INTRODUCCIÓN: En la práctica clínica de la Reproducción Asistida, cada vez es más habitual la realización de ciclos de transferencia de embriones. Este incremento no solo sucede por la edad avanzada de las pacientes y la consecuente indicación de ovodonación y embriodonación, sino también por el aumento del número de ciclos de criotransferencia. La introducción de la vitrificación como técnica de criopreservación y el aumento de la supervivencia y desarrollo embrionario permiten la existencia de un excedente de embriones, que pueden ser criopreservados para su posterior transferencia. La preparación endometrial previa a la transferencia puede realizarse siguiendo el ciclo natural de la paciente o administrando estrógenos exógenos durante la fase proliferativa. La vía de administración de los estrógenos más popular es la oral, si bien la transdérmica podría ofrecer ciertas ventajas sobre ella. OBJETIVOS: Nuestro objetivo principal es confirmar que la vía transdérmica es igual o superior a la vía oral para la administración de estrógenos en los ciclos de preparación endometrial para la transferencia de embriones, teniendo como variable principal el número de días necesarios para obtener un endometrio trilaminar de más de 7 mm. Como variables secundarias, evaluaremos la comodidad de la vía y satisfacción de la paciente, los niveles plasmáticos de estradiol y las tasas de embarazo, aborto y parto. MATERIAL Y MÉTODOS: Planteamos un estudio prospectivo, randomizado y comparativo, en el que 140 pacientes que van a realizar un ciclo de transferencia de embriones son aleatorizadas en 2 grupos: al grupo I se le asignará una pauta con comprimidos de valerato de estradiol; el grupo II recibirá una pauta con parches de estradiol hemidrato. Se medirá el grosor endometrial, mediante ecografía transvaginal, el día 10+1 de ciclo y, en caso de que no se haya alcanzado un endometrio de más de 7 mm, se realizará una segunda medición el día +15. Se realizará una determinación de los niveles de estradiol en sangre el día que la línea endometrial sea superior a 7 mm. Las pacientes rellenarán un cuestionario de satisfacción, en el que evaluarán la comodidad y efectos secundarios del tratamiento. RESULTADOS: Las pacientes del grupo II alcanzaron un endometrio significativamente mayor el día del primer control que las del grupo I (7.59 mm vs 7.01 mm; p:0.026), con menores niveles de estradiol en sangre (159.16 pg//ml vs 237.14 pg/ml; p:0.000) . Las pacientes del grupo I encontraron su tratamiento más cómodo que las del grupo II. En el grupo II, se reportaron más casos de mastalgia y dermatitis. No hubo diferencias significativas en cuanto a tasa de embarazo, aborto y parto. CONCLUSIONES: El tratamiento con estrógenos transdérmicos permite alcanzar un mayor grosor endometrial en menor número de días, con menores niveles plasmáticos de estradiol, aunque es peor tolerado por las pacientes. / INTRODUCTION: In the clinical practice of Assisted Reproduction, it is more and more frequent the performance of embryos transfer’s cycles. This increment is due not only to the patient’s advanced age and the subsequent indication of egg donation and embryos donation, but also to the increasing number of frozen embryos transfer. The introduction of vitrification as cryopreservation technique and the increment of embryo survival and development allow the existence of extra embryos that can be cryopreserved for its posterior transfer. Previous endometrial preparation can be performed following patient’s natural cycle or administering exogenous estrogens during the proliferative phase. The most common way of estrogens administration is the oral one, although the transdermal way might offer some advantages over the oral one. OBJECTIVE:Our fundamental aim is to confirm that the transdermal way is equal or superior than the oral way for the estrogens administration in endometrial preparation cycles for embryos transfer, taking as principal variable the number of days necessary for obtaining a triple line endometrium thicker than 7mm. As secondary variables, we evaluate comfort and patient’s satisfaction, plasmatic levels of estradiol as well as pregnancy, miscarriage and delivery rates. MATERIALS AND METHODS: We outlined a prospective, randomized and comparative study. In this study, 140 patients who are going to undergo an embryo transfer cycle are randomized in 2 groups: group I will follow a protocol with pills of estradiol valerate; group II will receive a protocol with patches of estradiol hemihydrate. Endometrial thickness will be measured with transvaginal ultrasound on day 10 of the cycle. Should the lining not measure more than 7mm, a second measurement will be performed on day 15 of the cycle. A blood analysis of estradiol level will be performed when the lining is thicker than 7mm. Patients will complete a satisfaction survey to evaluate treatment’s comfort and side effects. RESULTS: Patients of group II reached a significantly thicker endometrium on the day of first control compared to group I’s patients (7.59 mm vs 7.01 mm; p:0.026), with lower level of estradiol in blood (159.16 pg//ml vs 237.14 pg/ml; p:0.000). Patients of group I found their treatment more comfortable than patients of group II. In group II more cases of mastalgia and dermatitis were detected. No significant differences were found in terms of pregnancy, miscarriage and birth rates. CONCLUSIONS:Treatment with transdermal estrogens allows to reach a higher endometrial thickness in less days, with lower plasmatic levels of estradiol, although it is worst tolerated by patients.

La atención y la investigación en salud, especialmente en los pacientes ancianos y crónicos, no debe orientarse exclusivamente a los problemas biomédicos. La detección y alivio del sufrimiento de los enfermos es uno de los fines de la medicina actual. Según el modelo amenazas-recursos, el individuo sufre cuando percibe amenazada su integridad e implica tanto la percepción y sentido de la amenaza como la falta de recursos para hacerle frente. La fractura de cadera es un grave problema de salud cuya incidencia está aumentando, sobre todo entre los ancianos más vulnerables. La presente tesis engloba la valoración del sufrimiento de los ancianos con fractura de cadera en fase subaguda mediante la aplicación de cuestionarios con opción de respuesta cerrada y el análisis cualitativo de las entrevistas en las que fueron aplicados. Los ancianos ingresados por fractura de cadera sufren y su concepción de sufrimiento es inseparable de su situación personal. Han sido capaces, y han demandado, poder explicarse en términos más amplios que los requeridos por los instrumentos. El sufrimiento valorado mediante el instrumento PRISM (Pictorial Representation of Illness Self Measurement) y el cuestionario DME (Detección del Malestar Emocional) se relacionan entre sí y con variables geriátricas: la función previa, la comorbilidad, los síndromes geriátricos, y con la ansiedad. El uso de instrumentos ha comportado una baja tasa de inclusión sobre el total de la población con fractura de cadera. Y dificultades de comprensión y aceptación de los instrumentos por los pacientes, detectadas mediante el análisis cualitativo de los datos. Precisamente, dichos problemas de inclusión y de comprensión -específicamente de la tarea PRISM- se asocian a variables geriátricas relacionadas con la fragilidad de los ancianos, principalmente el bajo nivel funcional previo. No se ha encontrado asociación entre la comprensión de la tarea PRISM y el nivel educativo de los pacientes. El cuestionario DME, con su opción de respuesta categórica, ha sido aplicable sin mayores problemas de comprensión o aceptación por parte de los pacientes. En la aproximación al sufrimiento del paciente anciano con fractura de cadera ha resultado fundamental el abordaje mixto: evaluación cuantitativa y evaluación cualitativa. Aconsejamos que en el futuro los trabajos de investigación siempre incluyan un abordaje mixto. Para detectar clínicamente el sufrimiento es necesario establecer un vínculo afectivo, cordial y de respeto con el paciente mediante una comunicación abierta y no coercitiva, utilizar métodos flexibles y valorar el espacio-tiempo que se destina; y, sobre todo, individualizar cada caso. / Medicine, especially in the elderly, must not focus exclusively on biomedical problems. The detection and relief of suffering are goals of medicine. According to “the threat and resources model” –amenazas y recursos-, suffering appears when person perceives a threat to self’s integrity along with lack of coping capabilities. Hip fracture is a serious health problem. Its incidence is increasing, above all among the frailest elderly. This thesis includes the assessment of subacute hip fracture elderly patients’ suffering by using questionnaires and the qualitative analysis of interviews where these were applied. Hip fracture patients suffer and their idea of suffering is inseparable from their personal situation. Patients had been able to explain themselves better and in wider terms than those required by instruments. Suffering assessed by PRISM (Pictorial Representation of Illness Self Measurement) and DME questionnaire (Detección Malestar Emocional) relate to each other and to geriatric variables: previous function, comorbidity, geriatric syndromes, and to anxiety. The use of instruments entailed a low patient inclusion rate and also difficulties in comprehension and acceptance of the instruments, detected by the qualitative analysis of results. Inclusion and comprehension problems –especially of PRISM task- had been associated to variables related to geriatric frailty, mainly previous low functional status. No association was found between comprehension of PRISM task and educational level. DME questionnaire, including the categorical option of answer, has been applied without significant comprehension and acceptance problems. Mixed methodology –quantitative and qualitative- has been essential to approach suffering of the elderly hip fracture patient. We recommend this strategy for future research. Establishing an affective bond with patient, using flexible methods and appreciating used time-space, are all needed to detect and relieve suffering in clinical practice. And, above all, an individualized approach to each person.

La lesió de medul·la espinal és una de les principals causes de mortalitat entre pacients menors de 50 anys. Es dona en una taxa d’entre 20-­‐40 persones per milió d’habitants i amb una major prevalença en homes que en dones (amb una ratio de 4:1). A diferència del sistema nerviós perifèric (SNP), el sistema nerviós central (SNC) de mamífers adults presenta una limitada capacitat de regeneració espontània fet que porta a una pèrdua de dèficits funcionals permanents. Això és degut en part a: la escassa capacitat endògena de les neurones centrals per regenerar els seus propis axons després d’una lesió, la limitada capacitat del SNC per substituir neurones i oligodendròcits morts i la generació d’un ambient desfavorable en el SNC per promoure la regeneració axonal després de lesió. La fisiopatologia de les lesions de medul·la espinal inclou dues fases: la lesió primària i la lesió secundària. La lesió primària és conseqüència del trauma mecànic directe a la medul·la espinal que comporta el trencament d’axons, vasos sanguinis, membranes cel·lulars i mielina. La lesió primària es seguida per una segona onada de degeneració tissular que ocorre durant un període de varies setmanes i comporta una sèrie de processos cel·lulars i moleculars que tenen com a resultat l’increment del dany inicial en el parènquima medul·lar. Els mecanismes del dany secundari són diversos i no estan del tot ben definits, tot i així diversos estudis indiquen que la resposta inflamatòria n’és un dels principals components. La inflamació es un procés essencial després de lesió, un mecanisme per evitar infeccions i promoure reparació. En aquesta resposta, les citocines i les quimiocines juguen un paper essencial en el reclutament i l’activació de les cèl·lules immunes i les cèl·lules glials del SNC per iniciar i mantenir la resposta inflamatòria. A més, independentment del teixit en el qual es produeixi, la resposta immune es auto limitant i auto resolutiva. Encara que en lesions de medul·la espinal la resposta immune es necessària per retirar restes de mielina i les cèl·lules mortes e iniciar mecanismes de regeneració, les cèl·lules immunes secreten una sèrie de molècules que causen dany tissular. Aquest dany tissular és encara més pronunciat en el SNC que en altres degut a la limitada capacitat de regeneració i de reemplaçar cèl·lules mortes del SNC. Encara més, a diferència d’altres teixits, la resposta inflamatòria en el SNC no es auto resolutòria fet que porta a una cronificació de la inflamació incrementant la degeneració del parènquima medul·lar. La interleucina 37 és una citocina anti-­‐inflamatòria que es capaç de suprimir la resposta immune inhibint l’expressió de les citocines pro-­‐inflamatòries sense afectar a l’expressió de les anti-­‐inflamatòries. D’aquesta manera la IL-­‐37 es podria considerar com a un possible candidat per a reduir la resposta inflamatòria després de una lesió de medul·la espinal i d’aquesta manera promoure regeneració de recuperació funcional. També, la IL-­‐37 podria potencialment ser usada per a altres desordres tant del SNC com d’altres sistemes on la resposta inflamatòria té un efecte perjudicial com ara lesions traumàtiques al cervell, malaltia d’Alzheimer, arteriosclerosi, asma o artritis entre d’altres. / Spinal cord injury (SCI) is one of the main causes of mortality among patients under 50 years old. It occurs in most countries at an annual rate of 20–40 people per million of inhabitants, affecting more at men than women with a ratio of 4:1. Unlike peripheral nervous system (PNS), central nervous system (CNS) of adult mammals has limited abilities for spontaneous self-­‐repair which leads to permanent functional deficits. This is due, in part, by: the poor intrinsic capacity of central neurons to regenerate their axons following injury, the limited ability of the CNS to replace dead neurons and oligodendrocytes, the inappropriate environment of the CNS to support axonal growth. The pathophysiology of SCI involves two stages: the primary and the secondary injury. The first results from the mechanical trauma to the spinal cord that directly disrupts axons, blood vessels, membranes of neurons and glial cells, and myelin. This is followed by the secondary wave of tissue degeneration, which occurs over a period of several weeks, and encompasses a sequence of cellular and molecular events that are triggered in the spinal cord parenchyma as a result of the primary trauma. The mechanisms of secondary injury are multiple and not well defined, however a large number of studies indicates that inflammation is the main contributor to secondary injury. Inflammation is an essential aspect of the injury response and a means to curb infections and initiate wound healing. Chemokines and cytokines play an important role in the recruitment and activation of peripheral immune and CNS glial cells to initiate and maintain the inflammatory response. Regardless of the tissue in which it occurs, the inflammatory response is normally self-­‐limiting and undergoes resolution in a timely fashion. Although the inflammatory response is required for the clearance of cell and myelin debris and for wound healing in SCI, immune cells secrete several factors that cause damage to tissue. The damaging effects of inflammation are more pronounced in the CNS than other tissues because of the limited capacity of the CNS for axon regeneration and replenishment of damaged neurons and glial cells. Moreover, and in contrast to host tissues, inflammation does not terminate in a timely manner following SCI, leading to the development of chronic inflammation that further increase the degeneration of the spinal cord tissue. IL-­‐37, also known as IL-­‐1 family 7b (IL-­‐1F7) is an anti-­‐inflammatory cytokine. IL-­‐37 suppresses innate immune response by silencing the expression of pro-­‐inflammatory cytokines without altering those that are anti-­‐ inflammatory. IL-­‐37 might therefore be a suitable candidate to reduce inflammation and thus mediate protection and functional recovery after SCI. Moreover, IL-­‐37 could potentially be used for other CNS and non-­‐CNS disorders where the immune response plays a detrimental role such as acquired brain injury Alzheimer’s disease, atherosclerosis, asthma and arthritis, among others.

Los catecoles son compuestos aromáticos presentes en una gran variedad de sistemas naturales. Dada su gran versatilidad a nivel de propiedades fisicoquímicas, adquieren papeles clave en diferentes procesos naturales. Entre otros, los grupos catecol se encuentran en las proteínas adhesivas de los mejillones formando parte de aminoácido L-DOPA, que se considera responsable del extraordinario poder adhesivo de estos organismos en condiciones de extrema humedad. Este fenómeno ha fascinado a los científicos durante décadas y grandes esfuerzos se han destinado a entender e imitar estos sistemas. Otras propiedades de los catecoles, como su capacidad de formar complejos metálicos o su actividad redox, también han sido estudiadas tanto a nivel fundamental como en sistemas aplicados. En la presente tesis nos centramos en la obtención de sistemas de escala nanométrica basados en derivados de catecol y en el estudio de sus propiedades. Para ello, se llevó a cabo un trabajo multidisciplinar que incluye la síntesis de nuevos compuestos orgánicos, la obtención de nanoestructuras y el uso de microscopías y técnicas litográficas. En primer lugar se estudió la influencia de la densidad y orientación de los grupos catecol en las propiedades interfaciales de monocapas autoensambladas (SAMs) con unidades de catecol en el exterior; usando una punta de AFM o mediante la adsorción de nanopartículas magnéticas. Además, se estudió el efecto de la unidad de catecol en el proceso de formación y la estructura final de las monocapas. Por otro lado se llevó a cabo la síntesis de materiales poliméricos nanoestructurados basados en la funcionalidad catecol. Para ello se emplearon tanto metodologías clásicas como la síntesis confinada en pequeños volúmenes en superficie mediante el uso de litografía por escritura directa asistida por AFM. Esta técnica nos permitió fabricar estructuras de polidopamina y partículas de polímeros de coordinación mediante la deposición en superficie de los precursores de estos materiales en forma de gotas en la escala del femtolitro. De esta forma demostramos la viabilidad de la técnica para posicionar materiales funcionales en áreas concretas de una superficie. / Catechols are aromatic derivatives present in a variety of environments in nature. Due to their broad physicochemical versatility, they play pivotal roles in multiple natural processes. Probably their most popular appearance is in the adhesive proteins of mussels in the form of the rare aminoacid L-DOPA, which is considered to be essential for the strong adhesion of mussels to surfaces under high humidity conditions. This phenomenon has fascinated scientists for decades and intensive research has been carried out in order to understand and mimic these systems. Furthermore, other chemical properties of catechols, such as their metal-chelating and redox behaviour have also been addressed for both fundamental understanding and practical application. In this thesis we were interested in the obtention of nanoscale catechol-based systems and the study of their properties. For that, a multidisciplinary work was carried out which included the synthesis of new organic compounds, the preparation of nanostructures and the use of advanced microscopies and lithographic techniques. The role of packing density and orientation of catechol moieties in the interfacial properties of catechol-terminated SAMs was studied at the local scale using an AFM tip or, alternatively, magnetic nanoparticles. The influence that the presence of the catechol ring has on the formation and final structure of SAMs was also addressed. On the other hand, the synthesis of catechol-based polymers in confined volumes was performed using direct-write AFM-assisted lithography. Polydopamine and coordination polymer particles were fabricated directly on surfaces by controlled delivery of their molecular precursors in the shape of femtolitre-sized droplets. With that, we demonstrated the viability of using this technique to place functional amorphous materials on specific areas of surfaces.

Esta tesis se centra en la dinámica de la firma y el comercio internacional, y la relación entre ellos. Hay gran número de documentos que ya se han reportado aumentos de la productividad del comercio o de papel de la productividad internacional en la selección y el crecimiento de la empresa. Todos ellos tratan de responder a las siguientes preguntas conocidas: "¿La productividad determinan la selección y el crecimiento de las empresas?"; Aquí, podemos agregar algunas otras preguntas: ¿Cuál es el efecto del comercio en empresas de alta tecnología y de baja tecnología? ¿Tiene la inversión en actividades de innovación tiene ningún efecto sobre la productividad? El punto es que en la mayor de las obras anteriores, el efecto del comercio sobre la productividad y la demanda ha sido desigual. Si el uso de los resultados anteriores misdirects dinámica de firmes o efecto del comercio sobre la productividad de las empresas, puede haber algunas cosas que pueden ser dirigidas por una mejor medida de la productividad y el acceso a la ESEE. El primer capítulo, aborda la estimación de la productividad a nivel de empresa y la relación entre la productividad y el valor del producto con el rendimiento de las empresas. La productividad de la empresa se descompone al componente técnico y el componente de valor del producto. Nos encontramos con que el componente de valor del producto es significativamente importante como perturbaciones a la PTF en los resultados empresariales y la rotación, sin embargo, el grado de respuesta a la producción y los precios es más largo y más grande para perturbaciones a la PTF. Nuestros resultados muestran que tanto los exportadores y las empresas multinacionales tienen valores de productividad y de productos superiores. El papel del valor del producto es, sin embargo, más importante que el acceso a los mercados extranjeros. Usando STF físicas y de ingresos para evaluar la apertura comercial sobre el desempeño de las empresas muestra que la literatura previa exagera el papel del comercio en la productividad de las empresas, y distorsiona su efecto sobre la demanda. En este capítulo también se investiga el efecto de los gastos en I + D en la productividad a nivel de empresa, y el vínculo entre las actividades de innovación en firme y la productividad. Los resultados muestran que las empresas que invierten en actividades de I + D tienen una productividad más alta en comparación con otras empresas y empresas con eficiencia técnica bajo o alto valor del producto son más propensos a emprender la innovación de productos. En el último capítulo de la tesis, un modelo de equilibrio general de dos países se estudia que aborda conjuntamente la decisión de las empresas heterogéneas para servir a los mercados extranjeros, ya sea a través de las exportaciones o la inversión extranjera directa y sus opciones tecnológicas. En equilibrio, solamente las empresas más productivas optan por servir en los mercados extranjeros y las empresas más productivas elegirán además a actualizar su tecnología. Por último, las empresas de propiedad extranjera con tecnología de bajo nivel de salida del mercado más que los que la adopción de la alta tecnología. ESEE se emplea para verificar el efecto de la apertura sobre la productividad a nivel de empresa. Los resultados muestran que la reducción de aranceles, en promedio, disminuye la IED de baja tecnología en un 4% a 6%, pero no hay ningún efecto significativo en la alta tecnología las empresas de propiedad extranjera 1990-2009. / This thesis focuses on firm dynamics and international trade, and the link between them. During the last decade, extensive researches have been done on firm dynamics, especially on productivity, firms’ growth and innovation. Here, it is deeply focused on productiv- ity, innovation and trade. There are huge number of papers that have already reported productivity gains from international trade or role of productivity in firm’s selection and growth. They all try to answer the following well-known questions: ”Does productivity determine firms’ selection and growth?”; ”Are there productivity gains from opening to trade?” Here, we may add some other questions: What is the effect of trade on high-tech and low-tech firms? Does investing in innovation activities have any effect on productiv- ity? The point is that in the most of previous works, the effect of trade on productivity and demand has been mixed (due to lack of data on firm level prices). If using previous results misdirects firm dynamics or trade effect on firms’ productivity, there may be few things that can be directed by a better measure of productivity and accessing to a rich data set, ESEE. The first Chapter, addresses estimation of firm level productivity and the link between productivity and product value with firms performance by using information on firm level prices. Following Foster et al. (2008), a unique data set is employed to disentangle the role of productivity on manufacturing firms performance. Productivity of the firm is decomposed to technical component and product value component. We find that product value component is significantly as important as TFP shocks in firm performance and turnover, however the degree of response to output and prices is longer and larger for TFP shocks. Olley and Pakes (1996) method, for estimating the parameters of the production function, is extended to include other endogenous variables that impact on productivity like firms’ R&D expenses. Our results show that both exporters and MNEs (multinational enterprises) have higher productivity and product values. The role of product value is, however, more important for accessing to foreign markets. Using Physical and Revenue TFPs to evaluate trade openness on firms’ performance shows that previous literature exaggerates the role of trade in firms’ productivity, and distorts its effect on demand side. This chapter also investigates the effect of R&D expenditures on firm level productivity, and the link between firm innovation activities and productivity. Results show that those firms that invest in R&D activities have higher productivity comparing to other firms and firms with low technical efficiency or high product value are more likely to undertake product innovation, but firms that have high technical efficiency or high product value are more likely to perform process innovation. In the last chapter of thesis, a two-country general equilibrium model is studied that jointly addresses the decision of heterogeneous firms to serve foreign market either through export or foreign direct in- vestment (FDI) and their technological choices. In equilibrium, only the more productive firms (Exporters and FDIs) choose to serve in foreign markets and the most productive firms will further choose to upgrade their technology. In addition, as trade liberalization takes place, the cut off productivity of exporters increases and the cut off productivity of foreign-owned firms decreases. Finally, foreign-owned firms with low level technology leave the market more than those adopting high technology. ESEE is employed to verify the effect of openness on firm level productivity. Results show that tariffs reduction, in average, decreases low-tech FDIs by 4% to 6% but there is not any significant effect on high-tech foreign-owned firms from 1990 to 2009.

El zinc es un micronutriente esencial para las plantas, pero tóxico a concentraciones elevadas. La mayoría de las plantas adaptadas a suelos metalíferos excluyen el exceso de metales de sus tejidos. Sin embargo, algunas plantas denominadas hiperacumuladoras toleran y acumulan en parte aérea concentraciones de metales extremadamente altas. Una de las hipótesis más aceptadas que explica la adquisición de este rasgo relaciona una elevada concentración de metales con una mayor resistencia a patógenos y herbívoros (hipótesis de la defensa metálica). De hecho, existen evidencias de que altas concentraciones de metal en planta pueden ser tóxicas para microorganismos fitopatógenos (hipótesis de la defensa elemental), incluso a niveles por debajo del umbral de hiperacumulación (hipótesis de la mejora defensiva). No obstante, el Zn podría sobre o subregular compuestos orgánicos relacionados con el sistema inmune de la planta, acentuando la respuesta al estrés (hipótesis de los efectos conjuntos) o ahorrando costes metabólicos (hipótesis de la compensación). En esta tesis se examinó la hipótesis de la defensa metálica en plantas hiperacumuladoras y no hiperacumuladoras inoculadas con hongos necrotróficos. Para ello se consideraron el efecto directo tóxico del Zn y la interacción con las defensas orgánicas, estableciéndose tres patosistemas con plantas creciendo en distintas concentraciones de Zn: Noccaea caerulescens inoculada con Alternaria brassicicola y Arabidopsis thaliana inoculada con Alternaria o Botrytis cinerea. En el caso de Arabidopsis, se emplearon cuatro mutantes con defectos metabólicos en la respuesta al estrés: npr1, pad1, coi1 y etr1. Además, se localizaron en los Pirineos poblaciones naturales de plantas del género Noccaea, que fueron identificadas y caracterizadas con vista a futuros experimentos de campo. El Zn mejoró la resistencia de Noccaea a Alternaria, y se correlacionó negativamente con algunas de las defensas orgánicas. A pesar de que el SA, JA, ABA y las expresiones de varios genes marcadores de las rutas del SA, JA y JA/Et fueron inducidos por igual 24 horas tras la inoculación con Alternaria, una semana más tarde el Zn y las rutas de señalización de estrés se correlacionaron negativamente. Asimismo, se encontró una compensación entre el Zn y los glucosinolatos en hoja, pero, por el contrario, una semana después de la inoculación con Alternaria la concentración de glucosinolatos se vio incrementada en las hojas infectadas con mayor concentración de Zn. Las plantas de A. thaliana silvestres tratadas con Zn fueron más resistentes a Alternaria, pero no claramente a Botrytis. Arabidopsis silvestre y los mutantes de las rutas de señalización de estrés acumularon concentraciones similares de Zn en hoja, descritas como tóxicas para Alternaria, pero no para Botrytis. El Zn amplificó la expresión de los genes relacionados con las rutas de señalización del SA y del JA/Et en respuesta a la infección por Alternaria. Sin embargo, los cambios en las concentraciones de SA, JA, ABA y ACC no fueron responsables de las diferencias en la resistencia a Alternaria. Los mutantes tratados con Zn no fueron más resistentes a ninguno de los patógenos o incluso más susceptibles a Botrytis. Como el Zn no compensó su defecto metabólico, se sugiere que las defensas orgánicas activadas por el Zn tuvieron un papel más importante contra Alternaria que el Zn como defensa inorgánica. Las plantas de tres poblaciones de suelos no metalíferos de los Pirineos hiperacumularon Zn y Cd y fueron identificadas como Noccaea brachypetala según características morfológicas. Además, creciendo en hidroponía, presentaron diferencias fenotípicas, lo cual sugiere que existen diferencias genéticas subyacentes puestas de manifiesto en la expresión de genes de trasportadores de metales en respuesta a Zn y Cd exógenos. El uso de estas poblaciones para estudios de campo se ve limitado por su fragilidad y dificultad de acceso. / Zinc is an essential plant micronutrient but it can be toxic in elevated concentrations. Most of the plants adapted to metalliferous soils exclude metals from their tissues. However, some plants so-called hyperaccumulators are able to tolerate and accumulate extremely high metal concentrations in their shoots. Among the most accepted hypothesis to explain the acquisition of this trait is that heavy metals protect the plant against pathogens and herbivores (metal defense hypothesis). In fact, Zn and other heavy metals may be toxic for the attacking pathogens at high concentration in plant (elemental defense hypothesis). Metals have been accounted even for improving plant disease resistance below hyperaccumulation levels, thus being a possible explanation for the acquisition of the trait (defensive enhancement hypothesis). Nonetheless, other organic compounds related to the plant immune system, have been reported to be up or under regulated in response to Zn, thus enhancing the stress response (joint effects hypothesis) or saving metabolic cost to the plant (trade-off hypothesis). In this thesis the metal defense hypothesis was tested in metal and non-metal hyperaccumulating species inoculated with necrotrophic fungi. Both direct metal toxicity and indirect metal-induced enhancement of organic defenses were considered. For this purpose three pathosystems were established with plants growing at different Zn concentrations. The pathosystems were: Noccaea caerulescens infected with Alternaria brassicicola and Arabidopsis thaliana infected with Alternaria or Botrytis cinerea. In the case of A. thaliana, npr1, pad1, coi1 and etr1, four stress response defective mutants, were also used. Moreover, natural occurring populations of the genus Noccaea were located in the Pyrenees. Plants were identified and their Zn and Cd accumulation ability characterized with a view to future field experiments. Zn improved Noccaea resistance to Alternaria, leading to a trade-off between the metal and some of the organic-based defenses. Although SA, JA, ABA and the expression of SA, JA and JA/Et pathways marker genes were evenly induced by Alternaria 24 hours after the inoculation, one week later Zn and the hormone signaling showed a negative correlation. A trade-off was also reported between leaf glucosinolates and Zn, but, in contrast, one week after the inoculation glucosinolates concentration increased in the infected leaves with higher Zn concentration. A. thaliana WT Zn-treated plants were more resistant to Alternaria attack, but the Zn effect was not clear against Botrytis. A. thaliana WT and the stress signaling defective mutants concentrated similar leaf Zn values, that were accounted to be potentially toxic for Alternaria, but not for Botrytis. Zn amplified the expression of genes related to the SA and JA/Et signaling pathway in response to A. brassicicola infection. However, changes in the endogenous concentrations of SA, JA, ABA and ACC, were not reported to be responsible for the differences in the resistance to Alternaria. Zn-treated A. thaliana stress response defective mutants were not more resistant to none of the pathogens when Zn was applied or even more susceptible to Botrytis. As Zn did not compensate their metabolic defects, it is suggested that the plant organic defenses activated by the enhanced Zn levels against Alternaria played a more important role than Zn as a direct inorganic defense. The plants from four non-metalliferous Noccaea populations in the Eastern Pyrenees were identified attending to morphological characters as Noccaea brachypetala and they were reported to be Zn and Cd hyperaccumulators. Moreover, plants form three populations differed in the rosette shape while growing hydroponically, suggesting underlying genetic differences that were patent in the heterogeneous expression patterns of metal transporter genes in response to Zn and Cd supply. The populations were fragile and of difficult accessibility, which limits their use for field studies in metal hyperaccumulation and defense.

La presente tesis describe el desarrollo de nuevos métodos de sensado basados en nuevas propiedades de nanomateriales aplicados en la detección de proteínas y ADN. El trabajo ha sido basado en dos plataformas de sensado: primero, electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs). Estos electrodos fueron aplicados en un ensayo de detección por impedancia eléctrica de nanopartículas de oro (AuNPs). Del mismo modo, SPCE fueron adaptados mediante films de polythionina y nanopartículas de Iridio (IrOxNPs) para la detección de secuencias de ADN. La segunda plataforma utilizada fue basada en papel y tiene el formato de un inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, del inglés lateral flow immunoassays). Esta plataforma se adaptó para la detección de una proteína específica Parathyroid like hormone (PTHLH) utilizando AuNPs como marcas, con el fin de obtener una nueva estrategia más simple, sin marcaje de isótopos radioactivos, menos costosa y más rápida. En el Capítulo 1 se da una visión general de las aplicaciones llevabas a cabo y mejoras aportadas por parte de nanomateriales en el campo de los biosensores, y las posibles aplicaciones en la detección de biomarcadores. En el Capítulo 2 se presentan los objetivos de la tesis. El uso de SPCE como plataforma para la detección de AuNPs mediante medidas de impedancia se presenta en el Capítulo 3 consiguiendo una mejor detección en comparación con métodos similares publicados para la detección de AuNPs. La técnica desarrollada es aplicada satisfactoriamente en la detección de AuNPs de diferente tamaño, y en un magnetoinmunoensayo utilizando AuNPs como marca para la detección de una proteína modelo. En el Capítulo 4, se presenta el trabajo relacionado con el desarrollo de nuevos sensores para la detección de DNA. El sistema está basado en la modificación de SPCEs mediante películas de un polímero y nanopartículas de óxido de iridio (IrOxNPs) sobre las cuales se inmovilizan secuencias de captura de DNA. La detección del ADN objetivo se consigue mediante medidas de impedancia eléctrica, basadas en el efecto de bloqueo del ADN hibridado para la difusión de un indicador redox a la superficie del electrodo. El biosensor resultante, que opera en modo libre de marcas, fue utilizado para la detección de secuencias de ADN específicas para el parásito de Leishmania. En el Capítulo 5 se presentan conclusiones generales y perspectivas futuras. En el Anexo A, se presenta el trabajo relacionado con las plataformas de papel para la detección de una proteína específica, PTHLH. El sistema de detección presentado es del tipo LFIA. La técnica desarrollada supone una alternativa menos costosa, más rápida y menos peligrosa a las técnicas disponibles actualmente. El límite de detección (LOD) conseguido está en el rango de ng mL-1 en muestras reales (medio de cultivo celular y lisado celulares). Además, se comprobó la compatibilidad del método desarrollado con suero humano utilizando suero humano con PTHLH añadido. En el Anexo B, se presenta el trabajo llevado a cabo en una estancia de investigación. En esta sección se presenta la fabricación de sensores electroquímicos de ADN (E-DNA) y basados en aptameros (E-Ab), y la aplicación de dicha tecnología en sensores serigrafiados de oro y en SPCE modificados con AuNPs. El Anexo C representa la investigación llevada a cabo como continuación de otra hecha anteriormente en nuestro grupo. Las condiciones y materiales encontrados previamente se aplicaron en la fabricación de una plataforma de nanocanales para la detección de una proteína secretada por células cultivadas directamente sobre la plataforma de sensado. / This thesis describes the study and development of new biosensing approaches based on novel properties of nanomaterials for the detection of proteins and DNA. The work has been performed in basis of two sensing platforms: first platform, the carbon screen-printed electrodes (SPCEs), were used in a more sensitive detection of gold nanoparticles (AuNPs) through electric impedance measurements. Furthemore, the same platform (SPCE) was adapted through polythinione films and iridium oxide nanoparticles (IrOxNPs) for the detection of specific DNA sequences in a label free assay. The second platform, paper-based platforms in format of Flow Immunoassay (LFIA), using gold nanoparticles as labels is adapted for the detection of a specific protein, Parathyroid like Hormone (PTHLH), with the aim to find a new strategy for simpler, non-hazardous, cheaper and faster detection of the protein. In Chapter 1 a general overview of the application of nanomaterials for the improvement of biosensors and its application in the field of diagnostics and biomarkers detection is presented. In Chapter 2 the objectives of the thesis are presented. Use of SPCE as platform for detection of gold nanoparticles (AuNPs) through electric impedance measurements is presented in Chapter 3. The developed technique is successfully applied in the detection of AuNPs of different sizes, and in a magnetoimmnuoassay for the detection of a model protein using AuNPs as electrochemical labels. In Chapter 4, a novel biosensor for the detection of DNA is presented. The system is based in SPCE modified with polymer films and Iridium Oxide nanoparticles, where capturing DNA sequences have been immobilized. Detection of target DNA sequences is performed through electric impedance measurements, based in the blocking effect of the DNA against the diffusion of a redox indicator to the surface of the electrode. A label free immunoassay for detection of specific sequences of Leishmania parasite’s DNA is shown. In Chapter 5 general conclusions and future perspectives of the presented work are discussed. In Annex A the work related to the paper-based platform for protein detection is presented. In this annex, detection of a specific protein (parathyroid like hormone, PTHLH) through LFIA strips is described. The developed LFIA strips represent a cheaper, faster and non-hazardous alternative to current available systems for PTHLH detection. Limits of detection (LOD) in the range of ng mL-1 for PTHLH in real samples (cell culture media, cell lysates) are reported. Furthermore, the developed system is challenged using human serum spiked with PTHLH, proving the potential of the system to detect PTHLH In human serum. In Annex B the work carried out in a research stay is presented. In this section fabrication of electrochemical DNA (E-DNA), and electrochemical aptamer (E-Ab) biosensors is described. The aim of the work was focused on adapting the E-DNA and E-Ab technology to SPCE, using AuNPs as connecting platform between the thiol modified DNA and the SPCE. Annex C represents a research done as a continuation of a previous one done in the group related mostly to the study of compatible materials with interest to be used as cells growth platforms with interest in sensing. As continuation of this work, in Annex C the conditions and materials previously selected to grow cells are applied in a nanochannel platform for the detection of a protein secreted by the cells grown directly on the sensing platform.

Los ácaros Demodex son habitantes normales de la piel de los mamíferos. Los mismos se han adaptado a vivir dentro de los folículos pilosos y las glándulas sebáceas de la piel de sus huéspedes mamíferos. La demodicosis puede ser definida como una enfermedad inflamatoria cutánea caracterizada por la presencia de una sobrepoblación de ácaros Demodex. Se considera que la respuesta inmunitaria celular es la responsable del control de la población de ácaros, mientras que los roles de las respuestas inmunitarias humoral e innata, son desconocidos. En los animales domésticos, la forma más grave de la demodicosis, la padecen los perros. En consecuencia, la demodicosis canina es la enfermedad más estudiada. Se han identificado dos especies de ácaros Demodex en perros: Demodex canis y Demodex injai; mientras se ha propuesto una tercera especie denominada Demodex cornei. Muchos estudios han tratado de documentar la prevalencia de ácaros Demodex en los perros sanos mediante diferentes métodos. En la presente tesis doctoral, se describe una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real para detectar ADN de Demodex (secuencia del gen de la quitina sintetasa) en pelos de perros. Ésta técnica demostró la presencia de ácaros Demodex en porcentajes más altos que en los estudios anteriores, sugiriendo que los ácaros Demodex están presentes en todos los perros sanos independientemente de la edad, sexo, raza o pelaje. Además, la técnica demuestra que las poblaciones de Demodex están distribuidas a lo largo del cuerpo de los perro en pequeño número. Con el fin de establecer las relaciones filogenéticas entre las dos especies caninas y la propuesta tercera especie, amplificamos y secuenciamos un fragmento del ADN mitocondrial de la subunidad ribosomal 16S. El análisis filogenético demuestra que D. injai es una especie diferente de D. canis y que D. cornei es probablemente una variante morfológica de D. canis. Además, se desarrolló y estandarizó una técnica de PCR convencional para la detección específica de ADN de D. injai. Ésta técnica demostró que D. injai también es un habitante normal de la piel de algunos perros y que en la mayoría de los casos clínicos de demodicosis canina, la sobrepoblación de D. injai es infrecuente. Finalmente, con el fin de ampliar los conocimientos de la respuesta humoral en la demodicosis canina, obtuvimos un extracto antigénico crudo de D. canis y demostramos, mediante una técnica de Western-blot, la presencia de inmunoglobulinas G contra diversos antígenos de D. canis en el suero de perros sanos, de perros con demodicosis juvenil generalizada con o sin infección cutánea secundaria. En conclusión, ésta tesis doctoral demuestra que los ácaros Demodex son habitantes normales de la piel canina y que se distribuyen en pequeño número a lo largo del pelaje canino. Además, los ácaros D. canis deben ser considerados una especie diferente a ácaros D. injai y, los ácaros D. cornei, una variante morfológica del mismo. Por otro lado, los perros sanos y los perros con demodicosis juvenil generalizada presentan una respuesta humoral adquirida y anticuerpos dirigidos contra diversos antígenos proteicos de D. canis. / It is considered that Demodex mites are normal inhabitants of the mammalian skin. They have been adapted to live inside skin hair follicles and sebaceous glands of mammalian hosts. Demodicosis can be defined as an inflammatory skin disease characterized by the presence of Demodex mite overpopulation. It is considered that the cellular immune response is responsible for the control of mite population, while the role of the humoral and innate immune responses remains unknown. In domestic animals, the most severe form of demodicosis occurs in dogs. Consequently, canine demodicosis is the most studied disease produced by Demodex mites. Two canine Demodex species have been identified: Demodex canis, and Demodex injai, while a third species unofficially named Demodex cornei, has been proposed. Many studies have tried to report Demodex prevalence in healthy dogs by different methods. In the present doctoral thesis, we described a real-time PCR technique to detect Demodex DNA (sequence of chitin synthase gene) in canine hair samples. This technique demonstrated the presence of Demodex mites in higher percentages than previous reports, suggesting that Demodex mites are present in all healthy dogs independent of age, sex, breed, or coat. Furthermore, Demodex populations were distributed in small numbers along the dog’s body. In order to analyze the phylogenetic relationships between the two canine Demodex species and the proposed third species, we amplified and sequenced a fragment of the mitochondrial 16S rDNA gene. Phylogenetic analysis revealed that D. injai is a different species from D. canis. In addition, it demonstrated that D. cornei is probably a morphological variant of D. canis. A conventional PCR for the specific detection of D. injai DNA was also developed and standardized. This technique demonstrated that D. injai is also a normal inhabitant of some dogs. Moreover, it suggested that in the majority of clinical canine demodicosis cases, an overgrowth of D. injai is unlikely. Finally, to enlighten the field of the humoral response in canine demodicosis, a D. canis crude extract antigen was obtained and we demonstrated the presence of immunoglobulins G against several D. canis antigens in the sera of healthy dogs and in the sera of dogs with juvenile generalized demodicosis with and without secondary complicating pyoderma by western blot technique. In conclusion, this doctoral thesis demonstrated that Demodex mites are normal inhabitant of the canine skin, they are present in the majority of dogs, and are distributed in very low numbers along all the haired skin. Furthermore, Demodex injai must be considered a different species from D. canis, and D. cornei is a probable morphological variant of D. canis. Healthy dogs and dogs with canine juvenile generalized demodicosis have an acquired humoral immune response against Demodex mites and present serum antibodies directed against several Demodex canis protein antigens.

Els anellovirus són un grup de virus de cadena senzilla d’ADN amb una elevada diversitat genètica i que infecten a vertebrats. Els Torque teno sus virus (TTSuV) son ubics i és l’espècie d’anellovirus específica que infecta els porcs. S’han descrit 3 espècies víriques diferents, anomenades TTSuV1a i TTSuV1b dins del gènere Iotatorquevirus i TTSuVk2a, dins el gènere Kappatorquevirus. Aquests virus son genèticament molt diferents (>56% de diversitat de seqüencia nucleotídica) però comparteixen la mateixa organització del genoma i estratègia d’expressió. L ‘infecció de TTSuV en porcs es caracteritza per una virèmia persistent. Els TTSuVs no es consideren patogènics, però es creu que juguen un paper en la co-infecció amb altres agents infecciosos que causen malalties porcines importants. L'impacte real dels TTSuVs sobre la salut dels porcs, si n’hi ha , segueix sent objecte de debat. L'objectiu principal d'aquesta Tesi fou caracteritzar la variabilitat de TTSuV i explorar el desenvolupament de possibles prototipus vacunals enfront els TTSuVs. El primer estudi descriu la caracterització genètica d'una nova espècie de TTSuV, anomenada Torque teno sus virus k2b (TTSuVk2b). Segons l'anàlisi filogenètica, aquest nou virus pertany al gènere Kappatorquevirus, el mateix al qual pertany TTSuVk2a. Es van desenvolupar tècniques quantitatives de PCR basades en la tecnologia de SybrGreen pels estudis epidemiològics i per l’estudi de la distribució geogràfica. En concret, es va desenvolupar una tècnica que quantificava la càrrega total de TTSuV (TTSuV broad-spectrum qPCR) i tres més que quantificaven la càrrega viral específica de cada espècie de TTSuV. D'altra banda, es va estudiar la prevalença i la càrrega d'ADN vírica en animals afectats amb per circovirosi porcina (CP). L'estudi epidemiològic va revelar que TTSuVk2b es distribueix a tot el món, encara que és menys abundant que TTSuV1 i TTSuVK2a. TTSuVk2b es va associar amb la CP, una malaltia porcina d'importància econòmica molt significativa. El segon estudi contenia dos objectius: d'una banda, l'expressió de les proteïnes TTSuVs; per l'altra banda, l’avaluació de l'impacte d’una vacuna experimental multivalent enfront les 4 espècies de TTSuVs conegudes, utilitzant com a model l’infecció natural de TTSuV en porcs. Les proteïnes recombinants ORF1, ORF1-A, ORF2 i ORF3 dels quatre TTSuVs coneguts es van expressar amb èxit mitjançant un sistema d'expressió de baculovirus. Per altra part, la vacuna experimental multivalent (formada per les proteïnes dels gens ORF1 i ORF3) va ser administrada per via intramuscular i intradèrmica utilitzant dos esquemes de vacunació diferents (dues o tres dosis). La seroconversió i els títols vírics en sang es van mesurar a partir de 3 fins a 15 setmanes d'edat, utilitzant respectivament l'ELISA indirecte basat en proteïnes del virus expressades en baculovirus i tècniques de PCR quantitativa per detectar i quantificar els nivells de virèmia de cada espècie TTSuV, respectivament. Aquest estudi va mostrar que la vacuna multivalent induïa anticossos anti-TTSuV, però aquest prototipus vacunal no era capaç de controlar la virèmia durant l’infecció natural de TTSuV. Finalment, en el tercer estudi es va avaluar l’immunització enfront TTSuVk2a durant l’infecció natural en porcs. L’immunització va consistir en una combinació d'ADN i proteïnes víriques per augmentar les possibilitats d'activació de respostes immunitàries tant cel·lulars com humorals. Es van utilitzar tècniques de PCR quantitativa per detectar i quantificar els nivells de virèmia de cada espècie de TTSuV, mentre que l’inducció d'anticossos específics va ser monitoritzada mitjançant ELISA indirecte. El grup vacunat va mostrar una seroconversió i una reducció significativa de les càrregues víriques de TTSuVk2a en comparació amb el grup control. Aquest estudi va demostrar per primera vegada que la virèmia per TTSuV pot ser controlada a través de l’ús d’una combinació que inclou ADN i proteïnes recombinant. En general, aquesta Tesi Doctoral contribueix a augmentar el coneixement dels TTSuVs mitjançant la descripció d’una nova espècie vírica, la qual pot estar associada al desenvolupament de malalties del porc, com s’ha indicat per TTSuVk2a. A més, l’infecció per TTSuV pot ser controlada mitjançant l'administració d'una vacuna d'ADN i proteïnes recombinats del virus, mentre que la vacuna basada en múltiples proteïnes (multivalent) no va ser eficient. / Anelloviruses are a highly diverse group of circular single-stranded DNA viruses infecting vertebrates. Torque teno sus viruses (TTSuV) are ubiquitous pig-infecting anelloviruses. Three different viral species have been described, namely TTSuV1a and 1b within the genus Iotatorquevirus and TTSuVk2a, within the genus Kappatorquevirus. These viruses are genetically very distinct (>56% sequence diversity) but share similar genome organization and expression strategy. TTSuV infection in pigs is distributed worldwide, and is characterized by a persistent viremia. TTSuV themselves are considered non-pathogenic; however, it is believed that these viruses play a role in co-infection with other economically important viral porcine infections. Apparently, TTSuV infection can influence the development or may contribute to the pathogenesis of various porcine diseases during co-infection. The real impact of TTSuV on the pig health, if any, is still under debate. The present Thesis aimed to characterize a novel TTSuV species and to explore possible ways of vaccination against TTSuVs. The first study describes the discovery, genetic characterization and epidemiology of a novel TTSuV species, named Torque teno sus virus k2b (TTSuVk2b). According to phylogenetic analysis, this new virus belongs to the Kappatorquevirus genus, belonging to the same genus as TTSuVk2a. Quantitative PCR techniques based on SybrGreen technology were developed; one for quantification of total TTSuV load (TTSuV broad-spectrum qPCR) and others for quantification of each TTSuV species separately. These techniques were used for epidemiological studies and assess the geographical distribution. Moreover, prevalence and viral DNA load were determined in porcine circovirus type 2-systemic disease (PCV2-SD)-affected animals and healthy counterparts, since previous studies have associated another kappatorquevirus species, to the disease. The epidemiological study revealed that TTSuVk2b is worldwide distributed, although less abundant and displaying lower viral DNA titres in serum than TTSuV1 and TTSuVk2a. TTSuVk2b was associated with PCV2-systemic disease (PCV2-SD), which revealed that the two kappatorquevirus species are both genetically and biologically related. The second study contained two objectives. On one hand, TTSuV proteins were expressed in a baculovirus-based platform; on the other hand, the impact of a multivalent experimental vaccine was evaluated in a natural TTSuV infection model of pigs. The ORF1, ORF1-A, ORF2 and ORF3 recombinant proteins of all four known TTSuVs were successfully expressed in a baculovirus expression system. In additional, the multivalent experimental vaccine containing ORF1 and ORF3 proteins was administered by intramuscular and intradermal routes using two different vaccination schedules (twice or three times). Seroconversion and viral titres in blood were measured from 3 weeks until 15 weeks of age, using the indirect ELISA based on baculoviruses proteins and species-specific qPCRs, respectively. This study showed that vaccination induced anti-TTSuV antibodies; however the multivalent vaccine was not able to control viremia during TTSuV natural infection. Finally, in the third study, the immunization against TTSuVk2a during natural infection was evaluated using a different approach. The immunizations consisted of a combination of DNA and protein to increase the possibilities of activating both cellular and humoral immune responses. Quantitative PCR techniques were used to detect and quantify the viremia levels of each TTSuV species, while the induction of specific antibodies was monitored by indirect ELISA. The vaccinated group showed a seroconversion and a significant reduction of the TTSuVk2a viral loads compared to the control group. This study demonstrated for the first time that TTSuV viremia can be controlled by a combined DNA and protein immunization. Overall, the present Thesis contributes to increase the knowledge on TTSuV by means of describing a novel species, which may be involved in disease progression in co-infection with other pig pathogens. Moreover, TTSuV infection can be controlled by the administration of a combined DNA/protein immunization while a multivalent protein based vaccine was not efficient.

Los inhibidores de la calcineurina son los fármacos fundamentales para el tratamiento inmunosupresor del trasplante pulmonar (TP). El manejo de estos fármacos se basa en la monitorización farmacocinética de los mismos, generalmente mediante estrategias de muestreo limitado. El impacto que tienen las variaciones farmacocinéticas en los resultados y cuál es la bioequivalencia entre distintas formas farmacéuticas de algunos de ellos son las preguntas de la presente tesis doctoral. Pacientes y métodos: El primer estudio de farmacocinético de la Ciclosporina (CsA) analiza AUC, Cmin, Cmax y coeficiente de variabilidad intraindividual (CV), en 10 pacientes adultos portadores de TP estable. Se definieron dos grupos, alto CV (CV>20%) y bajo (CV<20%). El objetivo fue determinar el CV del AUC y su impacto en la supervivencia. El segundo estudio farmacocinético compara dos formulaciones de tacrolimus, la formulación clásica (TAC BID) y la formulación de liberación prolongada (TAC QD), analizando AUC, Cmin, Cmax, la correlación entre el AUC así como la correlación del AUC con las concentraciones a diferentes tiempos, en diecinueve pacientes adultos portadores de TP estable sin fibrosis quística. El objetivo fue determinar si ambas formulaciones eran bioequivalentes y la seguridad del cambio de una formulación por otra. Resultados: En el primer estudio seis pacientes (60%) presentan un CV bajo y cuatro (40%) tienen un CV alto. En los pacientes con CV bajo, la mejor correlación del AUC0-12h era con la concentración de CsA a las 2 horas (C2) (r=0674, p=0,002), mientras que en los pacientes con CV alto, la mejor correlación era con C5 (r=0,800, p=0,003). En el último grupo, la correlación con C2 era baja (r=0,327, p=0,32), mientras la correlación con C0 era alta (r=0,709, p<0,05). La supervivencia a los 5 años tiende a ser menor en el grupo con CV alto. En el segundo estudio farmacocinético la media del AUC0-24 h para el TAC BID era de 279,8 ng.ml/h y de 278,7 ng.ml/h para TAC QD (p=0,92). El AUC0-12h del TAC BID era mayor que el AUC12-24h. Hay una buena correlación entre el AUC0-24h y la C24 para ambas formulaciones, TAC QD (r=0,96) y TAC BID (r=0,94), respectivamente. No existieron diferencias en los efectos adversos observados con ambas formulaciones. Conclusiones: Existe una alta variabilidad intraindividual de la farmacocinética de la CsA en un número relevante de TP. En los pacientes con elevado CV, el uso de los niveles de C0 parece más apropiado para la monitorización de la CsA que los niveles de C2. La bioequivalencia del tacrolimus es similar en ambas formulaciones tras la conversión en pacientes con TP estable, excluyendo fibrosis quística. Los presentes resultados indican que el TAC BID puede ser cambiado de forma segura a la formulación TAC QD que es más cómoda y favorece el cumplimiento en esta población. / Calcineurin inhibitors are the main immunosuppressive drugs in lung transplantation (LT). The management of these drugs is based on pharmacokinetic monitoring, mainly by one limited sampling strategy. The impact of pharmacokinetic variations in outcomes and what is the bioequivalence between different preparations of some of them were the relevant questions developed in the present thesis. Patients and methods: In the first pharmacokinetic study AUC, Cmin, Cmax and intraindividual coefficient of variation (CV) of cyclosporine (CsA) was analized in 10 adult stable lung transplant patients. According to their CV two groups were defined: high CV (CV >20%) and low CV (CV<20%). The objective was to determine the CV of AUC and investigate the implications of this factor on outcomes. The second pharmacokinetic study compares two formulations of tacrolimus, the classical formulation (TAC BID) and extended release formulation (TAC QD). AUC, Cmin, Cmax and correlations between the AUC and the drug concentrations at different time points were analyzed in nineteen adult stable non-cystic fibrosis LT patients. The objective was to determine if both formulations of tacrolimus were or not bioequivalent and the safety of the switch from one to the other. Results: In the first pharmacokinetic study six (60%) patients presented low CV and four (40%) high CV. In patients with low CV, the best correlation of AUC0–12h was with CsA concentration at two hours post-dose (C2) (r = 0.674, p = 0.002), whereas in those patients with high CV, the best correlation was C5 (r = 0.800, p = 0.003). In the latter group, the correlation with C2 was low (r = 0.327, p = 0.32), whereas the correlation with C0 was high (r = 0.709, p < 0.05). Five years survival trends to be worse in patients with high CV. Results of the second pharmacokinetic study showed a mean AUC0-24h of 279.8 ng mL/hr for TAC BID and 278.7 ng mL/h for TAC QD (p=0.92). AUC0-12h of TAC BID was higher than the AUC12-24h. There was a good correlation between AUC0-24h and C24 for both TAC QD (r=0.96) and TAC BID (r=0.94) formulations, respectively. There were no differences in the adverse events occurring with both formulations. Conclusions: High intra-individual variability of CsA pharmacokinetics exists in a relevant number of stable LT recipients. In those patients, the use of C0 levels may be more appropriate for CsA monitoring than C2 levels. Tacrolimus bioavailability in steady state is similar in TAC BID and TAC QD formulations after conversion in stable non-cystic fibrosis LT recipients. Thus, our results indicate TAC BID can be safely switched to TAC QD formulation in this population that is more comfortable and could improve compliance.