 ng/ml (p=0.033). Un 39% de lo pacientes con fallo bioquímico presentaron progresión clínica vs un 8% de los pacientes libres de fallo bioquímico (p<0.001). *Recidiva local: 10.4%; factores pronóstico: estadio (p=0.005) y dosis (P=0.05). *Metástasis: 11%; factores pronóstico: edad (p=0.046), Gleason (p=0.006), estadio (p<0.001), dosis (p=0.009), PSA nadir < 1 ng/ml (p<0.001), fallo bioquímico (p< 0.001), recidiva local (p=0.009). *Toxicidad aguda: grado &#8805; 2: 66%. La cobaltoterapia (p=0.014) y la irradiación pélvica (p=0.019) se asocian significativamente con un aumento de la toxicidad aguda. *Toxicidad crónica grado &#8805;2: 22.8%. Factores pronóstico: toxicidad aguda (p<0.001), realización previa de RTU (p=0.009) y la irradiación pélvica electiva (p=0.041). *SG: 84%, 51% y 38% a 5, 10 y 15 años respectivamente. *SVCE: 93%, 68% y 57% a 5, 10 y 15 años. El estadio es un potente factor pronóstico de la muerte por cáncer de próstata, conjuntamente con la dosis y el PSA nadir. *SVLEC: 77% y 59% a 5 y 10 años. *SVLFB:72.6% a 5 y 10 años. *SVLP: 58% y 30% a 5 y 10 años. En un 50% de los casos la causa de muerte fue el cáncer de próstata (9%). La mortalidad por cáncer de próstata se asocia al estadio (20% en estadios T3-T4 vs 3.8% en estadios T1-T2). Conclusión: La radioterapia externa es un tratamiento curativo del cáncer de próstata localizado con una toxicidad aceptable. El estadio clínico y la dosis de radioterapia son factores pronóstico que se asocian fuertemente a la progresión de la enfermedad. / Prostate cancer is the most common malignant disease and the third leading cause-related death in men in Spain. Radical prostatectomy is the most common treatment for early prostate cancer. Radiotherapy is a curative alternative for these patients and the appropriate treatment for locally advanced tumors. Prognostic factors play an important role in optimal management of this disease.Patients and Methods: Between 1979 and 1999, 981 men with prostate cancer received potential curative external beam radiotherapy at the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. All clinical records were reviewed. Mean age was 68.5 years (ranging 44-84). Stages were: 24% T1; 45% T2, 29% T3, 1% T4 and 1% N+. Gleason score: 12% unknown, 13% &#8804; 4, 60% 5-7 and 15% > 7. PSA values: 17% unknown, 4% < 4 ng/ml, 32% 4-10 ng/ml: 24% >10-20 ng/ml and 23% > 20 ng/ml. Risk groups: 20% low risk, 28 % intermediate risk, 27% high risk and 25% were unclassifiable. Fifty-eight percent of patients received concomitant androgen suppression. Cobalt therapy was used in 30% of patients and 18 MV X-rays in 70%. The mean dose delivered was 70 Gy. Biochemical control was calculated according to the ASTRO definition in 673 patients. RTOG score was used to assess toxicity.Results: *Radiation response: 18% were non-responders. The mean nadir PSA (nPSA) was 1.12 ng/ml for biochemical failure-free survival (BFFS) patients and 0.65 ng/ml for the group with BF (p< 0.001). A nPSA &#8805; 1 ng/ml was related to greater probability of BF (p= 0.013), cancer progression (p=0.001) and prostate cancer death (p=0.001). Taking longer than 1 year to reach nPSA (TnPSA) was associated with less biochemical and/or clinical progression (24% vs 41%; p 0 0.001). *Biochemical failure: 27%; Prognostic factors: age (p=0.010), stage (p=0.001), Gleason (p=0.003), nadir PSA < 1 ng/ml (p=0.033). 39% of patients with BF showed clinical progression compared to 8% in the BFFS group (p< 0.001). *Local relapse: 10.4%; Prognostic factors: stage (p=0.005) and dose (p= 0.005). *Metastases: 11%; prognostic factors: age (p=0.046), Gleason (p=0.006), stage (p=< 0.001), dose (p=0.009), nPSA < 1 ng/ml (p< 0.001), BF (p<0.001) and local relapse (p=0.009). *Acute toxicity grade &#8805; 2: 66%. The use of cobalt energy (p= 0.014) and pelvic irradiation (p=0.019) was significantly associated with acute complications. *Late toxicity: grade &#8805; 2: 22.8%. Prognostic factors: acute toxicity (p<0.001), previous transurethral resection of prostate (TURP) (p=0.009) and pelvic irradiation (0.041). *Overall survival: 84%, 51% and 38% at 5, 10 and 15 years, respectively. *Cause-specific survival: 93%, 68% and 57% at 5, 10 and 15 years respectively. Stage was the most powerful factor associated to prostate cancer death followed by the radiation dose and nadir PSA. *BFFS: 72.6% at both 5 and 10 years. *Progression free-survival: 58% and 30% at 5 and 10 years respectively. Prostate cancer represented 50% of all deaths (9% of patients). There was a significant association between stage and prostate cancer death (20% for stages T3-T4 and 3.8% for stages T1-T2). Conclusions: external beam radiation is a curative treatment for localized prostate cancer and toxicity is acceptable. Clinical stage and radiation dose are strong prognostic factors of cancer progression.

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Las enfermedades mitocondriales pueden ser englobadas dentro de las enfermedades raras de la edad pediátrica. Esta tesis recoge aspectos clínicos, bioquímicos y genéticos de 241 pacientes con enfermedades mitocondriales diagnosticados en el hospital "Necker-Enfants Malades, Paris", en el período comprendido entre los años 1977 al 2002.. Este amplio espectro de información incluye características generales como son la descripción de las formas de presentación clínicas y procedimientos diagnósticos, pero también recoge aspectos poco conocidos como son los estudios clínicos de seguimiento a largo plazo de estos pacientes, déficits enzimáticos muy inusuales y nuevos hallazgos clínicos, bioquímicos y moleculares no reportados previamente. En cuanto a las manifestaciones clínicas, a parte de la forma de presentación clásica con afectación multiorgánica e hiperlactacidemia severa en los casos de debut precoz, se exponen algunos signos guía que pueden ser indicativos de algún déficit en concreto. En particular, los movimientos anormales asociado a un síndrome rígido acinético infantil nos pueden apuntar hacia un déficit de piruvato carboxilasa, mientras que hipoglucemias recurrentes aisladas son orientativas de un déficit de complejo III de la cadena respiratoria mitocondrial. Los estudios bioquímicos se demuestran de mayor ayuda en trastornos del metabolismo del piruvato y del ciclo de Krebs que en déficits de la cadena respiratoria. En concreto, una hiperlactacidemia asociada a una relación lactato/piruvato normal asociado a una actividad normal de la enzima piruvato deshidrogenasa, orientan hacia un déficit en el transportador mitocondrial del piruvato. Un punto en ocasiones conflictivo en el estudio de la cadena respiratoria mitocondrial, es el tipo de tejido a analizar. Lo más habitual es realizar una biopsia muscular Por el contrario se realizan escasos estudios en tejido hepático si los resultados en músculo han sido normales y no hay signos clínicos ó biológicos de afectación hepática. Los resultados de este estudio muestran que el análisis de la cadena respiratoria en tejido hepático pueden ser de gran ayuda en el diagnóstico, especialmente cuando el paciente presenta manifestaciones neurológicas predominantes. Por otro lado, existen escasos estudios de seguimiento clínico a largo plazo en el campo de los errores congénitos del metabolismo, en cambio, éstos son cruciales para tener una idea precisa del futuro de estos niños así como la posibilidad de establecer factores pronósticos. En este sentido, los neonatos con diversos déficits de la cadena respiratoria mitocondrial tienen una elevada mortalidad y una muy pobre calidad de vida aunque se recogen algunas formas "reversibles" y "benignas".Los datos relativos a mutaciones de genes nucleares recogidos en este trabajo son escasos ya que exponer las características genéticas ó establecer posibles relaciones entre el genotipo y el fenotipo de estas enfermedades no estaban dentro de los objetivos de este trabajo. A pesar de ello se reporta un nuevo gen nuclear responsable de un cuadro clínico de hipoglicemias de repetición asociado con un déficit del complejo III. / Mitochondrial disorders are rare causes of disease in childhood. This thesis reports clinical, biochemical and genetic aspects of 241 paediatric patients with mitochondrial disorders diagnosed in the "Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris" from 1977 to 2002. This wide spectrum of information includes general characteristics such as clinical presentation and diagnostic approach, poorly documented features such as follow-up studies or uncommon enzymatic deficiencies, and new particular findings, not reported before. Concerning clinical presentation, other than the well known multiorganic involvement associated with severe hyperlactacidemia in young children, some guideline signs that may indicate a particular defect are exposed. Movement disorders associated with rigid akinetic syndrome in pyruvate carboxylase deficiency or recurrent isolated hypoglycaemias in complex III deficiency are examples of these rare but very orientative signs. Biochemical tests appear to be of great help in deficiencies that do not concern the respiratory chain. Consequently, some "redox cycle", amino acids or organic acids profiles are more likely to correspond to defects in pyruvate or Krebs cycle metabolism. In particular, hyperlactacidemia with normal lactate/pyruvate ratio and normal pyruvate dehydrogenase activity would point towards impaired mitochondrial pyruvate carrier.Other diagnostic dilemma in MRC is the tissue of choice. It is unusual to perform a liver biopsy if the results of the activities in muscle have been normal but there is no apparent hepatic disease. The results of this study show that the analyse of the hepatic tissue could be very helpful, especially in patients with predominant neurological disease.Follow-up studies in inborn errors of metabolism are very infrequent. However, they are crutial to have a global and accurate idea about the future of these children as well as to establish possible prognostic factors. In this respect, newborns with respiratory chain deficiencies have a very high mortality and a poor quality of life, although some "reversible" and "benign" forms could be found.Little data about nuclear genes is here reported. Genetic characteristics or trying to establish phenotype-genotype correlations, are not among the aims of this study. Nevertheless a new nuclear gene related to isolated repetitive hypoglycaemias and complex III deficiency is also reported.

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La majoria de les proteïnes d'interès biomèdic com hormones, enzims, factors de creixement o antígens s'obtenen en proporcions molt petites de les seves fonts naturals i fa que la seva comercialització no sigui viable. Per això la producció de proteïnes heteròlogues en bacteris ha estat un gran avenç i actualment és un procés molt utilitzat per la indústria farmacològica, ja que és un procés ràpid i de baix cost. El bacteri Escherichia coli ha estat l'organisme productor més usat com a fàbrica cel·lular degut a l'exhaustiu coneixement que se'n té, la seva fàcil i econòmica manipulació i la gran varietat de sistemes i vectors d'expressió que s'han dissenyat específicament per aquest. Un dels principals obstacles que ens trobem quan utilitzem E.coli com a organisme productor és la dificultat de plegar la proteïna correctament, el que implica la seva degradació o la seva agregació en forma de cossos d'inclusió. La formació de cossos d'inclusió és un dels majors problemes d'aquests processos i per això es té un gran interès en evitar que es formin i en buscar estratègies per a millorar l'expressió de la proteïna soluble. En aquest treball s'ha estudiat profundament els mecanismes involucrats en la formació dels cossos d'inclusió amb l'objectiu de buscar solucions a la problemàtica que representa i d' entendre millor les bases moleculars que porten a l'agregació de proteïnes. Per això, s'ha estudiat la naturalesa dels agregats des de diferents punts de vista, des de l'anàlisi del seu creixement dins del citoplasma d'E. coli, l'estudi dels factors cel·lulars que hi estan implicats, com s'estructura la proteïna agregada a nivell molecular i com es pot recuperar la proteïna dels agregats en el seu estat natiu.Els resultats obtinguts ens han portat a proposar un model de construcció dels cossos d'inclusió, que ens demostra que l'agregació proteica és reversible i no irreversible com es creia prèviament. La formació dels cossos d'inclusió és el resultat d'un equilibri dinàmic entre l'agregació i la solubilització, que està desplaçat cap a l'agregació durant la sobreproducció d'una proteïna recombinant, però que és invertit quan aquesta s'atura. Per altra banda, també s'ha detectat que els agregats presenten plasticitat molecular, que es correspon amb un estat d'agregació reversible. El procés de formació i solubilització dels cossos d'inclusió és un mecanisme íntimament associat amb el sistema de control de qualitat proteic, on proteases i xaperones s'encarreguen d'assegurar el correcte estat conformacional de les noves cadenes polipeptídiques sintetitzades. Aquesta vinculació ens suggereix que l'agregació proteica pot representar un mecanisme de resposta a l'estrés desenvolupat per a reduir la toxicitat produïda per la presència d'estructures proteiques mal plegades en el citoplasma d'E. coli. Les xaperones DnaK i GroEL tenen un paper rellevant en la formació dels cossos d'inclusió. Mentre que DnaK evita la seva formació, sembla que GroEL indueix l'aglutinació dels petits preagregats que interaccionen per a formar un únic cos d'inclusió. La solubilització dels agregats in vivo és un procés multifactorial, en el que hi intervenen una gran part de les proteïnes de xoc tèrmic. En un àmbit més aplicat, hem estudiat possibles maneres de recuperar la proteïna acumulada en els cossos d'inclusió. Per una banda, hem desenvolupat un procediment que mimetitza la solubilització dels agregats que es dóna in vivo, basat en la incubació d'aquests amb extractes cel·lulars i per altra l'ús de la pressió hidrostàtica. Els dos casos ofereixen avantatges respecte els utilitzats fins ara, com que són més ecològics perquè s'evita l'ús d'agents químics, són més econòmics i fàcilment escalables i en el primer cas, és més genèric. / Most of the proteins of relevant biomedical value are found at very low concentrations in their natural sources. Nowadays, the production of recombinant proteins in host cells has became a novel technology extensively used because it offers the possibility to obtain any protein at high concentrations. However, the production of recombinant proteins in host cells, especially Escherichia coli, often results in the formation of insoluble aggregates known as inclusion bodies (IBs). Since insoluble polypeptides are not useful for biotechnological purposes, the formation of inclusion bodies is regarded as an obstacle for the use of bacterial cell factories. For this, there is a big effort in improving the solubility of the protein produced and on finding a general strategy to recover purified active proteins from IBs. In this study, we analysed the mechanisms involved in the inclusion body formation in order to overcome the problems they cause and for a better understanding of the molecular basis that leads to protein aggregation. For this, we studied the nature of inclusion bodies from different points of view, such as analysing their growing in the E.coli cytoplasm, studying the cellular factors that participate in this process, the molecular organisation of the aggregated protein and the ways to recover native protein from IBs. Since current days, inclusion bodies were believed to be compact protein aggregates, that being unreachable by proteases and chaperones remain inert once produced in the cell. However, the investigations carried out during this project demonstrate that Ibs are more labile structures, formed during a dynamic process that involves protein precipitation but also solubilisation and proteolytic degradation. IB particles are then formed because of the equilibrium between these antagonic processes, that is displaced towards precipitation when the recombinant protein is produced at high rates. In agreement with this finding, we have detected that polypeptides embedded in Ibs present molecular plasticity.In addition, our observations prove that IB protein is accessible to chaperones and other components of the cell quality control system that control IB formation and solubilisation. This observation suggest that the IB construction and deconstruction is a process included in the stress response, which might be developed to reduce the toxicity produced by the presence of unfolded proteins in the cytoplasm of E. coli. We have seen that chaperones DnaK and GroEL have a relevant function in the IB formation. While DnaK has a preventive role in the protein aggregation, GroEL seems to induce the precipitation of the small preaggregates that interact to form a big inclusion body. On the other hand, we detected that different chaperones participate in the IB solubilisation process, in a co-ordinate way. In a more applicable area, we explored new strategies to recover native protein from IBs. The first method proposed is based on the in vitro mimics of IB protein solubilisation that we observed in vivo, by using crude cell extracts to solubilise purified inclusion bodies. We have also analysed the application of a high hydrostatic pressure to dissociate IBs and refold recombinant protein. Both methods offer advantages from the actual strategies used up to now, such as they are more ecological since they skip the use of chemical agents, they are more economical and easy to adapt to industrial scale and in the first case, it is more generic.

All the processes that take place in a cell require one or more proteins, meaning that they are essential components of life. Proteins are macromolecules consisting of amino acid units, all of them being constructed with combinations of only 20 amino acids. The primary structure of a protein molecule is determined by the sequence of amino acids connected by peptide bonds forming a polypeptide chain. Once the amino acid chain is synthesized, the protein folds by a physical process that might be eventually assisted by other proteins, reaching its characteristic three&#8208;dimensional structure that is the final, functional conformation. However, although it is known that all the proteins must properly fold into their correct native conformation to be functional, their final conformation cannot be predicted from their primary amino acid sequence, being protein folding mechanisms one of the most challenging problems in biology today. Many proteins of relevant industrial or medical value are produced in low amounts in their natural sources. However, at the end of the seventies, the development of recombinant DNA technologies opened a new promising era for protein production in high amounts for both research and industrial applications. This had a tremendous impact, for example, in many areas of medicine as a tool to produce new drugs for the treatment of diseases and genetic disorders. Genetic engineering permits the introduction of the encoding genes of the protein of interest into recipient cells, where these genes are positioned downstream of regulable promoters in movable genetic elements, mainly plasmids. Under suitable conditions, these transgenic cells acting as protein production bio&#8208;factories would be expected to act as unlimited and inexpensive source of rare, highly valuable proteins not only for proteomics and structural functional genomics1 but also for large&#8208;scale preparative purposes. The quality as well as the quantity of the produced recombinant protein is greatly influenced by the chosen biological cell system. Bacteria have been the most commonly used organisms for protein production, specially the enterobacteria Escherichia coli, not only for the low cost of the used processes, but also for its fast growth. Generally, in Escherichia coli, the rather small host cell proteins can fold properly, adopting a native, biological active conformation. However, when producing heterologous proteins, specially those with eukaryotic or viral origin, important obstacles appear during the protein production process: a) in most cases, the protein is produced in a non functional conformation; b) sometimes the formed product is toxic for the cell; c) the protein often results proteolytically degraded2; d) the product is accumulated as an insoluble, non&#8208;functional protein aggregates, known as inclusion bodies3. Therefore, even though the important advantages of the use of bacteria as a expression system, Escherichia coli also presents some drawbacks, such as its inability to carry most of the post&#8208;transcriptional modifications, often required for eukaryotic protein function, the lack of a secretion mechanism to release the protein to the medium, and the inability to create an oxidative environment to facilitate disulfide bond formation required to achieve the final, functional structure of some proteins. Therefore, this leads to the production of proteins which are not always suitable for immediate use. This means that, to date, many proteins have been excluded from the biotechnological and pharmaceutical market because they cannot be produced in high yields as soluble and active products. To avoid protein folding problems encountered in bacteria under overexpression conditions, mainly secretion and post&#8208;transcriptional modifications, alternative host cells, such as yeast, filamentous fungi, mammalian or insect cells, have been explored. Nevertheless, an enormous number of deficiencies in these systems such as difficulty of genetic manipulation, low productivity and high costs, shows that these organisms are not ideal for this aim and that, even when bacteria show some obstacles in the production process and often this system has to be optimized for specific products, it is, in most of the cases, the best choice.

Aquesta tesi doctoral pretén analitzar la professió mèdica des de diferents perspectives: la dels metges; la dels ciutadans i, també, la perspectiva d'un conjunt representatiu de determinats agents socials de canvi(1).Per conèixer la perspectiva de cada un dels grups analitzats, s'han portat a terme tres estudis diferents, cadascun, amb una metodologia específica. Una enquesta mitjançant metodologia mini-Delphy a un total de 243 metges experts; una enquesta a 800 ciutadans de Catalunya, i sessions amb 3 grups de debat, amb la participació de 17 agents socials de canvi corresponents a sectors diferents.L'originalitat d'aquesta tesi es pot trobar en contrastar i analitzar les diferents perspectives que tenen metges, ciutadans i agents socials de canvi sobre la professió mèdica. Això permet identificar els temes sobre els quals hi ha consens o dissens, els elements de confort o disconfort dels protagonistes de la professió objecte d'estudi -els metges- o dels clients -els ciutadans- i, també, els valors o les llacunes actuals de la professió. És a dir, aquelles qüestions encara no resoltes i susceptibles de millora.Les conclusions principals que aporten aquests tres estudis, individualment, són les següents:L'estudi "perspectiva dels metges respecte a la professió mèdica" conclou que els metges estan satisfets de la formació rebuda en, només, quatre competències professionals, d'un conjunt de disset competències que ells mateixos han identificat com a molt importants per a l'exercici de la professió. Per tant, caldria desenvolupar progressivament aquest conjunt de competències. D'altra banda, els metges experts creuen que caldria harmonitzar els valors del coneixement científic tècnic especialitzat, amb els valors del coneixement global i humanístic en l'assistència. Finalment, es posa de manifest que caldria avançar vers una major correspondència entre les polítiques orientades a objectius de salut i els instruments de gestió i de finançament per portar-les a terme.L'estudi "perspectiva dels agents socials de canvi respecte a la professió mèdica" constata que la professió mèdica ha evolucionat molt i la societat també. S'identifiquen els elements clau d'aquest procés. Es remarca el pes que la indústria de tecnologia mèdica i farmacèutica té en el lideratge de la professió. Es destaca que la informació a l'abast del ciutadà i la tecnologia són el que més farà canviar la relació entre el metge i el malalt. Les opinions dels tres grups de debat han estat homogènies. No obstant això, el grup de polítics i directius d'institucions sanitàries s'han desmarcat en algunes qüestions.L'estudi "perspectiva dels ciutadans respecte a la professió mèdica" posa de manifest que l'opinió respecte a algunes qüestions depèn de les característiques sociològiques del ciutadà. Tanmateix, en els temes més fonamentals, hi ha una homogeneïtat en la resposta. Es pot afirmar que, en general, els ciutadans estan satisfets dels metges, que les seves expectatives són molt altes, i que la confiança és un element clau per a una bona relació entre el metge i el malalt, encara que els ciutadans no sabrien concretar en què es fonamenta.Pel que fa a les conclusions integrades dels tres estudis portats a terme, s'observa que hi ha qüestions relatives a la professió mèdica que la societat i els metges no valoren igual. En aquest sentit, destaca: que el metges es creuen socialment menys valorats del que, en realitat, ho són; que els metges se senten "cremats" (burn out) i, en canvi, els ciutadans no consideren que ho estiguin més que d'altres professions; o bé, que als metges els preocupa que els diagnòstics i els tractaments tinguin una base científica i, en canvi, als ciutadans no els sembla importar tant. D'altra banda, també hi ha aspectes en els quals els ciutadans i els metges tenen una visió compartida: que cal reformar a fons la formació de pregrau; que cal establir mecanismes de recertificació de la competència professional i, també, que el que el metge ha de millorar més -tant actitudinalment com competencialment- és en l'atenció vers els aspectes relatius a la comunicació, en orientar al malalt i en el maneig de la tecnologia mèdica.Quant a les conclusions finals, es destaquen els elements de concens i dissens respecte als diferents àmbits analitzats, així com les paradoxes observades en els tres estudis portats a terme.(1) La denominació "agents socials de canvi" s'ha utilitzat per nomenar als participants en el grups de debat, la característica principal dels quals és que són "ciutadans informats" amb una capacitat de generar opinió en la societat atesa la seva professió, llocs de treball, o capacitat d'influència social. / This doctoral thesis aims to analyze the medical profession from different perspectives: that of the physicians; of the general population; and also that of a representative panel of determinate agents of social change(1).Three different studies, each using a different methodology, were carried out to ascertain the perspective of the groups analyzed. A Mini-Delphi survey was conducted on a group of 243 medical specialists; a survey was given to 800 ordinary citizens; and sessions with three debate groups comprising 17 agents of social change corresponding to different sectors of society were held. The originality of this thesis lies in contrasting and analyzing the different perspectives of the medical profession held by physicians, ordinary citizens, and agents of social change. This has enabled the identification of points of consensus and disagreement, the attractions and drawbacks of the profession for those who practice it, the merits and shortcomings of the profession from the viewpoint of ordinary citizens, and the current strengths and weaknesses of the profession, i.e. those issues that have yet to be decided and areas that can be improved. The main conclusions reached by each of these three studies are:The study "physicians' perspective regarding the medical profession" concludes that physicians are satisfied with the training they receive in only four of a set of seventeen areas that they themselves qualify as being very important in the practice of medicine. Therefore, training in these areas should be progressively improved. On the other hand, medical specialists believe that specialized technical scientific qualities should be harmonized with general and humanistic knowledge in medical care. Finally, there is a manifest need to advance toward greater correspondence between health policy and the instruments and financing necessary for its realization. The study "perspective of social agents of change regarding the medical profession" shows that both the medical profession and society have evolved considerably, and key elements of this process have been identified. The impact of the pharmaceutical and medical technology industries on the profession is considered to be especially influential. The information available to citizens and technology are perceived to be the factors that will have the greatest impact on the physician-patient relationship. The opinions of the three groups were homogeneous; however, the group of politicians and administrators of healthcare institutions differed from the others on some issues. The study "perspective of ordinary citizens regarding the medical profession" reveals that the opinions with respect to some questions depend on the sociological characteristics of the citizen. Nevertheless, there is a general consensus regarding fundamental questions. It can be concluded that citizens are generally satisfied with their physicians, that their expectations are very high, and that their confidence is a key factor in good relations between the physician and patient, although ordinary citizens are not specific about what is fundamental. The integrated conclusions of the three studies show that there are discrepancies between the physicians' perspective and that of society in general. Along these lines, it is noteworthy that physicians believe that their status is lower than it in fact really is; that physicians feel overwhelmed by their workload (burn out), whereas, contrarily, other citizens do not perceive a difference in this respect between the medical profession and other professions; and that physicians believe that it is important for diagnosis and treatment to be based on scientific evidence, while this does not seem to be very important for other citizens. On the other hand, there are other aspects about which ordinary citizens and physicians concur: the need for reform in undergraduate studies; the need to establish mechanisms for recertification of professional competence; and also that the medical professionals need to improve aspects related to communication with patients, orienting patients, and managing medical technology. Regarding final conclusions, elements of consensus and disagreement with respect to the areas analyzed are emphasized, as well as the paradoxes observed in the three studies.(1) The term "agents of social change" has been used for the participants in the debates; their main characteristic is that they are "informed citizens" capable of influencing public opinion because of their professions, place of work, or social influence.

Introducción: La infección por VIH afecta a un importante número de la población penitenciaria, aproximadamente, a un 20%. A partir de la aparición del TARGA (Tratamiento antirretroviral de gran actividad) se ha reducido considerablemente el número de muertes, convirtiéndose en una enfermedad crónica. No obstante, su eficacia ha estado limitada por el grado de cumplimiento que exige (la adhesión estimada en torno al 95%). Además, la población penitenciaria presenta unas características idisioncráticas que dificultan el seguimiento del tratamiento como el consumo de drogas, una elevada impulsividad, una escala de valores diferente (entre los cuales destaca la concesión de una escasa importancia a la salud) y una falta de hábitos de autocuidado. Por otra pare, el ingreso en prisión tiene repercusiones en su salud, tanto en un sentido favorable (una facilidad en el acceso a los cuidados médicos, una contención en drogodependencias, etc.) como desfavorable (una baja calidad asistencial por el escaso número de profesionales sanitarios en prisión, estrés psicosocial como consecuencia del ingreso en prisión y consecuencias a nivell psicológico como la impotencia, una baja autoestima, etc.). Objetivos: Se han establecido como objetivos: evaluar la adhesión a los antirretrovirales en los internos afectados con VIH en prisión, compararla con la de los pacientes no reclusos, y analizar su evolución temporal; evaluar las variables teóricamente relacionadas con la adhesión a los antirretrovirales (del paciente - sociodemográficas, penales/penitenciarias y psicológicas -, la enfermedad, el tratamiento y estructurales); y analizar la capacidad predictiva de dichas variables sobre la adhesión a los antirretrovirales en internos con VIH en prisión, en el Centro Penitenciario de Hombres de Barcelona ("La Modelo").Material y métodos: Se ha realizado un estudio longitudinal, de carácter cuantitativo y cualitativo, en el cual se ha evaluado la adhesión al TARGA en internos con VIH en prisión durante un período de seis meses, a través de una entrevista semiestructurada y bases de datos, en los cuales se ha recogido información sobre las variables sociodemográficas, penales/penitenciarias, clínicas, características del tratamiento, psicológicas (relacionales, sociocognitivas y emocionales) y adhesión al TARGA. Como medidas de la adhesión se utilizó un autoinforme sobre el grado de adhesión global y un autoinforme sobre el número de pastillas no ingeridas en los últimos cuatro díasResultados: El estudio fue iniciado por 75 internos, descendiendo, a los tres meses, a 57 internos y, a los seis meses, a 40 internos, por razones ajenas al tratamiento antirretroviral (traslados a otros centros penitenciarios, salida en libertad y derivación a otros recursos comunitarios). El nivel de adhesión global autoinformada pasó de un 72,5% al inicio del estudio a un 76,9% a los seis meses, mientras que la adhesión medida a través de la información sobre las pastillas ingeridas en los últimos cuatro días fue de un 76,9%, tanto al inicio como al final del estudio. Los análisis de regresión múltiple más relevantes respecto a la adhesión global autoinformada fueron, a los seis meses, la autoeficacia (15,4%) medida al inicio del estudio y la fatiga (41,7%) medida a los tres meses. Respecto a las pastillas no ingeridas en los últimos cuatro días, las variables predictoras fueron, a los seis meses, la depresión (13,9%) evaluada al inicio y la fatiga (17%) evaluada a los tres meses.Conclusiones: El estado de ánimo, sobre todo, el vigor y la fatiga, y algunas creencias relacionadas con la salud, como la autoeficacia, la percepción de beneficios del tratamiento y la percepción de la complejidad del tratamiento son relevantes en la adhesión a los antirretrovirales en internos con VIH en prisión, por lo cual sería importante implementar programas específicos en los que se trabajaran estos aspectos para incrementar la adhesión al TARGA. De cara al futuro creemos conveniente la realización de más estudios de carácter longitudinal, de carácter multicéntrico, en que se utilicen pacientes reclusos varones y mujeres, en que se preste especial atención a las variables psicológicas como predictores de la adhesión, y se combinen metodologías cuantitativas y cualitativas. / Introduction: HIV infection affects an important number of penitentiary population, 20 % approximately. From the appearance of HAART (High Activity Anti-Retroviral Therapy) the number of deaths has fallen considerably, becoming a chronic disease. However, its effectiveness has been limited because of the fulfilling degree that it demands (the considered adhesion is round 95 %). In addition, penitentiary population shows idiosyncratic characteristics that make monitoring of the therapy difficult, as the drug use, a great impulsiveness, a different scale of values (amongst which the concession of limited importance to health is emphasized) and a lack of self-personal care habits. On the other hand, imprisonment has repercussions on their health, as much in a favourable sense (medical care with easy access, measures to restrict the drug dependency, etc.) as in an unfavourable one (a low welfare quality owing to the limited number of health workers in prison, psychosocial stress as a result of placing in jail and psychological consequences like impotence, a low self-steem, etc.).Objectives: The following objectives have been established: to evaluate antiretrovirals' adhesion to affected inmates with HIV; to compare it with the patients who are not inmates; to analyze their temporal progress; to evaluate the variables which are related to the anti-retrovirals' adhesion theoretically (patient, sociodemographic, criminal, penitentiary, psychological, disease, therapy and structural variables); and to analyze the predictive ability of these variables about anti-retrovirals' adhesion to inmates with HIV in Barcelona Men Prison (called " The Model ").Material and methods: A quantitative and qualitative longitudinal study has been carried out in which the adhesion to HAART has been evaluated in inmates with HIV through a semistructured interview and databases during a period of six months. In this study, some information about sociodemographic, criminal, penitentiary, clinical and psychological variables (study of relationships, sociocognitive, emotional), characteristics of the therapy and the adhesion to HAART has also been collected. As measures of the adhesion, a self-report on the degree of comprehensive adhesion and another one on the tablets which were not ingested were utilized in the last four days.Results: The study was initiated with 75 inmates, going down to 57 ones three months later, and going down to 40 after six months for reasons beyond the anti-retroviral therapy (transfers to other prisons, freeing and derivation to other community resources) . The level of comprehensive self-reported adhesion went from 72.5 % at the beginning of the study to 76.9 % six months later; whereas the measured adhesion through information on the ingested tablets was 76.9 % in the last four days, as much at the beginning of the study as at the end of it. Regarding the comprehensive self-reported adhesion, the most notable multiple regression analyses were the measured self-effectiveness at he beginning of the study (15.4 % six months later) and the measured fatigue (41.7 % after three months) . Regarding the tablets, which have not been ingested in the last four days, the predicted variables, which were evaluated at the beginning of the study, were depression (13.9 % after six months) and the evaluated fatigue (17 % three months later) .Conclusions: The state of mind, above all, energy, fatigue, some beliefs related to health like self-effectiveness, the perception of the benefits' and complexity's therapy are outstanding to anti-retrovirals' adhesion in inmates with HIV. That is why it would be important to implement specific programs on which these aspects were worked so that the adhesion to HAART was increased. In view of the future, it would be advisable the execution of more longitudinal and multicentral studies for which male and female inmate patients are utilized; to which as much the psychological variables as the predictive ones to the adhesion are paid special attention; and with which quantitative and qualitative methodologies are combined.

La tesis titulada “Plastic and paper platforms for nanoparticle based immunosensors” presentada como compendio de publicaciones, muestra avances significativos en el campo de los biosensores ópticos y electroquímicos. En la introducción (Capítulo 1) se presenta la importancia que tienen tanto los sensores inmunológicos basados en nanopartículas como los biosensores basados en plataformas de papel y nanomateriales para aplicaciones en diagnóstico. Ambas plataformas destacan por la versatilidad y facilidad de uso, bajo coste y tamaño reducido, lo que hace que sean unos dispositivos excelentes para aplicaciones en países en vías de desarrollo así como para el diagnóstico en casa por el propio paciente o en el consultorio médico. En el Capítulo 2 los objetivos de la tesis están presentados. En la primera parte del Capítulo 3, se explica cómo el tamaño de las nanopartículas de oro afecta a sus propiedades electroquímicas y, por consiguiente, a su detección. Se ha demostrado que para nanopartículas inferiores a 20 nm de diámetro, los efectos Brownianos disminuyen la velocidad de deposición de las nanopartículas en solución, lo que debe ser tenido muy en cuenta para aplicaciones en las que las nanopartículas de oro actúen como marcadores en biosensores. En la segunda parte, se trata sobre el desarrollo de un novedoso método de funcionalización de nanopartículas de oro con anticuerpos. Este método está basado en la interacción entre las cargas positivas que tienen los anticuerpos a pH inferior al de su punto isoeléctrico y las cargas negativas de la superficie de las nanopartículas de oro. Con este método es posible controlar la orientación de los anticuerpos y esto implica poder detectar una menor cantidad de analito (en este caso se uso la inmunoglobulina humana G como proteína modelo). Comparando este método con otro en donde no se controla la orientación, se ha obtenido un límite de detección un orden de magnitud mejor y se ha podido detectar la proteína modelo en una muestra real. En cuanto a la aportación en el campo de los biosensores ópticos, se ha desarrollado un sensor inmunológico basado en inmunoensayos de flujo lateral (LFIA) en papel, aplicado para la detección de inmunoglobulina G humana como se recoge en el Capítulo 4. Esta tecnología destaca por su aplicabilidad y bajo coste (similares a los populares test de embarazo). En esta tesis se han desarrollado dos modificaciones de la tecnología que, sin implicar pérdida en su simplicidad de uso y bajo coste, han aumentado los límites de detección en un orden de magnitud. Una de las modificaciones consiste en unos cambios de la geometría de las tiras que permiten la pre-concentración del complejo analito-marcador en la zona de detección. Esto implica que se puede detectar menor concentración de analito. La otra estrategia consiste en el desarrollo de un doble marcador, donde las nanopartículas de oro están acopladas a un enzima. De esta manera en el LFIA se puede obtener como señal el color rojo de las nanopartículas de oro, como se usa comúnmente, o es posible añadir el substrato del enzima para que catalice una reacción que genere un producto coloreado, que se suma al color rojo de las nanopartículas de oro, aumentando la intensidad del color y mejorando los límites de detección de analito. Ambas modificaciones permiten el uso de este tipo de sensores en una mayor variedad de campos, donde un límite de detección más bajo es necesario. Finalmente, en el Capítulo 5, se presenta también la integración de un transductor electroquímico en soporte de papel. Esta novedosa plataforma, presentada en la tesis como instrumento para la detección de nanopartículas, permite una fácil integración en sistemas ópticos como los LFIAs añadiendo la posibilidad de una cuantificación más precisa. / The thesis entitled “Plastic and paper platforms for nanoparticle based immunosensors” is presented as a compendium of publications and shows important improvements in the field of biosensors. In the Introduction (Chapter 1) the importance of immunosensors based on nanoparticles and on paper platforms is discussed. The resulting systems are versatile, easy-to-use, cheap and of small size, making them excellent devices for their use in third world countries as well as for home-diagnostics. The objectives of the thesis are presented in Chapter 2. Chapter 3 is divided into two main parts; in the first one it is explained that the size of gold nanoparticles (AuNPs) affects their electrochemical properties, and so their detection. It is shown that for AuNPs with a diameter smaller than 20 nm, the Brownian effects make the deposition of AuNPs in solution slower. This must be carefully considered for those biosensors in which the AuNPs are used as labels. In the second a new method to functionalize AuNPs with an oriented antibody is explained. The method is based on the interaction between the positive charges of the antibody, when the pH of the solution is lower than the isoelectric point, and the negative charges of the AuNP surface. In this way it is possible to control the antibody orientation so more antigen molecules can be captured. In this work the human immunoglobulin G (HIgG) was used as model protein. Comparing this method with one that does not control the orientation, an improvement of one order of magnitude in the limit of detection was achieved. Furthermore, the HIgG was detected in real human serum. Regarding the optical biosensors, the development of a lateral flow immunoassay (LFIA) that was used for the detection of HIgG is explained in Chapter 4. This technology stands out for its applicability in several fields and low cost (consider pregnancy tests strips). In this thesis two modifications of the technology are presented improving the limit of detection up to one order of magnitude, without losing the simplicity in the use and the low cost of the analysis. The first modification changes the geometry of the strip allowing the pre-concentration of the antigen-label conjugates on the test zone. In this way less concentrations of analyte are detectable. The second strategy uses as label an AuNPs-enzyme conjugate. In this way it is possible to consider as signal the red color of the AuNPs (as commonly used in the LFIA) or, adding the substrate of the enzyme, the color produced by the catalyzed reaction. The colored product adds intensity to the red of the AuNPs improving the limit of detection of the LFIA. The proposed modifications expand the applicability of this platform to fields, where better limits of detection are required. Finally, in Chapter 5, the integration of a screen printed electrode onto a paper platform is presented. This new platform, used for the detection of nanoparticles, allows an easy integration in paper-based optical sensors, such as LFIA, adding the possibility to a more precise quantification.